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CN107674868A - 一种从猪血中提取凝血酶的方法 - Google Patents

一种从猪血中提取凝血酶的方法 Download PDF

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CN107674868A CN201711147689.0A CN201711147689A CN107674868A CN 107674868 A CN107674868 A CN 107674868A CN 201711147689 A CN201711147689 A CN 201711147689A CN 107674868 A CN107674868 A CN 107674868A
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fibrin ferment
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Abstract

本发明公开了一种从猪血中提取凝血酶的方法，涉及凝血酶生产技术领域，包括如下几个步骤：对猪血进行离心收集上清抗凝血浆，利用DEAE sepharose A‑50吸附上清抗凝血浆中的凝血酶原，氯化钠溶液Ⅰ对凝血酶原进行洗涤后，用氯化钠‑氯化钙混合溶液洗脱并激活凝血酶原，得到的流出液即为凝血酶粗提液，再用724离子交换树脂纯化，收集凝血酶活性峰处的凝血酶精提液，对凝血酶精提液去除病毒后脱盐浓缩，最后冻干得到凝血酶成品，本发明加快了凝血酶原的活化效率，简化了制备工艺。

Description

一种从猪血中提取凝血酶的方法
技术领域
本发明涉及凝血酶生产技术领域，特别涉及一种从猪血中提取凝血酶的方法。
背景技术
凝血酶是机体凝血系统中的天然组分，由前体凝血酶原经凝血酶原激活物激活而成。凝血酶由两条肽链组成，肽链件以二硫键相连，是一种具有高特异性的丝氨酸蛋白酶。凝血酶能水解纤维蛋白原上的4个Arg-Gly肽键，使纤维蛋白原变成不溶性的纤维蛋白，从而使血液凝固。目前国内外主要从动物血浆和人血浆中制备，国内的养猪业规模大，区域广，猪血资源较为丰富，并且凝血酶在临床上应用广泛，从猪血中提取凝血酶，不仅有效利用了猪血资源，也解决因猪血废弃造成的环污染问题。
申请公布号为CN105624134A的中国发明专利公开了一种限制性凝血酶的制备方法，利用阴离子交换层析介质从猪血浆中吸附凝血酶原，对阴离子层析柱进行洗脱，活化凝血酶原，得凝血酶粗溶液，经超滤浓缩，得凝血酶浓缩液，再用阳离子交换层析介质吸附凝血酶，对阳离子层析柱进行洗脱，得凝血酶溶液，经超滤脱盐浓缩，最后冻干得限制性凝血酶成品。
上述制备方法在实际操作过程中，使用柠檬酸三钠作为猪血中提取凝血酶的洗脱剂，而柠檬酸三钠可与钙离子螯合，形成难以解离的可溶性柠檬酸盐复合物，使得钙离子减少，阻止凝血酶原转化成凝血酶，进而在后期需补充足量的钙离子，而后期加入的钙离子通常先与柠檬酸三钠螯合，待柠檬酸三钠被完全螯合后剩余的钙离子再促进凝血酶原转化成凝血酶，进而降低了凝血酶原被激活的效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种从猪血中提取凝血酶的方法，使得凝血酶原的洗脱和激活同步进行，加快了凝血酶原被激活的效率。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种从猪血中提取凝血酶的方法，包括如下步骤：
(1)往猪血中加入柠檬酸三钠溶液，将混合液离心至分层后收集上清液，上清液用双层脱脂纱布过滤后得上清抗凝血浆；
(2)将步骤(1)所得的上清抗凝血浆用A-50层析柱进行层析，上清抗凝血浆中的凝血酶原被吸附于A-50层析柱上，用氯化钠溶液Ⅰ洗涤A-50层析柱，随后用氯化钠-氯化钙混合溶液洗脱并激活吸附于A-50层析柱上的凝血酶，得到凝血酶粗提液；
(3)将步骤(2)所得的凝血酶粗提液用树脂层析柱进行层析，凝血酶粗提液中的凝血酶被吸附于树脂层析柱上，用氯化钠溶液Ⅱ洗脱吸附于树脂层析柱上的凝血酶，得到凝血酶精提液；
(4)将步骤(3)所得的凝血酶精提液去除病毒后进行脱盐浓缩，得凝血酶浓缩液；
(5)将步骤(4)所得的凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状凝血酶成品。
采用上述方案，猪血中加入柠檬酸三钠溶液阻止血液的凝结，猪血在离心后使得血细胞和血浆分层，通过双层脱脂纱布便于上清抗凝血清的收集，A-50层析柱对上清抗凝血浆中的凝血酶原进行吸附，氯化钠溶液Ⅰ将残留于A-50层析柱上的其他成分的血浆进行清洗，同时洗去残余的柠檬酸三钠溶液；氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠作为离子增强剂，促使被吸附于A-50层析柱中的凝血酶原进行洗脱，氯化钙作为活化剂，在凝血酶原洗脱的同时进行活化，以实现洗脱和活化的同步进行，直接得到凝血酶粗提液；随后凝血酶粗提液利用A-50层析柱进行提纯，得到高纯度的凝血酶精提液，并对其去病毒、脱盐浓缩以及冻干，以此阻止柠檬酸三钠对凝血酶原激活的影响，加快了凝血酶原被激活的效率，简化了凝血酶制备的工艺，同时增加了凝血酶的存储时间。
进一步优选为：
步骤(1)中加入猪血中的柠檬酸三钠溶液的用量为每1L猪血加入7.0-8.0mL的柠檬酸三钠溶液；
步骤(2)中洗涤A-50层析柱的氯化钠溶液Ⅰ的浓度为0.1-0.3M/L；
步骤(2)中洗脱并激活凝血酶原的氯化钠-氯化钙混合溶液的氯化钠的浓度为1.5-2.5M/L，氯化钙的浓度为1.0-2.0M/L；
步骤(3)中洗脱凝血酶的氯化钠溶液Ⅱ的浓度为2.0-3.0g/L。
采用上述方案，经研究(试验)发现，所使用的试剂在上述参数范围内所制得的凝血酶具有较高的效价和蛋白浓度，便于应用于实际生产过程中。
进一步优选为：
步骤(1)中加入猪血中的柠檬酸三钠溶液的用量为每1L猪血加入7.5mL的柠檬酸三钠溶液；步骤(2)中洗涤A-50层析柱的氯化钠溶液Ⅰ的浓度为0.2M/L；
步骤(2)中洗脱并激活凝血酶原的氯化钠-氯化钙混合溶液的氯化钠的浓度为2.0M/L，氯化钙的浓度为1.5M/L；
步骤(3)中洗脱凝血酶的氯化钠溶液Ⅱ的浓度为2.5g/L。
采用上述方案，经研究(试验)发现，所使用的试剂用上述参数所制得的凝血酶的效价和蛋白浓度最高。
进一步优选为：步骤(2)中的洗涤过程进行两次，每次洗涤时氯化钠溶液Ⅰ的用量为每1L上清抗凝血浆加入24-26mL的氯化钠溶液Ⅰ。
采用上述方案，经研究(试验)发现，分批次对上柱的凝血酶原进行清洗，且每1L上清抗凝血浆加入24-26mL的氯化钠溶液Ⅰ时，氯化钠溶液Ⅰ对凝血酶原的清洗效果较好，便于提高的凝血酶的蛋白浓度。
进一步优选为：步骤(2)中的洗涤的过程分两次进行，每次洗涤时氯化钠溶液Ⅰ的用量为每1L上清抗凝血浆加入25mL的氯化钠溶液Ⅰ。
采用上述方案，经研究(试验)发现，分批次对上柱的凝血酶原进行清洗，且每1L上清抗凝血浆加入25mL的氯化钠溶液Ⅰ时，氯化钠溶液Ⅰ对凝血酶原的清洗效果最佳，便于提高的凝血酶的蛋白浓度。
进一步优选为：步骤(2)中洗脱并激活凝血酶原的氯化钠-氯化钙混合溶液的用量为每100mL上清抗凝血浆加入18mL-20mL的氯化钠-氯化钙混合溶液。
采用上述方案，经研究(试验)发现，每100mL上清抗凝血浆中加入18mL-20mL的氯化钠-氯化钙混合溶液时，凝血酶的蛋白浓度较高。
进一步优选为：步骤(2)中洗脱并激活凝血酶原的氯化钠-氯化钙混合溶液的用量为每100mL上清抗凝血浆加入19mL的氯化钠-氯化钙混合溶液。
采用上述方案，经研究(试验)发现，每100mL上清抗凝血浆加入19mL的氯化钠-氯化钙混合溶液时，凝血酶的蛋白浓度最高。
进一步优选为：步骤(2)中的洗脱并激活的操作分两次进行，每次洗脱并激活的操作得到相应的流出液，两次流出液的总和为凝血酶粗提液。
采用上述方案，从多次制备凝血酶得到的数据可知，分批次进行洗脱和激活凝血酶原时，凝血酶的蛋白浓度最高。
进一步优选为：步骤(4)中的凝血酶精提液用孔径为20nm的滤膜去除病毒。
采用上述方案，用孔径为20nm的滤膜去除病毒，相对于巴氏病毒灭活工艺，减少了对凝血酶的活性损失。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、通过将洗脱和活化同步进行，减少了制备凝血酶的工艺步骤，避免凝血酶原在活化时抗凝剂对钙离子的抢夺，缩短了工艺的周期，同时提高了凝血酶的收率；
2、氯化钠作为离子增强剂，具有良好的洗脱作用，不产生毒性，降低了生产成本；
3、用孔径为20nm的滤膜去除病毒，减少了凝血酶的活性损失，增加了凝血酶的比活。
具体实施方式
预处理：
1、柠檬酸三钠溶液的配制：
称取38g柠檬酸三钠颗粒，将其溶于蒸馏水中，使得其浓度为38g/L，用1M/L的HCl溶液或1M/L的NaOH溶液调节其pH至7.0-7.4；
2、DEAE Sepharose A-50(简称A-50)的平衡：
将A-50悬浮于蒸馏水中，至溶液界面稳定，1h后倾去上清液以及浮于上清液中的A-50，将剩余的A-50浸泡于0.5mol/L的NaOH溶液中，搅拌后静置30min，用蒸馏水清洗A-50，至从A-50流出的流出液的pH为7，再用0.1mol/L的NaH2PO4溶液同上操作过程处理；最后用0.01mol/L、pH＝6.5的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(PB)平衡，使得从A-50流出的流出液的pH达到稳定值，减压抽干，保存备用；
3、724离子交换树脂(简称树脂)的平衡：
先用蒸馏水浸洗树脂5-6次，浸洗中可轻轻搅动(切勿剧烈搅动，以防树脂被破坏)；浸洗完毕的树脂用5％的HCl溶液(本次HCl溶液的用量为树脂体积的两倍)浸泡10min，用蒸馏水冲洗树脂，至从树脂流出的流出液的pH为6；随后用5％NaOH溶液(用量为树脂体积的两倍)浸泡树脂10min，用蒸馏水冲洗树脂，至从树脂流出的流出液的pH为9；再用5％的HCl溶液(本次HCl溶液的用量为树脂体积的三倍)浸泡树脂1h以上，待树脂转化为H型后用蒸馏水冲洗，至从树脂中流出的流出液的pH为7，装柱备用。
实施例1：
1、上清抗凝血浆的收集
1.1、用洁净的玻璃容器采集离体时间小于30min的新鲜猪血，往猪血中加入配制好的38g/L柠檬酸三钠溶液，每1L猪血加入6.5mL的柠檬酸三钠溶液，搅拌30min，置于4℃环境下冷藏至恒温，得猪血处理液；
1.2、调节离心机的参数为4℃、4020rpm，将猪血处理液置于离心机中离心至分层，收集上清液；
1.3、将上清液用双层脱脂纱布过滤，收集得上清抗凝血浆。
2、凝血酶粗提液的收集
2.1、将收集的上清抗凝血浆上样至事先平衡好的A-50层析柱中，上清抗凝血浆中的凝血酶原被吸附于A-50层析柱上；
2.2、将附着于A-50层析柱上的凝血酶原用浓度为0.2M/L的氯化钠溶液Ⅰ洗涤两次，每次洗涤时氯化钠溶液Ⅰ的用量为每1L上清抗凝血浆加入25mL的氯化钠溶液Ⅰ；
2.3、用氯化钠-氯化钙混合溶液分两次洗脱并激活A-50层析柱上的凝血酶原，每次洗脱并激活的操作得到相应的流出液，收集两次流出液得到凝血酶粗提液，其中氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠的浓度为2.0M/L，氯化钙的浓度为1.5M/L，且氯化钠-氯化钙混合溶液两次的总用量为每100mL上清抗凝血浆加入19mL的氯化钠-氯化钙混合溶液。
3、凝血酶精提液的收集
3.1、将凝血酶粗提液注入事先平衡好的树脂层析中，凝血酶粗提液中的凝血酶被吸附于树脂层析柱上；
3.2、用浓度为2.5g/L的氯化钠溶液Ⅱ洗脱树脂，同时利用高效液相色谱仪获取色谱图，收集达到凝血酶活性峰时从树脂中流出的流出液，即为凝血酶精提液。
4、凝血酶浓缩的制备
4.1、将凝血酶精提液用孔径为20nm的滤膜进行过滤，去除病毒；
4.2、随后用10kD孔径的超滤膜进行脱盐浓缩，并添加甘氨酸作保护剂，得凝血酶浓缩液。
5、凝血酶冷冻干燥
5.1、将凝血酶浓缩液进行分装，并常温入柜；
5.2、将隔板温度控制在40min内降至-40℃，保持3h；
5.3、开启真空泵，真空度控制在7-15Pa；
5.4、2h后将隔板升温至-30℃，保持3h；
5.5、4h后将隔板升温至-20℃，保持6h；
5.6、8h后将隔板升温至0℃，保持20h；
5.7、10h后将隔板升温至30℃，保持6h；
5.8、真空度控制在5Pa以下保持1h；
5.9、真空压塞出柜，得凝血酶成品。
实施例2：与实施例1的不同之处在于：每1L猪血加入7.0mL的柠檬酸三钠溶液。
实施例3：与实施例1的不同之处在于：每1L猪血加入7.5mL的柠檬酸三钠溶液。
实施例4：与实施例1的不同之处在于：每1L猪血加入8.0mL的柠檬酸三钠溶液。
实施例5：与实施例1的不同之处在于：每1L猪血加入8.5mL的柠檬酸三钠溶液。
实施例6：与实施例3的不同之处在于：氯化钠溶液Ⅰ浓度为0.05M/L。
实施例7：与实施例3的不同之处在于：氯化钠溶液Ⅰ浓度为0.1M/L。
实施例8：与实施例3的不同之处在于：氯化钠溶液Ⅰ浓度为0.3M/L。
实施例9：与实施例3的不同之处在于：氯化钠溶液Ⅰ浓度为0.4M/L。
实施例10：与实施例3的不同之处在于：每1L上清抗凝血浆加入23mL的氯化钠溶液Ⅰ。
实施例11：与实施例3的不同之处在于：每1L上清抗凝血浆加入24mL的氯化钠溶液Ⅰ。
实施例12：与实施例3的不同之处在于：每1L上清抗凝血浆加入26mL的氯化钠溶液Ⅰ。
实施例13：与实施例3的不同之处在于：每1L上清抗凝血浆加入27mL的氯化钠溶液Ⅰ。
实施例14：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为1.0M/L，氯化钙的浓度为0.5M/L。
实施例15：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为1.0M/L，氯化钙的浓度为1.0M/L。
实施例16：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为1.0M/L，氯化钙的浓度为1.5M/L。
实施例17：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为1.0M/L，氯化钙的浓度为2.0M/L。
实施例18：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为1.0M/L，氯化钙的浓度为2.5M/L。
实施例19：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为1.5M/L，氯化钙的浓度为0.5M/L。
实施例20：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为1.5M/L，氯化钙的浓度为1.0M/L。
实施例21：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为1.5M/L，氯化钙的浓度为1.5M/L。
实施例22：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为1.5M/L，氯化钙的浓度为2.0M/L。
实施例23：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为1.5M/L，氯化钙的浓度为2.5M/L。
实施例24：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为2.0M/L，氯化钙的浓度为0.5M/L。
实施例25：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为2.0M/L，氯化钙的浓度为1.0M/L。
实施例26：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为2.0M/L，氯化钙的浓度为2.0M/L。
实施例27：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为2.0M/L，氯化钙的浓度为2.5M/L。
实施例28：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为2.5M/L，氯化钙的浓度为0.5M/L。
实施例29：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为2.5M/L，氯化钙的浓度为1.0M/L。
实施例30：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为2.5M/L，氯化钙的浓度为1.5M/L。
实施例31：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为2.5M/L，氯化钙的浓度为2.0M/L。
实施例32：与实施例3的不同之处在于：氯化钠-氯化钙混合溶液中的氯化钠浓度为2.5M/L，氯化钙的浓度为2.5M/L。
实施例33：与实施例3的不同之处在于：每100mL上清抗凝血浆加入17mL的氯化钠-氯化钙混合溶液。
实施例34：与实施例3的不同之处在于：每100mL上清抗凝血浆加入18mL的氯化钠-氯化钙混合溶液。
实施例35：与实施例3的不同之处在于：每100mL上清抗凝血浆加入20mL的氯化钠-氯化钙混合溶液。
实施例36：与实施例3的不同之处在于：每100mL上清抗凝血浆加入21mL的氯化钠-氯化钙混合溶液。
实施例37：与实施例3的不同之处在于：氯化钠溶液Ⅱ浓度为1.5g/L。
实施例38：与实施例3的不同之处在于：氯化钠溶液Ⅱ浓度为2.0g/L。
实施例39：与实施例3的不同之处在于：氯化钠溶液Ⅱ浓度为3.0g/L。
实施例40：与实施例3的不同之处在于：氯化钠溶液Ⅱ浓度为3.5g/L。
将上述实施例中的凝血酶进行效价和蛋白浓度检测：
分别按照《中华人民共和国药典》2015版中的第二部第1561-1562页的有关凝血酶效价标准检测方法和第四部通则0731蛋白质含量测定法中的“第二法福林酚法(Lowry法)”。
测试结果见下表：
选实施例3为较优实施例，进行比较测试。
比较例1：实施例1、实施例2、实施例4和实施例5
相较于上述实施例3，本比较例1为上述实施例3改变柠檬酸三钠溶液用量情况下制备的凝血酶，比较得出柠檬酸三钠用量在7.0-8.0mL/L猪血时凝血酶的效价和蛋白浓度较高。
比较例2：实施例6、实施例7、实施例8和实施例9
相较于上述实施例3，本比较例2为上述实施例3改变氯化钠溶液Ⅰ浓度情况下制备的凝血酶，比较得出氯化钠溶液Ⅰ浓度在0.1-0.3M/L时凝血酶的效价和蛋白浓度较高。
比较例3：实施例10、实施例11、实施例12和实施例13
相较于上述实施例3，本比较例3为上述实施例3改变氯化钠溶液Ⅰ用量情况下制备的凝血酶，比较得出氯化钠溶液Ⅰ用量在24-26mL/L上清抗凝血清时凝血酶的效价和蛋白浓度较高。
比较例4：实施例14至实施例32
相较于上述实施例3，本比较例4为上述实施例3改变氯化钠-氯化钙混合溶液浓度情况下制备的凝血酶，比较得出使用1.5-2.5M/L氯化钠-1.0-2.0M/L氯化钙混合溶液时凝血酶的效价和蛋白浓度较高。
比较例5：实施例33、实施例34、实施例35和实施例36
相较于上述实施例3，本比较例5为上述实施例3改变氯化钠-氯化钙混合溶液的洗脱量情况下制备的凝血酶，比较得出氯化钠-氯化钙混合溶液的总用量为18-20mL/100mL上清抗凝血清时，凝血酶的效价和蛋白浓度较高。
比较例6：实施例37、实施例38、实施例39和实施例40
相较于上述实施例3，本比较例7为上述实施例3改变氯化钠溶液Ⅱ浓度情况下制备的凝血酶，比较得出氯化钠溶液Ⅱ浓度在2.0-3.0g/L时凝血酶的效价和蛋白浓度较高。
通过上述实验证明，通过柠檬酸三钠用量、氯化钠Ⅰ浓度、氯化钠溶液Ⅰ用量、氯化钠-氯化钙混合溶液浓度、氯化钠-氯化钙混合溶液的洗脱量以及氯化钠溶液Ⅱ浓度均能影响凝血酶的效价和蛋白浓度。其中，使用7.5mL/L猪血的柠檬酸三钠，浓度为0.2M/L、用量为25mL/L上清抗凝血清的氯化钠溶液Ⅰ、浓度为2.0M/L-1.5M/、总用量为19mL/100mL上清抗凝血浆的氯化钠-氯化钙混合溶液以及浓度为2.5g/L的氯化钠溶液Ⅱ时，蛋白质的效价和蛋白浓度较高。
通过该法制备的凝血酶，在保证凝血酶效价和蛋白浓度的情况下，提高了凝血酶原的活化效率，简化了制备工艺。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的保护范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）往猪血中加入柠檬酸三钠溶液，将混合液离心至分层后收集上清液，上清液用双层脱脂纱布过滤后得上清抗凝血浆；
（2）将步骤（1）所得的上清抗凝血浆用DEAE sepharose A-50层析柱（简称为A-50层析柱）进行层析，上清抗凝血浆中的凝血酶原被吸附于A-50层析柱上，用氯化钠溶液Ⅰ洗涤A-50层析柱，随后用氯化钠-氯化钙混合溶液洗脱并激活吸附于A-50层析柱上的凝血酶原，得到凝血酶粗提液；
（3）将步骤（2）所得的凝血酶粗提液用724离子交换树脂层析柱（简称为树脂层析柱）进行层析，凝血酶粗提液中的凝血酶被吸附于树脂层析柱上，用氯化钠溶液Ⅱ洗脱吸附于树脂层析柱上的凝血酶，得到凝血酶精提液；
（4）将步骤（3）所得的凝血酶精提液去除病毒后进行脱盐浓缩，得凝血酶浓缩液；
（5）将步骤（4）所得的凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状凝血酶成品。
2.根据权利要求1所述的一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于：
步骤（1）中加入猪血中的柠檬酸三钠溶液的用量为每1L猪血加入7.0-8.0mL的柠檬酸三钠溶液；
步骤（2）中洗涤A-50层析柱的氯化钠溶液Ⅰ的浓度为0.1-0.3M/L；
步骤（2）中洗脱并激活凝血酶原的氯化钠-氯化钙混合溶液的氯化钠的浓度为1.5-2.5M/L，氯化钙的浓度为1.0-2.0M/L；
步骤（3）中洗脱凝血酶的氯化钠溶液Ⅱ的浓度为2.0-3.0g/L。
3.根据权利要求2所述的一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于：
步骤（1）中加入猪血中的柠檬酸三钠溶液的用量为每1L猪血加入7.5mL的柠檬酸三钠溶液；
步骤（2）中洗涤A-50层析柱的氯化钠溶液Ⅰ的浓度为0.2M/L；
步骤（2）中洗脱并激活凝血酶原的氯化钠-氯化钙混合溶液的氯化钠的浓度为2.0M/L，氯化钙的浓度为1.5M/L；
步骤（3）中洗脱凝血酶的氯化钠溶液Ⅱ的浓度为2.5g/L。
4.根据权利要求2或3所述的一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于：步骤（2）中的洗涤过程进行两次，每次洗涤时氯化钠溶液Ⅰ的用量为每1L上清抗凝血浆加入24-26mL的氯化钠溶液Ⅰ。
5.根据权利要求4所述的一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于：步骤（2）中的洗涤的过程分两次进行，每次洗涤时氯化钠溶液Ⅰ的用量为每1L上清抗凝血浆加入25mL的氯化钠溶液Ⅰ。
6.根据权利要求2或3所述的一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于：步骤（2）中洗脱并激活凝血酶原的氯化钠-氯化钙混合溶液的用量为每100mL上清抗凝血浆加入18mL-20mL的氯化钠-氯化钙混合溶液。
7.根据权利要求6所述的一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于：步骤（2）中洗脱并激活凝血酶原的氯化钠-氯化钙混合溶液的用量为每100mL上清抗凝血浆加入19mL的氯化钠-氯化钙混合溶液。
8.根据权利要求2或3所述的一种凝血酶制备方法，其特征在于：步骤（2）中的洗脱并激活的操作分两次进行，每次洗脱并激活的操作得到相应的流出液，两次流出液的总和为凝血酶粗提液。
9.根据权利要求2或3所述的一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于：步骤（4）中的凝血酶精提液用孔径为20nm的滤膜去除病毒。
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