CN107690279B - 非人动物表现出上运动神经元功能和下运动神经元功能以及感知减弱 - Google Patents
非人动物表现出上运动神经元功能和下运动神经元功能以及感知减弱 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于疾病如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)中运动神经元功能紊乱的动物模型，包括经基因修饰的非人动物，所述经基因修饰的非人动物包含经基因修饰的DR6等位基因并在出生时及出生后若干周或月内表现出正常表型。但是，随着所述非人动物变老，其患有表现为一种或多种ALS样症状的运动神经元功能紊乱，这在发病后可快速发展。还提供了鉴定可用于预防、延迟或治疗ALS的候选试剂的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时申请序列号62/133,909(2015年3月16日提交)以及62/250,229(2015年11月3日提交)的权益，每个申请均据此以引用方式并入本文中。
序列表
通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表提交，该文件名称为2016-03-16-T0041WO01-SEQ-LIST_ST25.txt，创建日期为2016年3月16日，文件大小为约685千字节，并且该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本申请整体涉及随时间推移上运动神经元、下运动神经元和/或感知发育减弱的非人动物，所述动物可为神经退行性障碍(例如运动神经元疾病诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS))提供可用模型。
背景技术
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)(也称为卢伽雷氏病)是一种由于破坏负责随意运动的脊髓、脑干和皮质中运动神经元造成的致命的神经退行性疾病。这种疾病临床上表现为进行性肌无力和肌萎缩，在疾病发作3-5年内引起麻痹和死亡。
在美国大约20,000人患有ALS，并且每年新增5,000例ALS患者。ALS在世界范围内十分常见，影响所有种族和民族群体。ALS的平均发病年龄在40岁和60岁之间，但年轻人和老年男女也可患有ALS。在90％-95％的ALS病例中，该疾病是明显随机发生的(称为偶发性ALS(sALS))。在这类SALS病例中，不存在家族病史和明确相关的风险因素。在5％-10％的ALS病例中，存在遗传性基因联系(称为家族性ALS(fALS))。
在与ALS相关的突变中，长期以来认为在铜-锌过氧化物歧化酶(SOD1)基因中的那些突变通过毒性功能获得而非SOD1酶的抗氧化功能受损来引发ALS疾病。带有与fALS相关突变的其它基因包括alsin(ALS2)、senataxin(ALS4)、囊泡相关膜蛋白(VAPB、ALS8)、血管生成素以及动力蛋白激活蛋白的p150亚基(DCTN1)。近来，在具有或不具有明显家族史的ALS患者中已经鉴定出Tardbp的TDP-43-编码区中的三十多种突变，这些突变对应于大约4％的fALS和小于1％的sALS。多数带有TDP-43突变的患者具有经典的ALS表型但无认知缺陷，这表明TDP-43在ALS发展中的重要作用。另外，C9ORF72基因的启动子中的GGGGCC六核苷酸扩展重复序列似乎为fALS和sALS以及ALS相关的额颞叶痴呆(ALS-FTD)的非常常见的起因。
已经建立了用于ALS疾病的若干小鼠模型，这些模型包括下列品系：具有SOD1、TDP43或FUS突变的啮齿动物、ALS2-敲除小鼠以及具有经基因工程改造的编码神经丝亚单位的基因的小鼠。在这些模型中，人突变体SOD1(mSOD1)转基因小鼠模型是目前最常用的一种，因为它与ALS患者共有若干种临床表型。mSOD1小鼠的第一症状为在大约90至100日龄时出现的一个或多个肢体的轻微“抖动/震颤”。在后期阶段，小鼠开始表现出临床症状，首先表现出肌无力和/或后肢麻痹，然后轻瘫上升至前肢，最后出现严重四肢麻痹。然而，现有动物模型均不适用于人类疾病，因为动物并不表现上运动神经元症状、TDP43和/或SOD1聚集和/或非运动神经元损失。因此，需要更接近地反映人类ALS的动物模型。
发明内容
本文提供了一种经基因修饰的非人动物，其患有症状为上运动神经元、下运动神经元和/或感知功能紊乱的病症，因此可用作影响运动神经元的一种或多种神经退行性疾病(诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、原发性脊髓侧索硬化症、原发性脊髓侧索硬化症、进行性肌营养障碍等)的模型。具体地讲，本文提供了一种包含经修饰的内源性DR6基因座的啮齿动物(例如大鼠或小鼠)，其中经修饰的DR6基因座缺少(例如，不包含、不存在等)编码整个DR6胞质死亡结构域或DR6胞质结构域的第一核苷酸(例如，第一DNA、第一cDNA、第一基因组DNA等)序列，例如经修饰的DR6基因座缺少编码DR6胞质死亡结构域或DR6胞质结构域的任何部分的核苷酸序列。经修饰的DR6基因座还可缺少(i)编码整个DR6跨膜结构域的第二核苷酸(例如，第二cDNA、第二DNA、第二基因组DNA)序列，例如编码DR6跨膜结构域的任何部分的第二核苷酸序列；(ii)编码DR6胞外结构域或其任何部分的第三核苷酸(例如，第三cDNA、第三DNA、第三基因组DNA)序列，例如编码DR6胞外结构域的任何部分的第三核苷酸序列；(iii)第四核苷酸序列，例如从内源性啮齿动物DR6基因的整个外显子3横跨至整个外显子6(包括居间内含子)的第四基因组序列；和/或(iv)第五核苷酸序列，例如从内源性啮齿动物DR6基因的外显子2的一部分(例如碱基4103)横跨至整个外显子6例如终止密码子(包括居间内含子)的第四基因组序列，其中第五核苷酸序列编码全长和成熟内源性啮齿动物DR6蛋白。在一些实施方案中，啮齿动物为小鼠，并且经修饰的DR6等位基因缺少编码DR6胞质死亡结构域的第一核苷酸序列，例如经修饰的DR6等位基因缺少编码SEQ ID NO:15的第388-454位氨基酸或其任何部分的第一核苷酸序列。在一些实施方案中，提供了一种包含经修饰的DR6等位基因的小鼠，所述等位基因缺少编码胞质结构域(例如具有如SEQ ID NO:15的第330-614位氨基酸所示的氨基酸序列的胞质结构域)的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供的小鼠包含经修饰的DR6等位基因，所述等位基因缺少编码成熟DR6蛋白的核苷酸序列，例如，如SEQ ID NO:15的第1-614位氨基酸所示。在一些实施方案中，经修饰的DR6等位基因缺少大于5kb的内源性基因组序列。在一些实施方案中，经修饰的DR6等位基因缺少大于10kb的内源性基因组序列。在一些实施方案中，经修饰的DR6等位基因缺少大于20kb的内源性基因组序列。在一些实施方案中，经修饰的DR6等位基因缺少大于30kb的内源性基因组序列。在一些实施方案中，经修饰的DR6等位基因缺少大于40kb的内源性基因组序列。在一些实施方案中，经修饰的DR6等位基因缺少大于50kb的内源性基因组序列。在一些实施方案中，啮齿动物对经修饰的DR6基因座为杂合或纯合的，所述基因座缺少编码内源性DR6胞外结构域、内源性跨膜结构域和/或内源性DR6胞质结构域的任何部分的核苷酸序列。
如本文提供的经基因修饰的啮齿动物可例如在内源性DR6基因座(例如，如本文所述的经修饰的内源性DR6基因座)处表达核酸，例如该核酸可随机插入啮齿动物的基因组或可操作地连接至内源性DR6转录调控序列，其中该核酸编码包含功能性DR6信号肽(例如，功能性异源DR6信号肽、功能性内源性DR6信号肽、功能性大鼠DR6信号肽、功能性小鼠DR6信号肽等)、跨膜结构域(例如，DR6跨膜结构域或异源跨膜结构域(例如，ROR1跨膜结构域))、报告基因蛋白(例如，β-半乳糖苷酶蛋白)或其组合的多肽，并且其中多肽缺少(例如，未可操作地融合至、不包含等)功能性DR6胞质结构域或其任何部分。在一些实施方案中，多肽也缺少功能性DR6胞外结构域或其任何部分。在一些实施方案中，多肽基本上由功能性DR6信号肽组成或由其组成。在一些实施方案中，多肽基本上由可操作地融合至跨膜结构域的功能性DR6信号肽组成或由其组成。在一些实施方案中，多肽基本上由可操作地融合至跨膜结构域的功能性DR6信号肽组成或由其组成，该跨膜结构域可操作地融合至报告基因蛋白。在一些实施方案中，多肽基本上由可操作地融合至跨膜结构域的功能性DR6信号肽组成或由其组成。在一些实施方案中，多肽基本上由跨膜结构域组成或由其组成。在一些实施方案中，多肽基本上由可操作地融合至报告基因蛋白的跨膜结构域组成或由其组成。在一些实施方案中，多肽基本上由报告基因蛋白组成或由其组成。在一些实施方案中，DR6信号肽为啮齿动物DR6信号肽(例如小鼠DR6信号肽)，例如，如SEQ ID NO:15的第1至41位氨基酸(或其任何部分)所示，例如由如SEQ ID NO:6所示的序列或其编码相同氨基酸序列但只是由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:6的简并变体编码。在一些实施方案中，如本文提供的啮齿动物包含并表达核酸，该核酸包含、基本上由如SEQ ID NO:6所示的序列或其编码相同氨基酸序列但只是由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:6的简并变体组成或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域为ROR1跨膜结构域，例如由如SEQ ID NO:7所示的序列或其编码相同氨基酸序列但只是由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:7的简并变体编码。在一些实施方案中，核酸序列包含、基本上由如SEQ ID NO:7所示的序列或其编码相同氨基酸序列但只是由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:7的简并变体组成或由其组成。在一些实施方案中，报告基因蛋白为β-半乳糖苷酶，例如由如SEQ ID NO:8所示的序列或其编码相同氨基酸序列但只是由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:8的简并变体编码。在一些实施方案中，核酸序列包含、基本上由SEQ ID NO:8或其编码相同氨基酸序列但只是由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:8的简并变体组成或由其组成。在一些实施方案中，如本文提供的啮齿动物包含并表达编码可操作地融合至ROR1跨膜结构域的DR6信号肽的核酸，该ROR1跨膜结构域可操作地融合至β-半乳糖苷酶，例如，如本文提供的啮齿动物包含并表达如SEQ ID NO:17所示的核酸序列或其编码相同氨基酸序列但只是由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:17的简并变体。
在一些实施方案中，核酸在内源性DR6基因座处，任选地可操作地连接至一个或多个内源性DR6调控元件(例如内源性转录调控元件)，使得啮齿动物对经修饰的DR6基因座为杂合或纯合的，所述基因座包含核酸但至少缺少编码整个内源性DR6胞质结构域或其整个任何部分(例如，整个DR6胞质死亡结构域)的核苷酸序列，并任选地还缺少编码整个内源性DR6跨膜结构域或其任何部分的另外的核苷酸序列和/或整个内源性DR6胞外结构域。
在一些实施方案中，内源性DR6基因座的修饰和/或如本文所述核酸的表达影响神经元、神经胶质细胞或其组合的功能。在一些实施方案中，核酸的表达致使例如上运动神经元和/或下运动神经元的功能减弱如功能紊乱，其可表现为例如(a)驼背；(b)异常后肢抱握；(c)运动协调和运动学习能力缺陷；(d)体重减轻以及(e)相比于与经基因修饰的啮齿动物具有相同遗传背景例如品系相同的对照啮齿动物感知减弱。在一些实施方案中，包含经修饰的DR6基因座和/或表达如本文所述的核酸的啮齿动物可表现出一种或多种运动神经元功能紊乱症状，例如上运动神经元和/或下运动神经元功能紊乱。在一些实施方案中，症状为(a)驼背；(b)异常后肢抱握；(c)运动协调和运动学习能力缺陷；(d)体重减轻和/或(e)例如相比于与经基因修饰的啮齿动物具有相同遗传背景例如品系相同的对照啮齿动物感知减弱。在一些实施方案中，一种或多种症状为选自震颤、痉挛性麻痹(僵直)、反射异常以及它们的组合的涉及上运动神经元功能紊乱的ALS样症状和/或选自肌无力和消瘦、肌束震颤以及它们的组合的涉及下运动神经元功能紊乱的ALS样症状。这类ALS样症状可使用盲法主观ALS-TDI神经系统评分、转杆测试、猫步测试、旷场测试中的一者或多者进行直观观察。另外，如本文所公开的啮齿动物与在介于8周龄和20周龄之间的对照野生型动物相比可表现出体重增加减缓。如本文所公开的啮齿动物也可表现出对疼痛刺激作出反应的延迟时间不足，而无论啮齿动物是否表现出运动神经元功能减弱，该运动神经元功能减弱表现为在转杆上时间不足、运动功能受损、猫步能力减弱以及它们的组合。
在一个方面，啮齿动物在出生时可能看起来非常正常(例如，肉眼看起来正常，例如运动神经元功能紊乱和/或感知减弱在盲法主观神经系统评分测定、转杆测试、猫步测试、旷场测试、体重测量和/或经受疼痛测试中并不明显)，但随其变老，便会患上一种或多种可见ALS样症状，例如啮齿动物在2周龄、3周龄、4周龄、5周龄、6周龄等之后可能患上一种或多种ALS样症状。在一个方面，如本文所述的啮齿动物小于4周龄并且不表现出任何ALS样症状。在一个方面，如本文所述的啮齿动物小于8周龄并且不表现出任何ALS样症状。在另一方面，啮齿动物在22周龄之前患上ALS样症状。在一个实施方案中，啮齿动物为至少16周龄或更大并表现出下列表型中的一者或多者：(a)驼背；(b)异常后肢抱握；(c)运动协调和运动学习能力缺陷；(d)体重减轻以及(e)与对照啮齿动物相比对疼痛刺激作出反应的时间延迟。
本文所公开的啮齿动物的基因表达模式，例如神经系统器官(脑、脊髓等)的基因标签可分别类似于(1)ALS患者的基因表达模式或患者器官(脑、脊髓等)的基因标签，和/或(2)另一ALS动物模型(例如SOD1非人动物)的基因表达模式或非人动物器官(脑、脊髓等)的基因标签。例如，本文所公开的啮齿动物的大脑和/或脊髓的基因表达模式可与人类ALS生物表达数据集(bioset)和/或鼠科动物SOD1生物表达数据集相关，这些生物表达数据集可与免疫应答有关。与人类ALS和/或鼠科动物SOD1生物表达数据集的这种相关性表明，在本文所公开的啮齿动物中观察到的病变与在患有ALS的人或SOD1动物模型中观察到的病变非常相似。在一些实施方案中，如本文所公开的啮齿动物可具有免疫应答相关基因标签，但与野生型啮齿动物相比，在外周神经系统上可能不表现出异常免疫应答。
在一个方面，如本文所公开的啮齿动物中运动神经元的数目近似于(例如不明显大于或小于)野生型啮齿动物中运动神经元的数目。在一些实施方案中，如本文所公开的啮齿动物的运动神经元相比于野生型啮齿动物的运动神经元表现出氧化应激反应增加。
在一个方面，如本文所述的啮齿动物为大鼠或小鼠。在一些实施方案中，啮齿动物为小鼠，来自选自129品系、C57BL/6品系以及混合C57BL/6×129品系的品系。
本文还提供了一种从本文所述啮齿动物分离的或来源于本文所述啮齿动物的组织或细胞(例如胚胎干细胞、运动神经元细胞等)，例如，可用组织学方法检查和/或培养的这些组织或细胞。还提供了本文所述的核酸。
还提供了方法，该方法包括培养从本文所述的啮齿动物分离的细胞或细胞群，这可得到(例如)可用于体外操作的运动神经元。在一些实施方案中，提供了产生相比于对照运动神经元细胞表现出氧化应激反应增加的运动神经元群的方法，这种方法包括形成来源于本文所提供啮齿动物的胚体并将胚体分化成运动神经元。在一些实施方案中，胚体是由内细胞团胚胎干细胞发育而来的。在一些实施方案中，分离内细胞团胚胎干细胞，并例如在胚胎干细胞培养基(ESM：DMEM+15％胎牛血清+青霉素/链霉素+谷氨酰胺+非必需氨基酸+核苷+β-巯基乙醇+丙酮酸钠+LIF)中培养2天以形成胚体。随后胚体可在分化培养基(高级DMEM/F12+Neurobasal培养基+10％敲除血清+青霉素/链霉素+谷氨酰胺+β-巯基乙醇)中培养例如1-3天(例如2天)，然后在视黄酸和平和受体激动剂中进一步培养例如5天。由从本文所提供的啮齿动物分离的内细胞团胚胎干细胞发育而来的分化运动神经元可例如在胚胎干细胞衍生的运动神经元培养基(ESMN：Neurobasal培养基+2％马血清+B27+谷氨酰胺+青霉素/链霉素+β-巯基乙醇+10ng/mL GDNF、BDNF、CNTF)中成熟，以形成稳定的运动神经元细胞系，其相比于由不包含经修饰的DR6等位基因和/或核酸的啮齿动物发育而来的运动神经元细胞表现出氧化应激反应增加。
本文还提供了一种用于调节运动神经元功能紊乱的候选试剂的鉴定方法，该候选试剂可用于治疗、预防和/或抑制ALS，这种方法包括(a)向本文所公开的啮齿动物施用试剂；以及(b)确定相比于具有相同基因组结构但不接受候选试剂的测试对照啮齿动物，所述啮齿动物中候选试剂的效应，例如确定相比于对照啮齿动物，候选试剂是否预防、抑制、延迟和/或逆转所述啮齿动物的至少一种ALS样症状；其中至少一种ALS样症状例如啮齿动物运动神经元功能紊乱症状诸如驼背、异常后肢抱握、运动协调缺陷、运动学习能力缺陷、体重减轻以及感知缺陷的预防、抑制、延迟和/或逆转表明候选试剂可用于治疗运动神经元功能紊乱，例如预防和/或抑制ALS。试剂可在啮齿动物ALS样症状发作之前、与该症状发作同时或在该症状发作之后施用，例如在通过盲法主观ALS-TDI神经系统评分、转杆测试、猫步测试、旷场测试、体重测量或确定对疼痛刺激作出反应的延迟时间例如在两个或更多个不同时间点检测运动神经元功能紊乱的至少一种症状之前、与进行该检测同时或在进行该检测之后施用。
在一些实施方案中，候选试剂调节运动神经元功能紊乱的至少一种症状，使其减轻至少10％，例如至少15％，例如至少20％。在其它实施方案中，候选试剂的存在调节症状，使运动神经元功能紊乱的至少一种症状例如减轻至少50％，例如减轻至少75％，例如减轻至少80％，例如减轻至少95％，例如减轻至少99％。在一些实施方案中，候选试剂预防运动神经元功能紊乱的至少一种症状。通过(1)预防和/或抑制驼背和异常后肢抱握中的至少一者和/或通过(2)预防和/或修复运动协调缺陷、运动学习能力缺陷、体重减轻和/或感知缺陷来调节所述至少一种症状的候选试剂可用于治疗神经退行性疾病例如ALS。
确定相比于对照啮齿动物，试剂是否预防、抑制、延迟和/或逆转所述啮齿动物的至少一种ALS样症状的方法可包括检查从啮齿动物分离的组织和/或细胞，例如通过组织化学分析该组织和/或细胞以了解该组织和/或细胞的显微解剖学、功能和结构；细胞、组织和/或器官培养、显微镜技术和/或评估蛋白(例如髓磷脂结合蛋白(MBP)、神经生长因子受体(NGFR)、胆碱乙酰转移酶(Chat)、Mnx同源异型框、谷氨酸[NMDA]受体亚单位3B(Grin3b)以及谷氨酸受体2(Gria2))的表达。在一个方面，所评估细胞为神经元、神经胶质细胞或其组合。在另一方面，所评估组织为大脑和/或脊髓。确定相比于对照啮齿动物，试剂是否预防、抑制、延迟和/或逆转啮齿动物的至少一种ALS样症状的方法还可包括主观ALS-TDI神经系统评分、转杆测试、猫步测试、旷场测试和体重测量和/或确定对疼痛刺激作出反应的延迟时间。
在一些实施方案中，测试到的至少一种症状表明上运动神经元功能紊乱，例如所述至少一种症状选自震颤、痉挛性麻痹(僵直)、反射异常以及它们的组合。在一些实施方案中，测试到的至少一种症状表明下运动神经元功能紊乱，例如所述至少一种症状选自肌无力和消瘦、肌束震颤以及它们的组合。在一些实施方案中，所评估的至少一种症状为体重增加减缓。在一些实施方案中，所测试到的至少一种功能为伤害感受减弱。
本文还提供了一种鉴定用于减少运动神经元的氧化应激反应的候选试剂的方法，包括：(a)在存在或不存在试剂的情况下培养来源于如本文所公开的非人动物模型的运动神经元；(b)确定相比于在不存在试剂的情况下培养的对照运动神经元，试剂是否预防、抑制和/或减少运动神经元的氧化应激反应；其中运动神经元的氧化应激反应的预防、抑制和/或减少表明，用于减少运动神经元的氧化应激反应的候选试剂例如并且可为用于治疗、预防和/或抑制ALS的候选试剂。
在一些实施方案中，候选试剂将运动神经元的氧化应激反应减少至少10％，例如至少15％，例如至少20％。在其它实施方案中，候选试剂的存在抑制运动神经元的氧化应激反应，例如使其减少至少50％，例如减少至少75％，例如减少至少80％，例如减少至少95％，例如减少至少99％。在一些实施方案中，候选试剂预防运动神经元的氧化应激反应，例如氧化应激反应水平类似于野生型运动神经元的氧化应激反应水平。
本文还提供了一种包含(a)5’靶向臂和3’靶向臂、(b)选择盒以及任选地(c)跨膜结构域编码序列的靶向载体，其中5’靶向臂和3’靶向臂引导载体插入内源性DR6信号肽序列下游的内源性DR6基因座中。在一个实施方案中，跨膜结构域编码序列编码ROR1跨膜结构域。在另一个实施方案中，跨膜结构域编码序列可操作地连接至报告基因。在一个实施方案中，选择盒包含报告基因、药物抗性基因或其组合。在另一个实施方案中，选择盒包含药物抗性基因。在一些实施方案中，选择盒包含新霉素磷酸转移酶基因。在一些实施方案中，如本文提供的靶向载体包含如SEQ ID NO:16所示的序列。在一些实施方案中，靶向载体不包含选择盒。在一些实施方案中，如本文提供的靶向载体包含如SEQ ID NO:5所示的序列。
本文还提供了包含如本文所述的靶向载体的啮齿动物细胞，诸如胚胎干细胞，例如鼠科动物胚胎干细胞，例如C57BL/6NTac胚胎干细胞。
附图说明
图1示出了用于靶向破坏DR6基因座的策略。野生型小鼠DR6基因座如顶部线所示(未按比例绘制)，从5'至3'示出了5'UTR(白框)、起始密码子(ATG)、外显子1-6(虚线框)、终止密码子(TAG)和3'UTR。如图所示，内源性小鼠信号序列由外显子1以及外显子2的一部分(从起始密码子起约4103个碱基)编码，并且编码信号肽的核酸序列在与Zen-Ub1盒重组之后留下，如底部线所示(未按比例绘制)。如图1所示，ZEN-Ub1靶向载体(SEQ ID NO:5)(从5'至3')包含5'同源臂(5'臂；SEQ ID NO:1)、可操作地连接至大肠杆菌(E.coli)LacZ报告基因(LacZ；SEQ ID NO:8)的ROR1跨膜结构域编码序列(TM；SEQ ID NO:7)，该报告基因可操作地连接至多聚腺苷酸化信号(pA；SEQ ID NO:9)。Zen-Ub1盒也包括选择盒，该选择盒包含来自可操作地连接至新霉素磷酸转移酶抗性基因(Neo；SEQ ID NO:12)的人类泛素C基因(hUB；SEQ ID NO:11)的启动子，该新霉素磷酸转移酶抗性基因可操作地连接至多聚腺苷酸信号(pA；SEQ ID NO:13)，该选择盒侧接相同的loxP核酸序列(SEQ ID NO:10)。Zen-UB1盒的3'同源臂(3'臂)如SEQ ID NO:14所示。在同源重组之后，所得等位基因包含编码可操作地连接至ROR1跨膜结构域编码序列和LacZ报告基因的内源性DR6信号序列的核酸序列(该核酸序列如SEQ ID NO:17所示)，并缺少从外显子2的碱基4103开始至外显子6的终止密码子的整个内源性基因组序列，例如缺少编码内源性胞质结构域、跨膜结构域和胞外结构域的核苷酸序列。
图2A至图2I示出了与性别无关的随时间推移快速发展的DR6-/-小鼠肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)样运动损伤。图2A示出了野生型小鼠
和DR6-/-小鼠
在不同时间点(x轴)的平均运动损伤得分(y轴)，而图2B示出了雄性
和雌性
DR6-/-小鼠在不同时间点(x轴)的平均运动损伤得分。图2C示出了野生型小鼠
和DR6-/-小鼠
在不同时间点(x轴)的平均僵直得分(y轴)，而图2D示出了雄性小鼠
和雌性
DR6-/-小鼠在不同时间点(x轴)的平均僵直得分。图2E示出了野生型小鼠
和DR6-/-小鼠
在不同时间点(x轴)的平均震颤得分(y轴)，而图2F示出了雄性
和雌性
DR6-/-小鼠在不同时间点(x轴)的平均震颤得分。图2G示出了在介于9周龄至21周龄(x轴)之间的野生型小鼠
和DR6-/-小鼠
的平均运动损伤得分(y轴)。图2H示出了在介于9周龄至21周龄(x轴)之间的野生型小鼠
和DR6-/-小鼠
的平均僵直得分(y轴)。图2I示出了在介于9周至21周(x轴)之间的野生型小鼠
和DR6-/-小鼠
的平均震颤得分。对于实验1(图2A至图2F)，野生型小鼠n＝12，并且DR6-/-小鼠n＝16(雄性DR6-/-小鼠n＝8；雌性DR6-/-小鼠n＝8)，并且在每个时间点，对于每个测试野生型动物得分为0。对于实验2(图2G至图2I)，野生型小鼠n＝14，并且DR6-/-小鼠n＝18。所有数据均报告为平均值±SEM。进行双因素ANOVA统计分析，比较野生型小鼠的值与敲除小鼠的值，其中*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001，并且****表示P≤0.0001。
图3A至图3F示出了DR6-/-小鼠的ALS样表型，表现为体重减轻和显著运动异常。图3A：左图和右图示出了野生型小鼠(tnsfr21+/+)和DR6-/-小鼠(tnsfr21-/-)分别在2014年5月29日和2014年6月11日的体重(y轴；克)。图3B：左图和右图分别示出了野生型小鼠(tnsfr21+/+；条纹柱)和DR6-/-小鼠(tnsfr21-/-；实心柱)从转杆上掉落的最大和中值延迟时间(y轴；秒)。图3C：示出了野生型小鼠(tnsfr21+/+；条纹柱)和DR6-/-小鼠(tnsfr21-/-；实心柱)在60分钟内的总不动性(y轴)、基本运动(y轴)和精细运动动作。图3D：示出了野生型小鼠(tnsfr21+/+；条纹柱)和DR6-/-小鼠(tnsfr21-/-；实心柱)在一小时内的X+Y步行量(y轴)。图3E：左图和右图分别示出了野生型小鼠(tnsfr21+/+；条纹柱)和DR6-/-小鼠(tnsfr21-/-；实心柱)的总直立活动(y轴)和总直立时间(y轴；秒)。图3F：左图和右图分别示出了野生型小鼠(tnsfr21+/+；条纹柱)和DR6-/-小鼠(tnsfr21-/-；实心柱)行进的总距离和总休息时间(y轴；总共60分钟)。*(p<0.05)表示这两组小鼠之间统计意义上的显著性差异。
图4A至图4C示出了9周龄至21周龄的野生型小鼠(
n＝14)和DR6-/-小鼠(
n＝18)(x轴)的(A)平均体重(y轴；以克计体重)、(B)从转杆上掉落的中值延迟时间(y轴；秒)和(C)从转杆上掉落的最大时间(y轴；秒)。花费在转杆上的最大时间为180秒。所有数据均报告为平均值±SEM。进行双因素ANOVA统计分析，比较野生型小鼠的值与敲除小鼠的值，其中*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001，并且****表示P≤0.0001。
图5A至图5H示出了野生型小鼠和DR6-/-小鼠的旷场运动行为，例如介于10周龄-21周龄之间的野生型动物(
n＝14)和DR6-/-动物(敲除；
n＝16)在一小时内的总距离(图5A)、不动性(图5B)、总直立时间(图5C)、基本运动(图5D)、精细运动(图5E)、X+Y步行量(图5F)、总休息时间(图5G)和直立活动(图5H)。所有数据均报告为平均值±SEM。进行双因素ANOVA统计分析，比较野生型小鼠的值与敲除小鼠的值，其中*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001，并且****表示P≤0.0001。
图6A至图6F示出了猫步行为，例如介于10周龄-21周龄之间的野生型动物(
n＝14)和DR6-/-动物(敲除；
)的肢体间协调(图6A)、爪压力(图6B)、爪印面积(图6C)、步长(图6D)、站立期(图6E)、摆动期(图6F)、摆动速度(图6G)和占空比(图6H)。所有数据均报告为平均值±SEM。进行双因素ANOVA统计分析，比较野生型小鼠的值与敲除小鼠的值，其中*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001，并且****表示P≤0.0001。
图7A至图7G示出了介于9周龄和21周龄(x轴)之间的野生型动物(●，n＝14)和DR6-/-动物(■；n＝18)的前腿和后腿的步态能力。图7A提供了平均前爪压力和后爪压力。图7B提供了平均前爪印面积和后爪印面积。图7C提供了平均前步长和后步长。图7D提供了平均前站立期和后站立期。图7E提供了平均前摆动速度和后摆动速度。图7F提供了平均前摆动期和后摆动期。图7G提供了平均前占空比和后占空比。所有数据均报告为平均值±SEM。进行双因素ANOVA统计分析，比较野生型小鼠的值与敲除小鼠的值，其中*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001，并且****表示P≤0.0001。
图8示出了介于10-21周龄之间的野生型动物
和DR6-/-动物(敲除；
)动物的神经系统评分，例如运动损伤得分、震颤得分和僵直得分。所有数据均报告为平均值±SEM。进行双因素ANOVA统计分析，比较野生型小鼠的值与敲除小鼠的值，其中*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001，并且****表示P≤0.0001。
图9上图示出了从野生型动物(左侧)或DR6-/-动物(右侧)分离并用苏木精和伊红免疫染色的大脑的代表性载玻片。在下图中还示出了野生型动物(左侧柱状图)或DR6-/-动物(敲除；右侧柱状图)的脊髓(y轴；运动神经元的平均数目)中运动神经元的数目。
图10示出了野生型动物(左侧柱状图)或DR6-/-动物(敲除；右侧柱状图)的脊髓(左图)和大脑(右图)中MBP(上图)或NGFR(下图)的mRNA水平(相对于β-肌动蛋白的平均mRNA水平；y轴)。
图11示出了野生型动物(左侧柱状图)或DR6-/-动物(敲除；右侧柱状图)的脊髓(左图)和大脑(右图)中Chat(上图)或Mnx(下图)的mRNA水平(相对于β-肌动蛋白的平均mRNA水平；y轴)。
图12示出了野生型动物(左侧柱状图)或DR6-/-动物(敲除；右侧柱状图)的脊髓(左图)和大脑(右图)中Grin3b(上图)或Gria2(下图)的mRNA水平(相对于β-肌动蛋白的平均mRNA水平；y轴)。
图13示出了从野生型小鼠(WT；x轴)或DR6-/-(KO；x轴)小鼠的胸腺、脾或外周得到的不同细胞的数目占亲本细胞的百分比(亲本％；y轴)。
图14示出了从野生型小鼠(WT；x轴)或DR6-/-(KO；x轴)小鼠的胸腺、脾或外周得到的不同细胞的数目占亲本细胞的百分比(亲本％；y轴)。
图15示出了野生型动物(n＝6；黑色柱状图)或DR6-/-动物(n＝6；灰色柱状图)的血清中不同细胞因子或趋化因子(x轴)的浓度(平均观测浓度；y轴)。
图16A示出了在培养获自野生型动物(DR6+/+；黑色柱状图；x轴)和DR6+/-动物(DR6+/-；网纹柱状图；x轴)的胚胎干细胞起源的运动神经元之后得到的活细胞的数目(y轴)。图16B示出了在第1天或第7天(x轴)时获自野生型动物(DR6+/+；黑色柱状图)和杂合动物(DR6+/-；网纹柱状图)的胚胎干细胞起源的运动神经元在胚胎干细胞起源的运动神经元(ESMN)培养基中的氧化应激(平均光密度；y轴)。****表示P≤0.0001。
图17A示出了在介于10-21周龄之间的野生型动物(
n＝27)、杂合DR6+/-(
n＝14)动物和纯合DR6-/-(
n＝33)动物的神经系统评分，例如运动损伤得分、震颤得分和僵直得分。图17B示出了在介于10-21周龄之间的野生型动物(
n＝27)、杂合DR6+/-动物(
n＝14)和纯合DR6-/-动物(
n＝33)的平均体重(y轴；以克计体重)。图17C的上图示出了在12周龄至21周龄时野生型(
n＝13)动物、杂合DR6+/-动物(
n＝14)和纯合DR6-/-动物(
n＝15)从转杆上掉落的中值延迟时间(y轴；秒)；下图示出了在12周龄至21周龄时野生型动物(
n＝13)、杂合DR6+/-动物(
n＝14)和纯合DR6-/-动物(
n＝15)从转杆上掉落的最大时间(y轴；秒)。花费在转杆上的最大时间为180秒。图17D-17K示出了野生型小鼠、杂合DR6+/-小鼠和纯合DR6-/-小鼠的旷场运动行为，例如在介于10-21周龄之间的野生型动物(
n＝27)、杂合DR6+/-动物(
n＝14)和纯合DR6-/-动物(
n＝33)在一小时内的直立活动(图 17D)、总直立时间(图 17E)、基本运动(图17F)、不动性(图17G)、精细运动(图 17H)、X+Y步行量(图17I)、总距离(图17J)和总休息时间(图17K)。图17L-17Z示出了猫步行为，例如在介于10-21周龄之间的野生型动物(
n＝27)、杂合DR6+/-动物(
n＝14)和纯合DR6-/-动物(
n＝33)的步长(图 17L和17M)、摆动速度(图17N和17O)、肢体间协调(图17P)、摆动期(图17Q和17R)、占空比(图17S和17T)、爪印面积(图17U和17V)、站立期(图17W和17X)以及爪压力(图17Y和17Z)。所有数据均报告为平均值±SEM。进行双因素ANOVA统计分析，比较野生型小鼠的值与敲除小鼠的值，其中*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001，并且****表示P≤0.0001。
图18示出了经受温热至48℃、52℃或55℃恒定温度的金属板处理的野生型动物(左侧柱状图；n＝13)、杂合DR6+/-动物(中间柱状图；n＝14)和纯合DR6-/-动物(右侧柱状图；n＝15)对伤害感受性反应的延迟时间(时间；y轴)。所有数据均报告为平均值±SEM。进行双因素ANOVA统计分析，比较野生型小鼠的值与敲除小鼠的值，其中*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001，并且****表示P≤0.0001。
具体实施方式
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(“ALS”)(也称为卢伽雷氏病)是一种影响多达20,000名美国人的致命进行性神经系统疾病，在美国每年新增5,000个病例。这种障碍属于称为运动神经元疾病的障碍类别。当控制随意运动的大脑和脊髓中特定神经细胞逐渐退化时，出现ALS。此时，大脑和脊髓都丧失向机体的肌肉发起和发送消息的能力。而不能发挥作用的肌肉逐渐萎缩并抽搐。
根据哪种肌肉首先衰弱，ALS自身以不同方式表现。症状可包括摔跟头，丧失手和臂的运动控制，说话、吞咽和/或呼吸困难，持续疲劳以及抽搐和痉挛，有时非常严重。最后，当隔膜和胸壁的肌肉变得太弱时，患者需要呼吸机进行呼吸。患有ALS的多数患者通常在确诊3至5年之后死于呼吸衰竭；但是，一些患者可在确诊之后生存10年或更长。ALS在中年发病。男性更可能患上这种疾病，患病概率是女性的约1.5倍。
ALS不能治愈，也不存在预防或逆转这种障碍病程的有效疗法。食品和药物管理局(FDA)最近批准了利鲁唑，该药物经证实是可延长ALS患者生存期的第一药物。患者也可接受针对其某些症状的支持治疗。
本文提供了一种用于ALS的动物模型，其可用于找出可用于治疗人类ALS的候选试剂。
本文所述或所参考的技术和规程通常便于理解，并通常由本领域技术人员采用常规方法诸如例如，在Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual2nd.edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(Sambrook等人，《分子克隆：实验手册第二版》，1989年，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港)中所述的广泛利用的分子克隆方法。除非另外指明，否则根据需要，通常根据制造商限定的协议和/或参数实施涉及使用可商购获得的试剂盒和试剂的规程。
在描述本方法和测定法之前，应当理解，本发明不限于所述特定方法、协议、细胞系、动物物种或属、构建体和试剂，因此这些当然可改变。必须指出的是，单数形式“一”和“所述”包括多个指代物，除非上下文另有明确表示。因此，例如，提及“基因改变”包括多种这类改变，并且提及“探针”包括提及一个或多个探针以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。说明书和相关权利要求书中引用的所有数字(例如，氨基酸22-81、1-354等)应当理解为由术语“约”修饰。
本文提到的所有出版物均以引用方式并入本文，以公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。本文所引用的出版物是为了引用其在本申请的提交日期之前的公开内容。这里的任何内容都不得解释为承认发明人凭借较早的优先权日期或发明日期而无权早日出版。另外，实际发布日期可能与显示的日期不同，需要独立验证。
定义
术语“胚胎干细胞”或“ES细胞”包括胚胎起源的全能或多能细胞，其能够在引入胚胎后促使发育中的胚胎成为任何组织。术语“多能细胞”包括有能力发育成多于一种分化细胞类型的未分化细胞。
一些靶向载体是“大靶向载体”或“LTVEC”，其包括用于真核细胞的大靶向载体，该大靶向载体包含对应于和来源于这样的核酸序列的同源臂：该核酸序列比由旨在在真核细胞中进行同源基因靶向的其它方法通常使用的那些核酸序列大。LTVEC的示例包括但不限于细菌同源染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。使用LTVEC产生靶向基因修饰的示例公开于例如WO 2015/088643、US 2015/0159175、US 2015/0159174、US2014/0310828、US2014/0309487和US 2013-0309670中，这些专利中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入本文。LTVEC还包括含有这样的核酸插入物的靶向载体，该核酸插入物具有比由旨在在细胞中进行同源重组的其它方法通常使用的那些核酸序列大的核酸序列。例如，LTVEC使得能够对大基因座进行修饰，而传统的基于质粒的靶向载体由于有大小限制而无法实现这一点。例如，所靶向的基因座可以是(即，5’和3’同源臂可以对应于)在不存在核酸酶试剂(例如，Cas蛋白)诱导的切口或双链断裂的情况下，无法使用常规方法靶向，或仅可不正确地或仅以显著较低效率靶向的细胞基因座。
LTVEC的示例包括来源于细菌人工染色体(BAC)、人类人工染色体或酵母人工染色体(YAC)的载体。LTVEC及其制备方法的非限制性示例描述于例如美国专利6,586,251；美国专利6,596,541；美国专利7,105,348；和WO 2002/036789(PCT/US01/45375)中，这些专利中的每一者均以引用方式并入本文。LTVEC可以是线形形式或环形形式。
LTVEC可为任何长度，包括例如至少10kb或约50kb至约400kb或更长。LTVEC的尺寸可能太大，以致无法通过常规测定法如Southern印迹和长片段(例如，1kb至5kb)PCR来筛选靶向事件。5’同源臂和3’同源臂的总和可为例如至少10kb(每个同源臂均可在例如约5kb至约200kb的范围内)。LTVEC和核酸插入物可被设计成允许在一定长度例如从约5kb至约3Mb(例如，约500kb或更长)的靶基因座处缺失。同样，LTVEC和核酸插入物可被设计成允许在靶基因座中插入一定长度例如在约5kb至约400kb范围内或更长的外源核酸序列。
术语“重组位点”包括由位点特异性重组酶识别且可充当重组事件的底物的核苷酸序列。
术语“位点特异性重组酶”包括一组可有利于“重组位点”之间重组的酶。“位点特异性重组酶”的示例包括但不限于Cre、Flp和Dre重组酶。
指涉核酸序列的术语“种系”包括可传给子代的核酸序列。
短语“可操作地连接”意指组分以其预期方式连接在一起起作用。在一种情况下，编码蛋白的核酸序列可操作地连接至调控序列(例如，启动子、增强子、沉默子序列等)以保持适当的转录调控。在另一种情况下，编码信号肽的核酸序列可操作地连接至编码例如跨膜结构域的核酸序列，以便翻译成包含可操作地融合至跨膜结构域的信号肽的多肽，其中信号肽和跨膜结构域均保持其各自的生物功能。
术语“基因座”被定义为基因组DNA内的DNA片段。例如，DR6基因座为编码DR6的基因组DNA内的DNA片段，并包括与DR6表达相关的未翻译的和/或调控的DNA。
称为死亡受体6(DR6)的TNFR家族成员(在文献中也称为“TR9”；在文献中还称为TNF受体超级族成员21或TNFRS21)已被描述为具有四个细胞外富含半胱氨酸基序和细胞质死亡结构域结构的I类跨膜受体(Pan et al.,FEBS Lett.,431:351-356(1998)(Pan等人，《欧洲生化学会联合会快报》，第431卷，第351-356页，1998年)；另外参见美国专利6,358,508；6,667,390；6,919,078；6,949,358)。已经报道，DR6在某些转染细胞系中的过表达引起NF-kB和JNK两者细胞的凋亡和活化(Pan et al.,FEBS Letters,431:351-356(1998)(Pan等人，《欧洲生化学会联合会快报》，第431卷，第351-356页，1998年))。在DR6缺陷的小鼠模型中，T细胞在JNK活化中大大受损，并且当DR6(-/-)小鼠受蛋白抗原攻击时，发现其T细胞过度增殖并对Th2响应显示出明显的极化(而Th1分化未受到同等程度的影响(Zhao etal.,J.Exp.Med.,194:1441-1448(2001)(Zhao等人，《实验医学杂志》，第194卷，第1441-1448页，2001年))。另外有报道称，DR6的靶向破坏导致辅助性T细胞2(Th2)体外分化增强(如上Zhao等人)。DR6激动剂或拮抗剂在调节B细胞介导的或神经系统病症中的各种用途在2005年3月31日公布的US 2005/0069540和2010年8月12日公布的US 2010/0203044中有所描述。
鼠科动物DR6受体基因座存在于染色体17上并具有6个外显子。它编码具有推定信号序列(第1-41位氨基酸)、胞外结构域(第42-349位氨基酸)、跨膜结构域(第350-370位氨基酸)和胞质结构域(第370-655位氨基酸)的655氨基酸蛋白(SEQ ID NO:16)。成熟DR6蛋白是指其信号蛋白裂解之后的翻译的多肽，例如成熟鼠科动物DR6蛋白是指SEQ ID NO:16的第42-655位氨基酸。
下表1中提供了对由序列编号标识的序列的简单说明。
表2.序列说明。
I.包含至少一种DR6基因座的基因修饰的组合物
提供了非人动物、细胞、组织和胚胎，其包含经修饰的DR6基因座(该基因座缺少编码内源性DR6胞质结构域的任何部分的核苷酸序列)，并且还可包含编码DR6信号肽、跨膜结构域和/或报告基因蛋白的核酸序列。提供了用于操纵DR6表达的方法和组合物。还提供了涉及修饰DR6的靶向组合物。提供了表现出运动神经元功能紊乱(例如与调节DR6功能相关的ALS样表型)的非人动物、细胞和组织。虽然下面的描述是参照某些具体DR6的综述，但所述方法和组合物可与任何DR6一起实施。
本文提供了包含经修饰的DR6基因座和/或核酸的非人动物、细胞、组织和胚胎，其可影响DR6功能或用于DR6基因座中的靶向基因修饰(例如，报告基因敲入)。在这类情况下，经修饰的DR6基因座包含编码DR6的核酸序列中功能突变的丧失。还提供了来源于非人动物的细胞、组织和胚胎，其包含DR6的功能丧失突变。
如涉及DR6的术语“功能丧失”可包括DR6基因座中的任何修饰和/或转基因的表达，导致DR6表达的降低或缺乏和/或DR6活性/功能的降低或缺乏。可以直接(例如通过测定细胞或生物体中DR6的水平)测量DR6的表达水平。
一般来讲，如果DR6表达水平和/或DR6的活性水平在统计学上低于(p≤0.05)尚未经用于抑制DR6的表达和/或活性的基因修饰或诱变的适当对照细胞或生物体中的DR6水平，则该DR6的表达水平和/或活性有所降低。在具体实施方案中，相对于尚未经用以使其具有降低的DR6水平和/或活性的修饰的对照细胞或生物体，该DR6的浓度和/或活性被降低至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
在其它情况下，使用包括但不限于Southern印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析的方法来选择具有降低DR6的表达水平和/或活性的靶向基因修饰的细胞或生物体。然后将此类细胞或生物体用于本文所述的各种方法和组合物中。
“受试细胞”或“受试生物体”是其中已经实现了基因改变，诸如本文所公开的基因修饰的细胞/生物体，或是为如此改变的细胞/生物体的后代并且包含所述改变的细胞/生物体。“对照”或“对照细胞”或“对照生物体”提供了用于测量受试细胞或生物体的表型变化的参考点。在一个实施方案中，对照细胞/生物体与具有DR6基因修饰的细胞/生物体尽可能接近地匹配，区别为对照细胞/生物体缺乏导致表达和/或活性降低的基因修饰或突变(例如，相应细胞可以源自相同的细胞系)。在其它情况下，对照细胞/生物体可以包括例如：(a)野生型细胞/生物体，即与用于导致受试细胞/生物体中基因改变的起始物质具有相同基因型的细胞/生物体；(b)与起始物质具有相同基因型但已用无效构建体(即用对所关注性状没有已知作用的构建体，诸如包含标记基因的构建体)进行基因修饰的细胞/生物体；(c)作为受试细胞/生物体的非基因修饰后代的细胞/生物体(即，对照细胞和受试细胞源于相同的细胞系)；(d)在遗传上与受试细胞/生物体相同但未暴露于诱导所关注基因表达的条件或刺激下的细胞/生物体；或者(e)在其中基因修饰不会导致所关注多核苷酸的表达改变的条件下的受试细胞/生物体本身。
指涉动物、细胞、组织或胚胎的术语“动物”包括哺乳动物、鱼和鸟。哺乳动物包括，例如，人、非人灵长类动物、猴子、猩猩、猫、狗、马、公牛、鹿、野牛、绵羊、啮齿动物(如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠)、牲畜(如，牛物种诸如奶牛、阉牛等；羊物种诸如绵羊、山羊等；和猪物种诸如小猪和公猪)。鸟包括，例如，鸡、火鸡、鸵鸟、鹅、鸭等。还包括驯养的动物和农用动物。指涉动物、细胞、组织或胚胎的短语“非人动物”不包括人。
在一个实施方案中，动物为非人动物。在另一个实施方案中，非人动物为哺乳动物。在另一个实施方案中，哺乳动物为啮齿动物。在另一实施方案中，啮齿动物为小鼠、大鼠或仓鼠。在另一实施方案中，啮齿动物为小鼠或大鼠。在一些实施方案中，啮齿动物为小鼠。
如本文所述的基因修饰可包括DR6基因座中的一种或多种缺失、对DR6基因座的添加、对DR6基因座或其一部分的替换和/或它们的任何组合。基因座可包含编码区或非编码调控区。如本文所述的基因修饰还可包括在DR6基因座之外的基因组中插入转基因，其中转基因的表达妨碍内源性DR6蛋白的配体结合、放置在细胞膜中等，例如与内源性DR6蛋白竞争配体结合、放置在细胞膜中等。
本文提供的基因修饰可靶向DR6基因座。DR6的功能丧失可能是由于DR6基因中的靶向基因修饰(即，调控区、编码区、外显子和/或内含子等中的基因修饰)导致的。此类靶向修饰包括但不限于一个或多个核苷酸的添加，一个或多个核苷酸的缺失，一个或多个核苷酸的取代，DR6基因座的破坏，DR6基因座或其一部分的敲除，DR6基因座或其一部分的敲入，用异源核酸序列替换内源性DR6核酸序列或其一部分，或其组合。在具体实施方案中，改变至少1个、2个、3个、4个、5个、7个、8个、9个、10个、50个、100个、400个或更多个核苷酸，以形成靶向基因组修饰。
在一个实施方案中，功能丧失突变的特征在于至少一种DR6功能的破坏或敲除。
DR6基因座可在基因座的任何区域中进行基因修饰，以使这种修饰能调节DR6功能。在一个实施方案中，DR6基因座的修饰包括整个DR6编码区或其一部分的缺失。在一个实施方案中，经修饰的DR6基因座包括一种或多种编码成熟DR6蛋白或其一部分的外显子的缺失。在另一个实施方案中，这种缺失包括始于DR6基因座的第一、第二、第三、第四、第五和/或第六外显子的DR6基因座内一种或多种外显子的缺失。在其它实施方案中，这种缺失包括始于DR6基因座的第二外显子的DR6基因座内一种或多种外显子的缺失。
在一些情况下，DR6基因座或其一部分被插入核酸替代。在这类情况下，这种替代可为用插入核酸替换DR6基因座的整个RNA编码区或其一部分，用插入核酸替代DR6基因座的一种或多种外显子，用插入核酸替换DR6基因座内的一种或多种外显子(始于DR6基因座的第一外显子)，或者用插入核酸替换DR6基因座内的一种或多种外显子(始于第二外显子)。
在一些情况下，插入核酸被定位在DR6基因座中以致其与内源性DR6启动子可操作地连接，由此使得内源性DR6启动子驱动插入核酸的表达。在这类情况下，核酸序列的表达遵循DR6的表达模式。
在一个实施方案中，DR6基因座或其一部分被包含编码报告基因的第一核酸序列的插入核酸替代。例如，在插入核酸包含报告基因并置于可操作地连接至DR6启动子的DR6基因座中的情况下，报告基因的表达是由内源性DR6启动子驱动的。或者，插入核酸未以与内源性DR6启动子可操作地连接的方式插入。在这类情况下，插入核酸可包含启动子。在一个实施方案中，插入核酸包含可操作地连接至启动子的报告基因，该启动子驱动报告基因的表达。
在一些实施方案中，插入核酸可包含内源性DR6信号序列，例如可定位在DR6基因座中以致其与内源性DR6信号序列和任选内源性DR6跨膜结构域可操作地连接。在这类情况下，由位于DR6基因座外源或在内源性DR6基因座处的插入核酸编码的任何蛋白(例如，报告基因)的目的地类似于DR6的目的地(例如，锚固在例如具有内源性跨膜结构域的膜中)。在一个实施方案中，插入核酸可替代内源性跨膜结构域。在这类和其它情况中，插入核酸可包含编码异源跨膜结构域的第二核酸。在一个实施方案中，插入核酸包含可操作地连接至异源跨膜结构域基因的报告基因，并且插入核酸被插入到可操作地连接至内源性DR6信号序列的DR6基因中，以致插入核酸的表达受内源性DR6启动子驱动，并且由插入核酸编码的蛋白根据信号序列被锚固在膜中。
在一个实施方案中，DR6基因座或其一部分被包含编码选择性标记的另一核酸序列的插入核酸替代。在这类情况下，另一核酸序列可操作地连接至驱动选择性标记表达的启动子。
在另一个实施方案中，DR6基因座或其一部分被包含跨膜基因、报告基因和选择性标记基因的插入核酸替代。在这类情况下，报告基因和/或选择性标记基因可能或可能未可操作地连接至启动子。
在本文别处提供了可用于所述方法和组合物的各种启动子。
这类基因修饰(包括导致靶DR6的表达和/或活性降低或有所调节的那些)也能够通过种系传递。在具体实施方案中，基因修饰导致期望靶基因座敲除。这类非人动物例如可用于如本文别处论述的多种实验系统中。
例如，DR6敲除提供了动物模型来研究DR6功能、DR6在发育的作用和DR6在各种细胞路径和疾病(尤其运动神经元功能紊乱疾病例如ALS)中的作用。
本文提供了用于非人动物、细胞、组织或胚胎中DR6基因座的基因修饰的方法和组合物。
DR6基因座的基因修饰可为如本文别处详细描述的基因座的任何修饰(即缺失、插入、替换等)。在这类情况下，基因修饰导致DR6功能丧失。在一个实施方案中，基因修饰包括DR6的破坏或敲除。
A.报告基因敲入等位基因设计和构建
作为非限制性示例，缺失起始点可设置在第二外显子中以使得插入核酸能够可操作地连接至内源性信号序列。图1示出了编码DR6的全部或大部分序列的靶向缺失并用包含来自ROR1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体1)基因的跨膜结构域序列、来自编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌lacZ基因的序列以及表达用于选择G418抗性ES细胞菌落的新霉素磷酸转移酶的盒(neor)替换的示例。允许在表型分析之前Cre介导的切除的LoxP重组酶识别位点位于药物选择盒两侧。
可将LTVEC靶向载体引入ES细胞中，并通过等位基因修饰测定法筛选正确靶向的克隆(Frendewey,D.,et al.(2010),Methods Enzymol 476,295-307(Frendewey,D.等人，2010年，《酶学方法》，第476卷，第295-307页))。
可使用各种方法来鉴定具有靶向修饰诸如缺失或插入的细胞。此类方法可包括鉴定在靶基因座处具有靶向修饰的一个细胞。可完成筛选以鉴定具有经修饰基因组基因座的此类细胞。
筛选步骤可包括用于评估亲本染色体的等位基因(MOA)修饰的定量测定。例如，可经由定量PCR诸如实时PCR(qPCR)进行定量测定。实时PCR可利用识别靶基因座的第一引物组和识别非靶向参考基因座的第二引物组。引物组可包含识别扩增序列的荧光探针。
合适的定量测定法的其它示例包括荧光介导原位杂交(FISH)、比较基因组杂交、等温DNA扩增、定量固定探针杂交、Invader
MMP
分子信标、或EclipseTM探针技术(参见例如US2005/0144655，该专利全文以引用方式并入本文)。
在本文的实施例1中提供了用于产生DR6报告基因敲入动物的方法。
B.报告基因表达分析
如本文别处所述，DR6基因座的基因修饰可包括用插入核酸替换DR6基因座或其一部分或向DR6基因座或其一部分插入/添加插入核酸。在一些情况下，插入核酸包含报告基因。在一个实施方案中，报告基因被定位在与内源性DR6启动子可操作地连接的DR6基因座中。这样的修饰允许由内源性DR6启动子驱动报告基因的表达。或者，报告基因未以与内源性DR6启动子可操作地连接的方式放置。
任何报告基因(或可检测部分)可用于熟知的方法和组合物中。报告基因的非限制性示例包括例如，β-半乳糖苷酶(由lacZ基因编码)、绿荧光蛋白(GFP)、增强型绿荧光蛋白(eGFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、Emerald、CyPet、青色荧光蛋白(CFP)、Cerulean、T-Sapphire、荧光素酶、碱性磷酸酶或其组合。
本文所述的方法和组合物可在不存在报告基因的情况下或与任何报告基因一起实施。下面的描述是利用编码β-半乳糖苷酶的lacZ报告基因的非限制性示例。
C.表型
内源性DR6基因座的基因修饰可在本文提供的非人动物中产生各种表型。在一个实施方案中，内源性DR6基因座的基因修饰导致在出生时非常正常的非人动物，却在变老之后例如在1周龄之后、在2周龄之后、在3周龄之后、在4周龄之后、在5周龄之后、在6周龄之后、在7周龄之后、在8周龄之后等出现ALS样症状。在另一个实施方案中，内源性DR6基因座的基因修饰导致一种或多种细胞类型(例如神经元和/或神经胶质细胞和/或其一部分例如髓磷脂)功能异常。神经元包括感觉神经元、运动神经元和所有其它通常称为中间神经元的神经元类型。神经胶质细胞包括星形胶质细胞、寡树突胶质细胞等。
术语“ALS样症状”等一般是指“与ALS相关的症状”或“由于上运动神经元和/或下运动神经元功能紊乱导致的症状”。ALS样症状可能涉及神经元(例如运动神经元、感觉神经元和/或中间神经元)损伤。例如，涉及上运动神经元的ALS样症状可导致痉挛状态(例如，痉挛性麻痹、僵直)、反射增强和/或异常(例如，巴宾斯基征)、震颤以及它们的组合。涉及下运动神经元损伤的ALS样症状可导致肌无力和消瘦、肌束震颤以及它们的组合和/或涉及延髓损伤的ALS样症状可导致不能吞咽和舌头肌束震颤。ALS样症状也可包括下列表型中的一者或多者：a)驼背；b)异常后肢抱握、脚趾卷曲拖曳；c)运动协调和运动学习能力缺陷、转杆测试、猫步测试和/或旷场测试缺陷；d)脊髓中运动神经元损失；e)脊髓中星形细胞增多；f)与对照啮齿动物相比体重减轻；g)多泛素化蛋白蛋白积聚；(h)使用ALS-TDI神经系统评分系统所得神经系统评分升高和/或(i)对疼痛刺激的延迟反应时间变长。
ALS-TDI神经系统评分系统
0得分：当小鼠通过其尾悬挂时后腿远离侧向中线完全伸展，并且小鼠可保持这种姿势两秒钟，悬挂两三次。
1得分：后腿朝侧向中线伸展崩溃或部分崩溃(无力)或者后腿在尾悬挂期间发抖。
2得分：脚趾在行走12英寸期间向下卷曲至少两次或脚任何部分沿笼子底部/表面*拖曳。
3得分：僵直麻痹或关节活动最少，未用脚产生向前的运动。
4得分：小鼠在置于身体任一侧后30秒内不能恢复平稳。
II.用于修饰非人动物中内源性DR6基因座的方法
本文提供了用于基因修饰非人动物、细胞、组织或胚胎中内源性DR6基因座的方法。在一个实施方案中，提供了用于修饰多能细胞中DR6基因座的方法。这样的方法包括(a)将包含侧接有5’和3’同源臂的插入核酸的靶向构建体引入多能细胞中，这些同源臂可经历与DR6基因座的同源重组；以及(b)鉴定在DR6基因座处包含靶向基因修饰的经修饰的多能细胞。在这类方法中，基因修饰导致DR6功能丧失。在一个实施方案中，多能细胞为啮齿动物胚胎干细胞。在另一个实施方案中，多能细胞为人类iPS细胞。
A.靶向载体和插入核酸
另外还提供了靶向载体或靶向构建体，在用于产生本文提供的经基因修饰的非人动物、细胞、组织或胚胎的方法中使用。
在一个实施方案中，提供了包含侧接有5’和3’同源臂的插入核酸的靶向载体，这些同源臂可经历与DR6基因座的同源重组。
在下文中详细描述了靶向载体和靶向载体组分(即插入核酸、所关注多核苷酸、表达盒等)的示例。
i.插入核酸
“插入核酸”或“插入多核苷酸”包含希望在靶基因座处整合的DNA片段。在一个实施方案中，插入核酸包含一个或多个所关注多核苷酸。在其它实施方案中，插入核酸可包含一个或多个表达盒。给定表达盒可包含目标多核苷酸、编码选择标记和/或报告基因的多核苷酸，以及影响表达的各种调控组分。
任何所关注多核苷酸都可包含在各种插入多核苷酸中并由此整合在靶基因组基因座处。本文所公开的方法提供整合到所靶向的DR6基因组基因座中的至少1、2、3、4、5、6个或更多个所关注的多核苷酸。
在一个实施方案中，插入核酸中包含的所关注的多核苷酸编码报告基因。在另一个实施方案中，所关注的多核苷酸编码选择性标记。
在一个实施方案中，所关注的多核苷酸可侧接有位点特异性重组位点。在一个特定实施方案中，位点特异性重组位点位于编码报告基因的片段和/或编码选择性标记的片段两侧。
可包含在插入多核苷酸内的所关注的多核苷酸(包括选择标记和报告基因)的非限制性示例在本文别处详细讨论。
当在靶DR6基因座处整合时，插入多核苷酸内的所关注多核苷酸可将一个或多个基因修饰引入细胞中。所述基因修饰可包括缺失内源核酸序列和/或将外源或异源或直系同源多核苷酸添加到靶基因组基因座中。在一个实施方案中，所述基因修饰包括在靶基因组基因座处用所关注的外源多核苷酸替换内源核酸序列。因此，本文所提供的方法允许在靶DR6基因座中生成基因修饰，所述基因修饰包括敲除、缺失、插入、替换(“敲入”)、点突变、结构域交换、外显子交换、内含子交换、调控序列交换、基因交换，或其组合。此类修饰可在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或任何后续的插入多核苷酸整合到靶基因组基因座中后发生。
在插入多核苷酸内的和/或在靶基因组基因座处整合的所关注多核苷酸可包括对于其被引入的细胞为天然的或同源的序列；所关注多核苷酸对于其被引入的细胞可为异源的；所关注多核苷酸对于其被引入的细胞可为外源的；所关注多核苷酸对于其被引入的细胞可为直系同源的；或者所关注多核苷酸可来自与其被引入的细胞不同的物种。指涉序列的“同源”为对所述细胞天然的序列。指涉序列的术语“异源”为来源于外来物种的序列，或者，如果序列来源于同一物种，则通过有意的人为干预在组成和/或基因组基因座方面从其天然形式进行了实质性修饰。指涉序列的术语“外源”为源于外来物种的序列。术语“直系同源”为来自一种物种的在功能上与另一物种中的已知参考序列等效的多核苷酸(即，物种变体)。所关注的多核苷酸可来自任何所关注的生物体，包括但不限于原核生物、真核生物、非人、啮齿动物、仓鼠、小鼠、大鼠、人、猴、禽、农业哺乳动物或非农业哺乳动物。目标多核苷酸还可包含编码区、非编码区、调控区或基因组DNA。因此，第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7和/或后续插入多核苷酸中的任一者可包含此类序列。
在一个实施方案中，如上所述，所关注多核苷酸可在约500个核苷酸至约200kb的范围内。所关注的多核苷酸可以是约500个核苷酸至约5kb，约5kb至约200kb，约5kb至约10kb，约10kb至约20kb，约20kb至约30kb，约30kb至约40kb，约40kb至约50kb，约60kb至约70kb，约80kb至约90kb，约90kb至约100kb，约100kb至约110kb，约120kb至约130kb，约130kb至约140kb，约140kb至约150kb，约150kb至约160kb，约160kb至约170kb，约170kb至约180kb，约180kb至约190kb，或约190kb至约200kb。
在插入多核苷酸内的和/或插入在靶基因组基因座处的所关注多核苷酸可编码多肽，可编码RNA，或者其可包含任何所关注的调控区或非编码区，包括例如调控序列、启动子序列、增强子序列、转录阻遏物结合序列、Kozak共有序列、起始密码子，或非蛋白编码序列的缺失，但不包含蛋白编码序列的缺失。另外，在插入多核苷酸内的和/或插入在靶基因组基因座处的所关注多核苷酸可编码在神经系统、骨骼系统、消化系统、循环系统、肌肉系统、呼吸系统、心血管系统、淋巴系统、内分泌系统、泌尿系统、生殖系统或它们的组合中表达的蛋白。
在一个实施方案中，插入核酸包含内源性基因的至少一个外显子的敲入等位基因。在一个实施方案中，插入核酸包含整个内源性基因的敲入等位基因(即“基因交换敲入”)。
在一个实施方案中，插入核酸包含调控元件，包括例如启动子、增强子或转录阻遏物结合元件。
在进一步的实施方案中，插入核酸包含条件等位基因。在一个实施方案中，条件等位基因为如US 2011/0104799中所述的多功能等位基因，该专利全文以引用的方式并入本文。在具体实施方案中，条件等位基因包含：(a)相对于靶基因的转录呈有义取向的致动序列，以及呈有义或反义取向的药物选择盒；(b)呈反义取向的目标核苷酸序列(NSI)和倒转条件模块(conditional by inversion module)(COIN，其利用外显子断裂内含子和可倒转的基因诱捕样模块；参见，例如US 2011/0104799，该专利全文以引用的方式并入本文)；以及(c)在暴露于第一重组酶后重组以形成条件等位基因的可重组单元，所述条件等位基因(i)缺乏致动序列和DSC，并且(ii)含有呈有义取向的NSI和呈反义取向的COIN。
在一个实施方案中，插入核酸包含编码序列中的基因修饰。在一个实施方案中，基因修饰包括编码序列的缺失突变。在一个实施方案中，基因修饰包括两个内源性编码序列的融合。
在一个实施方案中，基因修饰包括非蛋白编码序列的缺失，但不包括蛋白编码序列的缺失。在一个实施方案中，非蛋白编码序列的缺失包括DR6基因座或其一部分的缺失。在一个实施方案中，非蛋白编码序列的缺失包括调控元件的缺失。在一个实施方案中，基因修饰包括启动子的缺失。在一个实施方案中，基因修饰包括启动子或调控元件的添加。在一个实施方案中，基因修饰包括启动子或调控元件的替换。
在一个实施方案中，靶向载体的核酸序列可包含多核苷酸，当所述多核苷酸被整合至基因组时将产生哺乳动物、非人动物或非人哺乳动物DR6基因座区域的基因修饰，其中在DR6基因座处的基因修饰导致DR6功能丧失。在一个实施方案中，生成了DR6敲除(“无效等位基因”)。在另一个实施方案中，生成了DR6基因座的破坏。
在另外的实施方案中，插入核酸导致哺乳动物、非人动物或非人哺乳动物DR6基因座的一部分被插入核酸序列替换。在一个实施方案中，插入核酸序列为报告基因核酸序列。
给定插入多核苷酸以及哺乳动物、非人或非人哺乳动物基因座被替换的对应区域可为非编码区、编码区、内含子、外显子、非翻译区、调控区、启动子、增强子或它们的任何组合。此外，给定插入多核苷酸和/或哺乳动物、非人或非人哺乳动物基因座所缺失的区域可以是任何期望的长度，包括例如在10至100个核苷酸之间的长度、100至500个核苷酸的长度、500个至1kb核苷酸的长度、1kb至1.5kb核苷酸的长度、1.5kb至2kb核苷酸的长度、2kb至2.5kb核苷酸的长度、2.5kb至3kb核苷酸的长度、3kb至5kb核苷酸的长度、5kb至8kb核苷酸的长度、8kb至10kb核苷酸的长度或更长。在其它情况中，插入或替换的大小为约5kb至约10kb，约10kb至约20kb，约20kb至约40kb，约40kb至约60kb。在其它实施方案中，给定插入多核苷酸和/或哺乳动物、人细胞或非人哺乳动物基因座所缺失的区域为至少100、200、300、400、500、600、700、800或900个核苷酸或至少1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb、17kb、18kb、19kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、50kb或更大。
在一个实施方案中，插入核酸被插入到所关注的DR6基因座中，使得其可操作地连接至内源性DR6启动子。在这类情况下，DR6启动子驱动插入核酸序列的表达。在一个实施方案中，插入核酸序列为报告基因核酸序列。
在一些情况下，插入核酸包含启动子。在一个实施方案中，插入核酸包含可操作地连接至启动子的所关注多核苷酸，该启动子驱动所关注多核苷酸的表达。在一个实施方案中，所关注多核苷酸包含报告基因核酸序列。在另一个实施方案中，所关注多核苷酸包含选择标记核酸序列。
在一个实施方案中，启动子为组成型活性启动子。
在一个实施方案中，启动子为诱导型启动子。在一个实施方案中，诱导型启动子为化学调控的启动子。在一个实施方案中，化学调控的启动子为醇调控的启动子。在一个实施方案中，醇调控的启动子为醇脱氢酶(alcA)基因启动子。在一个实施方案中，化学调控的启动子为四环素调控的启动子。在一个实施方案中，四环素调控的启动子为四环素应答型启动子。在一个实施方案中，四环素调控的启动子为四环素操纵子序列(tetO)。在一个实施方案中，四环素调控的启动子为tet-On启动子。在一个实施方案中，四环素调控的启动子为tet-Off启动子。在一个实施方案中，化学调控的启动子为类固醇调控的启动子。在一个实施方案中，类固醇调控的启动子为大鼠糖皮质素受体的启动子。在一个实施方案中，类固醇调控的启动子为雌激素受体的启动子。在一个实施方案中，类固醇调控的启动子为蜕皮激素受体的启动子。在一个实施方案中，化学调控的启动子为金属调控的启动子。在一个实施方案中，金属调控的启动子为金属蛋白启动子。在一个实施方案中，诱导型启动子为物理调控的启动子。在一个实施方案中，物理调控的启动子为温度调控的启动子。在一个实施方案中，温度调控的启动子为热激启动子。在一个实施方案中，物理调控的启动子为光调控的启动子。在一个实施方案中，光调控的启动子为光诱导型启动子。在一个实施方案中，光调控的启动子为光阻抑型启动子。
在一个实施方案中，启动子为组织特异性启动子。在一个实施方案中，启动子为神经元特异性启动子。在一个实施方案中，启动子为神经胶质特异性启动子。在一个实施方案中，启动子为肌细胞特异性启动子。在一个实施方案中，启动子为心脏细胞特异性启动子。在一个实施方案中，启动子为肾细胞特异性启动子。在一个实施方案中，启动子为骨细胞特异性启动子。在一个实施方案中，启动子为内皮细胞特异性启动子。在一个实施方案中，启动子为免疫细胞特异性启动子。在一个实施方案中，免疫细胞启动子为B细胞启动子。在一个实施方案中，免疫细胞启动子为T细胞启动子。
在一个实施方案中，启动子为发育调控的启动子。在一个实施方案中，发育调控的启动子只在发育的胚胎期有活性。在一个实施方案中，发育调控的启动子只在成体细胞中有活性。
在特定实施方案中，可根据细胞类型选择启动子。因此，各种启动子可用于真核细胞、哺乳动物细胞、非人类哺乳动物细胞、多能细胞、非人类多能细胞、人类多能细胞、人类ES细胞、人类成体干细胞、发育受限的人类祖细胞、人类iPS细胞、人类细胞、啮齿动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、仓鼠细胞、成纤维细胞或CHO细胞。
在一些实施方案中，插入核酸包含侧接有位点特异性重组靶序列的核酸。已经认识到，虽然整个插入核酸可侧接有这种位点特异性重组靶序列，但该插入核酸内的所关注的任何区域或单独多核苷酸也可侧接此类位点。位点特异性重组酶可通过任何方式引入细胞中，包括将重组酶多肽引入细胞中或将编码位点特异性重组酶的多核苷酸引入宿主细胞中。编码位点特异性重组酶的多核苷酸可位于插入核酸内或单独的多核苷酸内。位点特异性重组酶可操作地连接至细胞中有活性的启动子，包括例如诱导型启动子、对于细胞为内源的启动子、对于细胞为异源的启动子、细胞特异性启动子、组织特异性启动子或发育阶段特异性启动子。可侧接插入核酸或插入核酸中的任何目标多核苷酸的位点特异性重组靶序列可包括但不限于loxP、lox511、lox2272、lox66、lox71、loxM2、lox5171、FRT、FRT11、FRT71、attp、att、FRT、rox或它们的组合。
在一些实施方案中，位点特异性重组位点侧接插入核酸内所含的编码选择标记物和/或报告基因的多核苷酸。在此类情况下，在所靶向基因座处整合插入核酸之后，可除去位点特异性重组位点之间的序列。
在一个实施方案中，插入核酸包含编码选择标记的多核苷酸。选择标记物可以包含在选择盒中。此类选择标记包括但不限于新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(puror)、杀稻瘟菌素S脱氨酶(bsrr)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)或单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-k)，或者它们的组合。在一个实施方案中，编码选择标记的多核苷酸可操作地连接至细胞中有活性的启动子。在一个实施方案中，编码选择标记的多核苷酸侧接有位点特异性重组靶序列。
插入核酸还可包含可操作地连接至启动子的报告基因，其中所述报告基因编码报告基因蛋白，所述报告基因蛋白选自或包括β-半乳糖苷酶(由lacZ基因编码)、GFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、Emerald、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、CyPet、青色荧光蛋白(CFP)、Cerulean、T-Sapphire、荧光素酶、碱性磷酸酶以及/或者它们的组合。此类报告基因可操作地连接至在细胞中有活性的启动子。此类启动子可为诱导型启动子、对于报告基因或细胞为内源的启动子、对于报告基因或细胞为异源的启动子、细胞特异性启动子、组织特异性启动子或发育阶段特异性启动子。
ii.表达盒
本文提供了多核苷酸或核酸分子，其包含本文用于靶向DR6基因座而提供的靶向基因组整合系统中采用的各种组分(即，核酸酶试剂、识别位点、插入核酸、所关注多核苷酸、报告序列、靶向载体、选择标记和其它组分中的任一者或任何组合)。
术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”可在本文中互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等。多核苷酸可为任选含有合成、非天然或改变的核苷酸碱基的单链或双链的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个区段构成。多核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，其包括天然存在的分子和合成类似物两者以及这些的任何组合。本文提供的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎-环结构等。
还提供了重组多核苷酸，其包含用于靶向DR6基因座的靶向基因组整合系统的各种组分。术语“重组多核苷酸”和“重组DNA构建体”可在本文中互换使用。重组构建体包含核酸序列的人工或异源组合，例如自然界中不共存的调控序列和编码序列。在其它实施方案中，重组构建体可包含来源于不同来源的调控序列和编码序列，或来源于相同来源但以与自然界中的存在方式不同的方式排列的调控序列和编码序列。这种构建体可独自使用或可结合载体使用。如果使用载体，则载体的选择取决于如本领域技术人员众所周知的用以转化宿主细胞的方法。例如，可使用质粒载体。还提供了成功转化、选择和繁殖宿主细胞所需的且包含本文提供的分离核酸片段中的任一种的遗传元件。筛选可尤其通过DNA的Southern分析、mRNA表达的Northern分析、蛋白表达的免疫印迹分析或表型分析来实现。
在具体实施方案中，本文所述的用于靶向DR6基因座的靶向基因组整合系统的组分中的一者或多者可提供于表达盒中，以便在原核细胞、真核细胞、细菌、酵母细胞或哺乳动物细胞或其它目标生物体或细胞类型中表达。所述盒可包括可操作地连接至本文所提供的多核苷酸的5'调控序列和3'调控序列。“可操作地连接”包括其中组分以其预期方式可操作地连接功能的关系。例如，目标多核苷酸与调控序列(即，启动子)之间的可操作地连接为允许表达目标多核苷酸的功能性连接。可操作地连接的元件可为邻接的或不邻接的。当用以提到两个蛋白编码区的连接时，可操作地连接意指编码区在同一阅读框中。在另一种情况下，编码蛋白的核酸序列可操作地连接至调控序列(例如，启动子、增强子、沉默子序列等)以保持恰当的转录调控。所述盒可另外含有将共同引入生物体中的至少一个额外目标多核苷酸。或者，所述额外目标多核苷酸可提供于多个表达盒上。这种表达盒提供有多个限制位点和/或重组位点，以使重组多核苷酸的插入处于调控区的转录调控之下。所述表达盒可另外含有选择标记基因。
所述表达盒在5'-3'转录方向上可包含在哺乳动物细胞或目标宿主细胞中起作用的转录和翻译起始区(即，启动子)、本文所提供的重组多核苷酸、以及转录和翻译终止区(即，终止区)。所述调控区(即，启动子、转录调控区、Kozak序列和翻译终止区)和/或本文所提供的多核苷酸对于宿主细胞或对于彼此可为天然/类似的。另选地，所述调控区和/或本文所提供的多核苷酸对于宿主细胞或对于彼此可为异源的。例如，可操作地连接至异源多核苷酸的启动子来自与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自相同/类似的物种，则对一者或两者由其原始形式和/或基因组基因座进行了实质性修饰，或者启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。另选地，所述调控区和/或本文所提供的重组多核苷酸可以是完全合成的。
所述终止区对于转录起始区而言可为天然的，对于可操作地连接的重组多核苷酸而言可为天然的，对于宿主细胞而言可为天然的，或者可来源于对于启动子、重组多核苷酸、宿主细胞或它们的任何组合而言为另一种的(即，外来的或异源的)来源。
在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以便提供处于正确取向的DNA序列。为此目的，可采用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其它的操纵以提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。出于这个目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换(例如转换和颠换)。
多种启动子可用于本文所提供的表达盒中。可根据期望的结果来选择启动子。已经认识到，不同的应用可通过在表达盒中使用不同的启动子来增强，从而调整目标多核苷酸的表达的时机、位置和/或水平。如果需要，此类表达构建体还可含有启动子调控区(例如，赋予可诱导的、组成型的、环境或发育调控的，或细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调控区)、转录起始位点、Kozak共有序列、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多聚腺苷酸化信号。
含有本文所提供的多核苷酸的表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择标记基因。利用选择性标记基因来选择转化细胞或组织。
在适当的情况下，可优化在所述方法和组合物(即，目标多核苷酸、核酸酶试剂等)中采用的序列，以便增加在细胞中的表达。也就是说，所述基因可使用给定目标细胞中偏好的密码子来合成以便提高表达，所述密码子包括例如哺乳动物偏好密码子、人偏好密码子、啮齿动物偏好密码子、小鼠偏好密码子、大鼠偏好密码子、仓鼠偏好密码子等。
本文提供的各种方法和组合物均可采用选择标记。可在本文所公开的方法和组合物中使用各种选择标记。此类选择标记可例如赋予对抗生素如G418、潮霉素、杀稻瘟菌素、新霉素或嘌呤霉素的抗性。此类选择标记包括新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(puror)以及杀稻瘟菌素S脱氨酶(bsrr)。在另一些实施方案中，选择标记可操作地连接至诱导型启动子，并且选择标记的表达对细胞有毒性。此类选择标记的非限制性示例包括黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)或单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)。编码选择标记的多核苷酸可操作地连接至细胞中有活性的启动子。
iii.靶向载体
采用靶向载体将插入核酸引入真核生物、非人类、哺乳动物、非人类哺乳动物、人类、啮齿动物、小鼠、大鼠或仓鼠核酸的DR6基因座中。靶向载体包含插入核酸，并且还包含5'同源臂和3'同源臂，这些同源臂侧接插入核酸。侧接插入核酸的同源臂对应于真核生物、非人类、哺乳动物、非人类哺乳动物、人类、啮齿动物、小鼠、大鼠或仓鼠核酸的靶DR6基因座内的区域。为了便于提及，所靶向基因组基因座内的对应同源基因组区域称为“靶位点”。例如，靶向载体可包含侧接有与第一靶位点和第二靶位点互补的第一同源臂和第二同源臂的第一插入核酸。因此，靶向载体由此有助于通过在细胞的基因组内的同源臂与互补靶位点之间发生的同源重组事件，将插入核酸整合到靶基因座核酸中。
在一个实施方案中，真核生物、哺乳动物、非人类哺乳动物、人类、啮齿动物、小鼠或仓鼠核酸的靶基因座包含与5’同源臂互补的第一核酸序列和与3’同源臂互补的第二核酸序列。在一个实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列间隔至少5kb。在另一个实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列间隔至少1kb但不超过50kb。在一个实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列间隔至少2kb。在一个实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列间隔至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb或至少50kb。在另外的实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列间隔至少1kb但不超过2kb、至少2kb但不超过3kb、至少4kb但不超过5kb、至少5kb但不超过6kb、至少6kb但不超过7kb、至少7kb但不超过8kb、至少约8kb但不超过9kb、至少9kb但不超过10kb，或者至少10kb但不超过15kb、至少约15kb但不超过约20kb、至少约20kb但不超过约30kb，或至少约40kb但不超过约50kb。
靶向载体的同源臂可具有足以促进与对应靶位点的同源重组事件的任何长度，包括例如至少5-10kb、5-15kb、10-20kb、20-30kb、30-40kb、40-50kb、50-60kb、60-70kb、70-80kb、80-90kb、90-100kb、100-110kb、110-120kb、120-130kb、130-140kb、140-150kb、150-160kb、160-170kb、170-180kb、180-190kb、190-200kb的长度或更长。如下文进一步详细概述，大靶向载体可采用更大长度的靶向臂。在一个具体实施方案中，5'同源臂和3'同源臂的总和为至少10kb，或者5'同源臂和3'同源臂的总和为至少约16kb至约100kb或约30kb至约100kb。在其它实施方案中，LTVEC的总5'和3'同源臂的总和大小为约10kb至约150kb，约10kb至约100kb，约10kb至约75kb，约20kb至约150kb，约20kb至约100kb，约20kb至约75kb，约30kb至约150kb，约30kb至约100kb，约30kb至约75kb，约40kb至约150kb，约40kb至约100kb，约40kb至约75kb，约50kb至约150kb，约50kb至约100kb，或者约50kb至约75kb，约10kb至约30kb，约20kb至约40kb，约40kb至约60kb，约60kb至约80kb，约80kb至约100kb，约100kb至约120kb，或约120kb至约150kb。在一个实施方案中，缺失的大小与LTVEC的5'和3'同源臂的总和大小相同或近似。
当两个区域彼此共有足够水平的序列同一性时，同源臂和靶位点(即同源基因组区域)彼此“互补”，从而充当同源重组反应的底物。“同源性”意指DNA序列与对应或“互补”序列相同或共有序列同一性。给定靶位点与存在于靶向载体上的对应同源臂之间的序列同一性可为允许同源重组发生的任何程度的序列同一性。例如，靶向载体的同源臂(或其片段)与靶位点(或其片段)共有的序列同一性的量可为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，以使得所述序列经历同源重组。此外，同源臂与互补靶位点之间的互补同源区可具有足以促进在裂解的识别位点处同源重组的任何长度。例如，给定同源臂和/或互补靶位点可包含互补同源区，该互补同源区为至少5-10kb、5-15kb、10-20kb、20-30kb、30-40kb、40-50kb、50-60kb、60-70kb、70-80kb、80-90kb、90-100kb、100-110kb、110-120kb、120-130kb、130-140kb、140-150kb、150-160kb、160-170kb、170-180kb、180-190kb、190-200kb、200kb至300kb的长度或更长(诸如在本文别处描述的LTVEC载体中所述)，以使得同源臂与在细胞基因组内的对应靶位点具有足以经历同源重组的同源性。为了易于参考，同源臂在本文中称为5’和3’同源臂。该术语涉及靶向载体内的同源臂与插入核酸的相对位置。
靶向载体的同源臂因此被设计成与具有所靶向基因座的靶位点互补。因此，同源臂可与对细胞为天然的基因座互补，或者另选地，它们可与整合到细胞基因组中的异源或外源DNA区段的区域互补，所述区域包括但不限于转基因、表达盒或者异源或外源基因组DNA区域。另选地，靶向载体的同源臂可与人类人工染色体的区域或在适当宿主细胞中包含的任何其它经改造的基因组区域互补。更进一步，靶向载体的同源臂可与BAC文库、粘粒文库或P1噬菌体文库的区域互补，或者可来源于BAC文库、粘粒文库或P1噬菌体文库的区域。因此，在特定实施方案中，靶向载体的同源臂与对给定细胞为天然、异源或外源的真核生物、非人类、哺乳动物、非人类哺乳动物、人类、啮齿动物、小鼠或大鼠基因组基因座互补。在一个实施方案中，同源臂来源于合成DNA。
靶向载体(诸如大靶向载体)还可包含如本文别处所讨论的选择盒或报告基因。选择盒可包含编码选择标记的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至如本文别处所讨论的启动子。靶向载体的选择标记和/或报告基因可侧接有5'同源臂和3'同源臂，或可存在于同源臂的5’或3’。
在一个实施方案中，靶向载体包含插入核酸，该插入核酸包含编码报告基因的第一核苷酸序列。在一些情况下，在与DR6基因座同源重组之后，编码报告基因的第一核苷酸序列可操作地连接至驱动DR6在DR6基因座处表达的内源启动子。
在另一个实施方案中，靶向载体包含插入核酸，该插入核酸包含编码跨膜结构域并与编码报告基因的第二核苷酸序列可操作地连接的第一核苷酸序列。在一些情况下，在与DR6基因座同源重组之后，编码跨膜结构域的第一核苷酸序列可操作地连接至驱动跨膜结构域和报告基因到达目的地的内源DR6信号序列。
在另一个实施方案中，靶向载体的插入核酸包含另外的编码选择性标记的核苷酸序列。在一些情况下，所述另外的核酸可操作地连接至启动子。
在一个实施方案中，插入核酸的第一和/或另外的核苷酸序列包含Kozak共有序列。
在一个实施方案中，靶向载体(诸如大靶向载体)包含可操作地连接至如本文别处描述的启动子的报告基因和/或选择性标记基因。这类报告基因和/或选择性标记基因可操作地连接至在如本文别处描述的细胞中有活性的启动子。
在一个实施方案中，靶向载体包含位点特异性重组酶基因。在一个实施方案中，位点特异性重组酶基因编码Cre重组酶。在一个实施方案中，Cre重组酶基因为Crei，其中编码Cre重组酶的两个外显子由内含子隔开以防止其在原核细胞中表达。在一个实施方案中，位点特异性重组酶基因编码Dre重组酶。
在一个实施方案中，Cre重组酶基因还包含核定位信号以利于将Cre(或任何重组酶或核酸酶试剂)定位至核(例如，基因为NLS-Cre基因)。在一个特定实施方案中，Cre重组酶基因还包含核定位信号(NLS)和内含子(例如，NLS-Crei)。
在各种实施方案中，用于表达上述Cre或Crei重组酶的合适的启动子选自或包括Prm1、Blimp1、Gata6、Gata4、Igf2、Lhx2、Lhx5和/或Pax3。在一个具体实施方案中，启动子为Gata6或Gata4启动子。各种启动子可来自任何生物体，包括例如，啮齿动物诸如小鼠或大鼠、真核生物、非人类哺乳动物、哺乳动物、人类或仓鼠。在另一个特定实施方案中，启动子为Prm1启动子。在另一个特定实施方案中，启动子为小鼠Prm1启动子。在另一个特定实施方案中，启动子为Blimp1启动子或其片段，例如，Blimp1启动子的1kb或2kb片段。参见例如美国专利8,697,851、美国专利9,267,152、美国专利9,096,870、美国专利8,354,389、美国专利8,946,505、美国专利8,946,504、美国专利8,518,392，这些专利中的每一篇均全文以引用方式并入本文。
在一个实施方案中，插入核酸包含侧接有两个位点特异性重组位点的核苷酸序列。位点特异性重组位点的示例包括但不限于loxP、lox511、lox2272、lox66、lox71、loxM2、lox5171、FRT、FRT11、FRT71、attp、att、FRT、rox以及它们的组合。
iv.大靶向载体
术语“大靶向载体”或“LTVEC”包括这样的大靶向载体：其包含对应于且来源于一些核酸序列的同源臂，这些核酸序列比通常由意欲在细胞中进行同源靶向的其它方法使用的那些核酸序列大；并且/或者包含插入多核苷酸，所述插入多核苷酸包含的核酸序列比通常由意欲在细胞中进行同源重组靶向的其它方法使用的那些核酸序列大。在具体实施方案中，LTVEC的同源臂和/或插入多核苷酸包含真核细胞的基因组序列。LTVEC的尺寸太大，无法通过常规测定法例如Southern印迹和长片段(例如，1kb-5kb)PCR来筛选靶向事件。LTVEC的示例包括但不限于衍生自细菌人工染色体(BAC)、人类人工染色体或酵母人工染色体(YAC)的载体。LTVEC及其制备方法的非限制性示例描述于例如美国专利6,586,251、6,596,541、7,105,348和WO 2002/036789(PCT/US01/45375)中，这些专利中每一篇均以引用方式并入本文。
LTVEC可具有任何长度，包括但不限于至少约10kb，约15kb，约20kb，约30kb，约40kb，约50kb，约60kb，约70kb，约80kb，约90kb，约100kb，约150kb，约200kb，约10kb至约15kb，约15kb至约20kb，约20kb至约30kb，约30kb至约50kb，约50kb至约300kb，约50kb至约75kb，约75kb至约100kb，约100kb至125kb，约125kb至约150kb，约150kb至约175kb，约175kb至约200kb，约200kb至约225kb，约225kb至约250kb，约250kb至约275kb，或约275kb至约300kb。
在一个实施方案中，LTVEC的同源臂来源于BAC文库、粘粒文库或P1噬菌体文库。在其它实施方案中，同源臂来源于细胞的所靶向DR6基因组基因座，并且在一些情况下，LTVEC被设计用来靶向的靶基因组基因座无法使用常规方法靶向。在另一些实施方案中，同源臂来源于合成DNA。
在一个实施方案中，LTVEC中的上游同源臂和下游同源臂的总和为至少10kb。在其它实施方案中，上游同源臂在约5kb至约100kb的范围内。在一个实施方案中，下游同源臂在约5kb至约100kb的范围内。在其它实施方案中，上游和下游同源臂的总和为约5kb至约10kb，约10kb至约20kb，约20kb至约30kb，约30kb至约40kb，约40kb至约50kb，约50kb至约60kb，约60kb至约70kb，约70kb至约80kb，约80kb至约90kb，约90kb至约100kb，约100kb至约110kb，约110kb至约120kb，约120kb至约130kb，约130kb至约140kb，约140kb至约150kb，约150kb至约160kb，约160kb至约170kb，约170kb至约180kb，约180kb至约190kb，或约190kb至约200kb。在一个实施方案中，缺失的大小与LTVEC的5'和3'同源臂的总和大小相同或近似。
在一个实施方案中，LTVEC包含选择盒或报告基因，如本文别处所讨论。
III.引入序列并产生转基因动物的方法
如上所概述，本文提供了允许DR6基因座的所靶向基因修饰的方法和组合物。还认识到，可以进行另外的所靶向基因修饰。允许这些所靶向基因修饰的此类系统可采用多种组分，并且为了便于提及，在本文中术语“靶向基因组整合系统”通常包括整合事件所需的所有组分(即，各种核酸酶试剂、识别位点、插入DNA多核苷酸、靶向载体、靶基因组基因座和所关注多核苷酸)。
本文所提供的方法包括向细胞中引入包含靶向基因组整合系统的各种组分的一个或多个多核苷酸或多肽构建体。“引入”意指以使得序列(多肽或多核苷酸)能够进入细胞内部的方式将序列呈递到细胞。本文所提供的方法并不取决于将靶向基因组整合系统的任何组分引入细胞中的特定方法，只要使多核苷酸能够进入至少一个细胞内部即可。用于将多核苷酸引入到各种细胞类型中的方法是本领域已知的，并且包括但不限于稳定转染方法、瞬时转染方法和病毒介导的方法。
在一些实施方案中，在所述方法和组合物中采用的细胞具有稳定地掺入到其基因组中的DNA构建体。“稳定地掺入”或“稳定地引入”意指将多核苷酸引入到细胞中，使得核苷酸序列整合到细胞的基因组中且能够遗传给其子代。可使用任何方案稳定地掺入DNA构建体或靶向基因组整合系统的各种组分。
转染方案以及将多肽或多核苷酸序列引入到细胞中的方案可有所差别。非限制性转染方法包括基于化学的转染方法，其包括使用：脂质体；纳米粒子；磷酸钙(Graham etal.(1973).Virology 52(2):456-67(Graham等人，1973年，《病毒学》，第52卷，第2期，第456-467页)；Bacchetti et al.(1977)Proc Natl Acad Sci USA 74(4):1590-4(Bacchetti等人，1977年，《美国科学院院刊》，第74卷，第4期，第1590-1594页)；以及Kriegler,M(1991).Transfer and Expression:A Laboratory Manual.New York:W.H.Freeman and Company.pp.96-97)(Kriegler,M，1991年，《基因转染和表达实验手册》，纽约W.H.弗里曼公司，第96-97页))；树枝状体；或阳离子聚合物，诸如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺。非化学方法包括电穿孔、超声穿孔和光学转染。基于颗粒的转染包括使用基因枪、磁体辅助转染(Bertram,J.(2006)Current Pharmaceutical Biotechnology 7,277-28(Bertram,J.，2006年，《当今药物生物技术》，第7卷，第277-28页))。也可将病毒方法用于转染。
可采用本文所公开的各种方法产生非人动物。此类方法包括(1)采用本文所公开的方法在非人动物多能细胞的所关注靶DR6基因组基因座处整合一个或多个所关注多核苷酸，以生成在所靶向DR6基因组基因座中包含插入多核苷酸的经基因修饰的多能细胞；(2)选择在靶DR6基因组基因座处具有一个或多个所关注多核苷酸的经基因修饰的多能细胞；(3)将经基因修饰的多能细胞引入到例如处于桑椹胚前期的非人动物宿主胚胎中；以及(4)将包含经基因修饰的多能细胞的宿主胚胎植入代孕母体中，以产生来源于经基因修饰的多能细胞的F0代。可采用类似的方法来靶向具有挑战性的靶染色体基因座。所述非人动物可为非人哺乳动物、啮齿动物、小鼠、大鼠、仓鼠、猴、农业哺乳动物或家养哺乳动物，或者鱼或鸟。
所述多能细胞可为人ES细胞、非人ES细胞、啮齿动物ES细胞、小鼠ES细胞、大鼠ES细胞、仓鼠ES细胞、猴ES细胞、农业哺乳动物ES细胞或家养哺乳动物ES细胞。在其它实施方案中，所述多能细胞为非人类细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、非人类哺乳动物细胞、人类多能细胞、人类ES细胞、人类成体干细胞、发育受限的人类祖细胞、人类iPS细胞、啮齿动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、仓鼠细胞。在一个实施方案中，所靶向基因修饰导致DR6的功能丧失。
小鼠多能细胞、全能细胞或宿主胚胎可来自任何小鼠品系，包括例如近交品系、杂交品系和远交品系。小鼠品系的示例包括129品系、C57BL品系(例如，C57BL/6品系)、129和C57BL/6的混合(例如，50％129和50％C57BL/6)、BALB/c品系和Swiss Webster品系。129品系的示例包括129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，12951/SV、12951/SvIm)、129S2、129S4、129S5、12959/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1和129T2(参见例如，Festing et al.(1999)Revised nomenclature for strain 129 mice,Mammalian Genome10:836(Festing等人，1999年，“品系129小鼠的修订命名法”，《哺乳动物基因组》，第10卷，第836页))。C57BL品系的示例包括C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/01a。小鼠可为上述129品系(例如，129S6(129/SvEvTac)品系)和上述C57BL/6品系的混合、一种或多种上述129品系的混合，或一种或多种上述C57BL品系的混合。小鼠也可来自除129品系之外的品系。
大鼠多能细胞、全能细胞或宿主胚胎可来自任何大鼠品系，包括例如近交品系、杂交品系和远交品系。大鼠品系的示例包括ACI大鼠品系、黑刺(DA)大鼠品系、威斯塔鼠品系、LEA大鼠品系、Sprague Dawley(SD)大鼠品系，或者Fischer大鼠品系诸如Fisher F344或Fisher F6。大鼠多能细胞、全能细胞或宿主胚胎还可获自来源于以上列举的两种或更多种品系的混合的品系。例如，大鼠多能细胞、全能细胞或宿主胚胎可来源于选自DA品系和ACI品系的品系。ACI大鼠品系的特点是具有黑刺、白色的腹和足，为RT1av1单倍型。此类品系得自多种来源，包括Harlan实验室。来自ACI大鼠的大鼠ES细胞系的示例为ACI.G1大鼠ES细胞。黑刺(DA)大鼠品系的特点是具有花纹外皮并且为RT1av1单倍型。此类大鼠得自多种来源，包括查尔斯河(Charles River)和Harlan实验室。来自DA大鼠的大鼠ES细胞系的示例为DA.2B大鼠ES细胞系或DA.2C大鼠ES细胞系。大鼠品系的其它示例提供于例如US 2014/0235933、US 2014/0310828和US2014/0309487中，这些专利中的每一篇出于所有目的全文以引用方式并入本文。
例如，可生殖系传递的大鼠ES细胞可通过在具有培养基的饲养细胞层上培养分离的大鼠ES细胞获得，该培养基包含N2补充剂、B27补充剂、约50U/mL至约150U/mL白血病抑制因子(LIF)和由MEK抑制剂和GSK3抑制剂组成的抑制剂组合，其中饲养细胞层未经修饰来表达LIF，并且其中大鼠ES细胞：(i)已经过修饰以包含所靶向基因修饰并能够通过种系传递所述所靶向基因修饰，该所靶向基因修饰包括至少一个包含选择标记的异源多核苷酸插入到大鼠ES细胞的基因组中；(ii)具有正常核型；(iii)缺少c-Myc表达；并且(iv)在培养物中形成球形、自由浮动菌落(参见例如US2014-0235933 A1和US 2014-0310828 A1，这些专利中每一篇全文以引用方式并入)。例如在Yamamoto等人(“Derivation of rat embryonicstem cells and generation of protease-activated receptor-2 knockout rats,”Transgenic Res.21:743-755,2012(“大鼠胚胎干细胞的来源和蛋白酶活化受体-2敲除小鼠的产生”，《转基因研究》，第21卷，第743-755页，2012年))以及Kwamata和Ochiya(“Generation of genetically modified rats from embryonic stem cells,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107(32):14223-14228,2010(“由胚胎干细胞产生经基因修饰的大鼠”，《美国科学院院刊》，第107卷，第32期，第14223-14228页，2010年)中提供了大鼠胚胎干细胞的来源和所靶向修饰的其它示例。
也可使用核移植技术生成非人动物。简而言之，用于核移植的方法包括以下步骤：(1)将卵母细胞去核；(2)分离供体细胞或核，以与去核卵母细胞混合；(3)将所述细胞或核插入到所述去核卵母细胞中，以形成重建细胞；(4)将所述重建细胞植入到动物的子宫中，以形成胚胎；以及(5)允许所述胚胎发育。在此类方法中，一般从处死的动物体内取出卵母细胞，但也可从活动物的输卵管和/或卵巢中分离卵母细胞。卵母细胞可在去核之前在本领域普通技术人员已知的多种培养基中成熟。卵母细胞的去核可以本领域普通技术人员所熟知的多种方式进行。通常在融合之前在透明带下显微注射供体细胞来将供体细胞或核插入到去核卵母细胞中以形成重建细胞。融合可通过跨接触/融合平面施加直流电脉冲(电融合)、通过将细胞暴露于促进融合的化学品如聚乙二醇或者借助灭活病毒如仙台病毒来诱导。重建细胞通常在核供体和受体卵母细胞融合之前、期间和/或之后通过电和/或非电方式激活。激活方法包括电脉冲、化学诱导冲击、精子穿透、增加卵母细胞中二价阳离子水平以及减少卵母细胞中细胞蛋白磷酸化(如借助激酶抑制剂)。激活的重建细胞或胚胎通常在本领域普通技术人员所熟知的培养基中培养，然后移植到动物的子宫中。参见例如US20080092249、WO/1999/005266A2、US20040177390、WO/2008/017234A1和美国专利7,612,250，这些专利中的每一篇均以引用的方式并入本文。
提供了用于制备在其种系中包含一个或多个如本文所述的遗传修饰的非人动物的其它方法，所述方法包括：(a)采用本文所述的各种方法在原核细胞中修饰非人动物的所靶向基因组DR6基因座；(b)选择在所靶向基因组基因座处包含基因修饰的经修饰的原核细胞；(c)从经修饰的原核细胞的基因组分离经基因修饰的靶向载体；(d)将经基因修饰的靶向载体引入到非人动物的多能细胞中，以生成在所靶向DR6基因组基因座处包含插入核酸的经基因修饰的多能细胞；(e)选择经基因修饰的多能细胞；(f)将经基因修饰的多能细胞引入到处于桑椹胚前期的非人动物宿主胚胎中；以及(g)将包含经基因修饰的多能细胞的宿主胚胎植入代孕母体中，以产生来源于经基因修饰的多能细胞的F0代。在此类方法中，所述靶向载体可包括大靶向载体。所述非人动物可为非人哺乳动物、啮齿动物、小鼠、大鼠、仓鼠、猴、农业哺乳动物或家养哺乳动物。所述多能细胞可为人ES细胞、非人ES细胞、啮齿动物ES细胞、小鼠ES细胞、大鼠ES细胞、仓鼠ES细胞、猴ES细胞、农业哺乳动物ES细胞或家养哺乳动物ES细胞。在其它实施方案中，所述多能细胞为非人类细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、非人类哺乳动物细胞、人类多能细胞、人类ES细胞、人类成体干细胞、发育受限的人类祖细胞、人类iPS细胞、人类细胞、啮齿动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、仓鼠细胞。在一个实施方案中，所靶向基因修饰导致DR6的功能丧失。
在另外的方法中，分离步骤(c)还包括(c1)使经遗传修饰的靶向载体(即，经遗传修饰的LTVEC)线性化。在另外的实施方案中，引入步骤(d)还包括(d1)将核酸酶试剂引入到多能细胞中以利于同源重组。在一个实施方案中，通过将如本文所述的选择性试剂施加到原核细胞或多能细胞来执行选择步骤(b)和/或(e)。在一个实施方案中，经由如本文所述的等位基因修饰(MOA)测定法执行选择步骤(b)和/或(e)。
在一些实施方案中，本文所述的靶基因组基因座的各种基因修饰可使用来源于细菌人工染色体(BAC)DNA的LTVEC，采用
基因工程技术，通过一系列同源重组反应(BHR)在细菌细胞中实施(参见例如美国专利6,586,251和Valenzuela,D.M.et al.(2003),Nature Biotechnology21(6):652-659(Valenzuela,D.M.等人，2003年，《自然生物技术》，第21卷，第6期，第652-659页)，该文献全文以引用的方式并入本文)。
在一些实施方案中，包含如本文所述的各种基因修饰的DR6靶向多能和/或全能细胞用作插入供体细胞，并经由
方法引入到来自对应生物体的桑椹胚前期胚胎如8细胞期小鼠胚胎中(参见例如，US7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754和US2008-0078000 A1，所有这些专利全文以引用的方式并入本文)。孵育包含经基因修饰的多能和/或全能细胞的非人动物胚胎直至胚泡期，随后将其植入代孕母体中以产生F0代。在一些实施方案中，将包含如本文所述的各种基因修饰的所靶向哺乳动物ES细胞引入到胚泡期胚胎中。可经由如本文所述的等位基因修饰(MOA)测定法鉴定具有经基因修饰的基因组基因座(即DR6基因座)的非人动物。使来源于经基因修饰的多能和/或全能细胞的所得F0代非人动物与野生型非人动物杂交，从而得到F1代后代。在用特异性引物和/或探针进行基因分型之后，使对经基因修饰的基因组基因座杂合的F1非人动物相互杂交，从而产生对经基因修饰的基因组基因座纯合的F2代非人动物后代。
在一个实施方案中，提供了一种用于产生在至少一个DR6基因座中包含基因修饰的非人动物的方法。这种方法包括：(a)用包含侧接有5’和3’同源臂的插入核酸的靶向构建体接触多能细胞；其中靶向构建体经历与细胞的基因组中DR6基因座的同源重组以形成经修饰的多能细胞；(b)将经修饰的多能细胞引入宿主胚胎中；以及(c)在代孕母体中孕育宿主胚胎，其中代孕母体产生包含经修饰的DR6基因座的子代，其中所述基因修饰导致至少一个DR6的功能丧失。
IV.细胞
本文所述的各种方法在细胞中采用用于修饰DR6基因座的基因组基因座靶向系统。此类细胞包括：原核细胞，诸如细菌细胞，包括大肠杆菌；或者真核细胞，诸如酵母、昆虫、两栖动物、植物，或哺乳动物细胞，包括但不限于小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞、兔细胞、猪细胞、牛细胞、鹿细胞、绵羊细胞、山羊细胞、鸡细胞、猫细胞、狗细胞、白鼬细胞、灵长类动物(例如，狨猴、恒河猴)细胞等，以及来自家养哺乳动物的细胞或来自农业哺乳动物的细胞。一些细胞为非人细胞，特别是非人哺乳动物细胞。在一些实施方案中，对于不易获得合适的可基因修饰的多能细胞的那些哺乳动物，采用其它方法使体细胞重新编程为多能细胞，例如经由向体细胞中引入多能诱导性因子的组合来使其重新编程，所述多能诱导性因子包括但不限于Oct3/4、Sox2、KLF4、Myc、Nanog、LIN28和Glis1。在这类方法中，细胞也可为哺乳动物细胞、人类细胞、非人类哺乳动物细胞、非人类细胞、来自啮齿动物(大鼠、小鼠、仓鼠)的细胞、成纤维细胞或任何其它宿主细胞。在其它实施方案中，细胞为多能细胞、诱导的多能干(iPS)细胞、非人类胚胎干(ES)细胞。这类细胞包括多能细胞，其包括例如，诱导的多能干(iPS)细胞、人类iPS细胞、小鼠胚胎干(ES)细胞、大鼠胚胎干(ES)细胞、人类胚胎干(ES)细胞或发育受限的人类祖细胞、啮齿动物胚胎干(ES)细胞、小鼠胚胎干(ES)细胞或大鼠胚胎干(ES)细胞。
V.动物模型
本文还提供了一种鉴定用于治疗、预防和/或抑制ALS的候选试剂的方法。在一个具体实施方案中，通过向出生时表型正常但在8周龄之后患上ALS样症状的具有DR6功能丧失的动物施用试剂，在体内确定物质的抑制作用。
可例如通过全身注射、长期泵送接触或直接脑内注射，将试剂施用给动物以通过任何便利途径进行测试。这些动物可包括在行为研究中，以便确定相比于不接受试剂的合适对照动物，物质对这些动物行为(如运动行为)的影响。也可对动物脊髓、肌肉和/或脑组织执行活组织检查或解剖学检验，并且/或者可收集血液或CSF样品。
虽然已参照多个实施方案具体示出和描述了本发明，但本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神和范围的情况下可对本文所公开的各种实施方案进行形式和细节上的更改，并且本文所公开的各种实施方案不旨在对权利要求书的范围构成限制。
实施例
下面提供的实施例仅用于进行示意性的说明，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：DR6(Tnfrs21)基因座的基因修饰
如此前所述，采用了
方法，该方法允许在小鼠中快速且高通量地产生定制基因突变(Valenzuela,D.M.,et al.(2003b),Nat Biotechnol21:652-659(Valenzuela,D.M.等人，2003年b，《自然生物技术》，第21卷，第652-659页))。简言之，使用来自小鼠bMQ(129S7/SvEv Brd-Hprt b-m2)或RP23 BAC文库的BAC克隆生成大靶向载体(LTVEC)(Adams,D.J.,et al.(2005),Genomics 86:753-758(Adams,D.J.等人，2005年，《基因组学》，第86卷，第753-758页))。lacZ/neor报告基因/选择盒(图1)与用于NIH KOMP(序列可通过因特网在万维网(www)URL“www.velocigene.com/komp/detail/10020”上获得)的ZEN-Ub1盒相同，不同的是lacZ部分中β-半乳糖苷酶编码序列的氨基末端经过修饰以包含来自ROR1的跨膜结构域。
用多孔电穿孔装置(美国马萨诸塞州波士顿的哈佛仪器公司(HarvardApparatus,Boston,MA))在电穿孔缓冲液(密理博公司(Millipore))中将LTVEC引入C57BL/6NTac ES细胞(0.125mL体积中3.3×106个细胞、0.67μg DNA)(Poueymirou et al.(2007)(Poueymirou等人，2007年)；Valenzuela et al.(2003a)(Valenzuela等人，2003年a))，然后在15cm凝胶化板上培养。电穿孔48小时之后加入包含G418的选择培养基，此后每日更换。电穿孔10天之后挑出耐药菌落，用胰蛋白酶处理并在凝胶化96孔板中培养至少三天，然后进行DNA提取和纯化。通过等位基因修饰(MOA)测定法鉴定正确靶向的ES细胞克隆(Frendewey et al.(2010),Methods in enzymology 476:295-307(Frendewey等人，2010年，《酶学方法》，第476卷，第295-307页)；Valenzuela et al.(2003a),Nat.Biotechnol.21:652-659(Valenzuela等人，2003年a，《自然生物技术》，第21卷，第652-659页)。
采用
方法(Dechiara,T.M.,(2009),Methods Mol Biol530:311-324(Dechiara,T.M.，2009年，《分子生物学方法》，第530卷，第311-324页)；Poueymirou etal.(2007),Nat.Biotechnol.25:91-99(Poueymirou等人，2007年，《自然生物技术》，第25卷，第91-99页))，在该方法中，所靶向ES细胞被注射到未压实的8细胞期SwissWebster胚胎中，以产生携带DR6敲除突变的完全ES细胞衍生的F0代小鼠。雄性
直接用于lacZ表达分析，或与C57BL/129雌性交配以产生用于lacZ分析的胚胎或成体，或产生F1繁殖体，并对N2F1小鼠进行表型研究。通过指定鉴定阴道栓的早晨为第0.5天(E0.5)来进行定时交配。
实施例2：包含DR6基因座中突变的动物的表型分析
对N2F1小鼠的表型研究开始于6-8周龄。对于定时交配，指定鉴定阴道栓的早晨为胚胎第0.5天(E0.5)。从出生起观察DR6KO和同窝野生型小鼠的各种发育重要事件(发育不全、呼吸、面部和肢体异常、皮肤颜色、姿势、翻正和睁眼)，直至约6-8周龄，这时将它们圈养在69-74F和40-60％湿度下、每日光照12h以进行研究。所有实验开始于6-9周龄，并且所有动物程序均按照由Regeneron制药机构动物护理和使用委员会(RegeneronPharmaceuticals Institutional Animal Care and Use Committee)批准的规程进行。
使用转杆测试、旷场运动测试和猫步测试进行运动损伤分析。在猫步测试中，受试者在照亮的玻璃台上行走，同时摄像机从下面记录。报告每只动物的步态相关参数，诸如跨步模式、个体爪摆动速度、姿态持续时间和压力。该测试用于对小鼠的转基因品系进行分型并评估新型化学实体对运动性能的影响。CatWalk XT是用于定量评估大鼠和小鼠的脚步和步态的系统。其用于在几乎任何类型的中枢神经、外周神经、肌或骨肌异常实验模型中评估啮齿动物的运动能力。
上运动神经元损伤表现为痉挛状态(即僵直状态)、反射增强、震颤、运动迟缓和巴宾斯基征。下运动神经元损伤表现为肌无力、消瘦、抱握、脚卷曲和拖曳，以及肌束震颤。延髓损伤表现为吞咽困难、口齿不清和舌颤。表2提供了有关测试期间动物的运动损伤、震颤和僵直的评分方法。使用盲法主观评分测定进行总体运动功能评估，所有数据均报告为平均值+/-SEM。
表2
| 0 | 1 | 2 | 3 | |
| 运动损伤 | 无表型 | 抱握 | 抱握+脚趾拖曳/卷曲 | 麻痹 |
| 震颤 | 无 | 轻微 | 中等 | 严重 |
| 僵直 | 无 | 轻微 | 中等 | 严重 |
数据表明，相比于其野生对应小鼠，DR6-/-小鼠的不动性未增强，但在大约14周龄时表现出ALS样神经学表型(例如，直立活动较少表明后肢麻痹)，虽然早在9周龄时就观察到转杆和体重方面的时间差异(各自随时间推移而稳定下降(图4至图7))。但是，DR6-/-小鼠的运动神经元损失在约14周龄时达到临床症状阈值，此时运动损伤、僵直和震颤得分开始反映麻痹和/或严重疾病进展，这并不取决于动物的性别(图2)。有症状的DR6-/-动物体重有所减轻且运动异常显著，这表明上运动神经元和下运动神经元均有损伤(图3)，这些动物在约21周龄时死亡。
实施例3：包含DR6基因座中突变的动物的解剖分析
先用50mL盐水溶液、然后用50mL在pH 6.5的乙酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛(PFA)溶液和50mL在pH 9.5硼酸盐缓冲液中的4％PFA溶液灌注约20周龄的八只野生型小鼠和八只DR6敲除小鼠。在对动物进行灌注之后，收集小鼠的脑和脊髓，并将其置于在硼酸盐缓冲液中的15％蔗糖溶液、然后30％蔗糖溶液中，直至其下沉。然后，将组织包埋在OCT中并使用2-甲基丁烷冷冻。
切开冷冻组织，装在载玻片上，并用苏木精和伊红(H&E)以及罗克沙尔坚牢蓝进行免疫组化染色。对每个脊髓随机选择四块H&E染色玻片，以计算每个脊髓中运动神经元的数目。
代表性玻片示于图9中。每块野生小鼠脊髓玻片上运动神经元的平均数目为约18，而敲除小鼠的平均数目为约2，其中p值小于0.0001(图9)。这表明，相比于野生对应小鼠，有症状的DR6敲除小鼠脊髓中运动神经元大量丢失。此外，敲除小鼠的脊髓具有海绵状病变，该病变类似于克雅氏病患者的人脑病变，这表明这些动物可能具有阮病毒样运动神经元疾病表型。
实施例4：由包含DR6基因座中突变的动物表达神经元蛋白
从约20周龄的10只野生型小鼠和7只DR6敲除小鼠的脑和脊髓中收集总mRNA。然后用
在这些mRNA样品上执行RT-PCR。然后通过在样品中表达β肌动蛋白使髓磷脂结合蛋白(MBP)、神经生长因子受体(NGFR)、胆碱乙酰转移酶(Chat)、Mnx同源异型框、谷氨酸[NMDA]受体亚单位3B(Grin3b)和谷氨酸受体2(Gria2)基因的平均mRNA水平标准化。
图10至图12示出了DR6敲除小鼠的脊髓而非脑中MBP、Mnx和Grin3b的表达有所降低，进一步证实有症状的DR6敲除小鼠脊髓中运动神经元的损失。Ngfr、Chat和Gri2a的表达不受影响。
实施例5：包含內源DR6基因座中突变的动物的基因表达模式
用从10周龄野生型小鼠(n＝5只雄性)、症状前10周龄DR6-/-小鼠(n＝5只雄性)、20周龄野生型小鼠(n＝6只雄性和3只雌性)和有症状的20周龄DR6-/-小鼠(n＝6只雄性和3只雌性)的脑和脊髓组织提取的RNA进行基因表达谱分析。
来自10周龄和20周龄的DR6-/-小鼠的大脑和脊髓具有大量的基因表达重叠，并共有类似的基因表达特征(数据未示出)。经鉴定，10周龄DR6-/-小鼠的脑和脊髓中七十三种重要基因可能与发病机理和疾病进展相关。10周龄DR6-/-小鼠脊髓的基因标签与人ALS和鼠科动物SOD1生物表达数据集(数据未示出)高度相关，进一步确定DR6-/-小鼠作为ALS小鼠模型。10周龄DR6-/-小鼠的脑和脊髓具有免疫应答相关基因表达特征，这表明疾病过程涉及炎性通路。
实施例6：DR6-/-动物表现出外周免疫细胞内稳态
从10周龄和20周龄的野生型和DR-/-小鼠中分离血液、骨髓、胸腺和脾组织，以便通过流式细胞检测分析，使用抗CD3、B220、CD21和CD2的抗体(所有均购自美国加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学事业部(BD Biosciences San Jose,CA)或美国加利福尼亚州圣地亚哥的eBioscience公司(eBioscience San Diego,CA))进行表型分析。另外，使用用于同时定量测定基本FGF、GM--CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-12(p40/p70)、IL-17、IP-10、KC、MCP-1、MIG、MIP-1α、TNF-α和VEGF的Luminex小鼠细胞因子磁性20-Plex面板(Luminex Mouse Cytokine Magnetic 20-Plex Panel)评估了从20周龄野生型和DR6-/-小鼠中分离的血浆中细胞因子和趋化因子的浓度。
10周龄和20周龄的DR6-/-小鼠均未在外周免疫细胞内稳态方面显示出稳健效果(图13至图14)。DR6-/-小鼠表现出骨髓中B细胞发育正常和早期祖细胞内稳态，胸腺中B细胞增加2倍，脾过渡1B细胞增多且脾边缘区B细胞减少，外周中性粒细胞减少且外周淋巴细胞增多(图13)。在骨髓中，DR6-/-小鼠表现出巨核细胞/红细胞祖细胞增加14％，髓系祖细胞减少20％，但总细胞数目未显著改变(图14)。虽然DR6-/-动物表现出胸腺中正常的T细胞发育和分化，但脾普通/成熟树突细胞增加了20％，巨噬细胞和嗜曙红细胞增加了25％，脾中性粒细胞和单核细胞增加了75％，并且CD4+T细胞减少了19％。但是，脾中总细胞数目未显著改变(数据未示出)。此外，相比于野生型动物，20周龄DR6-/-小鼠的血浆中细胞因子和趋化因子的水平未发生改变(图15)。这些数据表明，DR6-/-小鼠在疾病进展期间未经历总体炎性反应，表明基因表达谱分析所观察到的炎性反应可能为局部神经炎症。
实施例7：DR6+/-小鼠中胚胎干细胞衍生的运动神经元显示氧化应激反应增加。
从野生型(DR6+/+)或杂合DR6+/-动物分离内细胞团胚胎干细胞，然后在胚胎干细胞培养基(ESM；DMEM+15％胎牛血清+青霉素/链霉素+谷氨酰胺+非必需氨基酸+核苷+β-巯基乙醇+丙酮酸钠+LIF)中培养2天，以使得拟胚体(EB)形成。将EB在分化培养基(DM：高级DMEM/F12+神经基础培养基+10％敲除血清+青霉素/链霉素+谷氨酰胺+β-巯基乙醇)中培养两天，并在DM、视黄酸和smo激动剂中另外培养5天，以得到运动神经元。在胚胎干细胞衍生的运动神经元培养基(ESMN；神经基础培养基+2％马血清+B27+谷氨酰胺+青霉素/链霉素+β-巯基乙醇+10ng/ml GDNF、BDNF、CNTF)中接种分离的运动神经元并使其成熟，以建立稳定的运动神经元品系。在第7天确定运动神经元计数，并在稳定的运动神经元品系建立1天和7天之后测量氧化应激反应。
数据表明，DR6+/-动物与野生型动物产生相同数目的运动神经元，但氧化应激反应相比于野生型动物有所增加(图16)。
实施例8：DR6+/-和DR6+/+动物的表型比较。
使用如实施例2中所述的测试比较对照动物和对如实施例1中所述的DR6基因修饰为杂合或纯合的小鼠的运动功能。神经系统得分比较示于图17A，体重增加比较示于图17B，转杆测试比较示于图17C，旷场测量提供于图17D至图17K，猫步测量示于图17L至图17Z。
在动物体重增加方面(图17B)、在转杆测试期间(图17C)、在旷场测试中测量的直立活动和直立时间方面(图17D至图17E)以及在猫步测试期间步长和后肢摆动速度方面(图17L至图17N)观察到DR6突变的显著“剂量依赖”型效应。
虽然在盲法主观评分测定中评估总体运动功能时，杂合小鼠在神经系统方面看起来类似于野生型动物(图17A)，但杂合小鼠的神经系统得分在21周龄时才开始趋向于纯合小鼠(图17A)的神经系统得分。若干其它测量遵循相同模式，由此在约20周龄之后杂合小鼠的表型趋向于纯合小鼠的表型(参见例如图17F至图17K、图17O)。
该数据表明，DR6突变在对突变杂合的小鼠中是单倍剂量不足的(haploinsufficient)。该数据也表明，随着杂合DR6+/-小鼠变老，小鼠开始表现出运动和/或神经系统缺陷，这类似于在那些测量中起初看起来正常的纯合DR6-/-小鼠(参见例如图17O至图17P、图17R)。
实施例9：DR6+/-和DR6+/+动物的感知缺陷
通过将动物置于保持在48℃、52℃或55℃的金属表面(加利福尼亚州伍德兰希尔斯的IITC公司(IITC,Woodland Hills,CA))，在动物20周龄时测试对照动物和对DR6基因修饰为杂合或纯合的小鼠的热伤害感受。测量了对热刺激作出反应的延迟时间，其被定义为在动物舔舐摇动的后爪以前所经过的时间。小鼠留在板上，直至它们进行下列两种疼痛反应行为之一：舔舐后爪或摇动后爪。
如图18所示，DR6+/-和DR6+/+动物均具有感知缺陷。在DR6+/-动物中观察到的感知缺陷可能是准确的，因为这些小鼠在20周龄时没有表现出明显的运动功能紊乱症状(参见实施例8)。但是，应当指出，DR6-/-小鼠反应延迟可能是由所观察到的运动缺陷症状引起。
本文所公开的啮齿动物提供了更近似地遵循人类ALS进展的新动物模型。不希望受理论的束缚，若干种可能性之一是啮齿动物在发育期间可能无法表现出正常修剪，如此，啮齿动物发育中连接活动增加并具有轻微兴奋过度，这可导致随时间累积的低水平兴奋性中毒。值得注意的是，虽然成年DR6敲除动物在发育过程中可能表现出血脑屏障(BBB)渗透性增加且BBB标记物发育受损，但本文所述小鼠的ALS样表型不可能是DR6在大脑血管发育中起作用导致的结果，因为血脑屏障缺陷通常表现为认知损伤而非运动损伤。
Claims (41)
1.一种经基因修饰的啮齿动物基因组，所述啮齿动物基因组中包含经修饰的内源性DR6基因座，所述经修饰的内源性DR6基因座包含
(i)编码成熟DR6蛋白的核苷酸序列的缺失，和
(ii)包含功能性DR6信号肽编码序列的核酸序列，所述功能性DR6信号肽编码序列可操作地融合至ROR1跨膜结构域编码序列，所述ROR1跨膜结构域编码序列可操作地连接至编码报告基因蛋白的基因，
其中包含所述啮齿动物基因组的啮齿动物表达所述功能性DR6信号肽，所述功能性DR6信号肽可操作地融合至可操作地连接至所述报告基因蛋白的ROR1跨膜结构域中并且发展出
(a)表现为一种或多种ALS样症状的运动神经元功能紊乱，
(b)脊髓中运动神经元的损失，
(c)相对于对照啮齿动物的伤害感受减弱，或者
(d)上述(a)、(b)、(c)的任意组合，以及
其中所述啮齿动物基因组为大鼠基因组，所述啮齿动物为大鼠，或其中所述啮齿动物基因组为小鼠基因组，所述啮齿动物为小鼠。
2.根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中所述功能性DR6信号肽为内源性DR6信号肽。
3.根据权利要求2所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中所述报告基因蛋白为β半乳糖苷酶。
4.根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中所述核酸序列可操作地连接至内源性DR6转录调控序列。
5.根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中所述经基因修饰的啮齿动物基因组对于所述经修饰的内源性DR6基因座是杂合的。
6.根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中所述经基因修饰的啮齿动物基因组对于所述经修饰的内源性DR6基因座是纯合的。
7.根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中所述啮齿动物存在表现出一种或多种ALS样症状的运动神经元功能紊乱。
8.根据权利要求7所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中所述运动神经元为上运动神经元或下运动神经元。
9.根据权利要求8所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中在所述啮齿动物大于4周龄以前，所述运动神经元功能紊乱在盲法主观神经系统评分测定、转杆测试、猫步测试、旷场测试和体重测量中并不明显。
10.根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中与对照啮齿动物相比，包含所述啮齿动物基因组的所述啮齿动物表现出伤害感受减弱。
11.根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中与对照啮齿动物相比，包含所述啮齿动物基因组的所述啮齿动物存在表现出一种或多种ALS样症状的运动神经元功能紊乱和伤害感受减弱。
12.根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中所述基因组为小鼠基因组。
13.根据权利要求12所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中所述小鼠基因组包含经修饰的内源性DR6基因座，所述经修饰的内源性DR6基因座
(i)缺少编码SEQ ID NO:15第1-614位氨基酸的核酸序列，并且
(ii)包含可操作地连接至内源性DR6转录调控序列的如SEQ ID NO:17所示的核酸序列。
14.根据权利要求13所述的经基因修饰的啮齿动物基因组，其中所述小鼠基因组来自选自129品系、C57BL/6品系和混合C57BL/6×129品系的品系，并且其中包含所述小鼠基因组的所述小鼠与介于8周龄和20周龄之间的对照野生型动物相比表现出体重增加减缓。
15.一种啮齿动物运动神经元，所述啮齿动物运动神经元在内源性DR6基因座中包含
(i)编码整个成熟DR6蛋白的核苷酸序列的缺失，和
(ii)包括功能性DR6信号肽编码序列的核酸序列，所述功能性DR6信号肽编码序列可操作地融合至ROR1跨膜结构域编码序列，所述ROR1跨膜结构域编码序列可操作地连接至编码报告基因蛋白的基因，
其中所述啮齿动物运动神经元表达所述功能性DR6信号肽，所述功能性DR6信号肽可操作地融合至ROR1跨膜结构域，所述ROR1跨膜结构域与所述报告基因蛋白可操作地连接，
其中，与野生型啮齿动物运动神经元的运动神经元相比，所述运动神经元表现出氧化应激反应增加，且
其中所述啮齿动物运动神经元是大鼠运动神经元或小鼠运动神经元。
16.一种产生经基因修饰的啮齿动物的方法，所述啮齿动物存在
(a)表现为一种或多种ALS样症状的运动神经元功能紊乱，
(b)脊髓中运动神经元的损失，
(c)相对于对照啮齿动物，伤害感受减弱，或者
(d)上述(a)、(b)、(c)的任意组合，
所述方法包括修饰所述啮齿动物的内源性DR6基因座的步骤，使所述内源性DR6基因座包含
(i)编码成熟DR6蛋白的内源性核苷酸序列的缺失，和
(ii)包含功能性DR6信号肽编码序列的核酸序列，所述功能性DR6信号肽编码序列可操作地融合至ROR1跨膜结构域编码序列，所述ROR1跨膜结构域编码序列可操作地连接至编码报告基因蛋白的基因，
其中所述啮齿动物为大鼠或小鼠。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述修饰的步骤包括用所述核酸序列替换编码全长和内源性成熟DR6蛋白的内源性核苷酸序列，使得所述核酸与内源性DR6转录调控和信号肽序列可操作地连接。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠，且其中经修饰的内源性DR6基因座(i)缺少编码SEQ ID NO:15第1-614位氨基酸的核酸序列，并且(ii)包含可操作地连接至内源性DR6转录调控序列的如SEQ ID NO:17所示的核酸序列。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠，所述小鼠来自选自129品系、C57BL/6品系和混合C57BL/6×129品系的小鼠品系，并且其中所述小鼠与介于8周龄和20周龄之间的对照野生型动物相比表现出体重增加减缓。
20.一种产生与对照运动神经元细胞相比表现出氧化应激反应增加的运动神经元群的方法，所述方法包括由内细胞团胚胎干细胞形成胚体，以及将所述胚体分化成所述运动神经元群；
所述内细胞团胚胎干细胞在内源性DR6基因座处包含(i)编码整个成熟DR6蛋白的核苷酸序列的缺失，和(ii)包含功能性DR6信号肽编码序列的核酸序列，所述功能性DR6信号肽编码序列可操作地融合至ROR1跨膜结构域编码序列，所述ROR1跨膜结构域编码序列可操作地连接至报告基因，其中啮齿动物内细胞团胚胎干细胞为大鼠啮齿动物内细胞团胚胎干细胞或小鼠啮齿动物内细胞团胚胎干细胞。
21.一种筛选候选试剂以用于调节运动神经元功能紊乱的方法，所述方法包括：
(a)向啮齿动物施用候选试剂，所述啮齿动物包含根据权利要求1至14中任一项所述的啮齿动物基因组，或者所述啮齿动物由根据权利要求16-19中任意一项所述的方法产生；以及
(b)确定相比于测试对照啮齿动物，所述候选试剂对所述啮齿动物的所述运动神经元功能紊乱的至少一种症状的任何调节作用；
其中相比于所述测试对照啮齿动物，存在对所述啮齿动物的所述运动神经元功能紊乱的所述至少一种症状的调节作用表示所述候选试剂能够用于调节运动神经元功能紊乱。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在通过盲法主观ALS-TDI神经系统评分、转杆测试、猫步测试、旷场测试、体重测量或确定对疼痛刺激作出反应的延迟时间来检测所述症状之前施用所述试剂。
23.根据权利要求21所述的方法，其中在通过盲法主观ALS-TDI神经系统评分、转杆测试、猫步测试、旷场测试、体重测量或确定对疼痛刺激作出反应的延迟时间中的一者或多者来检测所述症状之后施用所述试剂。
24.根据权利要求21所述的方法，其中在两个或更多个不同的时间点施用所述试剂。
25.根据权利要求21所述的方法，其中相比于品系与所述啮齿动物相同但在其基因组中不包含所述核酸的对照啮齿动物，所述至少一种症状选自驼背、异常后肢抱握、运动协调缺陷、运动学习能力缺陷、体重减轻以及感知缺陷。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种症状由上运动神经元功能紊乱引起。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述至少一种症状选自震颤、痉挛性麻痹、反射异常以及它们的组合。
28.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种症状由下运动神经元功能紊乱引起。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述至少一种症状选自肌无力和消瘦、肌束震颤以及它们的组合。
30.根据权利要求21所述的方法，其中运动神经元功能紊乱的所述至少一种症状为体重增加减缓。
31.根据权利要求21所述的方法，其中运动神经元功能紊乱的所述至少一种症状为伤害感受减弱。
32.根据权利要求21所述的方法，其中所述啮齿动物为包含经修饰的内源性DR6基因座的小鼠，所述经修饰的内源性DR6基因座
(i)缺少编码SEQ ID NO:15第1-614位氨基酸的核苷酸序列，并且
(ii)包含可操作地连接至内源性DR6转录调控序列的如SEQ ID NO:17所示的核酸序列。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述小鼠来自选自129品系、C57BL/6品系以及混合C57BL/6×129品系的品系。
34.一种用于筛选用于减少运动神经元中的氧化应激反应的候选试剂的方法，所述方法包括
(a)在存在或不存在试剂的情况下培养来源于啮齿动物的运动神经元，所述啮齿动物包含根据权利要求1-14中任一项所述的啮齿动物基因组、根据权利要求15所述的运动神经元，或者由根据权利要求20所述的方法产生的运动神经元；
(b)确定与来源于所述啮齿动物但在不存在所述试剂的情况下培养的对照运动神经元相比，所述试剂是否预防、抑制和/或减少所述运动神经元中的氧化应激反应；其中所述运动神经元中的氧化应激反应的所述预防、抑制和/或减少表明候选试剂用于减少运动神经元中的氧化应激反应。
35.一种核酸，所述核酸包含可操作地连接并从5'至3'的编码DR6信号肽的第一核酸序列、编码ROR1跨膜结构域的第二核酸序列、编码报告基因的第三核酸序列和/或编码药物选择盒的第四核酸序列，
其中所述核酸序列缺失编码成熟DR6蛋白的任何序列。
36.根据权利要求35所述的核酸序列，其中所述第一核酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述第二核酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述第三核酸序列如SEQ ID NO:8所示和/或所述第四核酸序列如SEQ ID NO:3所示。
37.根据权利要求35所述的核酸，还包含第一靶向臂和第二靶向臂，其中所述第一靶向臂为所述第一核酸序列、所述第二核酸序列和/或所述第三核酸序列的5'并可操作地连接至所述第一核酸序列、所述第二核酸序列和/或所述第三核酸序列，其中所述第二靶向臂为所述第一核酸序列、所述第二核酸序列和/或所述第三核酸序列的3'并可操作地连接至所述第一核酸序列、所述第二核酸序列和/或所述第三核酸序列，并且其中所述第一靶向臂和所述第二靶向臂用于靶向用于插入内源性非人动物DR6基因座的所述核酸，所述内源性非人动物DR6基因座可操作地连接至至少一个内源性非人动物调控元件。
38.根据权利要求37所述的核酸，其中所述非人动物为啮齿动物。
39.根据权利要求38所述的核酸，其中所述啮齿动物为小鼠。
40.根据权利要求39所述的核酸，其中所述核酸包括如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:17所示的序列。
41.一种啮齿动物细胞，所述啮齿动物细胞包含根据权利要求35至40中任一项所述的核酸，其中所述啮齿动物细胞并非胚胎干细胞。
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