CN107629988B - 一种可缓解结直肠癌的两歧双歧杆菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够显著抑制结直肠癌发生的两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)及其用途，属于微生物技术领域。本发明提供的两歧双岐杆菌HNJ6，其保藏编号为GDMCC No.60255，能耐受胃酸和胆盐，能够显著地减轻结直肠癌模型小鼠结直肠部位的炎症反应，通过调节结直肠组织中Notch1、Notch2信号通路及VEGFR2分子的表达，减少模型小鼠结、直肠部位的肿瘤数量。此外，两歧双歧杆菌HNJ6还可以改善肠道菌群结构和肠道内短链脂肪酸水平。所述的两歧双歧杆菌HNJ6用于制备抑制结直肠癌发生的发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

Description

一种可缓解结直肠癌的两歧双歧杆菌及其用途

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种能够通过调节Notch1、Notch2、VEGFR2信号通路显著抑制结直肠癌发生的两歧双歧杆菌及其用途。

背景技术

结直肠癌是一种恶性消化道肿瘤。随着结直肠癌在我国发病率和死亡率的持续上升，其对于我国人民身体健康的威胁正在逐步地加深。目前在临床上治疗结直肠癌的主流方法都有较大的副作用，这极大地影响了患者的生活质量。益生菌作为一种安全的可食用的食品，其在多种疾病中的缓解及治疗作用逐步被研究所证实，例如促进消化吸收、增强免疫力、预防生殖系统感染、缓解过敏反应、预防与抑制肿瘤、预防与抑制心脑血管疾病、预防与抑制神经性疾病等。

肠道不仅是结直肠癌直接的病发区域，也是益生菌发挥其益生作用的主要场所，关于益生菌对结直肠癌的作用的研究日益增加。一些研究表明，益生菌尤其是乳酸菌具有拮抗结肠癌细胞或是抑制结肠肿瘤发生的功效，它们可以在不同程度上抑制结肠癌细胞的增殖或是诱导结肠癌细胞的凋亡。此外，益生菌对于结直肠癌的拮抗功效还表现在以下几个方面：结合或代谢致癌物质、诱导癌细胞凋亡、提高免疫力、抑制癌细胞分化与增殖、保护肠道、维持肠道菌群平衡等，而益生菌对肠道菌群的调节最终会影响肠道中短链脂肪酸的浓度，进一步影响肿瘤的发生。

有研究显示，尽管结肠中有较高浓度的丁酸盐，结肠癌仍然能够发展和生长，富含丁酸盐的微环境可以选择能够代谢丁酸盐的肿瘤细胞。益生菌还可能通过对肿瘤相关信号通路的调节来抑制肿瘤的发生。结直肠癌所涉及的信号通路很多，包括AKT信号通路、GPCR信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、JAK信号通路、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、ESC信号通路、Apoptosis信号通路、CCC信号通路和Angiogenesis信号通路等。目前对于Wnt、NF-κB信号通路与结直肠癌关系的研究比较多，但Notch信号通路作为一条与上皮细胞分化相关的信号通路，与结直肠癌的关系也非常紧密。对于结直肠癌来说，Notch信号通路扮演着诱发、促进肿瘤以增加抗药性的角色。临床上的许多研究也表明，结肠部位的肿瘤组织相比于癌旁组织或正常组织，其Notch信号通路存在过激活。

除了Notch信号通路以外，大量研究也表明血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)在绝大多数肿瘤中呈现高表达。VEGF对内皮细胞的主要生理功能几乎都是通过激活VEGFR2来实现的，包括刺激内皮细胞增殖，增加血管通透性，对内皮细胞的趋化作用等。不同的研究者在多种内皮细胞中都观察到VEGF同VEGFR2结合后激活了MAPK信号转导途径的现象。VEGFR2不仅促进血管内皮细胞分裂、增殖，也能诱导肿瘤血管增生，并促使其肿瘤细胞生长转移。大量的报道也证明，在结直肠癌组织中VEGFR2也表现为高表达。因此，可将VEGFR2作为靶点治疗和诊断肿瘤的发生。

益生菌也可能通过对Notch、VEGFR信号通路进行调节，从而达到缓解结直肠癌发生或是抑制结肠癌细胞生长的效果。两歧双歧杆菌是乳酸菌的一种，其广泛存在动物及人体的肠道中。国内外对两歧双岐杆菌的生理功能有大量的研究报道，对双歧杆菌抑制结直肠癌发生也有少量的报道，但并不清楚是何机制。关于两歧双歧杆菌抑制结直肠癌发生的研究对食品科学、预防医学和微生物学等许多学科都有很高的价值。筛选优良的具备抑制结直肠癌发生功能的安全的两歧双歧杆菌，对于开发功能性食品及药物均具有重要意义。

在目前已经公开的文献与专利或专利申请中，有少量针对益生菌或益生菌复配、发酵产物抑制肿瘤的专利，但并无真正涉及具有抑制结肠癌发生功能的明确益生菌菌株。例如，CN105535650A公开了一种具有抗肿瘤(肝癌细胞株皮下移植)功能的益生菌组合物，组合物涉及到多种益生菌及中药成分，但未明确其中各成分肿瘤抑制功能，且所有益生菌均未明确到株，由于在益生功能上同种益生菌不同菌株间差异显著，故该配方并不具有普适性；同样，CN10468665 7A和CN101711775A中的益生菌也未明确到株，且发酵物成分功能不明确。

CN104523761A公开了一株基因工程构建的可诱导表达白细胞介素12的乳酸乳球菌可抑制肠道肿瘤生长，但该菌非自然界获得，只可用于药物而不能用于食品。CN105441357A公开了一株种产胞外多糖的植物乳杆菌SKT109，能够在体外抑制人结肠癌细胞HT-29的生长并抑制荷瘤裸鼠(腋下接种结肠癌细胞)肿瘤的生长；CN103445068A和CN103468600A公开了一株具有肿瘤抑制作用的植物乳杆菌Dy-1，该菌及其发酵产物能够在体外抑制人结肠癌细胞HT-29以及胃癌细胞SGC-7901的生长，抑制荷瘤裸鼠(腹部皮下接种的结肠癌细胞)肿瘤的生长。上述三个专利菌株明确，且功能明确，但涉及的动物模型采用结肠癌细胞株皮下荷瘤，与肠道内的肿瘤环境区别较大，且在肿瘤相关信号通路的调节方面作用不清晰。因此，需要从自然界筛选可食用、且具有清晰的抑制肿瘤发生机理的益生菌，用于抑制结直肠部位发生的肿瘤的生长。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种两歧双歧杆菌及其用途。本菌株单菌即具有很强的调节Notch1、Notch2信号通路及VEGFR2分子表达的能力，可显著抑制结直肠癌的发生，并且还有缓解结肠炎症，改善肠道菌群结构及短链脂肪酸水平等多种功能和用途。

本发明的技术方案如下：

一种两歧双歧杆菌HNJ6(Bifidobacterium bifidum)，于2017年10月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60255。

一种发酵食品，所述发酵食品为使用两歧双歧杆菌HNJ6发酵生产的乳制品、豆制品与果蔬制品。

所述的乳制品包括牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品包括豆奶、豆豉或豆酱；所述的果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。

所述的两歧双歧杆菌HNJ6或发酵食品的应用，应用于改善肠道菌群、降低肠道内异常升高的短链脂肪酸水平，减轻结直肠炎症，抑制结直肠癌发生。

所述两歧双歧杆菌HNJ6具有下述生物学特性：

(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动的细菌。

(2)菌落特征：厌氧培养36小时形成明显的菌落，直径在0.5-2mm之间，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素。

(3)生长特性：在37℃恒温厌氧的条件下，在mMRS培养基中培养约24小时达到对数末期。

(4)对人工模拟胃肠液具有较好的耐受能力；

(5)能够调节HT-29细胞的Notch1、Notch2信号通路以及VEGFR2的表达水平；

(6)能显著减少结肠癌模型小鼠结直肠癌组织内肿瘤的数量，改善模型小鼠肠道组织完整性；

(7)能显著缓解结肠癌模型小鼠结直肠炎症水平；

(8)调节结肠癌模型小鼠结肠组织中Notch1、Notch2信号通路以及VEGFR2的表达水平；

(9)改善结肠癌模型小鼠肠道微生态及短链脂肪酸水平。

本菌株的提取方法为：

(一)乳酸菌的分离筛选

(1)取1g来自湖北省钟祥市柴湖镇长寿村的健康男性老人新鲜粪便。梯度稀释后涂布于mMRS固体培养基，置于厌氧环境下37℃培养72小时。

(2)观察记录菌落形态，挑取菌落划线纯化。

(3)在mMRS液体培养基中，37℃培养48小时，所得菌落进行革兰氏染色，记录菌落形态。

(4)弃除菌落中的革兰氏阴性菌菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌。

(5)过氧化氢酶分析后，弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株。

(二)两歧双歧杆菌的初步鉴定：果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法

(l)将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体mMRS培养液中培养24h，然后取lmL培养物8000rpm离心2min；

(2)用含0.05％(质量百分数)半胱氨酸盐酸盐的pH6.5的0.05M KH₂PO₄溶液洗涤两次；

(3)重悬于200μL添加了0.25％(质量百分数)Triton X-100的上述磷酸盐缓冲液；

(4)添加50μL浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠的混合液以及50μL浓度为80mg/mL的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；

(5)添加300μL浓度为0.139g/mL、pH 6.5的盐酸羟胺，并于室温放置10min；

(6)分别添加200μL15％(质量百分数)的三氯乙酸和4M HCL；

(7)添加200μL含有5％(质量百分数)三氯化铁的0.1M HCL，体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，初步断定其为双歧杆菌。

(三)两歧双歧杆菌的分子生物学鉴定

(l)单菌基因组抽提

A.将步骤(二)所筛选得到的乳酸菌培养过夜，取培养过夜的菌悬液lmL于1.5mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；

B.用lmL无菌水吹洗菌体后，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；

C.加入200μLSDS裂解液，80℃水浴30min；

D.加入酚-氯仿溶液200μL于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为Tris饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，颠倒混匀后，12000rpm离心5-10min，取上清200μL；

E.加入400μL冰乙醇或冰异丙醇于200uL上清中，﹣20℃静置1h，12000rpm离心5-10min，弃上清；

F.加入500μL70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；

G.60℃烘箱烘干，或者自然晾干；

H.50μLddH₂O重溶沉淀以备PCR；

(2)16S rDNA PCR

A.细菌16S rDNA 50μLPCR反应体系：

10×Taq buffer，5μL；dNTP，5μL；27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，0.5μL；模板，0.5μL；ddH₂O，38μL。

B.PCR条件：

95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-4 30×；72℃5min；12℃2min；

(3)制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loading buffer混合，上样量5μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；

(4)将16S rDNA的PCR产物进行测序分析，将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果鉴定为两歧双歧杆菌的乳酸菌，-80℃保藏备用；

本发明有益的技术效果在于：

本发明两歧双歧杆菌HNJ6具有良好的耐胃酸耐胆盐特性，能够调节结直肠组织中的Notch1、Notch2信号通路及VEGFR2分子表达的能力实现对结直肠癌发生的抑制作用，显著地减轻结直肠癌模型小鼠结肠部位的炎症，并减少模型小鼠结肠、直肠部位的肿瘤数量。此外还可以改善肠道菌群、肠道内短链脂肪酸水平。

该菌在抑制结直肠癌发生的功效方面要优于商业菌株鼠李糖乳杆菌GG株(LGG)，且抑制结直肠癌发生的机理与LGG有所不同。因此，本发明的两歧双歧杆菌HNJ6可以作为临床治疗结直肠癌的辅助手段，且不具有药物的毒副作用。所以两歧双歧杆菌HNJ6可用于制备缓解、预防结直肠癌的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

附图说明

图1是本菌株对HT-29细胞株Notch1、Notch2信号通路分子及VEGFR2表达水平的影响；

图2是本菌株对HT-29细胞株其他癌症相关信号通路分子表达水平的影响；

图3是本菌株对结直肠癌模型小鼠结直肠部位肿瘤数量的影响；

图4是本菌株对结直肠癌模型小鼠结直肠部位组织损伤的改善情况；

图5是本菌株对结直肠癌模型小鼠血清中IL-17和IFN-γ水平的改善情况；

图6是本菌株对结直肠癌模型小鼠肠道组织中Notch1、Notch2信号通路分子及VEGFR2表达水平的影响；

图7是本菌株对结直肠癌模型小鼠肠道短链脂肪酸水平的影响；

图8是本菌株对结直肠癌模型小鼠肠道菌群结构的改善作用。

具体实施方式

下面结合附图和实施例、测试例，对本发明进行具体描述。

实施例1：两歧双歧杆菌HNJ6在对模拟胃肠液具有良好的耐受性

将冷冻保存的两歧双歧杆菌HNJ6划线接种于mMRS培养基(MRS培养基+0.05％半胱氨酸盐酸盐)固体培养基中，在温度37℃厌氧培养48h，再经mMRS培养液传代培养2～3次后，取两歧双歧杆菌HNJ6培养液，8000×g离心5min收集菌体，重悬于(1:1)pH 2.5的人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、pH＝2.5的mMRS培养基)混合，然后在37℃下厌氧培养，分别在开始(0h)、0.5h、1h和2h时取样，用mMRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中的活菌数与在第0h时活菌数之比，以％表示。

取两歧双歧杆菌HNJ6的培养液，8000×g离心5min收集菌体，重悬于(1:1)人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、pH＝8.0的mMRS培养基)中，在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h、2h、3h和4h时取样，用MRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中取样时的活菌数与在第0h时活菌数之比，以％表示。实验结果如表1、表2所示，可以看到两歧双歧杆菌HNJ6对人工胃、肠液具有良好的耐受性。

表1两歧双歧杆菌HNJ6在人工模拟胃液中的耐受性

表2两歧双歧杆菌HNJ6在人工模拟肠液中的耐受性

实施例2：两歧双歧杆菌HNJ6对HT-29细胞Notch1、Notch2、VEGFR2及结肠癌相关信号通路的调节

使用不含抗生素的RPMI1640细胞培养液重悬经PBS清洗两遍后的两歧双歧杆菌HNJ6(或对照两歧双歧杆菌BB37、LGG、大肠杆菌E.coli)菌泥，并调整菌体密度至约2×10⁸CFU/mL；按每孔2mL菌悬液的添加量将HNJ6(或BB37、LGG、E.coli)悬液加入培养有HT-29的6孔板中(细胞融合度达95％)，空白组加入2mL无抗生素的细胞培养液，置于37℃含有5％CO₂的细胞培养箱中培养2h；使用PBS将细胞洗涤3次后，每孔(6孔板)加入1mL TRIzol，在室温下静置5min后，使用无酶枪头反复吹打，之后移至无酶1.5mL EP管中，并按照TRIzol说明书提取细胞总RNA；参照Takara RR047A说明书进行反转录；荧光定量PCR参照Bio-Rad iTaqUniversal SYBR Green Supermix说明书，所用引物如表3。

表3 qPCR引物序列

结果如图1、图2所示。两歧双歧杆菌HNJ6对HT-29细胞Notch1、Notch2、Hes1、VEGFR2基因的转录水平均表现出下调作用，而LGG仅对Notch1和Hes1基因的转录水平表现出少量的下调，对Notch2和VEGFR2未表现出明显的下调作用；两歧双歧杆菌BB37和大肠杆菌对Notch1、Notch2、Hes1和VEGFR2的转录水平基本没有显著影响，反而在一定程度上提高了Notch1的转录水平。针对其他肿瘤相关信号分子的检测结果表明，LGG对除Notch1/2、VEGFR2以外的肿瘤相关信号分子的转录调节作用均较强于两歧双歧杆菌HNJ6。说明并非所有的两歧双歧杆菌都能抑制结直肠癌的发生，两歧双歧杆菌HNJ6抑制结直肠癌发生的作用是独特的，且机理与LGG有所不同，两歧双歧杆菌HNJ6主要通过调节Notch信号通路及VEGFR2的水平实现对结直肠肿瘤的发生。对照组大肠杆菌仅对CyclinD1的转录水平显示出一定的下调作用，对其他分子的转录水平没有明显的影响。

实施例3：两歧双歧杆菌HNJ6对小鼠无急性毒副作用

将两歧双歧杆菌HNJ6重悬于2％(w/v)蔗糖溶液中，菌体密度为4.0×10⁹CFU/mL。取体重25g左右的健康雄性BALB/c小鼠10只，每日给予该浓度悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况。

这些试验结果列于表4中。这些结果表明，喂食浓度4.0×10⁹CFU/mL的两歧双歧杆菌HNJ6未对小鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。

表4小鼠体重的变化及死亡情况

时间(天)	1	2	3	4	5	6	7
								体重(g)	24.7±1.8	25.1±1.2	25.4±1.3	25.5±1.5	25.7±1.3	25.8±1.1	26.0±1.7
死亡情况	-	-	-	-	-	-	-

注：-：小鼠无死亡

实施例4：两歧双歧杆菌HNJ6对小鼠结直肠癌的缓解作用

取体重20-25g的健康雄性BALB/c小鼠48只，随机分为6组：空白对照组、结直肠癌模型对照组、两歧双歧杆菌HNJ6干预组、两歧双歧杆菌BB37对照组、LGG对照组，E.coli对照组，每组含小鼠8只。

使用AOM-DSS法对模型对照组、两歧双歧杆菌HNJ6干预组、两歧双歧杆菌BB37对照组、LGG对照组及E.coli对照组进行结直肠癌造模。即腹腔注射AOM(7.5mg/kg)后，使用含有2％(m/v)DSS饮水代替正常饮水，持续饲养4d；恢复正常饮水7d；再次将正常饮用水换为有2％(m/v)DSS饮水，持续饲养4d；恢复正常饮水饲养15d。

造模过程中每天给干预组小鼠灌喂按本说明书实施例3制备的浓度为4.0×10⁹CFU/mL的两歧双歧杆菌HNJ6悬液0.25mL，BB37对照组灌胃等量的BB37，LGG对照组灌胃等量的LGG，E.coli对照组灌胃等量的E.coli，其余2组灌喂等量的不含菌的2％(w/v)蔗糖溶液。

造模结束后，取小鼠的血清、结肠与直肠。其中，将结场、直肠沿轴向剪开，计算肿瘤数量。同时取结肠组织进行石蜡切片操作并进行常规H&E染色。

肿瘤数量结果如图3所示。通过对比空白对照组与模型对照组可以看出，使用该方法可以诱导小鼠罹患结直肠癌。而经过本发明两歧双歧杆菌HNJ6灌胃的干预组可以显著减少肿瘤的数量，且效果相对好于LGG组，BB37和E.coli对肿瘤发生的抑制作用不明显，且E.coli组死去3只小鼠。H&E染色结果如图4所示。从切片中可以明显看出，模型组、BB37和E.coli干预组已经发生严重病变。相比于正常小鼠，恶性增生细胞显著增加，且肿瘤已经向内生长。经两歧双歧杆菌HNJ6灌胃后，无论是细胞浸润、肿瘤或是肠粘膜完整性都有所改观，且改善程度要强于LGG组。

实施例5：两歧双歧杆菌HNJ6对结直肠癌小鼠血清中结肠炎相关炎症因子的调节作用

取实施例4得到的血清，使用流式点阵仪测定血清中细胞因子的含量。根据试剂盒(Milliplex Map kit)说明书以及Luminex操作说明书，测定其中与结肠炎相关的炎症因子IL-17和IFN-γ的浓度。

结果如图5所示。结直肠癌模型小鼠血清中IL-17和IFN-γ水平较空白对照组显著升高(图中各柱对应的数据为血清中细胞因子浓度相对于空白对照组血清中细胞因子的相对浓度)，两歧双歧杆菌HNJ6则可将IL-17和IFN-γ水平显著降低至正常水平，而BB37、LGG和E.coli对IL-17和IFN-γ水平的升高无明显抑制作用。

实施例6：两歧双歧杆菌HNJ6对小鼠结肠组织Notch1、Notch2信号通路及VEFGR2的调节

取实施例4中约1cm的结肠组织，加入1mL TRIzol与3颗经干热灭菌的钢珠，随后使用组织破碎仪，以70Hz破碎30s作为一个循环，重复3次，之后将液体移至无RNA酶的1.5mLEP管中，并按照实施例2的方法提取总RNA、反转录并进行q-PCR。所用引物如表5所示。

表5 qPCR引物序列

结果如图6所示。除BB37外，LGG、E.coli与两歧双歧杆菌HNJ6对模型小鼠结肠组织中异常升高的Notch1基因转录水平均有下调作用；只有两歧双歧杆菌HNJ6对Notch2的转录水平有下调作用；只有LGG与两歧双歧杆菌HNJ6对模型小鼠Hes1基因的转录表现出明显的下调作用，且两歧双歧杆菌HNJ6的下调作用显著强于LGG；只有两歧双歧杆菌HNJ6对VEGFR2的转录水平有下调作用。

实施例7：两歧双歧杆菌HNJ6下调模型小鼠肠道的丁酸水平

取实施例4中小鼠的粪便，将500μL的饱和NaCl溶液加至50mg粪便样品中并充分震荡；加入20μL 10％硫酸溶液，充分震荡后，加入800μL乙醚再次震荡；离心(18000×g，15min，4℃)后取上清，并加入0.25g无水硫酸钠，充分震荡后再次离心(18000×g，15min，4℃)；取上清至气相瓶中，进行气质分析。

结果如图7所示。结肠癌模型模型小鼠肠道中的乙酸和丙酸无显著变化，但丁酸的含量相比于空白组显著上升。两歧双歧杆菌HNJ6和BB37能显著增加肠道内乙酸的水平，两歧双歧杆菌HNJ6和LGG能显著降低异常升高的丁酸的水平，且两歧双歧杆菌HNJ6使丁酸浓度降低的幅度要显著大于LGG，E.coli对三种酸的水平均无显著影响。

实施例8：两歧双歧杆菌HNJ6对结肠癌模型小鼠肠道菌群失调的修复作用取实施例4中0.1g小鼠粪便的宏基因组，提取参照试剂盒(FastDNA Spin Kit for Soil)说明书，略作改动，具体方法如下所示。将约0.1g粪便加至Lysing Matrix E管中，并加入978μLSodium Phosphate Buffer和122μL MT Buffer，然后于室温下静置30min；使用Fastprep，设置速度为6.0，设置时间为40，进行破碎；于4℃下以14000×g离心10min后取上清，加入250μL PPS，颠倒混匀；于4℃下以14000×g离心10min，取上清并加入1mL Binding MatrixSuspension，颠倒混匀后，于室温下静置3min，并弃去650μL上清，振荡重悬后，取650μL悬浊液至SPIN Fitter，于4℃下以14000×g离心2min，弃去托管中的液体并重复一次上述步骤；加入500μL SEWS-M(使用前加入100mL无水乙醇，并充分振荡混匀)，于4℃下以14000×g离心1min，弃去托管中的液体，再次以相同条件离心；使用新的集液管，并于室温下静置5min；加入50μL DES，放置在55℃的金属浴中保温5min；然后于4℃下以14000×g离心1min，集液管中即为DNA溶液，将得到的DNA溶液送至二代测序仪测序并分析。

结果如图8所示。模型小鼠肠道内厚壁菌门显著减少，而疣微菌门及梭杆菌门异常增多。两歧双歧杆菌HNJ6的摄入能够显著的增加模型小鼠肠道内厚壁菌门的丰度，并抑制异常增多的疣微菌门及梭杆菌门；LGG也能部分恢复失调的肠道菌群结构，但对于异常增多的疣微菌门并无显著抑制作用，且厚壁菌门的丰度依然偏少；BB37、E.coli可以部分恢复厚壁菌门的比例，对其他菌的失调没有显著恢复作用。

实施例9：利用本发明两歧双歧杆菌HNJ6制造含该菌的豆奶

采用软水浸泡大豆，在温度80℃下浸泡2h，再去除大豆皮。接着，沥去浸泡水，再加沸水磨浆，并在高于80℃的温度条件下保温12min。得到的浆料用150目筛网过滤，接着进行离心分离，得到的离心液即为粗豆奶，再将它加热到温度140-150℃，然后将此粗豆奶迅速导入真空冷却室进行抽真空，所述粗豆奶中的异味物质随着水蒸汽迅速排出。经过真空脱气后，将其温度降至约37℃，再接入本发明的两歧双歧杆菌HNJ6工作发酵剂，使其浓度达到10⁶CFU/ml以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明两歧双歧杆菌HNJ6活菌的豆奶。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)HNJ6，于2017年10月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60255。

2.一种发酵食品，其特征在于所述发酵食品为使用两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)HNJ6发酵生产的乳制品、豆制品与果蔬制品；

所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)HNJ6，于2017年10月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60255。

3.根据权利要求2所述的发酵食品，其特征在于所述的乳制品包括牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品包括豆奶、豆豉或豆酱；所述的果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。

4.权利要求1所述的两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)HNJ6在制备抑制直肠癌药物中的应用，其特征在于所述双歧杆菌改善肠道菌群、降低肠道内异常升高的短链脂肪酸水平，减轻结直肠炎症，从而抑制结直肠癌发生。

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