CN104774827A - 一种以鲍鱼内脏为原料制备褐藻胶裂解酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种以鲍鱼内脏为原料制备褐藻胶裂解酶的方法。包括如下步骤：粗酶提取；活性炭处理：所述粗酶液经过活性炭处理后过滤除去活性炭，所得为滤液；阴离子交换柱层析；膜处理；酶制剂制备：将所述浓缩液经喷雾干燥或冷冻干燥，得到高纯度、高活力的褐藻胶裂解酶制品；本发明采用活性炭脱色脱腥，离子交换柱层析除杂蛋白，膜浓缩及冷冻、喷雾干燥等技术从鲍鱼内脏中获得了纯度高、活力好的褐藻胶裂解酶，该工艺经放大后可应用于工业化生产，工艺简单、分离效果好。同时节约了生产成本，能够进行技术规模放大，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及海洋产品加工领域，更具体涉及一种褐藻胶裂解酶的制备方法。
背景技术
褐藻胶裂解酶是一类能够水解褐藻胶，形成褐藻胶寡糖的酶类。褐藻胶寡糖由于具有特殊的化学特性和生物活性，近年来成为一种潜在的功能产品不断受到关注。而能够实现褐藻胶转变为褐藻胶寡糖的酶-褐藻胶裂解酶也成为目前研究的热点。褐藻胶是由α-L-古罗糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸组成的线性多糖。按聚合形式可以分为多聚古罗糖醛酸（PG）、多聚甘露糖醛酸（PM）和不规则杂合片段PMG。依据褐藻胶裂解酶在褐藻胶中的断裂方式不同分为PG裂解酶、PM裂解酶和PMG裂解酶。褐藻胶裂解酶主要存在于海洋真菌和以海洋藻类为食的海洋动物体内。对于其理论及应用在国内外研究甚少。目前主要的研究热点在于确定褐藻胶裂解酶酶解产物褐藻胶寡糖的功能活性。其主要功能活性主要有：促进植物细胞的分裂，进而促进植物的生长；促进人体内皮细胞和角化细胞的生长，具有保水特性，作为美容产品进行开发；调节免疫功能，增强免疫力，抗菌抗病毒等功效。
据中国渔业年鉴统计数据，2012年我国鲍鱼产量为9.1万吨，较2011年增长18.11%，并呈现逐年增加的趋势。鲍鱼以海藻类为食，其消化道内含有丰富的多糖水解酶类，如：纤维素酶、褐藻胶裂解酶、琼胶酶等。鲍鱼加工过程中，产生的大量加工下脚料-内脏，常被弃除或制备成鱼粉等低值产品，不仅带来严重的环境污染，而且造成资源的浪费。因此，以鲍鱼加工副产物内脏为原料高效制备褐藻胶裂解酶，可有效提高鲍鱼加工的附加值，降低因将内脏直接废弃而造成的环境污染。
目前为止文献报道的关于褐藻胶裂解酶的分离纯化主要采用硫酸铵分级沉淀以及多步柱层析相结合的方法，分离纯化过程繁琐，操作复杂、耗时长、得率低、成本高，难于实现工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单、分离效果好，能够实现工业化生产的鲍鱼内脏褐藻胶裂解酶的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供一种以鲍鱼内脏为原料制备褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）粗酶提取：将鲍鱼内脏切碎，加入Tris-HCl缓冲液，组织捣碎，离心，上清液即为粗酶液；
2）活性炭处理：所述粗酶液经过活性炭处理后过滤除去活性炭，所得为滤液；
3）阴离子交换柱层析：将所得滤液经DEAE-Sepharose、DEAE-Sephacel或Q-Sepharose阴离子交换树脂，吸附后的树脂经阶段淋洗解吸，得到较高纯度的褐藻胶裂解酶；
4）膜处理1：将有褐藻胶裂解酶活性部分淋洗液用100-50 kDa 分子量截留的超滤膜超滤除杂，得到高纯度的褐藻胶裂解酶；
5）将上述超滤外液部分用10-3 kDa 分子量截留的超滤膜超滤浓缩；
6）酶制剂制备：将所述浓缩液经喷雾干燥或冷冻干燥，得到高纯度、高活力的褐藻胶裂解酶制品；
任选的，所述喷雾干燥前在所述浓缩液中加入海藻糖或β-环糊精。
所述步骤1）中，加入4倍体积20 mmol/L pH 8.5 的Tris-HCl缓冲液；所述离心为12000×g离心20 min。
所述步骤2）中，所述活性炭加入量为（W/V）0.5-3 %（指的是活性炭（w）占粗酶液（v）的比例），处理方式为4℃搅拌处理30-60 min。
所述步骤3）中，所述阶段淋洗解吸为吸附后的树脂经0.05、0.1、0.2 、0.3 mol/L NaCl盐浓度阶段洗脱。
所述步骤5）中，所述海藻糖或β-环糊精的加入量为10-30重量体积%。
本发明通过活性炭吸附去除大量的色素，同时达到脱腥脱色的效果；利用阴离子交换柱层析能将褐藻胶裂解酶有效吸附，通过改变盐浓度阶段淋洗方式，将褐藻胶裂解酶和杂蛋白(如：细胞骨架蛋白、纤维素酶、组织蛋白酶等含量较高的蛋白) 得到很好的分离。本发明在离子交换柱层析之后，采用超滤膜对褐藻胶裂解酶进行超滤除杂、浓缩，既实现了褐藻胶裂解酶的纯化，又能够将样品浓缩到较小体积，方便了后续喷雾干燥或冷冻干燥过程，节约了能源。喷雾干燥过程中，在酶液中添加海藻糖或β-环糊精等保护剂，保护了酶的活性。
综上所述，本发明采用活性炭脱色脱腥，离子交换柱层析除杂蛋白，膜过滤除杂、喷雾干燥等技术从鲍鱼内脏中获得了纯度高、活力好的褐藻胶裂解酶，该工艺经放大后可应用于工业化生产。
本发明通过活性炭吸附，去除了部分的色素蛋白、多糖；进而采用离子交换柱层析，运用阶段洗脱方式去除大量的杂蛋白，简化了纯化工艺，获得了高纯度的褐藻胶裂解酶。本发明避免了现有技术中采用的硫酸铵盐析、多步柱层析结合的方法，简化了工艺流程，节约了生产成本，能够进行技术规模放大，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明纯化褐藻胶裂解酶的SDS-PAGE电泳图。
图2 为所制备得到的肽质量指纹图谱获得的序列与其他物种褐藻胶裂解酶序列比对图。
图3为将制备的褐藻胶裂解酶对褐藻胶的分解效果及粘度变化图。
图4为将制备的褐藻胶裂解酶对褐藻胶的分解粘度变化图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：褐藻胶裂解酶的制备
1. 粗酶提取：取150 g鲍鱼内脏，切碎，加入600 mL体积20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)，组织捣碎，12000×g离心20 min，取上清，得到650 mL粗酶液；
2. 活性炭处理：向650 mL粗酶液中加入3.25 g活性炭，在4 ℃下搅拌吸附 30 min。吸附后用滤纸片进行抽滤，得630 mL滤液；
3. 阴离子交换柱层析：上述经活性炭吸附后的滤液上样于用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5) 平衡好的DEAE-Sepharose阴离子交换柱（2.5×10 cm），流速1.0 mL/min。上样完成后用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)充分流洗至流出液在280 nm处的吸光度值到基线。然后用含0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L NaCl 的20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)缓冲液分别进行阶段淋洗，收集0.1 mol/L NaCl淋洗液（5 mL/管）得到较高纯度的褐藻胶裂解酶，共400 mL；
4. 膜处理1：将得到的含有高纯度的褐藻胶裂解酶洗脱液用50 kDa 超滤膜超滤，得到360 mL超滤外液；
5. 膜处理2：将上述超滤杯外液用3 kDa超滤膜浓缩，得浓缩液50 mL；
6. 酶制剂制备：将50 mL浓缩液进行冷冻干燥，得到酶制剂。
实施例2：褐藻胶裂解酶的制备
1. 粗酶提取：取600 g鲍鱼内脏，切碎，加入2.4 L 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)，组织捣碎，12000×g离心20 min，取上清，得到2.5 L粗酶液；
2. 活性炭处理：向2.5 L粗酶液中加入75 g活性炭，在4 ℃下搅拌吸附45 min。吸附后用滤纸片进行抽滤，得2.4 L滤液；
3. 阴离子交换柱层析：经上述经活性炭吸附后的滤液上样于用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5) 平衡好的DEAE-Sephacel阴离子交换柱（5×15 cm），流速4.0 mL/min。上样完成后用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5) 充分流洗至流出液在280 nm处的吸光度值到基线。然后用含0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)缓冲液分别进行阶段淋洗，收集0.1 mol/L NaCl淋洗液（30 mL/管）得到较高纯度的褐藻胶裂解酶，共 2.2 L；
4. 膜处理1：将得到的含有高纯度的纤维素酶洗脱液用50 kDa 超滤膜超滤，得到2.0 L超滤外液；
5. 膜处理2：将上述超滤杯外液用10 kDa超滤膜浓缩，得浓缩液300 mL；
6. 酶制剂制备：在浓缩液中加入30g β-环糊精进行喷雾干燥，得到酶制剂。
实施例3：褐藻胶裂解酶的制备
1. 酶液提取：取3 kg鲍鱼内脏，切碎，加入12 L 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)，组织捣碎，12000×g离心20 min，取上清，得到12.6 L粗酶液；
2. 活性炭吸附：向12.6 L粗酶液中加入300 g活性炭，在4 ℃下搅拌吸附 60 min。吸附后用滤布过滤，得12.4 L滤液；
3. 阴离子柱层析：经上述经活性炭吸附后的滤液上样于用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5) 平衡好的Q-Sepharose 阴离子交换柱（5×30 cm），流速20.0 mL/min。上样完成后用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5) 充分流洗至流出液在280 nm处的吸光度值到基线。然后用含0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L NaCl 的20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)缓冲液进行阶段淋洗，收集0.2 mol/L NaCl淋洗液得到高纯度的褐藻胶裂解酶，共 8.4 L；
4. 膜处理1：将得到的含有高纯度的褐藻胶裂解酶洗脱液用:100 kDa 超滤膜超滤，得到8.2 L超滤外液；
5. 膜处理2：将上述超滤杯外液用10 kDa超滤膜浓缩，得浓缩液1.6 L；
6. 酶制剂制备：在浓缩液中加入480 g海藻糖进行喷雾干燥，得到465 g酶制剂。
实施例4：褐藻胶裂解酶的验证试验
为了验证纯化的蛋白分子量，将实施例1-3所得的酶制剂与4×SDS上样缓冲液以1:3体积比例混匀后，然后上样于SDS-PAGE 胶。在恒流10 mA下电泳结束后，卸下玻璃板，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色脱色后，用凝胶成像仪拍照。结果见附图1，其中泳道M为蛋白分子量标准；泳道1为非还原状态褐藻胶裂解酶；泳道2为还原状态褐藻胶裂解酶（额外加入1% （V/V）β-巯基乙醇）。褐藻胶裂解酶在非还原状态下分子量为28 kDa，还原状态下为30 kDa左右。
为了验证实施例1-3所得纯化的蛋白为褐藻胶裂解酶，将实施例1所得纯化的蛋白电泳染色后切胶回收，通过胶内酶解抽提酶解片段，脱盐后进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析，得到肽指纹图谱，用Mascot 软件将得到肽指纹图谱数据在NCBInr数据库中进行肽段序列比对。比对结果见附图2，从图中可以看出该褐藻胶裂解酶与欧洲鲍螺Haliotis tuberculata和大鲍螺Haliotis gigantea同源性分别为92%，100%。表明制备的蛋白为一种褐藻胶裂解酶。
为了验证纯化的蛋白为褐藻胶裂解酶，将实施例1所得纯化的蛋白用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5) 缓冲液配制成含量为0.01 mg/mL 的蛋白溶液，取 1 mL 加入到 50 mL 用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)溶液配制的1% (W/V) 褐藻胶（上海国药集团化学试剂有限公司）, 运用DNS法测定产物还原糖含量，A540值越高，还原糖含量越高。结果见附图3，从图中看出随反应时间的延长，还原糖含量不断增加，证明制备的蛋白具有分解褐藻胶的能力，为一种褐藻胶裂解酶。同时，该酶能够有效地降解褐藻胶，降低其粘度，结果见附图4，从图4可以看出，随着时间延长，粘度降低。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (5)
1.一种以鲍鱼内脏为原料制备褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于包括如下步骤：
粗酶提取：将鲍鱼内脏切碎，加入Tris-HCl缓冲液，组织捣碎，离心，上清液即为粗酶液；
活性炭处理：所述粗酶液经过活性炭处理后过滤除去活性炭，所得为滤液；
阴离子交换柱层析：将所得滤液经DEAE-Sepharose或DEAE-Sephacel或Q-Sepharose阴离子交换树脂，吸附后的树脂经阶段淋洗解吸，得到较高纯度的褐藻胶裂解酶；
膜处理1：将有褐藻胶裂解酶活性部分淋洗液用100-50 kDa 分子量截留的超滤膜超滤取外液，得到纯化的褐藻胶裂解酶；
膜处理2：将上述超滤外液部分用10-3 kDa 分子量截留的超滤膜超滤浓缩，得到浓缩液；
酶制剂制备：将所述浓缩液经喷雾干燥或冷冻干燥，得到高活力的褐藻胶裂解酶制品；
任选的，所述喷雾干燥前在所述浓缩液中加入海藻糖或β-环糊精。
2.权利要求1所述褐藻胶裂解酶的制备方法，其特征在于，所述粗酶提取中，加入4倍体积20 mmol/L pH 8.5 的Tris-HCl缓冲液；所述离心为12000×g离心20 min。
3.权利要求1所述褐藻胶裂解酶的制备方法，其特征在于，所述活性炭处理中，所述活性炭加入量为0.5-3 重量体积%，处理方式为4℃搅拌处理30-60 min。
4.权利要求1所述褐藻胶裂解酶的制备方法，其特征在于，所述阴离子交换柱层析中，所述阶段淋洗解吸为吸附后的树脂经0.05、0.1、0.2 、0.3 mol/L NaCl盐浓度阶段洗脱。
5.权利要求1所述褐藻胶裂解酶的制备方法，其特征在于，所述酶制剂制备中，所述海藻糖或β-环糊精的加入量为10-30重量体积%。
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