CN101974471A - 一种鞘氨醇单胞菌dx-t3-03菌株及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株及其提取方法，该菌株对锌具有高抗性并且具有降解苯酚能力。本发明的菌株从矿山尾矿坝土壤中分离提取，对锌的耐受性高达4mM/L的同时，苯酚的降解率高达88％，营养要求不高，在生物治理含酚工业废水和重金属双重污染中具有重要应用潜力；提取方法简便快捷，成本低，对环境友好。

Description

一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株及其提取方法

技术领域

本发明属于鞘氨醇单胞菌菌株领域，特别涉及一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株及其提取方法。

背景技术

随着采矿业的发展和重金属在电镀、冶金、化工和制药业等方面的应用，重金属污染日趋严重。由于重金属在土壤中难降解、难迁移、危害期长等特点，已使得土壤重金属污染成为国内外普遍关注的环境问题之一。其中重金属锌既是重要的营养元素，也是污染元素。锌曾被誉为“生命之花”，是维持机体正常生长发育、新陈代谢的重要物质。我国是产锌大国，最大的消费领域是镀锌工业，消费量约占锌总产量的30％40％。除此之外，其它工业产生的含锌废水也不容忽视。许多实验和流行病学调查已经证实，如果锌在人体内含量过高，将会抑制吞噬细胞的活性和杀菌力，从而降低人体的免疫功能，对疾病易感性增加。最近的科学研究表明，摄入过量的锌，会对人体造成一定的伤害，甚至可引起中毒，以至死亡；同时锌中毒会导致胰腺、肾和体内多元系统(Muitisystem)功能紊乱甚至死亡。

对于重金属的处理，由于传统的物理或化学方法常伴随二次污染，且运行费用高，操作复杂，已越来越不适宜现代污染治理的需要。近年来，微生物在重金属污染治理的潜在应用前景，使得其在处理重金属污染问题上成为国内外一个新型的研究方向。因此，筛选新的具有高抗性能力的微生物并研究它们的抗性机理也成为当前的主要任务之一。

苯酚是造纸、炼油、制药、焦化等工业过程中产生的一种有机污染物，会对动、植物产生有毒甚至致命的作用。大量酚类物质及其衍生物在土壤和水体中的排放和积累导致了生态环境的日趋恶化，许多国家已将其列入环境优先控制污染物的黑名单中。近年来，随着生物新技术的发展，利用微生物降解法处理高浓度含酚废水是一种经济高效且不会产生二次污染的方法，相关方面的研究越来越受到人们的关注。但含酚工业废水中往往含有较高浓度的重金属离子，而高浓度重金属离子的存在会抑制微生物对苯酚的生物降解。因此，获得有一定耐受重金属能力的苯酚降解菌在含酚工业废水的生物处理中将具有突出的应用潜力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株及其提取方法，该菌株对锌的耐受性高达4mM/L的同时，苯酚的降解率高达88％，营养要求不高，对苯酚有较好的降解能力，在生物治理含酚工业废水和重金属双重污染中具有重要应用潜力；提取方法简便快捷，成本低，对环境友好。

本发明的一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株，其特征在于：该菌株对锌具有高抗性并且具有降解苯酚能力。

本发明的一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，包括：

(1)定向驯化

在矿区取土制成土壤悬液按5wt％的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化2个月；

(2)菌株的富集分离和纯化

将上述驯化后的样品静置，取上层水样作梯度稀释，然后每种稀释浓度分别取1mL菌液于接种到固体培养基进行富集培养，如此反复多次确保长出纯的单一菌株，再接种到斜面培养基，即可。

所述步骤(1)中的无机盐培养基为(NH₄)₂SO₄ 10.0g，KH₂PO₄ 7.5g，Na₂HPO₄ 10.0g，FeCl₃ 0.0125g，MgSO₄·7H₂O 0.015g，蒸馏水1000mL，pH＝6.5～7.0。

所述步骤(1)中的梯度压力式驯化法为在无机盐培养基中，同时加入梯度浓度的滤菌苯酚和滤菌Zn²⁺溶液，使培养基中同时含有苯酚和Zn²⁺且两种物质浓度均依次升高，即苯酚300、400、500、600、700、800、900、1000mg/L，Zn²⁺浓度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mM/L，改变浓度的间隔时间为6～7d，于30～35℃，振荡速率150r/min条件下进行驯化培养。

所述步骤(2)中的梯度稀释为10^-1～10^-10的梯度稀释。

所述步骤(2)中的固体培养基为富集液体培养基基础上加入质量分数1.5％的琼脂，1×10⁵Pa灭菌30min，冷却后而形成的培养基，其中富集液体培养基为蛋白胨0.25g，胰蛋白胨0.25g，酵母粉0.5g，葡萄糖0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，蒸馏水1000mL，pH＝6.5～7.0。斜面培养基为将固体培养基加热溶化，取干净的试管，试管中倒入约5mL固体培养基，将试管口端放在玻璃棒上，使管内培养基形成斜面而形成。

所述步骤(2)中富集培养是指将菌液于接种到富集培养基后于30℃培养箱中培养48h，挑取形态清晰的单一菌落，编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，再观察结果，在电子显微镜下观察菌落形态，反复2～4次，确保长出纯的单一菌株。

鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株的16S rDNA序列如下：

CCAATGGCGGCTGCCTACACATGCAGTCGAACGAGATCTTCGGGTCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCCTTTGGTTCGGAATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGGATGATGACGAAAGTCCAAAGATTTATCGCCAGAGGATGAGCCCGCGTAGGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGATGATAATGACAGTACCGGGAGAATAAGCTCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGAGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTTAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAACTCCAGAACTGCCTTTAAGACTGCATCGCTTGAATCCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACTGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGGACTTGGTCTTTGGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCGTTTGACATGTCCGGACGATTTCCAGAGATGGATCTCTTCCCTTCGGGGACTGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTACCATCATTTAGTTGGGGACTCTAAAGGAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGCAGCAAACTCGCGAGAGTGCGCTAATCTCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTTCACCCGAAGGCGTTGCGCTAACTCGCAAGAGAGGCAGGCGACCACGGTGCTAGCGTGT。

菌株16S rDNA的基因全序列在NCBI数据库中分析比较，鉴定为鞘氨醇单胞菌，鉴定结果见图2，其系统进化树见图3，与Sphingomonas aquatilis strain JSS-7(AF131295)同源性高达99％，命名为Sphingomonas sp.Strain DX-T3-03。

所述的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.Strain DX-T3-03为革兰氏阴性短杆菌，好氧，菌体大小约为(0.4～0.6)μm×(1.0～2.0)μm，其电镜扫面见图4；在固体培养基中菌落呈圆形，凸起，乳白略带淡黄色，表面光滑湿润，不透明，边缘规则整齐，极易挑起；最适生长条件pH为6.7左右，温度为30～35℃，摇床震荡速率为150r/min。

该鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.strain DX-T3-03)可以有效地对重金属锌进行生物吸附和生物积累，能够在最高浓度为55mM/L锌浓度固体平板中生长，并且12h培养后就能在25mM/L锌浓度的培养液中良好生长。

该鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.Strain DX-T3-03)能将浓度为0.2、0.4、0.6g/L的苯酚，在24h内几乎完全降解；苯酚浓度0.8、1.0g/L时，能在36h降解率达70％左右；要完全降解1.2g/L苯酚，还需要一定时间，说明该菌株对苯酚有较好的降解能力，并且加入4mM/LZn²⁺并不会对该菌降解苯酚产生明显抑制作用，这对菌株在含重金属污染的含酚工业废水的处理应用中的作用十分重要。

Sphingomonas sp.Strain DX-T3-03具有降解苯酚及抗重金属的双重功效，由于重金属与污染物的共存抑制了污染物降解菌的降解能力。因此，在重金属污染的极端环境中，只具有降解有机物污染单一能力的细菌将难以发挥其降解效能，而此菌株的筛选为利用耐重金属的苯酚降解菌进行生物修复提供了参考。

有益效果

本发明的菌株对锌的耐受性高达4mM/L的同时，苯酚的降解率高达88％，营养要求不高，对苯酚有较好的降解能力，在生物治理含酚工业废水和重金属双重污染中具有重要应用潜力；提取方法简便快捷，成本低，对环境友好。

附图说明

图1为苯酚的分子结构式；

图2为Sphingomonas sp.Strain DX-T3-03的16S rDNA序列的鉴定结果；

图3为Sphingomonas sp.Strain DX-T3-03遗传发育树图；

图4为Sphingomonas sp.Strain DX-T3-03的扫描电镜图；

图5为添加4mM/L重金属锌时细菌对不同浓度苯酚降解率图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)取某矿山尾矿坝取土制成土壤悬液按5wt％的接入量接种于以苯酚为唯一碳源的含锌无机盐培养基中，其中无机盐培养基为(NH₄)₂SO₄ 10.0g，KH₂PO₄ 7.5g，Na₂HPO₄ 10.0g，FeCl₃ 0.0125g，MgSO₄·7H₂O 0.015g，蒸馏水1000mL，pH＝6.5～7.0。同时加入梯度浓度的滤菌苯酚和滤菌Zn²⁺溶液，使培养基中同时含有苯酚和Zn²⁺且两种物质浓度均依次升高，为苯酚500、600、700、800、900、1000mg/L，Zn²⁺浓度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mM/L，改变浓度的间隔时间为6～7d，于30～35℃，振荡速率150r/min条件下进行驯化培养2个月；

(2)取驯化2个月后的样品，静置30分钟，取上层水样1mL，作10^-1～10^-10梯度稀释。每种稀释浓度分别取1mL菌液于培养皿内，倒入固体培养基后将培养皿放在桌上，来回转动培养皿后，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，挑取形态清晰的单一菌落，编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，再观察结果，反复几次，并在电子显微镜下观察，确保是纯的单一菌株后，将分离出的菌种接种到斜面培养基上，4℃下保存于冰箱中待后续进行降解试验。其中固体培养基为富集液体培养基基础上加入质量分数1.5％的琼脂，1×10⁵Pa灭菌30min，冷却后而形成的培养基，其中富集液体培养基为蛋白胨0.25g，胰蛋白胨0.25g，酵母粉0.5g，葡萄糖0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，蒸馏水1000mL，pH＝6.5～7.0。斜面培养基为将固体培养基加热溶化，取干净的试管，试管中倒入约5mL固体培养基，将试管口端放在玻璃棒上，使管内培养基形成斜面而形成；

(3)分别挑取经分离纯化后的单一菌落于无机盐培养基中，各无机盐培养基中均含有0.6g/L的苯酚和4mM/L Zn²⁺，在30℃、150r/min、250mL锥形瓶中装填量100mL的条件下进行培养，培养时间为24h，培养后通过电子显微镜观察细菌生长情况以及测定溶液中苯酚的剩余浓度，从而确定出具有抗锌特性的苯酚高效降解菌株。

本菌株在初始pH值为6.7左右，温度为30℃，振荡速率为150r/min，250mL锥形瓶的装液量为100mL的条件下，苯酚初始浓度为0.6g/L，重金属Zn²⁺为4mM/L培养时间24h，然后利用4-氨基安替比林法对苯酚浓度进行测定，测定波长为510nm；苯酚的降解率高达88％。

Claims (6)

1.一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株，其特征在于：该菌株对锌具有高抗性并且具有降解苯酚能力；其16S rDNA序列如下：

CCAATGGCGGCTGCCTACACATGCAGTCGAACGAGATCTTCGGGTCTAGTGGCGCACGG

GTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCCTTTGGTTCGGAATAACAGTTGGAAACGACTGCTA

ATACCGGATGATGACGAAAGTCCAAAGATTTATCGCCAGAGGATGAGCCCGCGTAGGAT

TAGCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGA

TGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG

GAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCT

TAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGATGATAATGACAGTACCGGGAGAATAAGCTCCG

GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGAGCTAGCGTTGTTCGGAATTAC

TGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTTAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAA

CTCCAGAACTGCCTTTAAGACTGCATCGCTTGAATCCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCG

AGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACT

GGACTGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT

GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGGACTTGGTCTTTGGGTGGC

GCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAT

GAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGC

AGAACCTTACCAGCGTTTGACATGTCCGGACGATTTCCAGAGATGGATCTCTTCCCTTCG

GGGACTGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT

AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTACCATCATTTAGTTGGGGACTCTAA

AGGAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCC

TTACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGCAGCAAACTCGCG

AGAGTGCGCTAATCTCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGC

ATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGG

CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTTCACCCGAAGGCGTTGCGCTA

ACTCGCAAGAGAGGCAGGCGACCACGGTGCTAGCGTGT。

2.一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，包括：

(1)定向驯化

在矿区取土制成土壤悬液按5wt％的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化2个月；

(2)菌株的富集分离和纯化

将上述驯化后的样品静置，取上层水样作梯度稀释，然后每种稀释浓度分别取1mL菌液于接种到固体培养基进行富集培养；将培养的纯的单一菌株，接种到斜面培养基，即可。3.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中的无机盐培养基为(NH₄)₂5O₄ 10.0g，KH₂PO₄ 7.5g，Na₂HPO₄ 10.0g，FeCl₃ 0.0125g，MgSO₄·7H₂O 0.015g，蒸馏水1000mL，pH＝6.5～7.0。

4.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中的梯度压力式驯化法为在无机盐培养基中，同时加入梯度浓度的滤菌苯酚和滤菌Zn²⁺溶液，使培养基中同时含有苯酚和Zn²⁺且两种物质浓度均依次升高，即苯酚300、400、500、600、700、800、900、1000mg/L，Zn²⁺浓度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mM/L，改变浓度的间隔时间为6～7d，于30～35℃，振荡速率150r/min条件下进行驯化培养。

5.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中的梯度稀释为10^-1～10^-10的梯度稀释。

6.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中的固体培养基为富集液体培养基基础上加入质量分数1.5％的琼脂，1×10⁵Pa灭菌30min，冷却后而形成的培养基，其中富集液体培养基为蛋白胨0.25g，胰蛋白胨0.25g，酵母粉0.5g，葡萄糖0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，蒸馏水1000mL，pH＝6.5～7.0。

7.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌DX-T3-03菌株的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中富集培养是指将菌液于接种到富集培养基后于30℃培养箱中培养48h，挑取形态清晰的单一菌落，编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，再观察结果，在电子显微镜下观察菌落形态，反复2～4次，确保长出纯的单一菌株。

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