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CN107636460A - 改善测定装置中液体样品流动的方法 - Google Patents

改善测定装置中液体样品流动的方法 Download PDF

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CN107636460A
CN107636460A CN201680028598.2A CN201680028598A CN107636460A CN 107636460 A CN107636460 A CN 107636460A CN 201680028598 A CN201680028598 A CN 201680028598A CN 107636460 A CN107636460 A CN 107636460A
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CN201680028598.2A
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丁忠
P.C.霍斯梅
E.斯卡里塞
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Ortho Clinical Diagnostics Inc
Original Assignee
Ortho Clinical Diagnostics Inc
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Abstract

本发明公开了改善测定装置中的液体样品的流动的方法，以及对液体样品执行测定以用于检测一种或多种感兴趣的分析物的方法。所述方法在样品添加之前使用试剂诸如洗涤试剂的添加来润湿样品的流体流动路径，从而与所述样品通过未被润湿的所述流体流动路径的流动相比，改善所述样品通过已被润湿的所述流体流动路径的流动。所述试剂润湿样品添加区和芯吸区之间的所述流体流动路径。

Description

改善测定装置中液体样品流动的方法
相关申请的交叉引用
根据35USC§119的相关部分的规定，本申请要求2015年5月19日提交的USSN 62/163,793的优先权，其全部内容以引用方式并入。
技术领域
本发明涉及诊断测定领域，并且具体地涉及待检测的分析物存在于生物样品或非生物样品中的侧向流测定。
背景技术
诊断测定广泛用于多种疾病的诊断、治疗和管理并且对多种疾病的诊断、治疗和管理十分重要。多年来已经开发出不同类型的诊断测定，以简化对诸如血液、血清、血浆、尿液、唾液、组织活检、粪便、痰、皮肤或咽拭子以及组织样品或处理过的组织样品之类的临床样品中的各种分析物的检测。很多情况下期望这些测定能给出快速且可靠的结果，同时易于使用并且制造成本低。可以理解，在一次同样的测定中很难满足所有这些要求。在实践中，许多测定受到其速度的限制。另一个重要参数为灵敏度。测定技术近期的进展已导致灵敏度越来越高的测试，这些测试能够检测痕量分析物并且能够在尽可能早的时间内检测到样品中的疾病指标。
一种常见类型的一次性测定装置包括用于接收液体样品的区或区域、也称为试剂区的缀合物区、以及也称为检测区的反应区。这些测定装置通常称为侧向流测试条。它们采用多孔材料，例如硝化纤维，从而限定能够支持毛细流动的流体流动路径。示例包括在美国专利5,559,041、5,714,389、5,120,643和6,228,660中示出的那些，这些专利均以引用方式全文并入本文。
样品添加区在很多情况下由更为多孔的材料组成，这种材料能够吸收样品，并且当需要进行血细胞分离时还能有效地捕集红血球。此类材料的示例为纤维材料，诸如纸材、羊毛状物(fleece)、凝胶或薄纸，包括例如纤维素、羊毛(wool)、玻璃纤维、石棉、合成纤维、聚合物或它们的混合物。
另一种类型的测定装置为具有突出部以引起毛细流动的无孔测定装置。此类测定装置的示例包括如在PCT国际专利公开WO 2003/103835、WO 2005/089082、WO 2005/118139和WO 2006/137785中所公开的开放侧向流装置，这些专利均以引用方式全文并入本文。
图1中示出了已知的无孔测定装置。测定装置1具有至少一个样品添加区2、试剂区3、至少一个检测区4和至少一个芯吸区5。这些区形成流动路径，样品从样品添加区，通过该流动路径，流到芯吸区。还包括的是：检测区4中的诸如抗体之类的捕集元件，其能够结合到分析物，任选沉积在装置上(诸如通过涂布)；以及带标记的缀合物材料，其也能够参与将使得能测定分析物的浓度的反应，在试剂区中沉积在装置上，其中带标记的缀合物材料携带用于在检测区中检测的标记。当样品流动通过试剂区时，缀合物材料被溶解，从而形成溶解的带标记的缀合物材料与样品的缀合物羽流，该羽流向下游流至检测区。当缀合物羽流流入检测区中时，缀合材料将诸如通过缀合材料与分析物的复合物(如在“夹心”测定中)或直接地(如在“竞争性”测定中)被捕集元件所捕集。未结合的溶解的缀合物材料将快速经过检测区进入至少一个芯吸区5中。图1中也示出了突出部或微柱7。
仪器诸如美国专利公开US20060289787A1和US 20070231883A1以及美国专利7,416,700和6,139,800所公开的仪器，能够在检测区检测结合的缀合材料，所有这些专利全文均以引用方式并入本文。常见的标记包括可由器械检测的荧光染料，该器械激发荧光染料并且并入了能够检测荧光染料的检测器。
如图1所示的这种典型测定装置的样品量一般来讲为大约200μl。这样的样品量需要医学专业人员诸如抽血师从静脉抽血。因此，越来越需要那些能够用更小的样品量发挥作用以能够适应可从所谓的“手指针刺”抽血得到的大约25μl或更小量级的血量的侧向流装置。这样少量的样品是用采血针刺破指尖后获取的一滴血的血量。家用血糖仪通常使用以这种方式获取的一滴血来提供血糖水平。这种较小的样品量将不需要由医学专业人员抽血，并且能够使提供用于分析的样品的患者更加舒适。
为了减少所需的样品量，减小侧向流测定装置的尺寸以适应较小的样品量。然而，已经发现，减少样品量并减小装置的尺寸会在检测区中提供不足的缀合物，因此仪器可读取的信号减少(在某些情况下信号减少多达5倍)且灵敏度较差。检测区中不足的缀合物被认为是由于样品量的减少和装置中样品的低效使用以及其它条件。减小尺寸的另一个缺点是检测区的宽度也将减小，再次使得可供仪器读取的信号减少。此外，已经发现较小的装置具有减少的流动时间和缀合物材料接触时间，导致样品中的分析物与缀合物材料之间的结合减少。
持续需要较小样品体积测定装置，这些测定装置可以适应越来越少的样品量，可以适应各种样品(诸如全血)，并且可以提供具有所需灵敏度和特异性的结果。
发明内容
本发明涉及这种测定装置在改善测定装置中液体样品的流动的方法中的用途。根据本主题发明的方法的优点是能够测定具有改善的流动特性的液体样品的能力。
可用于本主题发明的方法的测定装置包括：液体样品添加区；在样品添加区的下游并与样品添加区流体连通的试剂区，该试剂区含有试剂材料；与试剂区流体连通的检测区；以及与检测区流体连通的芯吸区，该芯吸区具有接收从检测区流出的液体样品的能力。在该装置中，样品添加区、试剂区、检测区和芯吸区限定流体流动路径。该装置还包括试剂添加区，该试剂添加区沿着在样品添加区的下游并在检测区的上游的流体流动路径并与该流体流动路径流体连通。根据本主题发明的方法，在该试剂添加区(在其最广义的概念上为流体添加区)添加试剂。
本发明提供了一种改善测定装置中液体样品的流动的方法。该方法包括：提供液体样品添加区；提供在样品添加区的下游并与样品添加区流体连通的试剂区，该试剂区含有试剂材料；提供与试剂区流体连通的检测区；以及提供与检测区流体连通的芯吸区，该芯吸区具有接收从检测区流出的液体样品的能力。样品添加区、试剂区、检测区和芯吸区限定流体流动路径。该方法还包括提供试剂添加区，该试剂添加区沿着在样品添加区的下游并在检测区的上游的流体流动路径并与该流体流动路径流体连通。该方法还包括将试剂添加到试剂添加区，其中该试剂朝着样品添加区向上游流动并朝着芯吸区向下游流动，从而润湿流体流动路径；以及将液体样品添加到样品添加区，其中样品移动通过已被试剂润湿的流体流动路径，并且其中与未使用试剂时样品通过流体流动路径的流动相比，样品通过已被试剂润湿的流体流动路径的流动得到改善。优选地，添加到试剂添加区中的试剂是洗涤试剂(洗涤流体)。此外，优选的液体样品是全血。
本发明的另一方面涉及一种对液体样品执行测定的方法，以检测一种或多种感兴趣的分析物。该方法包括：提供液体样品添加区；提供在样品添加区的下游并与样品添加区流体连通的试剂区，该试剂区含有试剂材料；提供与试剂区流体连通的检测区；提供与检测区流体连通的芯吸区，该芯吸区具有接收从检测区流出的液体样品的能力，其中样品添加区、试剂区、检测区和芯吸区限定流体流动路径；以及进一步提供沿着在样品添加区的下游并在检测区的上游的流体流动路径并与该流体流动路径流体连通的试剂添加区。该方法还包括将试剂添加到试剂添加区，其中该试剂朝着样品添加区向上游流动并朝着芯吸区向下游流动，从而润湿流体流动路径；以及将含有感兴趣的分析物的液体样品添加到样品添加区，其中样品移动通过已被试剂润湿的流体流动路径，并且其中与未使用试剂时样品通过流体流动路径的流动相比，样品通过已被试剂润湿的流体流动路径的流动得到改善。该方法还包括通过毛细作用使样品移动到试剂区中，在试剂区中，样品溶解试剂材料；通过毛细作用使样品从其中具有溶解的试剂材料的试剂区往外流动到检测区中，其中通过读取所产生的信号而在检测区中检测感兴趣的分析物；以及使样品和任何未结合的材料流动到芯吸区中。优选地，添加到试剂添加区中的试剂是洗涤试剂(洗涤流体)。此外，优选的液体样品是全血。
从以下对优选实施方案的详细考虑，本发明的另外目标、特征和优点对本领域的技术人员将是显而易见的。
附图说明
图1示出了已知的测定装置。
图2示出了根据本发明的一个实施方案的测定装置的示意图。
图3示出了根据本发明的另一个实施方案的测定装置的示意图。
图4示出了根据本发明的测定装置包装的分层结构的分解图。
图5示出了根据本发明的一个实施方案的测定装置上的全血(WB)的平均流动时间，各种表面活性剂沉积在样品添加区中。
图6示出了使用全血时在中断洗涤方案下得出的卡马西平的剂量响应曲线与使用血浆获得的结果的比较。
图7示出了使用全血时在中断洗涤方案下得出的苯巴比妥的剂量响应曲线与使用血浆获得的结果的比较。
图8示出了在根据本发明的一个实施方案的测定装置上进行沿行洗涤时在各种NTproBNP水平下全血的平均流动时间。
图9示出了每个测试样品的荧光响应的平均峰面积与NTproBNP浓度的关系图，以及在根据本发明的一个实施方案的测定装置上进行沿行洗涤时针对全血样品获得的剂量响应曲线与具有相似NTproBNP浓度的血清样品进行比较。
图10和图11示出了使用NTproBNP作为分析物的不同测定装置设计的灵敏度。
图12是使用全血样品和洗涤液时原降钙素浓度对平均峰面积的曲线图。
图13是使用全血样品时原降钙素浓度对平均峰面积的曲线图。
图14示出了在预润湿和不预润湿作为流体流动路径的通道的情况下的平均流动时间。
具体实施方式
如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文中另有明确说明。
在整个说明书和权利要求书中结合数值使用的术语“约”，是指为本领域的技术人员所熟悉和接受的精度区间。该区间优选为±10％。
术语“样品”在本文是指一定体积的液体、溶液或悬浮液，其旨在经受对其任何特性(诸如组分存在与否、组分浓度等)的定性或定量的测定。本发明上下文中的样品是液体样品，诸如人或动物的体液诸如血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、唾液、精液、羊水、胃液、眼泪等。其它类型的样品得自人或动物的组织样品，其中组织样品已处理成液体，以便揭示用于检查的特定组织组分。本发明的实施方案适用于所有此类液体样品，但是优选适用于全血的样品。
在其它情况中，样品可与食物测试、环境测试、生物威胁或生物危害测试等有关。这仅仅是可以在本发明中使用的液体样品的一小部分示例。
在本发明中，基于样品的侧向流以及存在于样品中的组分与试剂的相互作用来进行的定性或定量测定可以用于任何目的，诸如诊断目的，这些试剂存在于装置中或在这种相互作用的过程和检测期间添加到装置中。此类测试通常称为侧向流测定。
诊断测定的示例包括但不限于测定对于不同障碍(例如慢性代谢障碍，诸如血糖、血酮、尿糖(糖尿病)、血液胆固醇(动脉硬化症、肥胖症等))是特异性的分析物(也称为标记物)；测定其它特定疾病(例如急性疾病)的标记物，诸如冠状动脉梗死标记物(例如，肌钙蛋白-T、NT-proBNP)、甲状腺功能的标记物(例如，测定促甲状腺激素(TSH))、病毒感染的标记物(使用侧向流免疫测定来检测特异性病毒抗体)；等等。
另一重要领域是将治疗剂诸如药物施用给需要这种药物的个体的伴随诊断领域。然后进行适当的测定来测定适当标记物的水平，从而确定药物是否具有其所需的效果。或者，可在施用治疗剂前使用本发明的测定装置，以确定药剂是否对有需要的个体有帮助。
还有一个重要的领域为药物测试领域，用于方便而快速地检测指示药物滥用的药物和药物代谢物；诸如尿样品中特定药物和药物代谢物(例如THC)的测定等。
术语“分析物”用作术语“标记物”的同义词，并且旨在包括可定量地或定性地测量的任何化学或生物物质，并且可包括小分子、蛋白质、抗体、DNA、RNA、核酸、病毒组分或完整的病毒、细菌组分或完整的细菌、细胞组分或完整的细胞以及它们的复合物和衍生物。
术语“区”、“区域”和“位点”在本说明书、实施例和权利要求书的上下文中用来限定在现有技术的装置中或在根据本发明实施方案的方法中所用的装置中，流体流动路径在基底上的部分。
术语“反应”用于定义发生在样品组分与基底上或基底中的至少一种试剂或多种试剂之间，或发生在存在于样品中的两种或更多种组分之间的任何反应。术语“反应”特别用于定义作为分析物定性或定量测定的一部分的发生在分析物和试剂之间的反应。
术语“基底”是指样品添加到其中，并且测定在其上或其中进行，或者分析物和试剂之间的反应在其中发生的载体或基质。
本发明涉及一种使用侧向流测定装置来确定至少一种分析物的存在或量的方法。图2和图3示出了此类装置的实施方案的示意图。测定装置10具有至少一个样品添加区20、至少一个试剂区30、至少一个检测区40和至少一个芯吸区50。这些区形成流动路径，样品从样品添加区，通过该流动路径，流到芯吸区。测定装置还包括至少一个试剂添加区35，其优选位于试剂区和检测区之间。
测定装置的部件(即，装置的物理结构，而不论是否为来自装置的其它部分的分立物件)可由共聚物、共混物、层合物、金属化箔、金属化膜或金属制备。或者，装置部件可由沉积在以下材料之一上的共聚物、共混物、层合物、金属化箔、金属化膜或金属制备：聚烯烃、聚酯、含苯乙烯的聚合物、聚碳酸酯、丙烯酸类聚合物、含氯的聚合物、缩醛均聚物和共聚物、纤维素及其酯类、硝化纤维、含氟的聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚甲基丙烯酸甲酯、含硫的聚合物、聚氨酯、含硅的聚合物、玻璃以及陶瓷材料。或者，装置的部件用塑料、弹性体、乳胶、硅片或金属制成；弹性体可包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、硅弹性体或乳胶。或者，装置的部件可由乳胶、聚苯乙烯乳胶或疏水性聚合物制备；疏水性聚合物可包括聚丙烯、聚乙烯或聚酯。或者，装置的部件可包含聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或聚碳酸酯。或者，装置部件由能够压印、铣削或注塑的塑料制成，或者由其上可吸收各种长链烷硫醇的铜膜、银膜和金膜的表面制成。能够铣削或注塑的塑料的结构可包含聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚丙烯酸酯。在一个实施方案中，测定装置是用环烯烃聚合物诸如以商品名销售的那些环烯烃聚合物注塑成型。优选的注塑技术描述于美国专利6,372,542、6,733,682、6,811,736、6,884,370和6,733,682中，所有这些专利的全文均以引用方式并入本文。
流动路径可包括开放或闭合的路径、沟槽和毛细管。优选地，流动路径包括相邻突出部的侧向流动路径，其尺寸、形状和相互间距使得毛细流动持续通过流动路径。在一个实施方案中，流动路径在具有底表面和侧壁的基底内的通道之中。在该实施方案中，突出部从通道的底表面突起。侧壁可有助于液体的毛细作用，也可没有帮助。如果侧壁不会有助于液体的毛细作用，那么可在最外侧突出部和侧壁之间提供间隙，使液体留在由突出部限定的流动路径中。图1示出了突出部7。
在一个实施方案中，流动路径至少部分开放。在另一个实施方案中，流动路径完全开放。开放是指在毛细距离处无封盖或覆盖件。因此，封盖如果作为流动路径的物理保护存在，则不会有助于流动路径中的毛细流动。开放的侧向流动路径描述于例如以下PCT国际公开号WO 2003/103835、WO 2005/089082、WO 2005/118139、WO 2006/137785和WO 2007/149042中，所有这些PCT国际公开的全文均以引用方式并入本文。突出部具有高度(H)、直径(D)和突出部(t1,t2)之间的一个或多个距离，使得该区中流体(诸如血浆，优选人血浆)的侧向毛细流动得以实现。这些尺寸在美国专利公开2006/0285996中示出，该专利公开全文以引用的方式并入本文。除了优化上述高度、直径，以及突出部之间的一个或多个距离之外，例如通过对突出部的表面进行改性，可以为突出部赋予期望的化学功能、生物功能或物理功能。在一个实施方案中，突出部具有在约15μm至约150μm、优选地约30μm至约100μm的区间内的高度，约10μm至约160μm、优选地约40μm至约100μm的直径，以及突出部彼此之间的约3μm至约200μm、优选地约5μm至约50μm或约10μm至约50μm的一个或多个间隙。流动通道可具有约5mm至约500mm、优选地约10mm至约100mm的长度，以及约0.3mm至约10mm、优选地约0.3mm至约3mm、优选地约0.5mm至约1.5mm和优选地约0.5mm至约1.2mm的宽度。
虽然大部分检测将发生在流体流动路径的检测区部分中，但检测也可发生在装置的其它部分中。例如，非侵入性、非反应性样品完整性测量可发生在样品区与试剂区或试剂添加区之间，优选在过滤元件(当存在时)之后。其它测量可包括空白读数，双部分反应序列的一个部分用于测量血红蛋白和糖化的血红蛋白，用于测定HbA1c等。
液体样品区也称为液体样品添加区，它从样品分配器(诸如吸管)接收样品。样品通常沉积在该区的顶部上。样品添加区能够将液体样品从样品沉积到试剂区的点运输通过任选的过滤器和试剂添加区，优选通过毛细流动。引发毛细流动的结构可包括多孔材料，诸如硝化纤维，或优选通过突出部，诸如微柱，如在图1中所示。在可以使用手指针刺体积的血液的那些装置中，样品可以直接从手指接触吸走或通过毛细吸管接触吸走，诸如标题为“Controlling Fluid Flow Through An Assay Device”(控制流过测定装置的流体流)的共同待审申请(2013年8月15日公布的美国专利申请公开US 2013-0210036A1)中所述，该申请全文以引用方式并入本文。
过滤材料(图4)可置于样品添加区中，以便从样品过滤掉颗粒或从血液过滤掉红血球，使得血浆可进一步行进通过该装置。
位于样品添加区和检测区之间的是试剂区。试剂区可包括整合在分析元件中的(一种或多种)试剂，并且通常是在反应中有用的试剂(结合配偶体，诸如用于免疫测定的抗体或抗原、用于酶测定的底物、用于分子诊断测定的探头)，或者是辅助材料，诸如使整合的试剂稳定的材料、抑制干扰反应的材料等。通常，在反应中有用的试剂之一携带下面论述的可检测信号。在一些情况下，试剂可以与分析物直接地或者通过反应级联进行反应以形成可检测信号，诸如但不限于使用光谱法可检测的分子，诸如有色分子或荧光分子。可以在保持相同试剂宽度的同时通过沉积到装置中的试剂的长度来调节试剂区中的试剂量。也可以通过在保持长度的同时改变宽度来调节试剂量。可以通过同时改变宽度和长度来进一步调节试剂量。在一个优选的实施方案中，试剂区包括缀合物材料。术语缀合物是指携带检测元件和结合配偶体二者的任何部分。
检测元件为可关于其物理分布或/和其传送的信号的强度被检测到的试剂，诸如但不限于发光分子(例如荧光剂、磷光剂、化学发光剂、生物发光剂等)、有色分子、反应时显色的分子、酶、放射性同位素、表现出特异性结合的配体等。检测元件(也被称作标记)优选选自生色团、荧光团、放射性标记和酶。合适的标记可得自商业供应商，提供宽范围的用于标记抗体、蛋白质和核酸的染料。例如，存在几乎跨整个可见和红外光谱的荧光团。合适的荧光或磷光的标记包括例如但不限于荧光素、Cy3、Cy5等。合适的化学发光标记为例如但不限于鲁米诺、cyalume等。
相似地，放射性标记为可商购获得的，或可合成检测元件以使得它们掺入放射性标记。合适的放射性标记为例如但不限于放射性碘和磷；例如125I和32P。
合适的酶标记为例如但不限于辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶等。
当两种标记可以单独地被检测并且优选同时定量时，两种标记为“可分辨的”而不会彼此显著干扰、妨碍或压制。两种或更多种标记可用于例如当多种分析物或标记物正在被检测的时候。
结合配偶体是可形成一种可用于确定分析物的存在或量的复合物的物质。例如，在“夹心”测定中，缀合物中的结合配偶体可形成包含分析物和缀合物的复合物，并且该复合物可进一步结合整合在检测区中的其它结合配偶体(也被称作捕集元件)。在竞争性免疫测定中，分析物将干扰缀合物中的结合配偶体与整合在检测区中的其它结合配偶体(也被称作捕集元件)的结合。缀合物中包含的示例性结合配偶体包括：抗体、抗原、分析物或分析物模拟物、蛋白质等。
位于流体流动路径中，在试剂区之前或之后，并且在检测区之前的是试剂添加区。试剂添加区35在图3中示出。在其最广义的概念上，试剂添加区是流体添加区。这样的流体可以是试剂流体，并且优选地是洗涤流体。试剂添加区可允许从装置外面添加试剂。“AssayDevice Having Controllable Sample Size”(具有可控样品量的测定装置)(2013年7月25日公布的美国专利申请公开US 2013-0189673A1，该专利申请公开全文以引用方式并入本文)公开了使用试剂添加区来添加中断试剂，该中断试剂可用于将存在于流体流动路径中的样品和其它未结合组分洗涤到芯吸区中。在一个优选的实施方案中，试剂添加区35位于试剂区30之后(参见图3)。
在根据本发明的测定装置中改善液体样品的流动的方法的一个优选实施方案中，将试剂添加到试剂添加区，并且试剂朝着样品添加区向上游流动并朝着芯吸区向下游流动，从而润湿流体流动路径。当将液体样品添加到样品添加区中时，样品移动通过已被试剂润湿的流体流动路径。与未使用试剂时样品通过流体流动路径的流动相比，样品通过已被试剂润湿的流体流动路径的流动得到改善。这种改善可以通过改善的平均流动时间来证明(参见图14)。优选地，添加到试剂添加区中的试剂是洗涤试剂，并且优选液体样品是全血。
来自试剂区的试剂羽流应尽可能宽，以尽可能覆盖检测区的宽度。用于增加试剂羽流的宽度的一种方法在标题为“Assay Device Having Multiple Reagent Cells”(具有多个试剂小室的测定装置)的共同待审申请(2013年7月25日公布的美国专利申请公开US2013-0189672A1)中有所描述，该申请全文以引用方式并入本文。总之，在试剂区中具有试剂材料的多个区域(下文称为“试剂小室”)以及将由多个试剂小室形成的多个流动流重新组合成一个流动流的元件，使得试剂羽流在离开试剂区并进入检测区时更为理想地混合且变得更宽。
在液体样品区和试剂区下游是检测区，其与样品添加区流体连通。检测区可包括诸如上文所述那些的突出部。也如上所指出的，这些突出部优选由诸如Zeonor之类的光学塑料材料一体模塑在基底中，诸如通过注塑或压花。检测区中流动通道的宽度对于常规尺寸的装置来说通常为大约2mm，然而，一些更小体积的装置，诸如上面所述以及全文以引用方式并入本文的标题为“Lower Volume Assay Device Having Increased Sensitivity”(较低体积的测定装置具有增加的灵敏度)的共同待审申请(2013年1月18日提交的美国专利申请13/744,617，代理人案卷号CDS5111USNP，第一发明人姓名：Phil Hosimer)中所述的那些，明显更狭窄，例如，为1.5mm或更小。
检测区是任何可检测信号被读取的地方。在一个优选的实施方案中，附接到检测区中的突出部的是捕集元件。捕集元件可包括缀合物或含有缀合物的复合物的结合配偶体，如上所述。例如，如果分析物是特异性蛋白质，缀合物可为偶联至诸如荧光探头之类的检测元件的将特异性地结合该蛋白质的抗体。捕集元件则可为也特异性地结合至该蛋白质的另一种抗体。又如，如果标记物或分析物是DNA，捕集分子可为但不限于合成的寡核苷酸、其类似物或特异性的抗体。其它合适的捕集元件包括特异于待检测的分析物的抗体、抗体片段、核酸配体和核酸序列。合适的捕集元件的一个非限制性示例是携带抗生物素蛋白官能团的分子，所述抗生物素蛋白官能团结合至含有生物素官能团的缀合物。
检测区可包括多个检测区。多个检测区可用于包括一种或多种标记物的测定。在存在多个检测区的情况下，捕集元件可包括多个捕集元件，诸如第一捕集元件和第二捕集元件。
可诸如通过涂覆在试剂区中将缀合物预沉积在测定装置上。类似地，可将捕集元件预沉积在测定装置的检测区上。优选地，将检测元件和捕集元件分别预沉积在测定装置的试剂区和检测区上。
在样品传送至样品区以后，样品将遇到试剂区。在样品已经流动通过试剂区和任选的试剂添加区并与其相互作用以后，样品和试剂羽流将被包含在流体流中。试剂羽流可含有已经溶解在反应区中的试剂材料或通过试剂添加区添加的那些试剂材料中的任一种。试剂羽流可包括具有检测元件和结合配偶体二者的缀合物，在这种情况下，它经常被称作缀合物羽流。
检测区下游是与检测区流体连通的芯吸区。芯吸区是测定装置中具有接收流动路径中的液体样品和任何其它物质(例如未结合的试剂、洗涤流体等)的能力的区域。芯吸区提供毛细力，以继续移动液体样品通过并离开检测区。芯吸区可包括多孔材料诸如硝化纤维，或者可为无孔结构，诸如本文所述的突出部。芯吸区还可包括非毛细管流体驱动装置，诸如使用蒸发加热或泵。有关在根据本发明的测定装置中所用的芯吸区的更多详细信息，可见于美国专利公开US 2005/0042766和US 2006/0239859，它们全文以引用方式并入本文中。芯吸区也在标题为“Controlling Fluid Flow Through An Assay Device”(控制通过测定装置的流体流)的共同待审专利申请(2013年8月15日公布的美国专利申请公开US2013-0210036A1)中有所描述，该专利申请全文以引用方式并入本文。
优选地，包括样品添加区、检测区和芯吸区在内的整个流动路径包括突出部，该突出部相对于基底基本上垂直，并且具有能够在流动路径中形成样品的侧向流的高度、直径和相互间距。
在任何上述实施方案中，该装置优选为一次性测定装置。测定装置可以容纳在壳体中以便于处理和保护。如果测定装置容纳在这种壳体中，则壳体将优选地包括用于将样品添加到测定装置中的端口。
测定装置可以与用于读取(阅读器)在测定装置上进行的测定的结果的装置一起使用。该阅读器包括用于读取由检测元件(诸如光电检测器)发出或由其反映的信号的装置，以及用于计算信号和显示结果的装置，诸如可包括在一体化阅读器中或位于单独的计算机上的微处理器。合适的阅读器在例如美国专利公开2007/0231883和美国专利7,416,700中有所描述，这两者均以引用方式全文并入本文。
另一个实施方案为用于读出在测定装置上进行的测定的结果的装置，其中该装置包括能够读出由存在于测定装置的限定位置中的至少一个检测元件发出或由其反反映的信号的检测器。在任一个上述实施方案中，读数优选选自对颜色、荧光、放射性或酶活性的检测和/或定量。
本主题发明还涉及一种对液体样品执行测定以检测感兴趣的一种或多种分析物的方法。将试剂添加到试剂添加区。试剂朝着样品添加区向上游流动并朝着芯吸区向下游流动，从而润湿流体流动路径。然后如上所述将含有感兴趣的(一种或多种)分析物的液体样品沉积到测定装置的样品添加区上，诸如通过装置的壳体中的端口，或者在手指针刺抽血的情况下通过直接从手指接触吸走到样品添加区上。样品移动通过已被试剂润湿的流体流动路径。与未使用试剂时样品通过流体流动路径的流动相比，样品通过已被试剂润湿的流体流动路径的流动得到改善。然后样品通过毛细作用移动通过任选的过滤器，并进入在此溶解试剂材料的试剂区。在一个优选的实施方案中，在夹心型测定的情况下，使样品与检测元件直接或间接(诸如通过抗体)反应。随着样品流到检测区中，样品从具有溶解的试剂羽流的试剂区流出。
接下来，样品通过毛细作用移入检测区中。在检测区中，产生代表分析物或对照物的信号。在一个优选的实施方案中，具有检测元件的样品或一种或多种试剂在检测区中诸如通过在检测区的表面上的抗体被捕集，并且产生代表(一种或多种)分析物或(一种或多种)对照物的存在或浓度的信号。然后使用上述的阅读器或检测仪器读取检测区中产生的信号，以确定(一种或多种)分析物或(一种或多种)对照物的存在或浓度。样品从检测区移出并进入芯吸区中。阅读器可在样品移动通过检测区后立即或在短时间内读出信号。另外，可在样品通过装置后进行一次或多次洗涤，以便从检测区中洗掉任何未结合的试剂，诸如检测元件。
根据本发明的方法具有许多优点并且可以与各种测定装置一起使用，诸如在以下文献中所述：标题为“Low Volume Assay Device Having Increased Sensitivity”(低体积的测定装置具有增加的灵敏度)的共同待审申请(2013年1月18日提交的美国专利申请13/744,617，代理人案卷号CDS5111USNP，第一发明人姓名：Phil Hosimer)，标题为“AssayDevice Having Multiple Reagent Cells”(具有多个试剂小室的测定装置)的共同待审申请(2013年7月25日公布的美国专利申请公开US 2013-0189672A1)，标题为“Assay DeviceHaving Uniform Flow Around Corners”(拐角周围具有均匀流动的测定装置)的共同待审申请(2015年7月25日公布的美国专利申请公开US 2013-0189796A1)，标题为“ControllingFluid Flow Through An Assay Device”(控制通过测定装置的流体流)的共同待审申请(2013年8月15日公布的美国专利公开US 2013-0210036A1)以及标题为“Assay DeviceHaving Multiplexing”(具有多路复用的测定装置)的共同待审申请(2013年7月25日公布的PCT国际公开WO 2013/109821)，所有这些申请全文均以引用方式并入本文。
根据本发明的测定装置可以如图4所示进行包装。包装100包括测定性能所需的所有功能元件，诸如：顶部覆盖件120、过滤器130、亲水胶带140、测定装置(芯片)150和基部覆盖件160。
应当理解，本发明不限于本文所示的特定实施方案。提供以下实施例是为了说明的目的，并不旨在限制本发明的范围，因为本发明的范围仅由所附权利要求及其等同物限制。
实施例
实施例1
使用由Zeonor(日本瑞翁(Zeon,Japan))制成的塑料基底芯片，其表面上具有氧化的右旋糖酐，用于通过席夫碱偶联共价固定蛋白质。对于NTproBNP芯片，沉积并干燥荧光标记的抗-NT-proBNP单克隆抗体以形成试剂区。沉积并干燥抗-NT-proBNP单克隆抗体以形成检测区。在该装置上沉积少量的Triton X-45以增加样品的润湿性，实现更佳的毛细流动。将样品添加到装置的样品区，并且微柱阵列的毛细作用使样品通过流动通道分布到芯吸区中。典型的测定时间为约10分钟。将检测区中荧光标记的复合物产生的信号强度记录在原型线照明荧光扫描仪中。对于卡马西平芯片，通过将卡马西平半抗原和荧光标记共价连接到牛血清白蛋白(BSA)来制备卡马西平检测试剂。通过将苯巴比妥半抗原和荧光标记共价连接到BSA来制备苯巴比妥检测试剂。沉积并干燥单克隆卡马西平和苯巴比妥抗体以形成检测区。将不同水平的NTproBNP、卡马西平和苯巴比妥加标到人血清中以产生数据。实验使用了减少体积的芯片设计(诸如图2所示)和减少体积且减少占用空间的芯片设计(诸如图3所示)。
将来自手指针刺样品的全血直接施加到测试装置上的过滤器以将红血球与血浆分离。血浆从过滤器流到微柱样品区内的毛细空间，并通过毛细流动前进到流体流动路径的末端。过滤膜与样品区的微柱表面的接触对于血浆从膜流出是重要的。当形成接触时，微柱结构内的毛细力从膜上芯吸血浆而形成血浆流。
在现有技术的芯片设计中，将200uL全血施加到过滤器，但测定仅需要约35uL的血浆。总样本利用效率仅为17.5％。
在本实施例中，在减少体积的芯片设计和减少体积且减少占用空间的芯片设计上仅使用25uL的全血。为了获得测定所需的9uL血浆，对于具有45％血细胞比容的25uL全血样品，过滤效率必须为至少36％。
可以将全血直接施加到微柱表面，而不使用过滤膜将血浆与红血球分离。由于全血的粘度比血清或血浆的粘度大得多，所以微柱空间内的流动阻力也大大增加，这导致流动非常缓慢或流动停止。此外，全血的粘度可能会因患者之间较大的血细胞比容差异而有很大变化。为了实现微柱空间内全血的一致流动，需要减小流动阻力或增加毛细力的方法。
在该实施方案中，通过在减少体积的芯片设计和减少体积且减少占用空间的芯片设计的样品添加区之中或附近添加含有非溶血性、非离子、良好润湿的表面活性剂的小体积(1μL或更少)溶液，来促进全血在微柱空间内的流动。添加此预润湿溶液后，立即将10-15μL全血直接添加到样品添加区中。含表面活性剂的溶液用于降低表面张力并防止红血球积聚在流体前缘。微柱结构内的毛细力推动全血通过试剂(缀合物)区、从检测(反应)通道向下流入芯吸区中。
在检测(反应)通道上添加亲水胶带增加微柱空间内的毛细力，并用于进一步改善全血通过芯片的流动。检测缀合物和捕集免疫材料与目标分析物的反应在全血存在下进行。然而，由于红血球干扰检测缀合物的光学测量，因此在读取之前必须将其除去。这通过在最终读取之前添加洗涤步骤来实现。
可以使用中断洗涤来控制样品体积，以及从检测区(通道)中除去红血球和其它干扰物质。通过在血液样品已将芯吸区填充到预定水平的时间点处添加洗涤流体来控制样品体积。由于微柱结构被设计为以均匀的方式逐行填充，可以手动地或通过仪器监测流动，以确定样品何时将芯片填充到目标体积。当达到目标样品体积时，在检测通道上游的位置处将洗涤流体添加到微柱通道中，如图2针对减少体积的芯片设计所示或者图3针对减少体积且减少占用空间的芯片设计所示。
施加10μL至15μL的洗涤流体液滴以形成穹顶形状液滴，该液滴在两个方向上流动，以有效地从下游检测(反应)通道中除去样品，并防止上游柱空间中的样品进入检测(反应)通道。
洗涤流体通常由0.1M磷酸钠、1％牛血清白蛋白和0.1％表面活性剂构成。表面活性剂在整个微柱空间是必需的，以减少表面张力，从而允许流体在毛细力作用下流动。对于现有技术的芯片设计，Triton X-45是在微柱芯片的样品区中沉积和干燥的优选表面活性剂。为了使全血在芯片中一致地流动，在样品区中沉积TX-45并不是最佳的。已证实若干其它非离子表面活性剂改善微柱芯片中全血的流速。图5示出了在样品添加区中沉积有各种表面活性剂的减少体积的芯片设计中，全血到达芯吸区起点的平均流动时间和到达芯吸区终点的时间。结果表明，与TX-45相比，采用所测试的所有表面活性剂时全血流速都更快。
这些结果采用单个全血样品获得。由于全血可能因人不同而差别很大，预计流速的变化很大。随着样品的血细胞比容水平升高，观察到流速减慢，并且在血细胞比容升高的样品中观察到流动停止。通过在样品添加区中使用优选的表面活性剂并且在样品添加之前添加含有相同表面活性剂的预润湿溶液，获得了全血的连续流动。
优选的预润湿和洗涤溶液含有表面活性剂485或465。其它优选的表面活性剂包括L7600、20、L64、表面活性剂10G、X-305、X-45和X-100。优选0.05％至1％的表面活性剂水平。
全血与中断洗涤测试结果：通过静脉采集获得EDTA全血，并用卡马西平和苯巴比妥加标至表1所示的水平。使用在胶带覆盖芯吸区和大约2/3的检测区情况下的减少体积的芯片设计(参见图2)来评估中断洗涤方案。每个多重芯片含有由固定的卡马西平捕获抗体组成的检测(反应)区以及固定有苯巴比妥捕获抗体的第二检测(反应)区。将由荧光团以及连接到BSA(作为载体分子)的每种药物组成的缀合物沉积在试剂(缀合物)区中。
将一微升在磷酸盐缓冲盐水中含有1％BSA、0.1％TX-100的洗涤流体滴在样品区中，并使其完全进入微柱空间，然后立即分配十五微升全血样品。通过目视检查来监测流体前缘，直到流体填充50％的芯吸区。然后将十五微升相同的洗涤流体直接施加在通道上(在试剂添加区)，并监测流体前缘直到芯吸区被完全填充。将芯片组装到盒中并在荧光阅读器中读取。
表1：全血CRBM/PHBR加标样品。
对每个全血样品的等分试样进行离心以从全血中分离血浆。收集每个等分试样的血浆并用相同的芯片设计进行评估。将十五微升的血浆直接添加到样品区。通过目视检查来监测芯片，并在确定芯吸区被完全填充后立即在荧光阅读器中读取。
图6和图7中的所得剂量响应曲线表明，可以使用所述的中断洗涤方案以小体积将全血直接施加到微柱芯片，并得出与用血浆获得的结果相似的结果。所述的卡马西平和苯巴比妥竞争性测定均在全血存在下进行，并产生预期的测定结果。
全血与过滤和中断洗涤：通过组合上述过滤和中断洗涤概念，可以在微柱装置中使用小体积的全血。使用过滤器在少至25微升或更少的全血中将红血球与血浆分离。当与中断洗涤方案组合使用时，转移到微柱结构的血浆体积可以少得多。在该实施方案中，所需的血浆体积要求足以产生用于测定的足够的检测信号，但没有填充芯片的总体积所需的体积那样大。当与洗涤组合时，可以使用少至2微升至6微升的血浆体积。
在该实施方案中，将全血施加到过滤器。将血浆滤液转移到样品添加区中的微柱空间，并继续流动通过试剂区和检测区。通过目视检查或仪器来监测流动前缘，直到其在芯吸区中达到限定的距离。将洗涤流体施加到上游通道，这防止或中断额外的样品进入通道，从而控制样品体积。洗涤流体在两个方向上流动，这防止额外的血浆进入通道并从检测(反应)通道中清除血浆和残留缀合物。洗涤流体还用于填充剩余的芯片体积。当芯吸区被完全填充时，监测并读取流体前缘。可以在一致的样品体积进入芯片之后施加中断洗涤液。理想情况下，该体积应允许试剂区中的任何试剂材料(诸如缀合物材料)完全溶解，但在芯吸区中留下足够的空间以进行充分洗涤。
全血与沿行洗涤：在另一个实施方案中，在荧光阅读器上展示了使用全血与沿行洗涤得出的剂量响应曲线。使用的芯片是如图2所示的减少体积的芯片设计，其上沉积有NT-proBNP试剂(检测/反应区中的检测抗体aNT-proBNP和试剂/缀合物区中的捕获抗体aNT-proBNP)，并且胶带覆盖芯吸区和检测区通道。样品由EDTA全血组成，在取出等体积的血浆后，向其中添加含有大约35000pg/mL NTproBNP的血清样品以获得75pg/mL、2220pg/mL、4550pg/mL和8942pg/mL NTproBNP的浓度。使用在磷酸盐缓冲盐水中含有1％牛血清白蛋白、0.1％Triton X-100、0.3mg/mL小鼠IgG、0.3mg/mL牛γ球蛋白的溶液作为预润湿和洗涤流体。
测定方案包括将1uL洗涤流体添加到样品添加区以预润湿流动通道，然后将4uL全血样品添加到样品添加区中。使样品流动到流动通道的微柱空间中，然后在样品添加区后添加2uL的洗涤流体。使洗涤流体完全流动到微柱空间中，然后再重复洗涤步骤两次。监测流体流动直到芯吸区被完全填充，然后在阅读器上读取芯片。
图8示出了对于具有各种NT-proBNP水平的全血样品获得的三次重复实验的平均流动时间。这些结果表明，这些全血样品在整个流动通道中的流速并没有明显变化。图9绘制了对于每个测试样品在荧光阅读器上获得的荧光响应的平均峰面积对NT-proBNP浓度的关系图。图9还示出了与相似NT-proBNP浓度的血清样品相比，对于全血样品获得的剂量响应曲线。因此，这些结果表明可以通过以下方式用荧光阅读器获得剂量响应曲线：将全血施加到如图2所示减少体积的芯片的流动通道中，以及在添加全血之前施加洗涤流体以促进流动，以及在添加全血之后施加额外的洗涤流体以洗涤流动通道。
实施例2
使用由Zeonor(日本瑞翁)制成的测定装置，其表面上具有氧化的右旋糖酐，用于通过席夫碱偶联共价固定蛋白质。沉积并干燥荧光标记的抗-NT-proBNP单克隆抗体以形成试剂区。沉积并干燥抗-NT-proBNP单克隆抗体以形成检测区。在该装置上沉积少量的Triton X-45以增加样品的润湿性，实现更佳的毛细流动。将用NT-proBNP加标的血清添加到装置的样品区中，并且微柱阵列的毛细作用使样品通过流动通道分布到芯吸区中。在小体积装置设计R2.02、R2.04、R2.09和R3.16上采用15微升的样品体积。R1.02装置设计是一种控制装置，旨在使用200微升全血，诸如图1所示。在本实施例中，用45微升血清测试R1.02装置。典型的测定时间为约10分钟。将检测区中荧光标记的复合物产生的信号强度记录在原型线照明荧光扫描仪中。
如图10和图11所示，条形和曲线A(R2.02)是具有单试剂小室和直接按比例缩小的检测区的小型化装置，检测区宽度为0.5mm，而条形和曲线B(R2.09)是具有双试剂小室和1mm的较宽检测区的小型化装置。还包括两个附加装置设计的数据以便进行比较。条形和曲线C(R1.02)是具有200uL全血样品体积的常规尺寸的测定装置，并且条形和曲线D(R2.04)是具有1mm检测区宽度的单试剂小室装置。曲线E(R3.16)包括双试剂小室和1mm宽的检测区。
实施例3
使用由Zeonor(日本瑞翁)制成的具有双试剂小室的小型化测定装置，其表面上具有氧化的右旋糖酐，用于通过席夫碱偶联共价固定蛋白质。沉积并干燥荧光标记的抗原降钙素单克隆抗体以形成试剂区。沉积并干燥抗原降钙素单克隆抗体以形成检测区。在该装置上沉积少量的Triton X-45以增加样品的润湿性，实现更佳的毛细流动。在该实施例中，将25微升含有原降钙素的全血施加到与测定装置的样品添加区接触的过滤器。将血浆从过滤器转移到样品添加区中，然后在毛细力作用下通过流动路径移动到芯吸区。通过目视检查来监测流体流动，并且当流体流动前缘填充了20％的芯吸区时，将10微升含有0.01M磷酸盐缓冲液、0.0027M氯化钾、0.137M氯化钠、1％牛血清白蛋白和0.1％triton X-100的洗涤流体添加到试剂添加区。在确定芯吸区被完全填充后，立即将测定装置插入荧光阅读器中。测量检测区内的荧光信号，并测定每个样品的响应曲线下的峰面积。从正常供体新鲜采集全血样品到肝素锂管中。将含有10μg/mL原降钙素的浓缩血清样品添加到全血的等分试样中，以形成含有0ng/mL、0.4ng/mL、5ng/mL、20ng/mL和35ng/mL原降钙素的样品。图12绘制了每个样品的五个重复结果的平均峰面积对原降钙素浓度的关系图。如图12所示，使用小样品量(即25μL全血/10μL洗涤液)可在宽范围的分析物浓度内提供令人满意的结果。
实施例4
使用由Zeonor(日本瑞翁)制成的具有双试剂小室的小型化测定装置，其表面上具有氧化的右旋糖酐，用于通过席夫碱偶联共价固定蛋白质。沉积并干燥荧光标记的抗原降钙素单克隆抗体以形成试剂区。沉积并干燥抗原降钙素单克隆抗体以形成检测区。在该装置上沉积少量的Triton X-45以增加样品的润湿性，实现更佳的毛细流动。在该实施例中，将35μl含有原降钙素的全血施加到与测定装置的样品添加区接触的过滤器。将血浆从过滤器转移到样品添加区中，然后在毛细力作用下通过流动路径移动到芯吸区。通过目视检查来监测流体流动，并在确定芯吸区被完全填充后立即插入荧光阅读器中。测量检测区内的荧光信号，并测定每个样品的响应曲线下的峰面积。从正常供体新鲜采集全血样品到EDTA管中。将含10μg/mL原降钙素的浓缩血清样品添加到全血的等分试样中，以形成含有0ng/mL、0.4ng/mL、5ng/mL和20ng/mL原降钙素的样品。图13绘制了每个样品的三个重复结果的平均峰面积对原降钙素浓度的关系图。如图13所示，使用小样品量(即35μL全血)在宽范围的分析物浓度内提供令人满意的结果。
实施例5
在根据本发明的装置上示出使用预润湿试剂改善了全血样品的流动。作为对照，在没有预润湿的情况下将12μL的全血(30％HCT)分配到样品区。为了证明流动得到改善，通过洗涤端口(试剂添加区)预先分配2μL洗涤流体，然后将12μL的全血(30％HCT)添加到样品添加区。测量到达芯吸区起点的流动时间并标记3(参见图3)。下表2(时间以分和秒表示)和图14示出了根据本主题发明的方法使用预润湿时流动时间得到改善。日期显示在预润湿的情况下血液流动至到达芯吸区起点的时间快约5分钟。到达标记3的总流动时间也快约5分钟，表明芯吸区本身中的流速大致相同。
表2
本领域的技术人员将会知道本文所述的本发明及其实施方案易受除特别描述的变型形式和修改形式之外的变型形式和修改形式影响。应当理解，本发明包括所有这些变型形式和修改形式。本发明还包括在本说明书中单独地或共同地提到的所有步骤和结构，以及任何两个或更多个步骤或结构的任意和所有组合。
标题为“Low Volume Assay Device Having Increased Sensitivity”(低体积的测定装置具有增加的灵敏度)的共同待审申请(2013年1月18日提交的美国专利申请13/744,617，代理人案卷号CDS5111USNP，第一发明人姓名：Phil Hosimer)，标题为“AssayDevice Having Multiple Reagent Cells”(具有多个试剂小室的测定装置)的共同待审申请(2013年7月25日公布的美国专利申请公开US 2013-0189672A1)，标题为“Assay DeviceHaving Uniform Flow Around Corners”(拐角周围具有均匀流动的测定装置)的共同待审申请(2013年7月25日公布的美国专利申请公开US 2013-0189796A1)，标题为“ControllingFluid Flow Through An Assay Device”(控制通过测定装置的流体流)的共同待审申请(2013年8月15日公布的美国专利申请公开US 2013-0210036A1)，标题为“Assay DeviceHaving Multiplexing”(具有多路复用的测定装置)的共同待审申请(2013年7月25日公布的PCT国际公开WO 2013/109821)以及标题为“Assay Device Having ControllableSample Size”(具有可控样品量的测定装置)的共同待审申请(2013年7月25日公布的美国专利申请公开US 2013-0189673A1)全文均以引用方式并入本文。

Claims (6)

1.一种改善测定装置中液体样品的流动的方法，包括：
提供液体样品添加区；
提供在所述样品添加区的下游并与所述样品添加区流体连通的试剂区，所述试剂区含有试剂材料；
提供与所述试剂区流体连通的检测区；
提供与所述检测区流体连通的芯吸区，所述芯吸区具有接收从所述检测区流出的液体样品的能力，其中所述样品添加区、所述试剂区、所述检测区和所述芯吸区限定流体流动路径；
还提供试剂添加区，所述试剂添加区沿着在所述样品添加区的下游并在所述检测区的上游的所述流体流动路径并与所述流体流动路径流体连通；
将试剂添加到所述试剂添加区，其中所述试剂朝着所述样品添加区向上游流动并朝着所述芯吸区向下游流动，从而润湿所述流体流动路径；以及
将液体样品添加到所述样品添加区，其中所述样品移动通过已被所述试剂润湿的所述流体流动路径，并且其中与未使用试剂时所述样品通过所述流体流动路径的流动相比，所述样品通过已被所述试剂润湿的所述流体流动路径的流动得到改善。
2.根据权利要求1所述的方法，其中添加到所述试剂添加区中的所述试剂是洗涤试剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体样品是全血。
4.一种对液体样品执行测定以用于检测感兴趣的一种或多种分析物的方法，包括：
提供液体样品添加区；
提供在所述样品添加区的下游并与所述样品添加区流体连通的试剂区，所述试剂区含有试剂材料；
提供与所述试剂区流体连通的检测区；
提供与所述检测区流体连通的芯吸区，所述芯吸区具有接收从所述检测区流出的液体样品的能力，其中所述样品添加区、所述试剂区、所述检测区和所述芯吸区限定流体流动路径；
还提供试剂添加区，所述试剂添加区沿着在所述样品添加区的下游并在所述检测区的上游的所述流体流动路径并与所述流体流动路径流体连通；
将试剂添加到所述试剂添加区，其中所述试剂朝着所述样品添加区向上游流动并朝着所述芯吸区向下游流动，从而润湿所述流体流动路径；以及
将含有感兴趣的分析物的液体样品添加到所述样品添加区，其中所述样品移动通过已被所述试剂润湿的所述流体流动路径，并且其中与未使用试剂时所述样品通过所述流体流动路径的流动相比，
所述样品通过已被所述试剂润湿的所述流体流动路径的流动得到改善；
通过毛细作用使所述样品移动到所述试剂区中，在所述试剂区中，所述样品溶解所述试剂材料；
通过毛细作用使所述样品从其中具有溶解的试剂材料的所述试剂区往外流动到所述检测区中，其中通过读取所产生的信号而在所述检测区中检测所述感兴趣的分析物；以及
使所述样品和任何未结合的材料流动到所述芯吸区中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中添加到所述试剂添加区中的所述试剂是洗涤试剂。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述液体样品是全血。
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