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CN112625964B - 一株鼠李糖乳杆菌在预防和缓解溃疡性结肠炎中的应用 - Google Patents

一株鼠李糖乳杆菌在预防和缓解溃疡性结肠炎中的应用 Download PDF

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CN112625964B CN202011596144.XA CN202011596144A CN112625964B CN 112625964 B CN112625964 B CN 112625964B CN 202011596144 A CN202011596144 A CN 202011596144A CN 112625964 B CN112625964 B CN 112625964B
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Abstract

本发明公开了一株鼠李糖乳杆菌在预防和缓解溃疡性结肠炎中的应用，属于功能性微生物技术领域。鼠李糖乳杆菌能耐受人体胃肠环境，显著减少溃疡性结肠炎患病期间体重减轻，改善粪便性状和便血情况，改善结肠粘膜损伤，降低MPO活性，减少结肠中促炎因子TNF‑α，IL‑1β，IL‑6，IFN‑γ含量，上调结肠紧密连接相关蛋白Claudin‑3、ZO‑1、ZO‑2和Occludin、抗菌肽Reg3g、Reg3b以及黏蛋白MUC2的转录水平，提高短链脂肪酸产生菌Coprococcus、Faecalibacterium丰度以及短链脂肪酸含量，增加肠道内有益菌Lactobacillus丰度并减少条件致病菌Acinetobacter丰度，提高肠道菌群丰富度和多样性。

Description

一株鼠李糖乳杆菌在预防和缓解溃疡性结肠炎中的应用
技术领域
本发明一株鼠李糖乳杆菌在预防和缓解溃疡性结肠炎中的应用，属于功能性微生物技术领域。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是炎症性肠病(Inflammatory boweldisease，IBD)的一种，主要临床表现为慢性或亚急性腹泻，黏液脓血便和腹痛。UC是结肠黏膜层和黏膜下层连续性炎症，疾病通常由直肠开始向向全结肠蔓延。UC的病程长，易复发，不仅影响患者的生活质量，还增加了患者罹患肠癌的风险。目前UC的发病机制尚不清楚，研究显示其主要与免疫因素、肠道菌群、遗传因素和环境因素有关，其发病基础是肠道屏障的破坏，病原体入侵，宿主对肠道微生物、食物抗原、自身抗原等产生无限制的免疫反应，从而引发炎症和一系列的疾病症状。
目前常用的UC治疗药物有三种，氨基水杨酸、激素和免疫抑制剂。氨基水杨酸类药物不会抑制免疫系统，可降低肠道的炎症，用于轻中度的UC。激素类药物和免疫抑制剂短期内可有效控制疾病活动，但不能长期使用。这三种药物对UC的治疗作用较局限且副作用较多。随着大量研究的深入，更多的新疗法和辅助疗法被提出，如干细胞移植，免疫接种，饮食干涉和益生菌制剂等。通过干细胞移植可促进肠道上皮再生，促进受损肠道的愈合和恢复，但其安全性和有效性还有待进一步的研究；在使用免疫抑制剂前进行免疫接种可减少由于使用免疫抑制剂发生的感染；通过去除UC患者敏感的食物或添加有益营养素可在一定程度上改善部分UC患者的疾病症状，但效果十分有限。近年来，一些研究显示，一些特殊的益生菌菌株被提出在干预UC的过程中能起到有益作用，这种效果在益生菌中不是普遍性的，具有菌株特异性，因此，若能筛选得到一株能够具备相应缓解UC症状的菌株，那将有望成为预防或辅助治疗UC的重要手段。
发明内容
鉴于目前能够用于缓解溃疡性结肠炎病症的菌株较少、或者效果不佳的问题，本发明筛选出了可有效缓解溃疡性结肠炎相关症状的益生菌。
本发明提供了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，于2020年7月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61100。
本发明提供了含有所述鼠李糖乳杆菌CCFM1129的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述菌剂的制备方法为：将鼠李糖乳杆菌CCFM1129在MRS培养基中培养，然后在温度35-39℃厌氧条件下培养18-24h，用pH为7.0-7.4磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬，使菌浓度达到1010CFU/mL；接着，悬浮液在温度37℃厌氧条件下预培养50-70min，再在-15～-20℃预冻8-14h，进行真空冷冻干燥得到所述的发酵菌剂。
在本发明的一种实施方式中，冻干保护剂为100g/L-150g/L脱脂奶粉、和/或100g/L-150g/L麦芽糊精、和/或140g/L-160g/L海藻糖。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中鼠李糖乳杆菌CCFM1129的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。
本发明提供了所述鼠李糖乳杆菌CCFM1129在制备改善溃疡性结肠炎症状的功能性产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包括功能性菌剂、发酵食品、药物、和/或药物组合物。
在本发明的一种实施方式中，鼠李糖乳杆菌CCFM1129在所述功能性菌剂中的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括酸奶、奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜、香蕉、木瓜制品。
在本发明的一种实施方式中，所述药物或药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂；所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。
在本发明的一种实施方式中，所述改善溃疡性结肠炎症状包括但不限于如下方面：
(a)减少因溃疡性结肠炎而体重减轻的状况；
(b)缓解结肠长度变短；
(c)调节结肠紧密连接相关蛋白和结肠中抗菌肽的转录水平，改善结肠粘膜损伤；
(d)减少结肠中促炎因子含量；
(e)提高短链脂肪酸含量；
(f)改善肠道菌群。
在本发明的一种实施方式中，所述结肠紧密连接相关蛋白包括Claudin-3、ZO-1、ZO-2和Occludin；所述结肠中抗菌肽包括CRAMP。
在本发明的一种实施方式中，所述结肠中促炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ。
在本发明的一种实施方式中，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸。
在本发明的一种实施方式中，所述改善肠道菌群包括降低不动杆菌属菌株丰度和提高乳杆菌属、粪杆菌属、或粪球菌属菌株丰度。
本发明的有益效果：本发明提供的鼠李糖乳杆菌CCFM1129能耐受人体胃肠环境，缓解溃疡性结肠炎患病期间体重减轻，改善粪便性状和便血情况，改善结肠粘膜损伤，降低MPO活性，减少结肠中促炎因子TNF-α，IL-1β，IL-6，IFN-γ含量，上调结肠紧密连接相关蛋白Claudin-3、ZO-1、ZO-2和Occludin、抗菌肽Reg3g、Reg3b以及黏蛋白MUC2的转录水平，提高短链脂肪酸产生菌Coprococcus、Faecalibacterium丰度并增加短链脂肪酸含量，增加肠道内有益菌Lactobacillus丰度并减少条件致病菌Acinetobacter丰度，提高肠道菌群丰富度和多样性。
本发明中的鼠李糖乳杆菌CCFM1129可用于制备具有预防和/或辅助治疗溃疡性结肠炎的乳制品、豆制品与果蔬制品。还可用于制备具有预防和/或辅助治疗溃疡性结肠炎的益生菌制剂和药物，用以辅助改善溃疡性结肠炎的症状，具有非常广泛的应用前景。
生物材料保藏
本发明所提供的鼠李糖乳杆菌，分类学命名为Lactobacillus rhamnosus，于2020年7月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61100，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1是鼠李糖乳杆菌CCFM1129的菌落形态图；
图2是鼠李糖乳杆菌CCFM1129对UC小鼠体重的影响图；
图3是鼠李糖乳杆菌CCFM1129对UC小鼠结肠粘膜损伤的影响图；
图4是鼠李糖乳杆菌CCFM1129对UC小鼠结肠组织病理评分和结肠MPO活性的影响图；
图5是鼠李糖乳杆菌CCFM1129对UC小鼠结肠中促炎因子含量的影响图；
图6是鼠李糖乳杆菌CCFM1129对UC小鼠结肠紧密连接相关蛋白转录水平的影响图；
图7是鼠李糖乳杆菌CCFM1129对UC小鼠结肠抗菌肽Reg3g和Reg3b以及黏蛋白MUC2的转录水平的影响图；
图8是鼠李糖乳杆菌CCFM1129对UC小鼠粪便中短链脂肪酸含量图；
图9是鼠李糖乳杆菌CCFM1129对UC小鼠肠道中短链脂肪酸产生菌属Coprococcus、Faecalibacterium丰度的影响；
图10是鼠李糖乳杆菌CCFM1129对UC小鼠肠道菌属Lactobacillus、Acinetobacter丰度的影响图；
图11是是鼠李糖乳杆菌CCFM1129对UC小鼠肠道菌群多样性和丰富度的影响图。
具体实施方式
鼠李糖乳杆菌CCFM1129具有下述生物学特性：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动的细菌。
(2)菌落特征：有氧或厌氧培养36小时形成明显的菌落，直径在0.5-2mm之间，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘不齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图1。
(3)生长特性：在37℃恒温有氧或厌氧的条件下，在mMRS培养基中培养约16小时达到对数末期。
本菌株的获得方法为：
(1)取1g来自健康人群的新鲜粪便。将样品在含有山梨醇GM17培养基中35℃富集12h；
(2)将富集样品进行梯度稀释后涂布于添加了0.02％嗅甲酚紫的GM17固体平板上，培养24～48h；
(3)选取变色圈明显，并且符合乳酸菌目基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出乳酸菌；
(4)将上述单菌落培养于液体GM17培养液中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验。
菌株FXJWS44-L2：记载于黄丹等《鼠李糖乳杆菌体外生物学特性和基因组》，公开于2019年。
mMRS培养基：MRS培养基+0.05g/100mL半胱氨酸盐酸盐。
实施例1：鼠李糖乳杆菌CCFM1129对模拟胃肠液的耐受性
将冷冻保存的鼠李糖乳杆菌CCFM1129接种于mMRS平板中，在温度37℃厌氧培养48h，再经mMRS培养液传代培养2～3次后，得到鼠李糖乳杆菌CCFM1129的培养液。
取1mL鼠李糖乳杆菌CCFM1129的培养液，与9.0mL pH 2.5人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、pH＝2.5的mMRS培养基)混合，并在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h、2h和3h时取样，用mMRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。
取1mL鼠李糖乳杆菌CCFM1129的培养液加入9mL人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、pH＝8.0的mMRS培养基)中，在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h、2h、3h和4h时取样，用mMRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。
实验结果如表1和表2所示。结果表明，鼠李糖乳杆菌CCFM1129对人工胃肠液具有较好的耐受性。
表1鼠李糖乳杆菌CCFM1129在人工模拟胃液中的耐受性
Figure BDA0002868679290000051
表2鼠李糖乳杆菌CCFM1129在人工模拟肠液中的耐受性
Figure BDA0002868679290000052
实施例2：鼠李糖乳杆菌CCFM1129对C57BL/6J小鼠无毒副作用
将鼠李糖乳杆菌CCFM1129菌体重悬于3g/100mL的蔗糖溶液中，制成浓度为5.0×109CFU/mL的菌悬液。取体重14-16g左右的健康雄性C57BL/6J小鼠6只，适应环境一周后，每日给予该浓度菌悬液灌胃一次(每次灌胃0.2mL)，观察一周，记录死亡和体重情况。
这些试验结果列于表3中。这些结果表明，喂食浓度5.0×109CFU/mL的鼠李糖乳杆菌CCFM1129未对小鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。
表3小鼠体重的变化及死亡情况
时间(天) 1 2 3 4 5 6 7
体重(g) 19.53±0.32 19.72±0.31 19.88±0.25 20.22±0.31 20.54±0.16 20.76±0.30 20.98±0.24
死亡情况 - - - - - - -
注：-：小鼠无死亡
实施例3：鼠李糖乳杆菌CCFM1129对UC小鼠疾病症状的影响：
取体重14-16g的健康雄性C57BL/6J小鼠30只，适应环境1周，每组6只小鼠，随机分为5组：空白组、模型组、药物组、鼠李糖乳杆菌CCFM1129干预组(CCFM1129)、鼠李糖乳杆菌FXJWS44-L2对照组(FXJWS44-L2)。灌胃菌悬液的剂量为5.0×109CFU/mL，重悬于3g/100mL的蔗糖溶液中，每次灌胃0.2mL。第5周在饮水中添加终浓度为2.5g/100mL的葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium，DSS)持续7天以诱导小鼠结肠炎。实验动物分组及处理方法见表4：
表4动物分组及处理方法
Figure BDA0002868679290000061
第五周，即造模期间(DSS处理期间)，每天定时称量小鼠体重并计算其变化的百分比。此外，每日观察小鼠的粪便性状，将其分为三个等级：第一，正常小鼠的粪便成型，且为颗粒状；第二，粪便粘度增加且易散，但不粘附于肛门则为“松散”；第三，粪便呈稀水样或不成形且粘附于肛门，即为“稀便”。同时，使用匹拉米洞法测定小鼠粪便隐血情况，若小鼠粪便含有肉眼可见的红褐色或鲜红色血液，则判定为肉眼便血。最后，根据小鼠体重、粪便性状和便血情况，计算得出小鼠的疾病活动指数(Disease activity index，DAI)，具体评分项目的得分如表5。
表5动物疾病活动指数(DAI)评分系统
Figure BDA0002868679290000062
表6小鼠患病期间疾病活动指数
Figure BDA0002868679290000063
Figure BDA0002868679290000071
实验结果如图2和表6所示。造模期间，UC模型组小鼠出现明显的便血，粪便松散和体重下降，如图2，模型组小鼠体重从第5天开始显著下降，在第七天时体重下降率接近10％，此外，模型组小鼠的疾病活动指数从造模第4天开始显著上升，第7天时增长至2.72±0.14(表6)，而鼠李糖乳杆菌CCFM1129的摄入可显著减少UC小鼠的体重下降，并改善粪便性状和便血情况，降低DAI值，这表明本发明筛选的鼠李糖乳杆菌CCFM1129具有缓解UC小鼠疾病症状的功能。
实施例4：鼠李糖乳杆菌CCFM1129可改善小鼠结肠粘膜损伤
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。
在第36天处死小鼠后，收集小鼠结肠组织，按照MPO试剂盒说明书测定结肠MPO活性，制作结肠石蜡切片并进行HE染色，实验步骤为：(1)取距肛门1cm处的一段远端结肠1cm用4％多聚甲醛固定48h；(2)将固定好的结肠组织流水冲洗8h后进行脱水，样品依次经70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95％、100％各2次，每次20min；(3)将结肠样品放入1:1的二甲苯和酒精混合液中15min，然后放入二甲苯I和二甲苯II各15min；(4)将结肠组织转移至二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各1h，温度保持60℃；(5)用莱卡石蜡包埋机将结肠包埋于重新融化的蜡块中；(6)用组织切片机对包埋好的组织切片，厚度为5μm；(7)粘片后晾干，置于62℃烘箱中1h。
HE染色过程如下：(1)石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5min，然后放入100％、95％、90％、80％、70％各级酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3min；(2)用苏木精染色20s；(3)蒸馏水洗去未结合的苏木精；(4)伊红染色2s，依次进入95％乙醇Ⅰ、Ⅱ，70％乙醇中，并快速拿出，然后进入80％乙醇中50～55s，进入无水乙醇中2min；(5)切片放入1:1的二甲苯和酒精混合液中1min，接着放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各2～3min；(6)用中性树胶封片。
实验结果如图3和图4所示。由图3可见，模型组小鼠的结肠可见大量黏膜上皮细胞变性、坏死，杯状细胞数量明显减少和肠隐窝损伤，炎细胞浸润等病理变化，其结肠组织损伤评分显著高于空白对照组，且结肠MPO值显著升高。灌胃鼠李糖乳杆菌CCFM1129显著改善了UC小鼠结肠粘膜损伤，且结肠结构接近于空白组(图3)，显著降低结肠组织损伤评分。此外，CCFM1129处理显著降低了UC小鼠的MPO活性并接近于空白对照组。说明鼠李糖乳杆菌CCFM1129能够显著改善UC小鼠的结肠粘膜损伤，且效果优于药物美沙拉嗪和鼠李糖乳杆菌FXJWS44-L2。
实施例5：鼠李糖乳杆菌CCFM1129可显著降低结肠中促炎因子含量
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。
在第36天处死小鼠后，收集小鼠结肠组织。小鼠结肠组织按1:9比例加入预冷PBS缓冲液进行组织研磨，12000×g，离心15min，取上清，分别按照TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ酶联免疫试剂盒的检测方法测定结肠中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的含量。
实验结果如图5所示，模型组小鼠结肠中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ含量显著增高，灌胃鼠李糖乳杆菌CCFM1129显著降低了小鼠结肠中促炎因子IL-1β、IL-6和IFN-γ含量，并在一定程度上减少TNF-α含量，且效果优于药物美沙拉嗪和鼠李糖乳杆菌FXJWS44-L2。
实施例6：鼠李糖乳杆菌CCFM1129可增强肠道屏障功能
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。
在第36天处死小鼠后，收集小鼠结肠组织测定结肠中紧密连接相关蛋白Claudin-3、ZO-1、ZO-2和Occludin、抗菌肽Reg3g、Reg3b以及黏蛋白MUC2的转录水平。
测定方法如下：合成Claudin-3、ZO-1、ZO-2、Occludin、Reg3g、Reg3b和GAPDH的引物序列，引物信息如表6。取小鼠同部位的结肠组织1cm，迅速放入液氮中，置于负80℃冰箱冻存，取出冻存结肠组织放入已加入1mL TRIzol和3粒锆珠的1.5mL无酶离心管中，用组织研磨匀浆机充分匀浆，室温静置5min。加入0.2mL氯仿，剧烈振荡30s，静置10min。接着以12000g，4℃离心15min。小心吸取上层水相至一新的无酶1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，上下轻轻颠倒混匀，室温静置10min。接着以12000g，4℃离心15min。弃去上清，加入1mL预冷75％乙醇，轻弹洗涤沉淀。以12000g，4℃离心5min，小心吸取弃去上清，于超净台内吹干沉淀，加入50μL无酶超纯水溶解RNA。使用微量分光光度计测定提取的RNA浓度，OD260/OD280在1.9～2.0之间的质量合格。以提取质量合格的总RNA为模板，按照反转录试剂盒说明书的步骤合成cDNA。反转录得到的cDNA进行q RT-PCR检测，PCR体系为：5μL SYBR GreenSupermix，3μL去离子水，0.5μL上游引物(10μmol/L)，0.5μL下游引物(10μmol/L)和1μL的cDNA模板(100ng/μL)。qPCR运行程序设定：94℃，2min，(94℃，30s；61℃，30s；72℃，20s)39个循环；目的基因经过Real-time PCR检测后，以GAPDH为内参基因，采用2-△△CT法进行相对基因表达分析。
表7引物序列
基因 序列(5’→3’)
GAPDH F TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG SEQ ID NO.1
R AAGGTGGAAGAGTGGGAGTTG SEQ ID NO.2
Claudin-3 F AACTGCGTACAAGACGAGACG SEQ ID NO.3
R ATCCCTGATGATGGTGTTGG SEQ ID NO.4
ZO-1 F CTTCTCTTGCTGGCCCTAAAC SEQ ID NO.5
R TGGCTTCACTTGAGGTTTCTG SEQ ID NO.6
ZO-2 F ATGGGAGCAGTACACCGTGA SEQ ID NO.7
R TGACCACCCTGTCATTTTCTTG SEQ ID NO.8
Occludin F CACACTTGCTTGGGACAGAG SEQ ID NO.9
R TAGCCATAGCCTCCATAGCC SEQ ID NO.10
Rge3b F ACTCCCTGAAGAATATACCCTCC SEQ ID NO.11
R CGCTATTGAGCACAGATACGAG SEQ ID NO.12
Rge3g F ATGCTTCCCCGTATAACCATCA SEQ ID NO.13
R GGCCATATCTGCATCATACCAG SEQ ID NO.14
MUC2 F ATGCCCACCTCCTCAAAGAC SEQ ID NO.15
R GTAGTTTCCGTTGGAACAGTGAA SEQ ID NO.16
实验结果如图6和图7所示。由图6可以看出，模型组小鼠结肠中四种主要紧密连接蛋白Claudin-3、ZO-1、ZO-2和Occludin均发生了显著下调，灌胃鼠李糖乳杆菌CCFM1129显著提高了结肠中四种紧密连接相关蛋白的转录水平，此外，如图7所示，鼠李糖乳杆菌CCFM1129还显著提高了结肠中抗菌肽Reg3g、Reg3b和黏蛋白MUC2的转录水平，其中，对抗菌肽Reg3b的相对mRNA水平的上调作用约为空白组的5倍。说明鼠李糖乳杆菌CCFM1129能够增强UC小鼠的肠道屏障功能。
实施例7：鼠李糖乳杆菌CCFM1129可提高UC小鼠粪便中短链脂肪酸含量
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。
试验末期收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃。首先对粪便进行冻干处理，称取50mg粪便，用500μl饱和NaCl溶液重悬，加入20μL的10％H2SO4酸化；加入800μL无水乙醚，震荡均匀，提取脂肪酸，然后18000g离心15min；取上层乙醚相，加入0.25g无水Na2SO4进行干燥；静置30min后18000g离心10min取上层乙醚相，利用GC-MS测定小鼠冻干粪便中的短链脂肪酸含量。使用Rtx-Wax柱(柱长30m，内径25μm)；载气为He，流速为2mL/min；进样体积1μL，按7.5℃/min升温至140℃，然后按60℃/min升温至200℃保持3min，离子化温度20℃；分析采用全扫描模式，为通过外标法值得标准曲线，从而计算出各短链脂肪酸浓度。
实验结果如附图8所示。由实验结果可以看出，与空白组相比，模型组小鼠粪便中短链脂肪酸总量减少，尤其是丁酸含量显著减少；鼠李糖乳杆菌CCFM1129灌胃处理显著提高了小鼠粪便中短链脂肪酸的含量，包括乙酸、丙酸、丁酸和总短链脂肪酸含量，且效果优于药物美沙拉嗪和对照菌FXJWS44-L2。
实施例8：鼠李糖乳杆菌CCFM1129能够增加短链脂肪酸产生菌属Coprococcus、Faecalibacterium丰度
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。
试验末期收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃，用DNA快速提取试剂盒按说明书方法步骤提取粪便中的DNA，对样本16S rDNA的V3-V4区进行PCR扩增，用胶回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收，在Illumina miseq pe300平台进行高通量测序，采用QIIME2分析平台对扩增子进行分析。
PCR扩增引物：
F：5’-AYTGGGYDTAAAGNG-3’，SEQ ID NO.17；
R：5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’，SEQ ID NO.18。
实验结果如附图9所示。由实验结果可以看出，与空白组相比，模型组小鼠产短链脂肪酸的菌属粪球菌属(Coprococcus)丰度显著降低，且产丁酸的菌属粪杆菌属(Faecalibacterium)数量大大降低以至于无法检测到，鼠李糖乳杆菌干预后显著提高shannon指数，说明鼠李糖乳杆菌CCFM1129干预后显著提高了Coprococcus和Faecalibacterium的丰度。
实施例9：鼠李糖乳杆菌CCFM1129在调节UC小鼠肠道菌群中的应用
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。
试验末期收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃，用DNA快速提取试剂盒按说明书方法步骤提取粪便中的DNA，对样本16S rDNA的V3-V4区进行PCR扩增，用胶回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收，在Illumina miseq pe300平台进行高通量测序，采用QIIME2分析平台对扩增子进行分析(引物为SEQ ID NO.17和18)。
实验结果如附图10所示。由实验结果可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠有害菌属Acinetobacter丰度明显提高，灌胃鼠李糖乳杆菌CCFM1129显著减少了UC小鼠肠道致病菌不动杆菌属(Acinetobacter)丰度，并增加了有益菌属乳杆菌属(Lactobacillus)的丰度。
实施例10：鼠李糖乳杆菌CCFM1129可提高UC小鼠肠道菌群丰富度和多样性
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。
试验末期收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃，用DNA快速提取试剂盒按说明书方法步骤提取粪便中的DNA，对样本16S rDNA的V3-V4区进行PCR扩增，用胶回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收，在Illumina miseq pe300平台进行高通量测序，采用QIIME2分析平台对扩增子进行分析(引物为SEQ ID NO.17和18)。
实验结果如附图11所示，与空白组相比，模型组小鼠shannon指数显著降低，且chao1指数降低，说明UC小鼠肠道菌群多样性和丰富度下降。鼠李糖乳杆菌CCFM1129干预后提高了shannon和chao1指数，说明鼠李糖乳杆菌CCFM1129可提高结肠炎小鼠肠道菌群的丰富度和多样性。
实施例11：利用本发明鼠李糖乳杆菌CCFM1129制造含该菌的发酵食品
菌剂制备：将鼠李糖乳杆菌CCFM1129在MRS培养基中培养，然后在温度35-39℃厌氧条件下培养18-24h，用pH为7.0-7.4磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬，使菌浓度达到1010CFU/mL；接着，悬浮液在温度37℃厌氧条件下预培养50-70min，再在-15～-20℃预冻8-14h，进行真空冷冻干燥得到所述的发酵菌剂；冻干保护剂为100g/L-150g/L脱脂奶粉、和/或100g/L-150g/L麦芽糊精、和/或140g/L-160g/L海藻糖。
选用新鲜的水果和蔬菜洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接入本发明制备的鼠李糖乳杆菌CCFM1129或含鼠李糖乳杆菌CCFM1129的菌剂，使其浓度达到1.0×106CFU/mL以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明鼠李糖乳杆菌CCFM1129活菌的果蔬饮料。
还可以利用鼠李糖乳杆菌CCFM1129发酵生产制备其他发酵食品，包括酸奶、奶油、干酪、豆制品、果蔬制品等，或者果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜、香蕉、木瓜制品等。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株鼠李糖乳杆菌在预防和缓解溃疡性结肠炎中的应用
<130> BAA200755A
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<213> 人工序列
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tcaagaaggt ggtgaagcag 20
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aactgcgtac aagacgagac g 21
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<400> 5
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tgaccaccct gtcattttct tg 22
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actccctgaa gaatataccc tcc 23
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<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, or t
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<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 18
tacnvgggta tctaatcc 18

Claims (6)

1.鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus），于2020年7月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61100。
2.含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌的微生物菌剂。
3.权利要求1所述鼠李糖乳杆菌在制备改善溃疡性结肠炎症状的功能性产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括功能性菌剂、药物、和/或药物组合物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，鼠李糖乳杆菌在所述功能性菌剂中的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述改善溃疡性结肠炎症状包括但不限于如下方面：
（a）调节结肠紧密连接相关蛋白和结肠中抗菌肽的转录水平，改善结肠粘膜损伤，所述抗菌肽为Reg3g和Reg3b，所述改善结肠粘膜损伤为提高黏蛋白MUC2的转录水平；
（b）提高总短链脂肪酸含量；
（c）改善肠道菌群，所述改善肠道菌群包括降低不动杆菌属菌株丰度、提高乳杆菌属、粪杆菌属、或粪球菌属菌株丰度。
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