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CN107580453A - 可溶性葡聚糖纤维的酶促合成 - Google Patents

可溶性葡聚糖纤维的酶促合成 Download PDF

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CN107580453A
CN107580453A CN201580040749.1A CN201580040749A CN107580453A CN 107580453 A CN107580453 A CN 107580453A CN 201580040749 A CN201580040749 A CN 201580040749A CN 107580453 A CN107580453 A CN 107580453A
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CN
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glucans
alpha
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CN201580040749.1A
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程琼
R.迪科斯莫
A.C.埃里奥特
A.奥维汉德
B.M.罗伊施
S.C.罗斯曼
K.鲁伊布林格-贾斯
游正
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EIDP Inc
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
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Abstract

本发明提供酶促制备的可溶性α‑葡聚糖纤维组合物，其适于用作食物和饲料应用中的耐消化纤维。所述可溶性α‑葡聚糖纤维组合物可与一种或多种附加的食物成分共混以制备包含纤维的组合物。本发明还提供了包含所述可溶性α‑葡聚糖纤维的组合物的制备和使用方法。

Description

可溶性葡聚糖纤维的酶促合成
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年5月29日提交的，标题为“Enzymatic Synthesis of SolubleGlucan Fiber”的美国临时申请62/004300的权益，其公开内容以引用方式全文并入本文。
以引用方式并入的序列表
在2015年5月13日创建并且与本文一起提交的，以大小为47,472字节的名称为“20150515_CL5914WOPCT_SequenceListing_ST25.txt”文件提供的序列表以引用的方式全文并入本文。
技术领域
本公开涉及可溶性α-葡聚糖纤维，包含所述可溶性纤维的组合物，以及制备和使用所述可溶性α-葡聚糖纤维的方法。所述可溶性α-葡聚糖纤维是在上胃肠道中高度耐消化的，在下胃肠道中表现出可接受的产气率，作为膳食纤维具有良好的耐受性，并且具有一种或多种通常与可溶性膳食纤维相关联的有益特性。
背景技术
膳食纤维(可溶性和不可溶性两者)是对于健康、消化和预防病症诸如心脏病、糖尿病、肥胖症、憩室炎和便秘重要的营养物质。然而，大多数人不食用每日推荐摄入的膳食纤维。2010年美国人膳食纤维指南(美国农业部和美国卫生和人类服务部，Dietary Guidelines for Americans，2010，第7版，Washington，DC：美国政府印刷局，2010年12月)报道了膳食纤维摄入不足是成人和儿童的公共健康问题。因此，仍然需要增加每日膳食纤维摄入量，尤其是适用于多种食物应用的可溶性膳食纤维。
历史上，膳食纤维被定义为植物中固有的和完整的非消化性碳水化合物和木质素。该定义已经扩展为包括具有不被人类上消化道中的内源性酶显著水解并通过普遍接受的科学证据证明具有有益生理效果的三个或更多个单体单元的碳水化合物聚合物。可溶性寡糖纤维产物(诸如果糖、葡聚糖的低聚物等)当前用于多种产品应用中。然而，许多可商购获得的可溶性纤维具有不可取的特性诸如低耐受性(造成不可取的效果诸如腹部胃气胀或气体、痢疾等)、缺乏耐消化性、在低pH(例如pH4或更低)下的不稳定性、高成本或制备方法需要至少一个酸催化的热处理步骤以将更易消化的糖苷键(例如葡聚糖中的α-(1，4)键)随机重排为具有更耐消化性的键的更高度支化的化合物。仅使用天然存在的酶以由安全和容易获得的底物，诸如蔗糖合成适宜的葡聚糖纤维的方法可能对消费者更具吸引力。
各种菌种具有由蔗糖合成右旋糖酐低聚物的能力。Jeanes等人(JACS(1954)76：5041-5052)描述了由96种细菌菌株制备的右旋糖酐。右旋糖酐被报道包含显著百分比(50-97％)的α-(1，6)糖苷键与不同量的α-(1，3)和α-(1，4)糖苷键。未报道存在于单独菌株内的酶(数量和类型两者)，并且在某些菌株中的右旋糖酐特征表现出可变性，其中由每种菌种产生的右旋糖酐可以是由每种菌种产生的多于一种酶的产物。
属于葡糖苷水解酶家族70的葡糖基转移酶(葡聚糖蔗糖酶；GTF)能够聚合蔗糖的D-葡糖基单元以形成同寡糖或同多糖。葡聚糖蔗糖酶通过形成的糖低聚物的类型进一步分类。例如，右旋糖酐蔗糖酶为产生主要具有α-(1，6)糖苷键的糖低聚物(“右旋糖酐”)的那些，变聚糖蔗糖酶是趋于产生具有富含α-(1，3)糖苷键的主链的不溶性糖低聚物的那些，罗伊糖蔗糖酶区域产生富含α-(1，4)、α-(1，6)和α-(1，4，6)糖苷键的糖低聚物，并且交替糖蔗糖酶为区域产生具有交替的α-(1，3)糖苷键和α-(1，6)糖苷键的直链主链的糖低聚物。这些酶中的一些能够在不同程度上引入其它糖苷键，常常作为支化点。V.Monchois等人(FEMSMicrobiol Rev.，(1999)23：131-151)讨论了提出的多种葡聚糖蔗糖酶的作用机制和结构-功能关系。H.Leemhuis等人(J.Biotechnol.，(2013)163：250-272)描述了葡聚糖蔗糖酶的特征性三维结构、反应、机制和α-葡聚糖分析。
描述使用葡聚糖蔗糖酶(野生型、截短型或其变体)制备糖低聚物的专利和公布的专利申请的非限制性列表已被报道用于右旋糖酐(美国专利4,649,058和7,897,373；以及美国专利申请公布2011-0178289A1)、罗伊糖(reuteran)(美国专利申请公布2009-0297663A1和美国专利6,867,026)、交替糖和/或麦芽交替糖低聚物(“MAO”)(美国专利7,402,420和7,524,645；美国专利申请公布2010-0122378A1；和欧洲专利EP1151085B1)、α-(1，2)支链右旋糖酐(美国专利7,439,049)、和包含α-(1，3)、α-(1，6)和α-(1，3，6)键的混合物的混合键糖低聚物(缺乏交替糖样主链)(美国专利申请公布2005-0059633A1)。授予Kol-Jakon等人的美国专利申请公布2009-0300798A1公开了表达产生改性淀粉的变聚糖蔗糖酶的基因改性的植物细胞。
已经报道了使用葡糖基转移酶和α-葡聚糖水解酶的组合来酶促制备异麦芽糖、异麦芽寡糖和右旋糖酐。美国专利2,776,925描述了用于酶促制备中间分子量的右旋糖酐的方法，该方法包括右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的同时作用。美国专利4,861,381A描述了使用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的组合酶促制备包含39-80％异麦芽糖的组合物。Goulas等人(Enz.Microb.Tech(2004)35：327-338)描述了使用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶由蔗糖批量合成异麦芽寡糖(IMO)。美国专利8,192,956公开了使用重组表达的杂交基因酶促制备用于临床应用的异麦芽寡糖(IMO)和低分子量右旋糖酐，所述杂交基因包含融合在一起的编码α-葡聚糖酶的基因和编码右旋糖酐蔗糖酶的基因，其中葡聚糖酶基因是来自节杆菌属(Arthrobacter sp.)的基因，其中右旋糖酐蔗糖酶基因是来自明串珠菌属(Leuconostoc sp.)的基因。
Hayacibara等人(Carb.Res.(2004)339：2127-2137)描述了变异聚糖酶和右旋糖酐酶对由来自牙斑中蔗糖的糖基转移酶形成的葡聚糖的产生和结构的影响。报道的研究目的在于评价在突变酶和右旋糖酐酶存在下(单独的或组合的)由GTF合成的葡聚糖的产量和结构，试图阐明在牙斑形成期间可发生一些相互作用。
右旋糖酐酶(α-1，6-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶)是水解右旋糖酐的α-1，6-键的酶。N.Suzuki等人(J.Biol.Chem.(2012)287：19916-19926)描述了变异链球菌(Streptococcusmutans)右旋糖酐酶的晶体结构，并且识别了三个结构域，包括包含酶的催化模块的域A，和右旋糖酐结合域C；还相对于酶结构描述了催化机制。A.M.Larsson等人(Structure，(2003)11：1111-1121)报道了来自朱黄青霉(Penicillium minioluteum)的右旋糖酐酶的晶体结构，其中所述结构用于限定反应机制。H-K Kang等人(Yeast，(2005)22：1239-1248)描述了来自斯达油脂酵母菌(Lipomyces starkeyi)的右旋糖酐酶的特征。T.Igarashi等人(Microbiol.Immunol.，(2004)48：155-162)描述了来自大鼠链球菌(Streptococcusrattus)的右旋糖酐酶的分子特征，其中氨基酸序列的保守区域包含两个功能域，催化位点和右旋糖酐结合位点。
已经报道来自氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的酶糊精右旋糖酐酶(“DD酶”；E.C.2.4.1.2；有时在替代方案中称为“右旋糖酐糊精酶)由麦芽糊精底物合成右旋糖酐。DD酶催化α-(1，4)连接的供体底物(即，麦芽糊精)的非还原端葡糖基残基转移至生长的α-(1，6)受体分子的非还原端。Naessans等人(J.Microbiol.Biotechnol.(2005)32：323-334)总结了来自氧化葡糖杆菌的糊精右旋糖酐酶和右旋糖酐。
其他人已经研究了糊精右旋糖酐酶的特性。Kimura等人(JP2007181452(A))和Tsusaki等人(WO2006/054474)两者公开了糊精右旋糖酐酶。Mao等人(Appl.Biochem.Biotechnol.(2012)168：1256-1264)公开了来自氧化葡糖杆菌DSM-2003的糊精右旋糖酐酶。Mountzouris等人(J.Appl.Microbiol.(1999)87：546-556)公开了通过氧化葡糖杆菌NCIB 4943的细胞悬浮液由麦芽糊精制备右旋糖酐的研究。
授予Okada等人的JP4473402B2和JP2001258589公开了使用来自氧化葡糖杆菌的糊精右旋糖酐酶与α-葡糖苷酶的组合制备右旋糖酐的方法。将所选的α-葡糖苷酶用于水解麦芽糖，其被报道为针对右旋糖酐合成具有抑制性。
本领域中已经报道了各种糖低聚物组合物。例如，美国专利6,486,314公开了α-葡聚糖，其包含至少20个，最多至约100,000个α-葡糖酐单元，其中38-48％为4-连接的葡糖酐单元，其中17-28％为6-连接的葡糖酐单元，并且7-20％为4，6-连接的葡糖酐单元，和/或葡萄糖-寡糖，其包含至少两个4-连接的葡糖酐单元、至少一个6-连接的葡糖酐单元和至少一个4，6-连接的葡糖酐单元。美国专利申请公布2011-0020496A1公开了支链糊精，所述糊精具有以下结构的，其中葡萄糖或异麦芽寡糖通过α-(1，6)糖苷键连接至糊精的非还原端，并且具有10至52的DE。美国专利6,630,586公开了支链麦芽糊精组合物，其包含22-35％(1，6)糖苷键；还原糖含量为＜20％；多分散性指数(Mp/Mn)＜5；并且数均分子量(Mn)为4500g/mol或更小。美国专利7,612,198公开了可溶性、高度支化的葡萄糖聚合物，其具有小于1％的还原糖含量，介于13％和17％之间的α-(1，6)糖苷键的含量和具有介于0.9×105和1.5×105道尔顿之间的值的分子量，其中所述可溶性高度支化的葡聚糖聚合物具有以下支链长度分布曲线：70至85％的聚合度(DP)小于15，10至14％的DP介于15和25之间，并且8至13％的DP大于25。
糖低聚物和/或包含所述低聚物的碳水化合物组合物已经被描述为适于用作食物应用中的可溶性纤维的来源(美国专利8,057,840和美国专利申请公布2010-0047432A1和2011-0081474A1)。美国专利申请公布2012-0034366A1公开了低糖、包含纤维的碳水化合物组合物，其被报道为适于用作食物产品中的传统玉米糖浆、高果糖玉米糖浆和其它甜味剂的替代物。
仍然需要开发新的可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其耐消化，表现出下消化道中气体形成的较低含量和/或在较慢速率、耐受良好、具有低粘度、并且适用于食物和其它应用中。优选地，α-葡聚糖纤维组合物可使用已经与在人类中安全使用相关联的酶由蔗糖酶促制备。
发明内容
本发明提供一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其适用于多种应用，包括但不限于食物应用、改善胃肠健康的组合物和个人护理组合物。可溶性纤维组合物可直接用作食物中的成分或可掺入适用于食物应用的碳水化合物组合物中。
本发明提供一种用于制备可溶性葡聚糖纤维组合物的方法。
本发明还提供了在食物应用中使用可溶性纤维组合物或包含所述可溶性纤维组合物的碳水化合物组合物的方法。在某些方面，提供了用于改善受试者的健康的方法，所述方法包括以有效量将本发明可溶性纤维组合物施用于受试者，以有效发挥通常与可溶性膳食纤维相关联的至少一种健康益处，诸如改变食物的含热量、降低食物的血糖指数、改变粪便重量和支持肠功能、改变胆固醇代谢、通过结肠发酵提供能量生成代谢物、并且可提供益生元效果。
本发明提供一种水溶性纤维组合物，其基于干固体计包含以下物质：
a.10至20％的α-(1，4)糖苷键；
b.60至88％的α-(1，6)糖苷键；
c.0.1至15％的α-(1，4，6)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键；
d.小于50000道尔顿的重均分子量；
e.在水中12重量％下小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
f.如分析化学师协会(Association of Analytical Communities，AOAC)方法2009.01所测量的小于12％的消化度；
g.在25℃下，pH 7水中至少20％(w/w)的溶解度；和
h.小于10的多分散性指数。
本发明还提供了一种包含上述可溶性α-葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物。
本发明还提供了一种制备上述可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供一系列的反应组分，其包括：
i.麦芽糊精底物；
ii.至少一种具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽(E.C.2.4.1.2)；
iii.至少一种具有内切右旋糖酐酶活性的多肽(E.C.3.2.1.11)，其能够内切水解具有一个或多个α-(1，6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
b.在适当的含水反应条件下在单一反应体系中将所述反应组分的系列混合，从而制备包含可溶性α-葡聚糖纤维的产品；以及
c.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物与步骤(b)的产品分离。
本发明还提供食物产品、个人护理组合物或药学产品，其包含本发明的α-葡聚糖纤维组合物或包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物。
本发明还提供一种用于制备共混碳水化合物组合物的方法，该方法包括将本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物与以下物质混合：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、安赛蜜钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、蔗糖素、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲基酯、糖精、麦芽糊精、淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糊精、支链麦芽糊精、菊粉、聚右旋糖、果寡糖、半乳糖寡糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、异麦芽寡糖、填料、赋形剂、粘合剂或它们的任意组合。
在另一个实施方案中，提供一种制备食物产品的方法，该方法包括将一种或多种可食用食物成分与本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物、或上述碳水化合物组合物、或它们的组合混合。
在另一个实施方案中，提供一种减小食物或饮料的血糖指数的方法，所述方法包括向食物或饮料中掺入本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物，从而减小食物或饮料的血糖指数。
在另一个实施方案中，提供一种抑制血糖含量升高的方法，所述方法包括向哺乳动物施用本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的步骤。
在另一个实施方案中，提供一种降低哺乳动物活体中脂质的方法，所述方法包括向哺乳动物施用本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的步骤。
在另一个实施方案中，提供一种改变哺乳动物结肠中脂肪酸产生的方法，所述方法包括将有效量的本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤；优选地其中短链脂肪酸产生增加和/或支链脂肪酸产生减少。
在另一个实施方案中，提供一种治疗哺乳动物便秘的方法，所述方法包括向哺乳动物施用本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的步骤。
在另一个实施方案中，提供一种低龋性组合物，其包含本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物和至少一种多元醇。
在另一个实施方案中，还提供本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物在适于包括人类在内的动物食用的食物组合物中的用途。
在另一个实施方案中，提供一种组合物，其包含0.01至99重量％(基于干固体)的本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物和以下物质：合生素、肽、肽水解产物、蛋白质、蛋白质水解产物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、维生素、矿物质、草药、草药提取物、脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)、植物甾体、甜菜碱、类胡萝卜素、消化酶、益生生物或它们的任意组合。
在另一个实施方案中，还提供一种由本发明方法中任一种制备的产品。
生物序列简述
下面的序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”)，并且符合世界知识产权组织(WIPO)ST.25标准(2009)以及欧洲专利公约(EPC)和专利合作条约(PCT)的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政规程的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。
SEQ ID NO：1为编码来自氧化葡糖杆菌的右旋糖酐糊精酶的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：2为由氧化葡糖杆菌的菌株表达的右旋糖酐糊精酶(本文中称为“DD酶”)的氨基酸序列(EC 2.4.1.2)(参见JP2007181452(A))。
SEQ ID NO：3是大肠杆菌(E.coli)malQ的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是大肠杆菌malS的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是大肠杆菌malP的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：6是大肠杆菌malZ的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：7是大肠杆菌amyA的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：8是终止子序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：9是接头序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：10为用于表达载体中的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)AprE信号肽的氨基酸序列，所述表达载体偶联到各种酶以在枯草芽孢杆菌中表达。
SEQ ID NO：11是质粒pTrex的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：12为来自多糖奈瑟球菌(Neisseria polysaccharea)的淀粉蔗糖酶的氨基酸序列，如gi：4107260中所提供的。
具体实施方式
在本公开中，使用了大量术语和缩写。除非另有具体说明，应用下述定义。
如本文所用，在本发明的元素或组分之前的词语“一个”、“一种”和“这个”旨在表明元素或组分的实例(即出现的事物)数量为非限制性的。因此，应将“一个”和“一种”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“包含”是指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或成分的存在，但它不预先排除一种或更多种其它特征、整数、步骤、成分或其组的存在或添加。术语“包含”意在包括由“基本由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施方案。类似地，术语“基本由……组成”包含”意在包括术语“由……组成”所涵盖的实施方案。
如本文所用，用术语“约”修饰成分或反应物的数量时是指数值量的变化，该变化可能发生在例如典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中等等。术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求都包括量的等同量。
当存在时，所有的范围均包括端值以及其中的组合。例如，当列出范围“1至5”时，所列范围应视为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2&4-5”、“1-3&5”等等。
如本文所用，术语“得自”应当是指源材料(例如，淀粉或蔗糖)能够得自特定来源，但不必须限于所述特定来源。
如本文所用，术语“有效量”将是指适于实现期望效果的所用的或所施用的物质量。物质的有效量可根据应用变化。本领域技术人员将通常能够在不进行实验的情况下确定特定应用或受试者的有效量。
如本文所用，术语“分离的”是指物质呈自然界中不存在的形式或环境。分离的物质的非限制性示例包括：(1)任何非天然存在的物质，(2)至少部分地从一种或多种或所有所述物质在自然界中与之缔合的天然存在的成分中至少部分地移除的任何物质，包括但不限于任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于存在于自然界中的物质，通过人工改性的任何物质；或者(4)通过相对于与所述物质天然缔合的其它成分，增加所述物质的量来改性的任何物质。
如本文所用，术语“非常低至没有消化度”、“很少或没有消化度”、和“低至无消化度”将是指如通过国际官方分析化学家协会(AOAC)方法2009.01(“AOAC 2009.01”，McCleary等人，(2010)J.AOAC Int.，93(1)，221-233)所测量的可溶性葡聚糖纤维的消化度的相对水平；其中很少或没有消化度将是指基于干固体计(d.s.b.)，小于12％的可溶性葡聚糖纤维组合物是可消化的，优选地小于5％可消化，更优选地小于1％可消化。在另一方面，消化度的相对水平可另选地使用AOAC 2011.25(综合总膳食纤维检测定，IntegratedTotal Dietary Fiber Assay)(McCleary 等人，2012，J.AOAC Int.，95(3)，824-844)测定。
如本文所用，术语“水溶性”将是指由在25℃下在pH7的水中以20重量％或更高可溶解的纤维构成的本发明的葡聚糖纤维组合物。
如本文所用，术语“可溶性纤维”、“可溶性葡聚糖纤维”、“α-葡聚糖纤维”、“可溶性玉米纤维”、“玉米纤维”、“葡聚糖纤维”、“可溶性膳食纤维”和“可溶性葡聚糖纤维组合物”是指由水溶性葡萄糖低聚物构成的本发明纤维组合物，所述低聚物具有3或更大的葡聚糖聚合度，其为耐消化的(即表现出非常低至没有消化度)，在人小肠中具有很少或没有吸收，并且在下消化道中至少部分地可发酵。可溶性葡聚糖纤维组合物的消化度使用AOAC方法2009.01测量。本发明可溶性葡聚糖纤维组合物由例如得自经加工淀粉或蔗糖(使用淀粉蔗糖酶)的麦芽糊精底物酶促合成。
如本文所用，“重均分子量”或“Mw”计算为Mw＝∑NiMi 2/∑NiMi；其中Mi为链的分子量并且Ni为所述分子量的链数。重均分子量可通过诸如静态光散射、小角中子散射、X射线散射和沉降速度的技术来测定。
如本文所用，“数均分子量”或“Mn”是指样本中所有聚合物链的统计平均分子量。数均分子量计算为Mn＝∑NiMi/∑Ni；其中Mi为链的分子量并且Ni为所述分子量的链数。聚合物的数均分子量可通过如下技术来测定：诸如凝胶渗透色谱法，通过(Mark-Houwink方程)测定粘度，和依数法诸如蒸气压渗透压、端基测定或质子NMR。
如本文所用，“多分散性指数”、“PDI”、“不均匀性指数”、“分散性”是指给定聚合物(诸如葡萄糖低聚物)样本中分子质量分布的量度，并且可通过将重均分子量除以数均分子量来计算(PDI＝Mw/Mn)来计算。
应当注意，如本文所用，术语“葡聚糖”和“吡喃葡萄糖”被认为是同义词并可互换使用。类似地，用于本文的术语“葡糖基”和“吡喃葡糖基”被认为是同义词并可互换使用。
如本文所用，“糖苷键(glycosidic linkages)”或“糖苷键(glycosidic bonds)”是指连接糖低聚物(寡糖和/或多糖)内的糖单体的共价键。糖苷键的示例可包括具有以下键的α-连接的葡萄糖低聚物：1，6-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1，6)键或简称为“α-(1，6)”键)；1，3-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1，3)键或简称为“α-(1，3)”键)；1，4-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1，4)键或简称为“α-(1，4)”键)；1，2-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1，2)键或简称为“α-(1，2)”键)；以及通常与支链糖低聚物缔合的此类键的组合。
如本文所用，术语“糊精右旋糖酐酶”、“DD酶”或“右旋糖酐糊精酶”将是指通常来自氧化葡糖杆菌的酶(E.C.2.4.1.2)，其由麦芽糊精底物合成右旋糖酐。DD酶催化α-(1，4)连接的供体底物(即，麦芽糊精)的非还原端葡糖基残基转移至生长的α-(1，6)受体分子的非还原端。在一个方面，DD酶以截短形式和/或成熟形式表达。在另一个实施方案中，具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：2至少90％，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性。
如本文所用，术语“葡聚糖蔗糖酶”、“葡糖基转移酶”、“葡糖苷水解酶70型”、“GTF”和“GS”是指分类为通常存在于乳酸菌诸如链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weisella)或乳杆菌属(Lactobacillus)中的糖苷-水解酶家族70的转葡糖苷酶(参见，Carbohydrate Active Enzymes database；“CAZy”；Cantarel等人，(2009)Nucleic Acids Res 37：D233-238)。GTF酶能够聚合蔗糖的D-葡糖基单元以形成同寡糖或同多糖。葡糖基转移酶可通过特征性结构识别，诸如Leemhuis等人(J.Biotechnology(2013)162：250-272)和Monchois等人(FEMS Micro.Revs.(1999)23：131-151)中所述的那些。取决于GTF酶的特异性，可形成包含各种糖苷键诸如α-(1，2)、α-(1，3)、α-(1，4)和α-(1，6)的直链和/或支链葡聚糖。葡糖基转移酶还可将D-葡糖基单元转移到羟基受体基团上。受体的非限制性列表可包括碳水化合物、醇、多元醇或类黄酮。特异性受体还可包括例如麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。
如本文所用，术语“异麦芽寡糖”或“IMO”是指基本上由通常具有DP 2至20的平均尺寸的α-D-(1，6)糖苷键构成的葡聚糖低聚物。异麦芽寡糖商业上可由α-淀粉酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶和α-葡糖苷酶对玉米淀粉或淀粉衍生物产物的酶促反应制成。可商购获得的产品包括异麦芽寡糖(DP的范围是从3到8，例如异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽五糖、异麦芽六糖、异麦芽七糖、异麦芽八糖)的混合物，并且还可包括潘糖。
如本文所用，术语“右旋糖酐”是指包含至少95％的α-D-(1，6)糖苷键(通常具有在支化点处的最多5％的α-D-(1，3)糖苷键)的水溶性α-葡聚糖，如通过国际官方分析化学家协会(AOAC)方法2009.01(“AOAC2009.01”)所测量的，其多于10％是可消化的。右旋糖酐常常具有大于1000kDa的平均分子量。如本文所用，能够由蔗糖合成右旋糖酐的酶可描述为“右旋糖酐蔗糖酶”(EC 2.4.1.5)。
如本文所用，术语“变聚糖”是指水不溶性α-葡聚糖，其主要包含(存在50％或更多的糖苷键)的1，3-α-D糖苷键并且通常具有常常大于9的聚合度(DP)。能够由蔗糖合成包含大于50％的1，3-α-D糖苷键的变聚糖或α-葡聚糖低聚物的酶可被描述为“变聚糖蔗糖酶”(EC 2.4.1.-)，前提条件是所述酶不产生交替糖。
如本文所用，术语“交替糖”是指在至少50％的直链寡糖主链内具有交替的1，3-α-D糖苷键和1，6-α-D糖苷键的α-葡聚糖。能够由蔗糖合成交替糖的酶可描述为“交替蔗糖酶”(EC 2.4.1.140)。
如本文所用，术语“罗伊糖”是指在支化点处包含1，4-α-D-糖苷键(通常＞50％)；1，6-α-D-糖苷键；以及4，6-二取代的α-葡糖基单元的可溶性α-葡聚糖。能够由蔗糖合成罗伊糖的酶可描述为“罗伊糖蔗糖酶”(EC2.4.1.-)。
如本文所用，术语“麦芽糊精底物”或“麦芽糊精”将是指包含适于用作具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽的底物的包含α-(1，4)糖苷键的寡糖或多糖。麦芽糊精容易消化并且主要由α-(1，4)糖苷键构成，并且具有3至20的DE范围，对应于10至40的典型的DP范围。糊精右旋糖酐酶催化α-(1，4)连接的供体底物(即，麦芽糊精)的非还原端葡糖基残基转移至生长的α-(1，6)受体分子的非还原端。麦芽糊精底物可得自经加工的淀粉或可使用具有淀粉蔗糖酶(EC 2.4.1.4)活性的酶由蔗糖制备(淀粉蔗糖酶为催化以下化学反应的酶：
蔗糖+(1，4-α-D-葡糖基)nD-果糖+(1，4-α-D-葡糖基)n+1。
淀粉蔗糖酶的示例为多糖奈瑟球菌淀粉蔗糖酶，如gi：4107260(SEQ ID NO：12)所提供的。
如本文所用，术语“α-葡聚糖水解酶”和“葡聚糖水解酶”是指能够内切水解α-葡聚糖低聚物的酶。如本文所用，葡聚糖水解酶可由针对某些α-D-糖苷键的内切水解活性来定义。示例可包括但不限于右旋糖酐酶(EC3.2.1.1；能够内切水解α-(1，6)-连接的糖苷键)、突变酶(EC 3.2.1.59；能够内切水解α-(1，3)-连接的糖苷键)和交替糖酶(EC 3.2.1.-；能够内切水解裂解交替糖)。各种因素包括但不限于某些α-葡聚糖内的支化程度、支化类型和相对分支长度，可不利地影响α-葡聚糖水解酶内切水解一些糖苷键的能力。
如本文所用，术语“右旋糖酐酶”(α-1，6-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶；EC 3.2.1.11)是指能够内切水解1，6-α-D-糖苷键的酶(主要存在于右旋糖酐中的键)。已知右旋糖酐酶可用于多种应用中，包括用作用于预防龋齿、斑块和/或牙垢的牙粉中的成分和用于水解原糖果汁或甘蔗和糖用甜菜的糖浆。已知多种微生物能够产生右旋糖酐酶，其中为青霉属(Penicillium)、拟青霉属(Paecilomyces)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢霉属(Fusarium)、穗孢属(Spicaria)、轮枝孢属(Verticillium)、蠕孢菌属(Helminthosporium)和毛壳霉属的真菌(Chaetomium)；乳酸菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、噬细胞菌属(Cytophaga)、枯草芽孢杆菌(Brevibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)和黄杆菌属(Flavobacterium)的细菌，以及酵母如斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)。食物级右旋糖酐酶是可商购获得的。食物级糊精酶的示例为Plus L，由Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark出售的来自毛壳菌的酶。在一个实施方案中，本发明α-葡聚糖纤维组合物使用具有糊精右旋糖酐酶活性的至少一种多肽和至少一种内切右旋糖酐酶的组合来制备。在一个优选的方面，用于制备本发明α-葡聚糖纤维组合物的方法包括单一反应体系，其中存在两种酶(至少一种糊精右旋糖酐酶和至少一种内切右旋糖酐酶)以便实现受权利要求保护的α-葡聚糖纤维组合物。
如本文所用，术语“突变酶”(葡聚糖内切-1，3-α-葡糖苷酶；EC3.2.1.59)是指水解切断1，3-α-D-糖苷键(主要存在于变聚糖中的键)的酶。突变酶购自多种细菌和真菌源。
如本文所用，术语“交替糖酶”(EC 3.2.1.-)是指内切水解裂解交替糖的酶(授予Cote等人的U.S.5,786,196)。
如本文所用，术语“野生型酶”是指包含如存在于获得和/或注释的生物体中的氨基酸序列的酶(其全长和活性截短形式)。所述酶(其全长或催化活性截短形式)可在微生物宿主细胞中重组产生。取决于微生物宿主，可引入微小的修改(通常N-端或C-端)以有利于所需酶以活性形式表达。所述酶通常在用作制备本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物中的加工助剂之前纯化。在一个方面，使用同时存在于反应体系中的至少两种野生型酶的组合以便获得本发明的可溶性葡聚糖纤维组合物。在另一个方面，本方法包括单个反应室，其包含至少一种具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽和至少一种具有内切右旋糖酐酶活性的多肽。
如本文所用，术语“底物”或“合适的底物”将是指包含具有至少3的DP的麦芽糊精的组合物。在一个实施方案中，具有糊精右旋糖酐酶活性的能够形成具有α-(1，6)糖苷键的葡萄糖低聚物的至少一种多肽的组合与至少一种内切右旋糖酐酶组合用于相同反应混合物中(即，它们同时存在并且在反应混合物中是活性的)。因此，内切右旋糖酐酶的“底物”是通过糊精右旋糖酐酶由麦芽糊精在反应体系中同时合成的葡萄糖低聚物。
如本文所用，术语“合适的酶促反应混合物”、“合适的反应组分”、“合适的含水反应混合物”和“反应混合物”是指反应物与酶在其中发生接触的材料(合适的底物)和水。合适的反应组分可由多种酶构成。在一个方面，合适的反应组分包含至少一种具有糊精右旋糖酐酶(DD酶)活性的至少一种多肽。
如本文所用，“一个单位的葡聚糖蔗糖酶活性”或“一个单位的葡糖基转移酶活性”定义为当在pH 5.5和37℃下与200g/L蔗糖温育时，转化1μmol蔗糖/分钟的酶量。蔗糖浓度使用HPLC确定。
如本文所用，“一个单位的糊精右旋糖酐酶活性”定义为当在pH 4.65和30℃下与25g/L麦芽糊精(DE 13-17)温育时，消耗1μmol的淀粉葡糖苷酶可消化的葡萄糖当量所需的酶量。淀粉葡糖苷酶可消化的葡萄糖当量通过在pH 4.65和60℃利用黑曲霉淀粉葡糖苷酶(目录号A7095，Sigma，0.6单位/mL)处理30分钟，之后HPLC定量在淀粉葡糖苷酶处理时形成的葡萄糖。
如本文所用，“一个单位的右旋糖酐酶活性”定义为当在与pH 5.5和37℃下与0.5mg/mL右旋糖酐底物温育时，形成1μmol还原糖/分钟的酶量。所述还原糖使用PAHBAH测定盒测定(Lever M.，(1972)，A New Reaction for Colorimetric Determination ofCarbohydrates，Anal.Biochem.47，273-279)。
如本文所用，“一个单位的突变酶糖酶活性”定义为当在与pH 5.5和37℃下与0.5mg/mL变聚糖底物温育时，形成1μmol还原糖/分钟的酶量。所述还原糖可使用PAHBAH测定盒测定(Lever M.，同上)。
如本文所用，术语“酶催化剂”是指包含酶和酶的组合的催化剂，其具有获得期望的可溶性葡聚糖纤维组合物的必要活性。将酶催化剂的组合用于获得期望的可溶性葡聚糖纤维组合物。在一个优选的实施方案中，两种催化剂不以单个融合蛋白质的形式偶联在一起。酶催化剂可以呈完整的微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分、部分纯化的酶、或纯化的酶的形式。在某些实施方案中，酶催化剂还可以是化学改性的(诸如通过聚乙二醇化或通过与交联剂反应)。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将酶催化剂固定到可溶性或不溶性载体上；参见例如，Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff编辑；Humana出版社，Totowa，NJ，USA；1997。
如本文所用，“药用的”是指所考虑的化合物或组合物适用于与人和其它动物的组织接触，但不具有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、过敏反应等，与合理的益处/风险比相称。
如本文所用，术语“寡糖”是指包含介于3和约30个由α-糖苷键连接的单糖单位的均聚物。
如本文所用，术语“多糖”是指包含大于30个由α-糖苷键连接的单糖单位的均聚物。
如本文所用，术语“食物”广义地用于本文以包括多种物质，所述物质可被人类消化，其包括但不限于饮料、乳制品、烘焙食物、能量棒、果冻、果酱、谷物、膳食补充剂和药用胶囊或片剂。
如本文所用，术语“宠物食物”或“动物饲料”广义地用于本文以包括多种物质，其可被非人类动物消化，并且可包括例如狗粮、猫粮和家畜饲料。
“受试者”一般是指人类，虽然如将由本领域技术人员理解的，受试者可以为非人类动物。因此，其它受试者可包括哺乳动物，诸如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、牛、马、山羊、绵羊、猪和灵长类动物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)。
如本文所用，术语“胆固醇相关疾病”包括但不限于涉及胆固醇，具体地血浆中的非高密度脂质(非HDL)胆固醇的含量升高的病症，例如LDL胆固醇的含量升高和升高的HDL/LDL比率，高胆固醇血症和高甘油三酯血症等。在具有高胆固醇血症的患者中，降低LDL胆固醇是治疗的主要目标之一。在具有高甘油三酯血症的患者中，降低高血清甘油三酯浓度是治疗的主要目标之一具体地，如本文所定义的治疗胆固醇相关的疾病包括通过施用本发明的葡聚糖纤维或包含本发明葡聚糖纤维的组合物来控制血液胆固醇水平、血液甘油三酯水平、血液脂蛋白水平、血糖和胰岛素敏感性。
如本文所用，“个人护理产品”是指用于美容处理毛发、皮肤、头皮和牙齿的产品，其包括但不限于洗发剂、爽身水、沐浴凝胶、局部保湿剂、牙膏、牙胶、漱口剂、漱口水、抗牙斑漱口液和/或其它局部治疗物。在一些特别优选的实施方案中，这些产品用于人体，而在其它实施方案中，这些产品用于由非人类动物美容使用(例如在某些兽医应用中)。
如本文所用，术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”和“分离的核酸片段”将可以互换使用，并指单链或双链RNA或DNA的聚合物，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单位。在本文中使用下列缩写来表示具体氨基酸：
本领域普通技术人员将认识到，可以进行本文公开的氨基酸序列的改性，同时保留与所公开的氨基酸序列相关的功能。例如，在本领域中熟知的是，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸但可不影响编码蛋白的功能性质的基因改变。例如，本文所公开的氨基酸序列中任何特定氨基酸可以取代另一功能等同的氨基酸。为了本发明目的，将取代定义为在以下五组中的一组内的互换：
1.小的脂族非极性残基或弱极性的残基：Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；
2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
3.极性的、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；
4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及
5.大的芳族残基：Phe、Tyr和Trp。
因此，氨基酸中丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸取代谷氨酸)或一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸取代精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N-端和C-端部分改变的核苷酸变化也预计不会改变蛋白的活性。所提出的修饰中的每一者均完全在本领域常规技术内，由所编码的产物的生物活性的保留决定。
如本文所用，术语“密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体典型的密码子使用情况。
如本文所用，“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位组装而成。将这些构件进行连接并退火以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。当涉及DNA序列时，“化学合成的”是指体外装配组分核苷酸。可以采用完善建立的方法来完成DNA的人工化学合成，或者可使用许多可商购获得的机器的其中一种来完成自动化学合成。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员能预期成功的基因表达的可能。优选密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中可获得序列信息)的检测。
如本文所用，“基因”是指能够表达特定蛋白质的核酸分子，其包括编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”是指与其自身调控序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含不同时天然可见的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”是指在生物体基因组中处于其天然位置的原生基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，但是它通过基因转移引入到宿主生物中。外来基因可包含插入到非天然生物内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法引入基因组的基因。
如本文所用，“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上核酸序列的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，即，该编码序列处于该启动子的转录控制下时，该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接到调控序列。
如本文所用的，术语“表达”指源于本发明的核酸分子的有义RNA(mRNa)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文所用，“转化”指将核酸分子转移至宿主生物体的基因组内，导致在基因上稳定遗传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(例如质粒)基因。含有转化核酸分子的宿主生物被称为“转基因”、“重组”或“转化”生物。
如本文所用，术语“序列分析软件”是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，Accelrys Software Corp.，San Diego，CA)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228S.Park St.Madison，WI53715USA)、CLUSTALW(例如，1.83版；Thompson等人，NucleicAcids Research，22(22)：4673-4680(1994))以及并入了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，开会日期1992，111-20。编辑：Suhai、Sandor.出版社：Plenum，New York，NY)、Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher v.4.05。在本申请的上下文中，应理解，在使用序列分析软件进行分析的情况中，除非另有指明，否则分析的结果将基于所提到的程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”将指在首次初始化时由软件制造商为软件最初加载的任何值或参数集。
本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物的结构特性和功能特性
人胃肠酶容易识别和消化具有大量α-(1，4)糖苷键的直链α-葡聚糖低聚物。用交替的键诸如α-(1，2)、α-(1，3)和α-(1，6)替代这些键通常减小α-葡聚糖低聚物的消化度。增加支化度(例如，α-(1，4，6)支化)也可降低相应的消化度水平。
本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物使用一种或多种酶促加工助剂由麦芽糊精底物制备，所述酶促加工助剂具有来自微生物的基本上与存在于自然界中相同的氨基酸序列(或其活性截短形式)，所述微生物具有具有长期暴露于人类的历史(天然存在于口腔中或存在于食物如啤酒、发酵的大豆等中的微生物)，或已在食物应用中被公认为安全(GRAS)的酶。可溶性纤维具有低消化度至没有消化度，表现出高耐受性(即，如由可接受的气体形成量所测量的)、低粘度(能够在宽范围食物应用中使用)、和至少部分地可被肠道菌群发酵，提供可能的益生元效应(例如，增加据报道与提供潜在的益生元效应相关的双歧杆菌和乳酸菌的数量和/或活性)
本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物由以下参数的组合来表征：
a.10-20％的α-(1，4)糖苷键；
b.60-88％的α-(1，6)糖苷键；
c.0.1-15％的α-(1，4，6)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键；
d.小于50000道尔顿的重均分子量；
e.在水中12重量％下小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)，优选地小于0.01Pa·s的粘度；
f.如分析化学师协会(Association of Analytical Communities，AOAC)方法2009.01所测量的小于12％的消化度；
g.在25℃下，pH 7水中至少20％(w/w)的溶解度；和
h.小于10，优选地小于5的多分散性指数。
在一个实施方案中，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含10-20％的α-(1，4)糖苷键，优选地13至17％的α-(1，4)糖苷键。
在一个实施方案中，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含60-88％的α-(1，6)糖苷键，优选地65至80％的α-(1，6)糖苷键；并且最优选地70-77％糖苷键。
在一个实施方案中，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含10-20％的α-(1，4)糖苷键，优选地7至11％的α-(1，4)糖苷键。
在一个实施方案中，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含0.1-15％的α-(1，4，6)和α-(1，2，6)糖苷键，优选地0.1至12％的α-(1，4，6)和α-(1，2，6)糖苷键；最优选地7至11％的α-(1，4，6)和α-(1，2，6)糖苷键。
在另一个实施方案中，除了上述实施方案之外，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物还包含小于1％的α-(1，3)糖苷键。
在另一个实施方案中，通过条件，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物(单独地或与上述实施方案中任一个组合)包含小于1％的α-(1，2)糖苷键。
在另一个实施方案中，除了以上提及的糖苷键含量实施方案之外，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含小于50000道尔顿、优选地小于40000道尔顿、更优选介于500道尔顿和40000道尔顿之间，并且最优选地约500道尔顿至约35000道尔顿的重均分子量(Mw)。
在另一个实施方案中，除了任何以上特征之外，在25℃下和水中12重量％下，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物还可具有小于250厘泊(cP)(0.25帕斯卡秒(Pa·s))、优选小于10厘泊(cP)(0.01帕斯卡秒(Pa·s))、优选小于7cP(0.007Pa·s)、更优选小于5cP(0.005Pa·s)、更优选小于4cP(0.004Pa·s)、并且最优选小于3cP(0.003Pa·s)的粘度。
如分析化学师协会(Association of Analytical Communities，AOAC)方法2009.01所测量，本发明的可溶性α-葡聚糖组合物具有小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％消化度的消化度。在另一方面，消化度的相对水平可另选地使用AOAC2011.25(综合总膳食纤维检测定，Integrated Total Dietary Fiber Assay)(McCleary等人，2012，J.AOAC Int.，95(3)，824-844)测定。
除了任何以上实施方案之外，本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物在25℃下pH 7水中还具有至少20重量/重量％、优选至少30％、40％、50％、60％或70％的溶解度。
在一个实施方案中，本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含的还原糖的含量小于10重量％、优选小于5重量％、并且最优选1重量％或更少。
在另一个实施方案中，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含介于1000和5000g/mol之间；优选地1250至4500g/mol的数均分子量(Mn)。
在一个实施方案中，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含少于4kcal/g、优选少于3kcal/g、更优选少于2.5kcal/g、并且最优选约2kcal/g或更少的含热量。
包含葡聚糖纤维的组合物
取决于期望的应用，可利用适用于食物、个人护理产品和/或药物的一种或多种其它材料配制(例如，共混、混合、掺入等)本发明的葡聚糖纤维/纤维组合物。因此，本发明包括包含本发明葡聚糖纤维组合物的组合物。在该上下文中，术语“包含本发明葡聚糖纤维组合物的组合物”可包括例如，营养或食物组合物，诸如食物产品、食物补充剂、膳食补充剂(例如，呈粉末、液体、凝胶、胶囊、香囊或片剂的形式)或功能性食物。在另一个实施方案中，“包含本发明葡聚糖纤维组合物的组合物”还可包括个人护理产品、化妆品和药物。
可直接包括本发明葡聚糖纤维/纤维组合物作为期望的产品(例如食物、个人护理产品等)中的成分，或可以与一种或多种附加的食物级材料共混以形成用于期望的产品例如食物、个人护理产品等)中的碳水化合物组合物。掺入碳水化合物中的α-葡聚糖纤维组合物的量可根据应用变化。因此，本发明包含碳水化合物组合物，所述碳水化合物组合物包含本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。在一个实施方案中，碳水化合物组合物包含0.01至99重量％(基于干固体)，优选地0.1至90重量％，更优选地1至90％，并且最优选地5至80重量％的上述可溶性葡聚糖纤维组合物。
如本文所用，术语“食物”旨在包括人类食用以及动物食用的食物。所谓“功能性食物”，是指声称具有除供应营养物的基础营养功能之外的健康促进和/或疾病预防和/或疾病(风险)降低特性的任何新鲜的或经加工的食物。功能性食物可包括例如，经加工的食物或利用健康促进添加剂强化的食物。功能性食物的示例为利用维生素强化的食物，或具有活的培养物的发酵食物。
包含本发明可溶性α-葡聚糖纤维素组合物的碳水化合物组合物可包含本领域已知包含在营养组合物中的其它材料，诸如水或其它水性溶液、脂肪、糖、淀粉、粘合剂、增稠剂、着色剂、调味剂、着嗅剂、酸化剂(例如乳酸或苹果酸等)、稳定剂、或高强度甜味剂、或矿物质等。适宜的食物产品的示例包括面包、早餐谷物、饼干、蛋糕、曲奇、梳打饼、酸奶、酸乳酒、味噌、纳豆、豆豉、泡菜、酸菜、水、牛奶、果汁、蔬菜汁、碳酸软饮料、非碳酸软饮料、咖啡、茶、啤酒、葡萄酒、烈酒、酒精饮料、小吃、汤、冷冻甜点、油炸食物、比萨、意面制品、马铃薯制品、大米制品、玉米制品、小麦制品、乳制品、硬糖、营养棒、谷物、生面团、加工肉类和奶酪、酸奶、冰淇淋甜点、基于牛奶的饮料、沙拉酱、调味汁、浇头、甜点、糖果产品、基于谷物的小吃棒、制备的菜肴等。包含本发明α-葡聚糖纤维的碳水化合物组合物可以呈液体、粉末、片剂、立方体、颗粒、凝胶或糖浆的形式。
在一个实施方案中，根据本发明的碳水化合物组合物可包含至少两种纤维源(即，本发明α-葡聚糖纤维组合物之外的至少一种附加的纤维源)。在另一个实施方案中，一种纤维源为本发明的葡聚糖纤维并且第二纤维源为寡糖或多糖，其选自抗性/支链麦芽糊精/纤维糊精(诸如得自Roquette Freres(Lestrem，France)的得自DM-Matsutani LLC(Decatur，Illinois)的)，聚右旋糖(得自Danisco-DuPontNutrition&Health(Wilmington，DE)的)，可溶性玉米纤维(例如，得自Tate&Lyle(London，UK)的)，异麦芽寡糖(IMO)、交替糖和/或麦芽交替糖寡糖(MAO)(例如，得自Aevotis GmbH(Potsdam，Germany)的FIBERMALTTM；SUCROMALTTM(得自Cargill Inc.(Minneapolis，MN)、支链淀粉、抗性淀粉、菊糖、果寡糖(FOS)、半乳糖寡糖(GOS)、木寡糖、阿拉伯木寡糖、尼古尔寡糖、龙胆寡糖、半纤维素和果糖低聚物糖浆。
本发明可溶性α-葡聚糖纤维可作为常规碳水化合物的替代物或补充剂加入食物中。因此，本发明的另一个实施方案是包含本发明可溶性α-葡聚糖纤维的食物产品。在另一个方面，所述食物产品包含通过本发明方法制备的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
可溶性α-葡聚糖纤维组合物可用于碳水化合物组合物和/或食物产品中，所述组合物和/或食物产品包含一种或多种高强度人造甜味剂，包括但不限于甜叶菊、阿斯巴甜、蔗糖素、纽甜、丁磺氨钾、糖精、以及它们的组合。本发明可溶性α-葡聚糖纤维可与糖替代物共混，所述糖替代物诸如甜味蛋白、仙茅甜蛋白、赤藓醇、甘油醇、甘草甜素、氢化淀粉水解物、菊粉、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、麦芽寡糖、麦芽交替寡糖(诸如，SUCROMALTTM，购自Cargill Inc.(Minneapolis，MN)、甘露醇、神奇蛋白、罗汉果苷混合物、莫纳甜、莫内林、osladin、五聚糖、山梨醇、甜菊糖、塔格糖、索马甜、木糖醇以及它们的任意组合。
包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的食物产品将具有比其中使用常规碳水化合物的类似食物产品更低的血糖应答、更低的血糖指数、和更低的血糖负载。另外，因为可溶性α-葡聚糖纤维的特征在于人类胃或小肠中的非常低的消化度至没有消化度，所以降低了食物产品的含热量。本发明的水溶性α-葡聚糖纤维可以粉末的形式使用，共混入具有其它可溶性食物成分的干粉末中，或可以包含本发明膳食纤维的液体糖浆(本文中也被称为“可溶性纤维糖浆”、“纤维糖浆”或简称“糖浆”)的形式共混或使用。“糖浆”可作为可溶性纤维源加入食物产品中。其可增加食物产品的纤维含量，但对风味、口感、或质感不具有负面影响。
纤维糖浆可单独地或与增量剂诸如糖醇或麦芽糊精组合地用于食物产品中，以减少含热量和/或增强产品的营养特征。纤维糖浆还可用作食物产品中脂肪的部分替代物。
纤维糖浆可作为嫩化剂或调质剂用于食物产品中，以增加脆性或折断性、改善视觉吸引力、和/或改善生面团、奶蛋糊或其它食物组合物的流变性。纤维糖浆还可作为湿润剂用于食物产品中，以增加产品的架藏寿命、和/或产生更柔软、更湿润的质地。其还可用于食物产品中以降低水活性或固定和管理水。纤维糖浆的附加用途可包括：替代涂蛋液和或增强食物产品的表面光泽、改变面粉淀粉糊化温度、改性产品的质地、以及增强产品的褐变。
纤维糖浆可用与各种类型的食物产品中。其中本发明糖浆可非常有用的一种食物产品类型是烘焙产品(即烘焙食物)，诸如蛋糕、布朗尼、曲奇、曲奇松脆片、松饼、面包和甜面团。常规的烘焙产品可具有相对高的糖和高的总碳水化合物。本发明糖浆用作烘焙产品中的成分可有助于降低糖和碳水化合物含量，以及降低总卡路里，同时增加烘焙产品的纤维含量。
存在烘焙产品的两种主要类型：酵母发酵和化学发酵。在酵母发酵的产品，如甜甜图、甜面团和面包中，本发明的包含纤维的糖浆可用于替代糖，但少量糖仍然可能是期望的，这是由于酵母或外壳褐变需要发酵底物。纤维糖浆可作为包含非纤维的糖浆或液体甜味剂的直接替代物与其它液体一起添加。然后，生面团可在烘焙行业中常用的条件下加工，包括混合、发酵、分开、成形或挤出为长面包或挤出成型、发面、和烘焙或油炸。可使用类似于传统产品的条件，将产品烘焙或油炸。面包可通常在420°F至520°F(216-271℃)范围内的温度下烘焙20至23分钟，并且甜甜圈可在400-415°F(204-213℃)范围内的温度下油炸，但还可使用其它温度和时间。
化学发酵的产品通常具有更多的糖，并且可包含更高含量的包含本发明可溶性α-葡聚糖纤维的碳水化合物组合物和/或可食用糖浆。成品曲奇可包含30％糖，其可完全地或部分地用包含本发明葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物和/或糖浆替代。这些产物可具有例如4-9.5的pH。含水量可例如介于2-40％之间。
在膏化步骤期间在开始混合时，或在类似于糖浆或干甜味剂正在被替代的任何方法中，本发明碳水化合物组合物和/或包含纤维的浆料可容易地掺入并可加入脂肪中。可将产品混合并且然后例如通过成片、旋转切割、线切割或通过另一成型工艺成形。然后可在典型的烘焙条件下，例如在200-450°F(93-232℃)下，烘焙产品。
其中可使用碳水化合物组合物和/或包含纤维的糖浆的另一食物产品类型是早餐谷物。例如，包含纤维的糖浆可用于替换在挤出的谷物片中和/或那些片的外部包衣中的全部或部分的糖。所述包衣通常为成品谷物片总重量的30-60％。糖浆可以例如喷雾或洒落形式施用。
其中可使用(任选地以碳水化合物组合物和/或包含纤维的糖浆的形式)本发明α-葡聚糖纤维组合物的另一食物产品类型是乳制品。其中其可使用的乳制品的示例包括酸奶、酸奶饮料、乳饮料、调味乳、冰沙、冰淇淋、奶昔、脱脂乳酸干酪、脱脂乳酸干酪调味品、和乳制品甜点，诸如脱脂凝乳和打发的慕斯型产品。这可包括旨在直接食用的乳制品(例如包装好的冰沙)以及旨在与其它成分共混的那些(例如共混的冰沙)。其可用于巴氏灭菌乳制品，诸如在160°F至285°F(71-141℃)的温度下巴氏灭菌的乳制品。
其中可使用包含α-葡聚糖纤维组合物的组合物的另一食物产品类型是糖果。其可用于其中的糖果的示例包括硬糖、方旦糖、牛轧糖和棉花糖、明胶果冻糖或胶糖、果冻、巧克力、甘草、口香糖、焦糖和太妃糖、求斯糖、薄荷糖、片状糖果和水果干。在水果干中，包含本发明α-葡聚糖纤维的组合物可与果汁组合使用。所述果汁可提供大部分甜味，并且包含葡聚糖纤维的组合物可减少总糖含量并增加纤维。可将包含葡聚糖纤维的本发明组合物加入最初的糖浆中并且加热至最终固含量。所述浆料可从200-305°F(93-152℃)加热以实现最终固含量。可在加热之前或之后加入酸以产生为2-7的最终pH。可将包含葡聚糖纤维的组合物用作存在的0-100％的糖和1-100％的玉米糖浆或其它甜味剂的替代物。
其中可使用包含α-葡聚糖纤维组合物的组合物的另一食物产品类型是果酱和果冻。果酱和果冻由水果制成。果酱包含水果片，然而果冻由果汁制成。包含本发明纤维的组合物可如下代替糖或其它甜味剂使用：将水果和果汁称入罐中；将糖、含纤维组合物和果胶预混；将干组合物加入液体中并煮至214-220°F(101-104℃)的温度；热填充到广口瓶中并蒸馏5-30分钟。
其中可使用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物(诸如包含纤维的糖浆)的另一食物产品类型是饮料。其可用于其中的饮料的示例包括碳酸饮料、果汁、浓缩果汁混合物(例如玛格丽特混合物)、清水、和饮料干混物。使用本发明α-葡聚糖纤维可克服当将其它类型的纤维加入饮料中时产生的透明度问题。糖的完全替代是可能的(其可以例如为高达总配方的12％或更多)。
另一产品类型是高固体填充物。高固体填充物的示例包括小吃条、烤酥饼、甜甜圈和曲奇中的填充物。高固体填充物可以为例如酸/水果填充物或有香味的填充物。纤维组合物可加入原样食用的产品中，或加入可通过食物加工机(附加的烘焙)或通过消费者(烘焙稳定填充)进行进一步加工的产品中。在本发明的一些实施方案中，高固体填充物可具有介于67-90％之间的固体浓度。所述固体可被包含本发明α-葡聚糖纤维的组合物完全替换，或其可用于存在的其它甜味剂固体的部分替换(例如，替换5-100％的现有固体)。通常水果填充物可具有2-6的pH，然而有香味的填充物可介于4-8pH之间。填充物可冷却制备或在高达250°F(121℃)下加热以蒸发至期望的最终固含量。
其中可使用α-葡聚糖纤维组合物或(包含α-葡聚糖纤维组合物)的碳水化合物组合物的另一食物产品类型是挤出和成片的小吃。其可使用的挤出和成片小吃的示例包括膨化小吃、梳打饼、未经发酵的玉米片和玉米薄片。在制备挤出片时，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可与干产品一起直接添加。可在挤出机中添加少量水，并且然后，其可通过在100°F至300°F(38-149℃)范围内的各种区域。所述干产品可以干产品混合物的0-50％的含量添加。包含本发明葡聚糖纤维的糖浆还可沿挤出机在液体端口之一处加入。产品可以低含水量(5％)制出，并且然后烘焙以移除过量水分，或以略高水分含量(10％)制出，并且然后油炸以移除水分并煮出产品。烘焙可以在高达500°F(260℃)的温度下持续20分钟。烘焙可更典型地在350°F(177℃)下持续10分钟。烘焙可通常在350°F(177℃)下持续2-5分钟。在片状小吃中，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可用作其它干燥成分(例如，面粉)的部分替代物。其可以为干重的0-50％。可将产品干混，并且然后加入水以形成粘性面团。产品混合物可具有5至8的pH。然后可将生面团成片并切割，并且然后烘焙或油炸。烘焙可以在高达500°F(260℃)的温度下持续20分钟。烘焙可通常在350°F(177℃)下持续2-5分钟。来自使用包含本发明葡聚糖纤维的组合物的另一潜在益处是当其作为内部成分添加或作为油炸食物的外部上的包衣添加时，油炸小吃中的脂肪含量减少多达15％。
其中可使用包含纤维的糖浆的另一食物产品类型是明胶状点心。明胶状点心的成分常常作为干混物出售，其中明胶作为胶凝剂。糖固体可利用干混物中包含本发明葡聚糖纤维的组合物部分或完全地替代。然后可将干混物与水混合并加热至212°F(100℃)以溶解明胶，并且然后可加入更多水和/或水果以完成明胶状点心。然后使明胶冷却并固化。明胶还可以架藏稳定的包装出售。在该情况下，稳定剂通常是基于角叉菜胶的。如上所述，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可用于替代最高达100％的其它甜味剂固体。可将干燥成分混入液体中并且然后巴氏灭菌并放入杯中，并使其冷却和固化。
其中可使用包含本发明葡聚糖纤维的组合物的另一食物产品类型是小吃棒。其可用于其中的小吃棒的示例包括早餐替代棒和代餐棒、营养棒、granola棒、蛋白质棒、和谷物棒。其可用于小吃棒的任一部分中，诸如在高固体填充物、结合糖浆、或颗粒部分中。完全或部分替代结合糖浆中的糖是可能的。结合糖浆通常为50-90％固体，并且以在10％结合糖浆与90％颗粒，至70％结合糖浆与30％颗粒范围内的比率施用。结合糖浆通过将甜味剂、增量剂、和其它粘合剂(如淀粉)的溶液加热至160-230°F(71-110℃)来制备(取决于糖浆中所需的最终固体)。然后将糖浆与颗粒混合以包覆颗粒，从而提供遍布基质的包衣。包含本发明葡聚糖纤维的组合物还可用于颗粒本身。这可以为直接膨胀或枪式膨化的挤出片。其可以与另一种谷物成分、玉米粗粉、米粉或其它类似成分组合使用。
其中可使用包含本发明葡聚糖纤维糖浆的组合物的另一食物产品类型是奶酪、奶酪酱和其它奶酪制品。其可用于其中的奶酪、奶酪酱和其它奶酪制品的示例包括低乳固体奶酪、低脂奶酪、和低卡路里奶酪。在块状奶酪中，其可有助于改善熔融特性，或减小通过其它成分诸如淀粉增加的熔融限制效果。其还可用于奶酪酱中，例如作为增量剂，来替代脂肪、乳固体或其它典型的增量剂。
其中可使用包含本发明葡聚糖纤维的组合物的另一食物产品类型是可食用和/或水溶性的膜。其可用于其中的膜的示例包括用于包封旨在用于水中的各种食物和饮料的干混物的膜，或者用于递送颜色或风味剂的膜，诸如在烹饪之后但仍然热时加入食物中的香料膜。其它膜应用包括但不限于水果和蔬菜植物鞣皮，以及其它柔性膜。
在另一个实施方案中，可使用的包含本发明葡聚糖纤维的组合物为汤、糖浆、酱汁、和调味品。典型的调味品可以为0-50％油，其pH范围为2-7。其可冷加工或热加工。可将其混合，并且然后可添加稳定剂。根据需要，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可容易地以液体形式或干燥形式与其它成分一起添加。调味品组合物可需要加热以活化稳定剂。典型的加热条件可以为170-200°F(77-93℃)并持续1-30分钟。在冷却之后，加入油以制备预乳液。然后，使用匀化器、胶体磨或其它高剪切工艺将产品乳化。
酱汁可具有0-10％油和10-50％总固体，并且可具有2-8的pH。酱汁可冷加工或热加工。将成分混合并且然后热加工。根据需要，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可容易地以液体形式或干燥形式与其它成分一起添加。典型的加热可以为170-200°F(77-93℃)并持续1-30分钟。
汤更典型地为20-50％固体并且处于更中性的pH范围(4-8)。它们可以为干混合物，可向其添加包含本发明葡聚糖纤维的干燥组合物，或者将液体汤罐装并且然后蒸馏。在汤中，可使用最高达50％固体的抗性玉米糖浆，但更典型的用途是可以递送5g纤维/份。
其中可使用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物的另一食物产品类型是咖啡奶精。其可用于其中的咖啡奶精包括液体奶精和干奶精两者。干共混的咖啡奶精可与以下脂肪类型的商业奶精粉末共混：大豆油、椰子油、棕榈油、葵花油或卡诺拉油、或乳脂。这些脂肪可以为非氢化的或氢化的。包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物可作为纤维源，任选地与果寡糖、聚右旋糖、菊糖、麦芽糊精、抗性淀粉、蔗糖和/或常规玉米糖浆固体一起添加。所述组合物还可包含高强度甜味剂，诸如蔗糖素、乙酰磺胺酸钾、阿斯巴甜、或它们的组合。可将这些成分干共混以制备期望的组合物。
喷雾干燥的奶精粉末为脂肪、蛋白质和碳水化合物、乳化剂、乳化盐、甜味剂和抗结块剂的组合。脂肪源可以为大豆油、椰子油、棕榈油、葵花油或卡诺拉油或乳脂中的一种或多种。蛋白质可以为酪蛋白酸钠或酪蛋白酸钙、乳蛋白、乳清蛋白、小麦蛋白或大豆蛋白。碳水化合物可以为单独包含本发明的α-葡聚糖纤维组合物的组合物，或包含本发明的α-葡聚糖纤维组合物与果寡糖、聚右旋糖、菊粉、抗性淀粉、麦芽糊精、蔗糖、玉米糖浆或它们的任意组合的组合的组合物。乳化剂可以为甘油单酯和甘油二酯、乙酰化甘油单酯和甘油二酯、或丙二醇单酯。所述盐可以为柠檬酸三钠、磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠、焦磷酸四钠、磷酸二氢钾、和/或磷酸二钾。所述组合物还可包含高强度甜味剂，诸如上述那些。适宜的抗结块剂包括硅铝酸钠或二氧化硅。产品可混合于浆料中，任选地均化，并且以颗粒或附聚形式喷雾干燥。
液体咖啡奶精仅是脂肪(乳脂或氢化植物油)、一些乳固体或酪蛋白酸盐、玉米糖浆和香草风味剂或其它风味剂的经匀化和巴氏灭菌的乳液，以及稳定化共混物。产品通常在185°F(85℃)下经由HTST(高温短时)巴氏灭菌30秒，或在285°F(141℃)下UHT(超高温)巴氏灭菌4秒，并且在两塔板均化器中以第一塔板500-3000psi(3.45-20.7MPa)，和第二塔板200-1000psi(1.38-6.89MPa)均化。通常将咖啡奶精稳定化使得其在加入咖啡中时不分解。
其中可使用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物(诸如包含纤维的糖浆)的另一食物产品类型是食物包衣诸如糖衣、糖霜、糖浆。在糖衣和糖霜中，包含纤维的糖浆可用作甜味剂替代物(完全或部分的)以降低含热量并增加纤维含量。糖浆通常为约70-90％的糖，其中剩余的大部分为水，并且包含纤维的糖浆可用于完全或部分替代糖。糖霜通常包含约2-40％的液体/固体脂肪组合、约20-75％甜味剂固体、颜料、风味剂和水。包含纤维的糖浆可用于替换完全或部分的甜味剂固体，或作为低脂肪体系中的增量剂。
其中可使用包含纤维的糖浆的另一食物产品类型是宠物食物，诸如干或湿的狗粮。宠物食物以各种方式制备，诸如挤出、成形、和配制成肉汁。包含纤维的糖浆可以0-50％的含量用于这些类型的每一种中。
其中可使用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物(诸如糖浆)的另一食物产品类型是鱼和肉。在一些肉中已经使用了常规的玉米糖浆，所以包含纤维的糖浆可用作部分或完全的替代物。例如，糖浆可在其真空翻滚或注入肉中之前，加入盐水中。其可与盐和磷酸盐，以及任选地与水结合成分诸如淀粉、角叉菜胶或大豆蛋白一起添加。这可用于增加纤维，典型的含量可以为5g/次，这可满足对优异纤维源的要求。
包含本发明可溶性纤维的个人护理和/或药物组合物
本发明葡聚糖纤维和/或包含本发明葡聚糖纤维的组合物可用于个人护理产品中。例如，可能够使用此类材料作为湿润剂、水解胶体或可能的增稠剂。如果需要，本发明纤维和/或包含本发明纤维的组合物可与一种或多种其它类型的增稠剂结合使用，诸如在美国专利8,541,041中所公开的那些，该专利以引用方式全文并入本文。
本文个人护理产品包括但不限于皮肤护理组合物、美容组合物、抗真菌组合物、和抗菌组合物。本文的个人护理产品可为例如洗剂、霜剂、糊剂、油膏、膏剂、润发油、凝胶、液体以及它们的组合等的形式。本文公开的个人护理产品可包含至少一种活性成分。活性成分公认为产生期望药理效果或美容效果的成分。
在某些实施方案中，可将皮肤护理产品施用于皮肤，以解决与缺乏水分相关的皮肤损伤。皮肤护理产品也可用于改善皮肤的视觉外观(例如减少片状、破裂和/或红皮肤的外观)和/或皮肤的触感(例如，降低皮肤的粗糙度和/或干燥度，同时增加皮肤的柔滑度和细腻度)。皮肤护理产品通常可包含至少一种活性成分以治疗或预防皮肤疾病，提供美容效果，或向皮肤提供保湿益处，所述活性成分如氧化锌、凡士林、白凡士林、矿物油、鱼肝油、羊毛脂、聚二甲基硅氧烷、硬脂肪、维生素A、尿囊素、菱锌矿、高岭土、甘油、或胶状燕麦、以及这些的组合。例如，皮肤护理产品可包含一种或多种天然的增湿因子，例如神经酰胺、透明质酸、甘油、角鲨烷、氨基酸、胆固醇、脂肪酸、甘油三酯、磷脂、糖鞘脂、脲、亚油酸、糖胺聚糖、黏多糖、乳酸钠或吡咯烷酮羧酸钠。可包含在皮肤护理产品中的其它成分包括但不限于甘油酯、杏仁油、芥花籽油、角鲨烷、角鲨烯、椰油、玉米油、霍霍巴油、霍霍巴蜡、卵磷脂、橄榄油、红花油、芝麻油、牛油树脂、豆油、甜杏仁油、向日葵油、茶树油、牛油树脂、棕榈油、胆固醇、胆固醇酯、蜡酯、脂肪酸和橙油。
本文的个人皮肤护理产品还可以是化妆品或其它产品的形式，包括但不限于例如唇膏、睫毛膏、胭脂、粉底、腮红。眼线膏、唇线笔、唇彩、其它化妆品、防晒霜、防晒剂(sunblock)、指甲油、摩丝、喷发剂、定型凝胶、指甲调理剂、洗浴凝胶、淋浴凝胶、身体洗涤剂、洗脸剂、洗发剂、皮肤调理剂(免洗型或清洗型)、营养发水、染发剂、染发产品、亮发产品、护发精华素、头发防卷曲产品、头发分叉端修复产品、唇膏、皮肤调理剂、冷霜、保湿剂、身体喷剂、肥皂、身体擦洗剂、去死皮剂、收敛剂、紧肤洗剂、脱毛剂、烫发液、去屑制剂、止汗剂组合物、除臭剂、剃须产品、剃须前产品、剃须后产品、清洁剂、皮肤凝胶、漂洗剂、牙膏或漱口剂。
本文的药学产品可例如呈乳液、液体、酏剂、凝胶、混悬液、溶液、霜剂、胶囊、片剂、香囊或膏剂的形式。此外，本文的药物产品可以是本文所公开的任意个人护理产品的形式。药物产品还可包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或药学上可接受的盐。本发明纤维和/或包含本发明纤维的组合物还可用于胶囊、包封材料、片剂包衣中，并作为赋形剂用于药剂和药物。
可溶性α-葡聚糖纤维组合物的酶促合成
提供酶促制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括至少一种具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽(E.C.2.4.1.2)与至少一种具有右旋糖酐酶活性(E.C.3.2.1.11)，优选地内切右旋糖酐酶活性的多肽的组合使用。在优选的方面，具有糊精酶右旋糖酐酶活性的多肽(CAS 9025-70-1)和具有内切右旋糖酐酶活性的多肽存在于相同反应混合物中以便实现受权利要求保护的α-葡聚糖纤维组合物。用于本发明方法的酶优选具有与天然存在的氨基酸序列一致的氨基酸序列(即，与存在于源生物体的全长序列或其催化活性截短形式相同)。
在一个方面，所述具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽包含具有与SEQ ID NO：2至少90％，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。然而，应当注意一些野生型序列可以截短形式存在于自然界中。因此，并且在另一个实施方案中，适用的糊精右旋糖酐酶可以为野生型序列的截短形式。在另一个实施方案中，截短的葡糖基转移酶包含选自SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明酶促合成还包含(除了具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽之外)具有内切右旋糖酐酶活性的α-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.11)。在一个方面，内切右旋糖酐酶得自毛壳属(Chaetomium)，优选地毛壳菌(Chaetomium erraticum)。在另一优选的方面，内切右旋糖酐酶是来自毛壳菌的右旋糖酐酶L。在一个优选的实施方案中，内切右旋糖酐酶不具有显著的麦芽糖水解活性，优选地不具有麦芽糖水解活性。
含水反应制剂中催化剂的浓度取决于每种催化剂的特定催化活性，并且对该浓度进行选择以获得所需的反应速率。每种催化剂的重量(至少一种具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽和至少一种具有内切右旋糖酐酶活性的多肽)通常在0.0001mg至20mg/mL总反应体积，优选0.001mg至10mg/ml范围内。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将催化剂固定到可溶性或不溶性支持体上；参见例如，Immobilization of Enzymes and Cells；GordonF.Bickerstaff，编辑；Humana出版社，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化催化剂允许在后续反应中进行回收和重复使用。酶催化剂可为下列形式：全微生物细胞、透化微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的或纯化的酶以及它们的混合物。
最终反应制剂的pH值为约3至约8，优选约4至约8，更优选约5至约8，甚至更优选约5.5至约7.5，甚至更优选约5.5至约6.5。可通过添加合适的缓冲液，包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、或柠檬酸盐，来控制反应的pH值。使用缓冲剂时，其浓度通常为0.1mM至1.0M，优选1mM至300mM，最优选10mM至100mM。
当将反应组分混合时，最初存在的麦芽糊精底物浓度为至少10g/L，优选地50g/L至600g/L，更优选地100g/L至500g/L，更优选地150g/L至450g/L，并且更优选地250g/L至450g/L。麦芽糊精底物将通常具有在3至40，优选地3至20范围内的DE；对应于3至约40，优选地6至40，并且最优选地6至25的DP范围)。内切右旋糖酐酶的底物将为由糊精右旋糖酐酶形成的葡萄糖低聚物群体的成员。存在于反应体系中的每种物质的实际浓度将变化。
反应的长度可变化并且可通常通过使用所有可获得的蔗糖底物所花费的时间量来测定。在一个实施方案中，进行反应直至消耗至少90％，优选地至少95％，并且最优选地至少99％的最初存在于反应混合物中的麦芽糊精底物。在另一个实施方案中，反应时间为1小时至168小时，优选地1小时至120小时，或优选地1小时至72小时，或另外1小时至24小时。
可溶性葡聚糖纤维合成-包含糊精右旋糖酐酶和内切右旋糖酐酶的反应体系
本发明提供使用至少一种具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽与至少一种具有内切右旋糖酐酶活性的多肽的组合(即，同时处于反应混合物中)，酶促制备本发明可溶性葡聚糖纤维的方法。当与相同酶的顺序施用(即，首先使用糊精右旋糖酐酶由麦芽糊精合成葡聚糖聚合物并且随后利用内切右旋糖酐酶处理葡聚糖聚合物)相比时，同时使用两种酶产生不同产物特征(即，可溶性纤维组合物的特征)。在一个实施方案中，特别排除了基于糊精右旋糖酐酶与内切右旋糖酐酶的顺序施用的葡聚糖纤维合成方法。
α-葡聚糖水解酶可通过对某些α-D-糖苷键的内切水解活性来定义。示例可包括但不限于右旋糖酐酶(能够水解α-(1，6)-连接的糖苷键；E.C.3.2.1.11)、突变酶(能够水解α-(1，3)-连接的糖苷键；E.C.3.2.1.59)、霉菌右旋糖酐酶(能够内切水解包含(1→3)-和(1→4)-键两者的α-D-葡聚糖的(1→4)-α-D-糖苷键；EC 3.2.1.61)、葡聚糖1，6-α-葡糖苷酶(EC3.2.1.70)和交替糖酶(能够内切水解裂解交替糖；E.C.3.2.1.-；参见U.S.5,786,196)。各种因素包括但不限于某些α-葡聚糖内的支化程度、支化类型和相对分支长度，可不利地影响α-葡聚糖水解酶内切水解一些糖苷键的能力。
在一个实施方案中，α-葡聚糖水解酶为右旋糖酐酶(EC 3.2.1.11)、突变酶(EC3.1.1.59)或他它们的组合。在一个实施方案中，右旋糖酐酶是来自毛壳菌的食物级右旋糖酐酶。在另一个实施方案中，右旋糖酐酶是来自毛壳菌的右旋糖酐酶L。在另一个实施方案中，来自毛壳菌的右旋糖酐酶为PLUS L，购自Novozymes A/S，Denmark。
可对包括同时使用至少一种糊精右旋糖酐酶和至少一种α-葡聚糖水解酶(具有内切右旋糖酐酶活性)的酶促反应体系的温度进行选择，来控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反应温度范围可以从仅高于反应制剂的凝固点(约0℃)至约60℃，优选的范围为5℃至约55℃，更优选的反应温度范围为约20℃至约47℃。
糊精右旋糖酐酶活性与内切右旋糖酐酶活性的比率可根据选择的酶变化。在一个实施方案中，糊精右旋糖酐酶活性与内切右旋糖酐酶活性的比率的范围是从1∶0.01到0.01∶1.0。
在一个实施方案中，提供了一种制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，该方法包括：
a.提供一系列的反应组分，其包括：
i.麦芽糊精底物；
ii.至少一种具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽(E.C.2.4.1.2)；以及
iii.至少一种具有内切右旋糖酐酶活性的多肽(E.C.3.2.1.11)，其能够内切水解具有一个或多个α-(1，6)糖苷键的葡聚糖聚合物；
b.在适当的含水反应条件下在单一反应体系中将所述反应组分的系列混合，从而制备包含可溶性α-葡聚糖纤维的产品；以及
c.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物与步骤(b)的产品分离。
在优选的实施方案中，上述方法还包括步骤(d)：将可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
识别具有期望活性的基本上相似的酶的方法
本领域技术人员认识到，基本上相似的酶序列也可以用于本发明的组合物和方法中，只要保留期望的活性(即，能够形成具有期望的糖苷键的葡聚糖的糊精右旋糖酐酶活性或α-葡聚糖水解酶具有针对目标糖苷键的内切水解活性(即内切右旋糖酐酶活性)即可。在一个实施方案中，基本上类似的序列通过它们在高严格条件下杂交到与本文例示的序列相关联的核酸分子上的能力进行定义。在另一个实施方案中，可基于与本文提供的DNA或氨基酸序列的百分比同一性，使用序列对比算法定义基本上类似的酶。
如本文所用，当第一个分子的单链能够在合适的温度和溶液离子浓度条件下对其他分子退火时，核酸分子对另一个核酸分子如cDNA、基因组DNA、或RNA来说是“可杂交的”。杂交和洗涤条件是熟知的并且例示于Sambrook，J.和Russell，D.，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor(2001)。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的分子(例如来自远缘生物的同源序列)到高度相似的分子(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后洗涤通常决定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC，0.5％SDS在室温洗涤15分钟，然后用2X SSC，0.5％SDS在45℃重复30分钟，然后用0.2X SSC，0.5％SDS在50℃重复洗涤两次，每次30分钟。一组更优选的条件使用较高温度，其中洗涤步骤与上述那些步骤相同，不同的是最后两次用0.2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的高度严格的杂交条件是0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，并且2X SSC，0.1％SDS洗涤，之后是0.1X SSC，0.1％SDS的最终洗涤。
杂交需要包含互补序列的两种核酸，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经导出了用于计算Tm的公式(Sambrook，J.和Russell，D.，T.，同上)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更为重要，而且寡核苷酸的长度确定了其特异性。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交的核酸的最小长度为至少约15个核苷酸，更优选至少约20个核苷酸，甚至更优选至少30个核苷酸，甚至更优选至少300个核苷酸，最优选至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。
如本文所用，术语“百分比同一性”为两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的核苷酸或氨基酸的匹配数确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.，编辑)，Oxford University出版社，NY(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)，Academic出版社，NY(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.与Griffin，H.G.编辑)Humana出版社，NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic出版社(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov，M与Devereux，J.编辑)Stockton出版社，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中被编成了代码。序列比对和同一性百分比计算可使用LASERGENE生物信息学计算软件包的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)、或EMBOSS Open Software Suite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends inGenetics 16，(6)：276-277(2000))。可使用比对的CLUSTAL方法(诸如CLUSTALW；例如版本1.83)利用默认参数来进行序列的多重比对(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.22：4673-4680(1994)以及Chenna等人，Nucleic AcidsRes 31(13)：3497-500(2003)，可通过European Bioinformatics Institute得自EuropeanMolecular Biology Laboratory)。CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括GAP Existencepenalty＝15、GAP extension＝0.2、matrix＝Gonnet(例如Gonnet250)、protein ENDGAP＝-1，protein GAPDIST＝4、以及KTUPLE＝1。在一个实施方案中，使用默认设置进行快速或慢速比对，其中优选慢速比对。另选地，可将使用CLUSTALW方法(例如1.83版)的参数修改为也使用KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝10、GAP extension＝1、matrix＝BLOSUM(例如BLOSUM64)、WINDOW＝5、以及TOP DIAGONALS SAVED＝5。
在一个方面，合适的分离型核酸分子编码下述多肽，其包括的氨基酸序列与本文报道的氨基酸序列至少约20％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同。在另一方面，合适的分离型核酸分子编码下述多肽，其包含的氨基酸序列至少约20％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％与本文报道的氨基酸序列相同；前提条件是所述多肽维持了相应活性(即糊精右旋糖酐酶或(内切)右旋糖酐酶活性)。
气体产生
在下消化道中的快速气体产生速率引起胃肠道不适，诸如肠胃气胀和胃气胀，然而如果气体产生是渐进的和少的，则身体可以更容易地应付。例如，当在当量剂量(可溶性纤维克数)下与本发明葡聚糖纤维组合物相比时，菊粉产生快速且高的气体产生增加，然而在当量剂量下本发明葡聚糖纤维组合物优选具有低于菊粉的气体释放速率。
在一个实施方案中，包含本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的食物产品的食用包括对于食物应用而言良好耐受的气体产生速率。在一个实施方案中，在当量剂量下，气体产生的相对速率不大于在类似条件下对于菊粉所观察到的速率，优选地与菊粉相同或小于菊粉，更优选地小于菊粉，并且最优选地远小于菊粉。在另一个实施方案中，使用本文所用的方法，经过3小时或24小时，测量气体形成的相对速率。在优选的方面，在相同反应条件下，气体形成速率比对于菊粉所观察到的速率小至少1％，优选的2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或至少30％。
有益的生理特性
短链脂肪酸产生
使用根据本发明的化合物可有利于通过结肠发酵产生产能代谢物。使用根据本发明的化合物可有利于制备短链脂肪酸(SCFA)，诸如丙酸盐和/或丁酸盐。已知SCFA降低胆固醇。因此，本发明的化合物可降低形成高胆固醇的风险。在发酵研究中，本发明的葡聚糖纤维组合物可以促进SCFA，尤其是丙酸盐和/或丁酸盐的产生。因为SCFA的产生或SCFA与乙酸盐的比例的增加有利于在有需要的哺乳动物中控制胆固醇含量，所以本发明对营养学家和消费者用于预防和/或治疗心血管风险是特别有意义的。因此，本发明的另一方面提供用于改善受试者的健康的方法，所述方法包括以有效量向受试者施用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物，以对所述受试者的健康施加益处，诸如治疗胆固醇相关疾病。此外，通常已知SCFA降低肠道中的pH，并且这有助于钙吸收。因此，根据本发明的化合物还可影响矿物质吸收。这是指通过由于肠道中SCFA增加而降低pH，它们还可改善骨骼健康，或预防或治疗骨质疏松症。产生SCFA可增加小肠中的粘度，这减少了胆汁酸的再吸收；增加由胆固醇合成胆汁酸并减少了低密度脂蛋白(LDL)胆固醇循环。
考虑有益的生理效应，化合物或组合物的“有效量”是指在各种剂量下并对于必要的时间段而言，有效实现期望的有益生理效应，诸如降低血液胆固醇、增加短链脂肪酸产生或者预防或治疗胃肠道疾病的量。例如，施用于受试者的组合物的量将根据各种因素而变化，诸如受试者的病症、受试者的体重、受试者的年龄、以及组合物是否是唯一营养来源。有效量可由执业医师或营养师容易地设定。一般来讲，施用足量的组合物以向受试者提供最高达约50g的膳食纤维(不溶性和可溶性)/天；例如约25g至约35g的膳食纤维/天。受试者接收的本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物的量优选在约0.1g至约50g/天的范围内，更优选地以0.5g至20g/天，并且最优选地1至10g/天的范围内。如本文所限定的，化合物或组合物可以多剂量摄取，例如1至5次，分散于一天中或急性地，或可以单剂量摄取。如本文所限定的，化合物或组合物还可在期望的时间段内连续喂食。在某些实施方案中，期望的时间段为至少一周或至少两周或至少三周或至少一个月或至少六个月。
在优选的实施方案中，本发明提供通过将如本文定义的化合物或组合物施用于有需要的受试者来降低有需要的受试者的血甘油三酯水平的方法。在另一优选的实施方案中，本发明提供通过将如本文定义的化合物或组合物施用于有需要的受试者来降低有需要的受试者的低密度脂蛋白水平的方法。在另一优选的实施方案中，本发明提供通过将如本文定义的化合物或组合物施用于有需要的受试者来增加有需要的受试者的高密度脂蛋白水平的方法。
血糖浓度/血糖应答的减弱
在本发明α-葡聚糖纤维组合物中存在不是α-(1，4)主链键的键，提供改善的耐消化性，因为人类消化道中的酶可难以水解此类键和/或支化键。支链的存在向葡聚糖纤维提供部分或完全的不消化性，并且因此实质上没有葡聚糖吸收到体内或葡聚糖更慢地吸收到体内，这导致较低的血糖应答。因此，本发明提供用于制备导致较低血糖应答的食物和饮料组合物的α-葡聚糖纤维组合物。例如，这些化合物可用于代替糖或其它可快速消化的碳水化合物，从而降低食物的血糖负荷、减少热量、和/或减低食物的能量密度。因此，具有这些类型的键的本发明α-葡聚糖纤维组合物的稳定性使得它们容易地通过进入大肠中，其中它们可用作对结肠微生物菌群具有特异性的底物。
改善肠道健康
在另一个实施方案中，本发明的化合物可用于治疗和/或改善肠道健康。本发明α-葡聚糖纤维组合物优选在肠道中通过肠道微生物群缓慢发酵。优选地，本发明化合物表现出在体外肠道模型中不差于菊粉或其它可商购获得的纤维诸如(可溶性玉米纤维，Tate&Lyle)、(可溶性玉米纤维或糊精，Roquette)、或-2(耐消化麦芽糊精，Archer Daniels Midland Company&MatsutaniChemical)的耐受性，(即相似的气体产生水平)，优选地优于一种或多种可商购获得的纤维的改善的耐受性，即本发明葡聚糖纤维的发酵导致在3小时或24小时内比菊粉更少的气体产生，从而减少由于气体形成的不适，诸如肠胃气胀和胃气胀。在一个方面，本发明还涉及通过将如本文所限定的化合物或组合物施用于有需要的受试者来减轻受试者胃肠道中气体形成的方法，以便减少由于肠胃气胀和胃气胀的肠道疼痛或肠道不适。在另一个实施方案中，本发明的组合物向受试者提供对食物发酵的改善的耐受性，并且可与纤维，诸如菊粉或FOS、GOS、或乳果糖混合以通过减少气体产生来改善耐受性。
在另一个实施方案中，可施用本发明的化合物以通过增加大便体积来改善排便或改善排便规律。
益生元和益生菌
可溶性α-葡聚糖纤维组合物可用作益生元，或当益生菌组合使用时用作“合生素”，如下所述。所谓“益生元”，是指通过选择性地刺激胃肠道，特别是结肠中的一种或有限数量的细菌的生长和/或活性，从而改善宿主的健康来有益地影响受试者的食物成分。益生元的示例包括果寡糖、菊粉、聚右旋糖、抗性淀粉、可溶性玉米纤维、低聚葡萄糖和半乳糖寡糖、阿拉伯木寡糖、乳糖醇和乳果糖。
在另一个实施方案中，包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物还包含至少一种益生生物。所谓“益生生物”是指通过它们在消化道中的功能向受试者提供益处的活微生物膳食补充剂。为了有效，益生微生物必须能够在消化条件下存活，并且它们必须能够至少暂时移植于胃肠道而对受试者没有任何伤害。仅某些微生物的菌株具有这些特性。优选地，益生微生物选自：乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、埃希氏菌属(Escherichiaspp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)和酵母属(Saccharomyces spp.)。特定微生物包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、双歧杆菌(Bifidobacterium bificum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、屎链球菌(Streptococcus faecium)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、球拟酵母(Torulopsia)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和链霉菌(Streptomyces)等，包括它们的营养孢子、非营养孢子(芽孢杆菌(Bacillus))和合成衍生物。更优选的益生菌微生物包括但不限于三种细菌属的成员：乳杆菌属、双歧杆菌属和酵母属。在优选的实施方案中，益生菌微生物是乳杆菌属、双歧杆菌属以及它们的组合。
可将益生微生物作为在益生菌保持存活的水或其它液体或半固体培养基中的培养物掺入组合物中。在另一种技术中，可通过混合或共混将包含益生生物的冻干粉末掺入特定材料或液体或半固体材料中。
在优选的实施方案中，组合物包含益生生物，其含量足以递送至少1至200亿活益生生物，优选1至100亿，并且最优选1至50亿活益生生物。如上所述益生生物递送量可按剂量和/或按天计，其中多剂量/天可适用于一些应用。可将两种或更多种益生生物用于一种组合物中。
获得酶促制备的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法
可将任何数量的常用纯化技术用于从反应体系中获得本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其包括但不限于离心、过滤、分级、色谱分离、渗析、蒸发、沉淀、稀释或它们的任意组合，优选地通过渗析或色谱分离，最优选地通过渗析(超滤)。
重组微生物表达
本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞尤其是微生物宿主细胞中产生。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞是存在于真菌或细菌家族中并在宽温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长的微生物宿主。例如，预期细菌、酵母和丝状真菌中任何一种均适于作为表达本发明核酸分子的宿主。酶可在细胞内、细胞外或细胞内和细胞外组合表达，其中细胞外表达细胞外表达比细胞内表达能够从发酵产物中更容易地回收期望蛋白。转录、翻译和蛋白生物合成设备相对于用于生成细胞生物质的细胞原料保持不变；无论如何将表达功能基因。宿主菌株的示例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红发夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)。在一个实施方案中，真菌宿主细胞是木霉属，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株。在一个实施方案中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属、芽孢杆菌属、克鲁维酵母属以及假单胞菌属。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞为枯草芽孢杆菌或大肠杆菌。
大规模微生物的生长和功能基因的表达可利用各种单一碳水化合物或络合碳水化合物、有机酸和醇或饱和烃(对于光合自养宿主或化能自养宿主而言，例如甲烷或二氧化碳)，并可利用各种形式和数量的氮、磷、硫、氧、碳或任何微量营养素(包括小无机离子)。可通过向培养物中加入或不加入特定的调节分子(通常不将其视为营养物质或能源)来影响生长速率的调节。
可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区和控制转录终止的DNA片段3′区。最优选的是当两个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源的基因和/或对生产宿主是天然的基因，尽管它们无需来源于此。
可用于驱动本发明的先锋霉素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所熟悉。实质上能够驱动这些基因的任何启动子均适用于本发明，其包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在酵母菌中表达)；AOX1(可用于在毕赤酵母中表达)；以及lac、araB、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc(可用于在大肠杆菌中表达)、以及amy、apr、npr启动子和用于在芽孢杆菌中表达的各种噬菌体启动子。
终止控制区也可以源于优选宿主细胞的天然的多种基因。在一个实施方案中，包含的终止控制区是任选的。在另一个实施方案中，嵌合基因包括源于优选宿主细胞的终止控制区。
工业生产
多种培养方法可用来制备酶。例如，从重组微生物宿主过表达的特定基因产物的大规模生产可通过分批、分批补料和连续培养的方法进行。分批和分批补料培养方法在本领域内是常用的且熟知的，并且示例可见于Wulf Crueger和Anneliese Crueger(作者)的Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，(SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1990))和Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，第三版，Richard H.Baltz、Arnold L.Demain和Julian E.Davis(编辑)，(ASM出版社，Washington，DC(2010))。
所需酶的商业生产也可用连续培养的方法实现。连续培养是一种开放式系统，其中将成分确定的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。另选地，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体支持体进行，所述固体支持体由天然材料和/或合成材料组成。
从分批发酵、分批补料发酵或连续培养中回收期望的酶可通过本领域技术人员已知的任何方法完成。例如，当在细胞内产生酶催化剂时，通过离心或膜过滤从培养基中分离细胞浆液，任选地用水或期望pH的含水缓冲液洗涤，然后将期望pH的含水缓冲液中的细胞浆液悬浮使其匀化，产生出包含期望酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可任选地通过合适的助滤剂例如硅藻土或二氧化硅过滤来去除细胞残片，然后进行热处理步骤，将不需要的蛋白质从酶催化剂溶液中沉淀出。然后通过膜过滤或离心将含有所需酶催化剂的溶液从沉淀的细胞残片和蛋白质分离，并且所得的部分纯化的酶催化剂溶液通过额外的膜过滤浓缩，然后任选地与合适的载体(例如，麦芽糊精、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其混合物)混合并喷雾干燥以产生含有所需酶催化剂的固体粉末。另选地，可通过加入多元醇如麦芽糊精、山梨醇或丙二醇，任选向其中加入防腐剂如山梨酸、山梨酸钠或苯甲酸钠，将所得部分纯化的酶催化剂溶液稳定为液体制剂。
可溶性α-葡聚糖纤维的制备可以通过在任何合适的水性反应条件下将所得的酶混合来进行，所述反应条件导致可溶性α-葡聚糖纤维的产生，诸如本文所公开的条件。反应可在水溶液中进行，或者在某些实施方案中，反应可在食物产品内原位进行。使用酶催化剂在食物产品中原位产生纤维的方法是本领域所熟知的。在某些实施方案中，将酶催化剂加入包含麦芽糊精的液体食物产品中。酶催化剂可减少液体食物产品中麦芽糊精的量，同时增加可溶性α-葡聚糖纤维和果糖的量。适于使用多肽材料(即酶催化剂)在食物产品内原位产生纤维的方法可见于WO2013/182686，其内容以引用方式并入本文，用于对使用酶催化剂在食物产品中原位产生纤维的方法的公开。当含量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点以及在该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不旨在将范围限定于所列举的具体数值。
特定实施方案的描述
在第一实施方案中(“第一实施方案”)，提供一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含：
a.10-20％的α-(1，4)糖苷键，优选地13至17％的α-(1，4)糖苷键；
b.60-88％的α-(1，6)糖苷键；优选地65至80％的α-(1，6)糖苷键，并且最优选地70-77％糖苷键；
c.0.1-15％的α-(1，4，6)和α-(1，2，6)糖苷键，优选地0.1至12％的α-(1，4，6)和α-(1，2，6)糖苷键；最优选地7至11％的α-(1，4，6)和α-(1，2，6)糖苷键。
d.小于50000道尔顿，优选地小于40000道尔顿，更优选地介于500道尔顿和40000道尔顿之间，并且最优选地约500道尔顿至约35000道尔顿的重均分子量；
e.在水中12重量％下小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)，优选地小于0.01Pa·s的粘度；
f.如分析化学师协会(Association of Analytical Communities，AOAC)方法2009.01所测量的小于12％，优选地小于11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的消化度；
i.在25℃下，pH7水中至少20％(w/w)，优选地至少30％、40％、50％、60％或70％的溶解度；和
h.小于10，优选小于的多分散性指数。
在第二实施方案中，提供一种碳水化合物组合物，其包含0.01至99重量％(基于干固体)，优选地10至90重量％的上文第一实施方案中所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
在第三实施方案中，提供一种食物产品、个人护理产品或药学产品，其包含第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物或包含第二实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物。
在另一个实施方案中，提供一种低龋性组合物，其包含第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物和至少一种多元醇。
在另一个实施方案中，提供一种制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，该方法包括：
a.提供一系列的反应组分，其包括：
i.麦芽糊精底物；
ii.至少一种具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽(E.C.2.4.1.2)；
iii.至少一种具有内切右旋糖酐酶活性的多肽(E.C.3.2.1.11)，其能够内切水解具有一个或多个α-(1，6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列混合，从而制备包含可溶性α-葡聚糖纤维的产品；
c.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物与步骤(b)的产品分离；以及
d.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
在一些实施方案中，本发明提供一种方法，其中麦芽糊精底物由淀粉获得。在一些实施方案中，在适当的含水反应条件下将反应组分的系列混合包括将食物产品中的反应组分的系列混合。
在另一个实施方案中，提供一种用于制备共混碳水化合物组合物的方法，该方法包括将第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与以下物质混合：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、安赛蜜钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、蔗糖素、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲基酯、糖精、麦芽糊精、淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糊精、支链麦芽糊精、菊粉、聚右旋糖、果寡糖、半乳糖寡糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、异麦芽寡糖、填料、赋形剂、粘合剂或它们的任意组合。
在另一个实施方案中，提供一种制备食物产品、个人护理产品或药学产品的方法，所述方法包括，将一种或多种可食用食物成分、美容上可接受的成分或药学上可接受的成分分别与第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物、第二实施方案的碳水化合物组合物、或它们的组合混合。
在另一个实施方案中，提供一种减小食物或饮料的血糖指数的方法，所述方法包括将第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物掺入食物或饮料中。
在另一个实施方案中，提供一种抑制哺乳动物中血糖水平升高、降低活体中脂质、治疗便秘、或减少通过肠胃时间的方法，所述方法包括将第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤。
在另一个实施方案中，提供一种改变哺乳动物结肠中脂肪酸产生的方法，所述方法包括将本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物给药于哺乳动物的步骤；优选地其中短链脂肪酸产生增加和/或支链脂肪酸产生减少。
在另一个实施方案中，还提供第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物在适于包括人类在内的动物食用的食物组合物中的用途。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物或方法，其中α-葡聚糖纤维组合物包含小于10％，优选地小于5重量％，并且最优选地小于1重量％或更小的还原糖。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物和方法，其中所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含小于1％的α-(1，3)糖苷键。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物和方法，其中所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含小于1％的α-(1，2)糖苷键。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物或方法，其中可溶性α-葡聚糖纤维组合物的特征在于介于1000和5000g/mol之间，优选地1250至4500g/mol的数均分子量(Mn)。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物，其中碳水化合物组合物还包含：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、安赛蜜钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、蔗糖素、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲基酯、糖精、麦芽糊精、淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糊精、支链麦芽糊精、菊粉、聚右旋糖、果寡糖、半乳糖寡糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、异麦芽寡糖、填料、赋形剂、粘合剂或它们的任意组合。
涉及用于制备共混碳水化合物组合物的方法的另一个实施方案包括将可溶性α-葡聚糖纤维组合物与以下物质混合：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、安赛蜜钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、蔗糖素、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲基酯、糖精、麦芽糊精、淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糊精、支链麦芽糊精、菊粉、聚右旋糖、果寡糖、半乳糖寡糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、异麦芽寡糖、填料、赋形剂、粘合剂或它们的任意组合。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物或方法，其中所述碳水化合物组合物呈液体、糖浆、粉末、颗粒、成形球、成形棒，成形板、成形立方体、片剂、粉末、胶囊、香囊或它们的任意组合的形式。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物或方法，其中所述食物产品为：
a.焙烤食物，其选自：蛋糕、布朗尼、曲奇、曲奇松脆片、松饼、面包和甜面团、挤出谷物片和包衣谷物片；
b.乳制品，其选自：酸奶、酸奶饮料、乳饮料、调味乳、冰沙、冰淇淋、奶昔、脱脂乳酸干酪、脱脂乳酸干酪调味品、脱脂凝乳和打发的慕斯型产品
c.糖果，其选自：硬糖、方旦糖、牛轧糖和棉花糖、明胶果冻糖、焦糖、果冻、巧克力、甘草、口香糖、焦糖、太妃糖、求斯糖、薄荷糖、片状糖果和水果干；
d.饮料，其选自：碳酸饮料、果汁、浓缩果汁混合物、清水、以及饮料干混合物；
e.小吃棒、烤酥饼、甜甜圈或曲奇的高固体填充物；
f.挤出和成片的小吃，其选自：膨化小吃、梳打饼、未经发酵的玉米片和玉米薄片；
g.小吃棒、营养棒、granola棒、蛋白质棒、和谷物棒；
h.奶酪、奶酪酱和其它可使用的奶酪制品；
i.可食用膜；
j.水溶性汤、糖浆、酱汁、调味品、或咖啡奶精；或者
k.膳食补充剂；优选地呈片剂、粉末、胶囊或香囊的形式。
一种组合物，其包含0.01至99重量％(基于干固体)的本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物和以下物质：合生素、肽、肽水解产物、蛋白质、蛋白质水解产物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、维生素、矿物质、草药、草药提取物、脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)、植物甾体、甜菜碱、类胡萝卜素、消化酶、益生生物或它们的任意组合。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中分离步骤包括离心、过滤、分级、色谱分离、渗析、蒸发、稀释、或它们的任意组合中任一个。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中当将反应组分的系列混合时，单一反应混合物中的麦芽糊精底物浓度最初为至少20g/L。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中糊精右旋糖酐酶活性与内切右旋糖酐酶活性的比率的范围是从0.01∶1到1∶0.01。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中合适的含水反应条件包括介于0℃和45℃之间的反应温度。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中合适的含水反应条件包括介于3至8之间，优选地4至8之间的pH范围。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中合适的含水反应条件包括缓冲液，其选自磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐和柠檬酸盐。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中所述具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽包含具有与SEQ ID NO：2至少90％，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中所述至少一种包含内切右旋糖酐酶活性的多肽优选为来自毛壳菌的内切右旋糖酐酶，更优选地来自毛壳菌的糊精酶L，并且最优选地Plus L。在优选的实施方案中，适用于食物中的右旋糖酐酶公认为是安全的(GRAS)。
通过上述方法实施方案中任一个制备的产物；优选地，其中所述制备的产物为第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
实施例
除非本文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的含义相同。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D版，John Wiley和Sons，New York(1994)，和Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，N.Y.(1991)为本领域技术人员提供了用于本发明的许多术语的通用字典。
本发明在以下实施例中进一步限定。应该理解，这些实施例尽管说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围内的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
缩写的含义如下：“sec”或“s”表示秒，“ms”表示毫秒，“min”表示分钟，“h”或“hr”表示小时，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“mL/min”是毫升每分钟，“μg/mL”是微克每毫升；“LB”是LB培养基；“μm”是微米，“nm”是纳米；“OD”是光学密度；“IPTG”是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；“g”是重力；“mM”是毫摩尔；“SDS-PAGE”是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺；“mg/mL”是毫克每毫升；“N”是标称；“w/v”是重力/体积；“DTT”是二硫苏糖醇；“BCA”是二喹啉甲酸；“DMAc”是N，N’-二甲基乙酰胺；“LiCl”是氯化锂，“NMR”是核磁共振；“DMSO”是二甲基亚砜；“SEC”是尺寸排阻色谱；“GI”或“gi”表示GenInfo标识符，由和其它序列数据库使用的系统以唯一地识别相应数据库内的多核苷酸和/或多肽序列；“DPx”是指在长度内具有“x”个单元的葡聚糖聚合物度；“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，“DSMZ”和“DSM”将是指莱布尼茨研究所-德国微生物菌种保藏中(Braunschweig，Germany)；“EELA”是芬兰食物安全局(Helsinki，Finland)；“CCUG”是指瑞典哥德堡大学文化收藏中心；“Suc.”是指蔗糖；“Gluc.”是指葡萄糖；“Fruc.”是指果糖；“Leuc.”是指明串珠菌二糖；并且“Rxn”是指反应。
一般方法
本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且描述于Sambrook，J.和Russell，D.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)；以及Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory Press Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Short Protocols in Molecular Biology，第5版，Current Protocols and John Wiley andSons，Inc.，N.Y.，2002。
适合细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域内也是众所周知的。适用于如下实施例的技术可见于如下文献列出的内容中：Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑)，American Society forMicrobiology，Washington，DC.(1994))，Wulf Crueger和Anneliese Crueger(作者)，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，(SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1990))和Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，第三版，Richard H.Baltz、Arnold L.Demain和Julian E.Davis(编辑)，(American Society of Microbiology出版社，Washington，DC(2010))。
除非另外说明，所有用于培养并维持细菌细胞的试剂、限制性酶和材料均获取自BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)，Invitrogen/Life Technologies Corp.(Carlsbad，CA)，Life Technologies(Rockville，MD)，QIAGEN(Valencia，CA)，Sigma-AldrichChemical Company(St.Louis，MO)或Pierce Chemical Co.(Thermo Fisher ScientificInc.的分公司(Rockford，IL)。IPTG(目录号I6758)和三苯基四唑氯化物得自Sigma Co.(St.Louis，MO)。BELLCO旋转烧瓶得自Bellco Co.(Vineland，NJ)。LB培养基得自Becton，Dickinson and Company(Franklin Lakes，New Jersey)。BCA蛋白质测定得自Sigma-Aldrich(St Louis，MO)。
pHYT载体
pHYT载体主链是包含枯草芽孢杆菌aprE启动子的复制性枯草芽孢杆菌表达质粒。其衍生自大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY320PLK(登录号D00946，并且可从Takara Bio Inc.(Otsu，Japan)商购获得)。大肠杆菌和氨苄青霉素抗性基因的复制起点是从pACYC177(X06402，并且可从New England Biolabs Inc.(Ipswich，MA)商购获得)枯草芽孢杆菌和四环素抗性基因的复制起点是从pAMalpha-1(Francia等人，J Bacteriol.2002年9月；184(18)：5187-93)。
为构建pHYT，在四环素抗性基因之后插入来自噬菌体λ的终止子序列：5’-ATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTAT-3’(SEQ ID NO：8)。使用破坏HindIII位点的BamHI-HindIII接头，将包含aprE启动子-编码感兴趣的酶的AprE信号肽序列-编码序列(例如，DD酶的编码序列)-BPN’终止子的序列)的整个表达盒(EcoRI-BamHI片段)克隆到pHYT的EcoRI和HindIII位点中。接头序列为5’-GGATCCTGACTGCCTGAGCTT-3’(SEQ ID NO：9)。aprE启动子和AprE信号肽序列(SEQ ID NO：10)对于枯草芽孢杆菌是天然的。BPN′终止子来自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶。在使用天然信号肽的情况下，用经表达基因的天然信号肽替换AprE信号肽。
里氏木霉的生物转化
将里氏木霉孢子悬浮液涂布在直径为6cm的乙酰胺酶转化平板的中心上(150μL的5×107-5×108个孢子/mL悬浮液)。然后将板在生物罩中空气干燥。将停止屏(BioRad165-2336)和巨携带子支撑物(BioRad 1652322)浸泡在70％乙醇中并空气干燥。将干燥剂(硫酸钙干燥剂；W.A.HammondCompany(Xenia，OH)置于小培养皿(6em Pyrex)中并用Whatman滤纸(GE Healthcare Bio-Sciences，Pittsburgh，PA)覆盖。将包含大载体(BioRad 165-2335；Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA))的大载体支架平放在滤纸的顶部上并更换培养皿盖。通过将60mg钨M-10颗粒(微携带子，0.7微米，BioRad#1652266，Bio-Rad Laboratories)加入到Eppendorf管中来制备钨颗粒悬浮液。加入乙醇(1mL)(100％)。将钨在乙醇溶液中涡旋并使其浸泡15分钟。将Eppendorf管以最大速度短暂地微离心以将钨制粒。滗出乙醇并利用无菌蒸馏水洗涤三次。在第三次滗出洗涤水之后，将钨重新悬浮于1mL的无菌50％甘油中。通过向1.5mL-Eppendorf管中加入25μL悬浮的钨准备转化反应用于每个转化。后续添加按如下顺序进行：2μL DNA pTrex3表达载体(SEQ ID NO：11；参见美国专利6,426,410)、25μL 2.5M CaCl2、10μL0.1M亚精胺。将反应连续涡旋5-10分钟，从而保持钨悬浮。然后将Eppendorf管短暂微离心并且滗出。将钨粒料利用200μL的70％乙醇洗涤，短暂微离心成粒状并滗析。所述粒料用200μL的100％乙醇洗涤，短暂微离心成粒状并滗析。将钨粒料重新悬浮于24μL 100％乙醇中。将Eppendorf管置于超声水浴中并持续15秒，并将8μL等分试样转移到经干燥的大载体的中心上。将巨携带子保留在经干燥的培养皿中干燥。
将氦气罐打开至1500psi(～10.3MPa)。将1100psi(～7.58MPa)破裂盘(BioRad165-2329)用于型号PDS-1000/HeTM 颗粒递送体系(BioRad)中。当将钨溶液干燥时，将停止屏和巨携带子支撑体插入PDS-1000中。将包含目标里氏木霉孢子的乙酰胺酶平板放置在停止屏下6cm处。对室抽29英寸Hg(～98.2kPa)的真空并保持。启动He颗粒递送体系。将所述室放气，取出乙酰胺酶平板以在28℃下温育，直至出现菌落(5天)。
改性的amdS Biolistic琼脂(MABA)/升
第I部分，在500mL蒸馏水(dH2O)中制备
1000x盐1mL
Noble琼脂20g
pH至6.0，高压釜
第II部分，在500mL dH2O中制备
乙酰胺0.6g
CsCl 1.68g
葡萄糖20g
KH2PO415g
MgSO4·7H2O0.6g
CaCl2·2H2O0.6g
pH至4.5，0.2微米过滤灭菌；置于50℃烘箱中加热，加入琼脂，混合，倾注平皿。在室温下贮存(～21℃)
1000x盐/升
FeSO4·7H2O5g
MnSO4·H2O1.6g
ZnSO4·7H2O1.4g
CoCl2·6H2O1g
达到1L dH2O。
0.2微米过滤灭菌
测定糖苷键
在使用高灵敏度冷冻探针以500MHz操作的Varian Unity Inova系统(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)上采集一维1H NMR数据。通过将观测发射器频率小心地置于“普氏(presat)”实验的残余水信号的共振处，并然后使用具有完整相位循环(32多次)和10ms的混合时间的“tnnoesy”实验获得水抑制。
通常，将干燥的样本溶解在1.0mL的D2O中并超声波处理30分钟。从样本的可溶部分中，将100μL连同350μL D2O和包含15.3mM DSS(4，4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸钠盐)作为内标和0.29％NaN3作为杀菌剂的100μL D2O一起加入5mm NMR管中。通过将相应的化学位移处的峰面积积分来测量每种类型的异头键的丰度。每种类型的异头键的百分比由特定键的丰度和来自寡糖的异头键总丰度计算。
甲基化分析
葡聚糖中糖苷键的分布通过通常称为“甲基化分析”或“部分甲基化分析”的公知技术来测定(参见：F.A.Pettolino等人，Nature Protocols，(2012)7(9)：1590-1607)。所述技术具有多个细微变化但常常包括：1.将葡萄糖单元的所有游离羟基基团甲基化，2.将甲基化的葡聚糖水解成独立的单体单元；3.还原开环以消除异头物并形成甲基化的葡萄糖醇；异头碳通常用氘原子标记以形成不同的质谱；4.游离羟基乙酰化(通过水解和开环形成)以产生部分甲基化的乙酸葡萄糖醇酯，也被称为部分甲基化产物，5.通过与质谱法和/或火焰离子化检测偶联的气相色谱分析所得的部分甲基化产物。
部分甲基化产物包括非还原性末端葡萄糖单元、连接单元和支化点。单独的产物通过保留时间和质谱来识别。部分甲基化产物的分布是每种产物占所有部分甲基化产物的总峰面积的百分比(面积％)。气相色谱条件如下：RTx-225柱(30m×250μm ID×0.1μm膜厚度，Restek Corporation，Bellefonte(PA，USA)，氦载气(0.9mL/min恒定流量)，烘箱温度程序在80℃下起始(保持2分钟)，然后30℃/min至170℃(保持0分钟)，然后4℃/min至240℃(保持25分钟)，1μL进样量(分成5：1)，使用电子轰击质谱(全扫描模式)检测。
粘度测量
使用配备有锥体和板状几何形状的TA Instruments AR-G2控制应力旋转流变仪(TA Instruments-Waters，LLC(New Castle，DE)测量可溶性纤维的12重量％水性溶液的粘度。该几何形状由两者均具有光滑表面的40mm 2°的上锥体和peltier下板组成。在测试期间，配备有经水饱和海绵的环境室用于使溶剂(水)蒸发最小化。在20℃下测量粘度。将peltier设置为期望的温度，并使用Eppendorf移液管(Eppendorf North America，Hauppauge，NY)将0.65mL的样本加载到板上。将锥体降低至锥体底部和板之间50μm的间隙。将样本热平衡3分钟。在500-10s-1的剪切速率范围内进行剪切速率扫描。通过在测试结束时运行重复剪切速率点来确认样本稳定性。
测定蔗糖、葡萄糖、果糖和明串珠菌二糖的浓度
通过利用两个串联的Aminex HPX-87C柱(Bio-Rad，Hercules，CA)的HPLC定量蔗糖、葡萄糖、果糖和明串珠菌二糖。所用的色谱条件为在柱和检测器隔室处85℃，在样本和注射器隔室处40℃，流量为0.6mL/min，并且进样量为10μL。用于数据还原的软件包是来自Waters(Waters Corp.，Milford，MA)的EMPOWERTM版本3。用各种浓度的标准品对每种单独的糖进行校准。
测定寡糖的浓度
可溶性寡糖通过利用两个串联Aminex HPX-42A柱(Bio-Rad)的HPLC来定量。所用的色谱条件为85℃柱温和40℃检测器温度，水作为移动相(流量为0.6mL/min)，并且进样量为10μL。用于数据还原的软件包为来自Waters Corp.的EMPOWERTM版本3。DP2至DP7的寡糖样本得自Sigma-Aldrich：麦芽七糖(DP7，目录号47872)、麦芽六糖(DP6，目录号47873)、麦芽五糖(DP5，目录号47876)、麦芽四糖(DP4，目录号47877)、麦芽三糖(DP3，目录号47884)和麦芽糖(DP2，目录号47288)。利用各种浓度的标准品对每种单独的寡糖进行校准。
测定消化度
消化度测试方案改编自Megazyme Integrated总膳食纤维测定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最终酶浓度保持与AOAC方法相同：50单位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，对于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言为3.4单位/mL。如由AOAC方法所推荐的，每种反应中的底物浓度为25mg/mL。每种反应的总体积为1mL，而不是由初始方案建议的40mL。在具有或不具有两种消化酶的处理的情况下，一式两份分析每种样本。详细方案描述如下：
通过将来自Integrated总膳食纤维测定盒的20mg纯化的猪胰腺α-淀粉酶(150,000单位/g；AOAC方法2002.01)溶于29mL的马来酸钠缓冲液(50mM，pH 6.0加2mM CaCl2)中并搅拌5分钟，之后从添加来自相同试剂盒的60uL淀粉葡糖苷酶溶液(AMG，3300单位/mL)来制备酶原液。然后在玻璃小瓶中将0.5mL酶原液与0.5mL可溶性纤维样本(50mg/mL)混合，并将消化反应混合物在振荡培养箱中以轨道运动在37℃和150rpm下温育恰好16H。对于每种纤维样本平行进行重复反应。通过将0.5mL马来酸盐缓冲液(50m，pH 6.0加上2mM CaCl2)和0.5mL可溶性纤维样本(50mg/mL)混合，并且反应混合物在振荡培养箱中以轨道运动在37℃和150rpm下温育恰好16H，一式两份进行对照反应。在16h之后，从培养箱中移除所有样本并且立即加入75μL的0.75M碱性溶液以终止反应。将小瓶立即置于95-100℃的加热块中，并且温育20分钟，偶尔振摇(用手)。淬灭之后，每种反应混合物的总体积为1.075mL。如一般方法中所述，通过利用Aminex HPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量每个反应中释放的葡萄糖量。将麦芽糊精(DE4-7，Sigma)用作酶的阳性对照。为计算消化度，使用下式：
消化度＝100％*[用酶处理后释放的葡萄糖量(mg)-酶不存在时释放的葡萄糖量(mg)]/1.1*总纤维量(mg)”
测量经淀粉酶处理的淀粉或麦芽糊精向糊精右旋糖酐酶反应产物转化的方法
经由使用淀粉葡糖苷酶的酶促反应监测经淀粉酶处理的淀粉或麦芽糊精向DD酶反应产物的转化。通过将23uL市售原液与10mL的50mM乙酸钠(pH 4.65)混合来制备工作稀释液黑曲霉菌淀粉葡糖苷酶(Sigma-Aldrich A7095-50ml；St.Louis，MO)。在各个时间点下获取DD酶反应样本，并且在90℃下热淬20分钟。将100uL经淬灭的反应样本与700uL经稀释的淀粉葡糖苷酶混合，然后将混合物在60℃下温育30分钟，之后在90℃下温育20分钟。然后将样本在12,000xg下离心3分钟并且经由HPLC和RI检测来分析上清液的葡萄糖。对照包括经淬灭的反应样本但不具有淀粉葡糖苷酶处理并且空白包含100uL的水(或50mM乙酸钠，pH4.65)与700uL的经稀释淀粉葡糖苷酶的组合。葡萄糖定量根据柱制造商推荐，使用快速碳水化合物柱(BioRad#125-0105；BioRad，Hercules，CA)进行。底物的消耗的定量基于淀粉葡糖苷酶释放的葡萄糖的损失，减去空白样本中和不添加淀粉葡糖苷酶的反应样本中的葡萄糖。在任何时间点处的收率基于消化后该时间下DD酶反应样本中的葡萄糖含量与消化前相同反应样本中的葡萄糖量的比较来计算。将所有反应样本的分析结果与“时间＝0”样本(其在加入DD酶之后立即从反应器中取出)的分析进行比较。
可溶性寡糖纤维的纯化
通过尺寸排阻柱层析(SEC)纯化和分离如在以下实施例中所述制备的存在于产物混合物中的可溶性寡糖纤维。在典型的程序中，将产物混合物在60℃至90℃下热处理15分钟至30分钟，并且然后在4000rpm下离心10分钟。将所得的上清液注入纯化系统(SEC；GE Healthcare Life Sciences)(10mL-50mL注入量)中，所述纯化系统连接至装填有1.1L的Bio-Gel P2凝胶(Bio-Rad，细，45-90μm)的GE HK 50/60柱，其使用水作为洗脱剂以0.7mL/min洗脱。使用Bio-Rad HPX-47A柱，通过HPLC分析寡糖的SEC级分(～5mL/管)。将包含＞DP2寡糖的级分混合，并通过旋转蒸发混合的级分来分离可溶性纤维，以产生包含3重量/重量％至6重量/重量％固体的溶液，其中将所得溶液冻干以产生可溶性纤维作为固体产物。
纯培养物在特定碳源上的生长
为测试微生物在特定碳源(寡糖或多糖可溶性纤维)上生长的能力，选择的微生物在不含除了研究下的碳源之外的碳源的适当培养基中生长。通过在无氧环境(80％N2、10％CO2、10％H2)中在600nm下定期(每30分钟)测量光学密度来评价生长。生长表示为曲线下面积并且与阳性对照(葡萄糖)和阴性对照(不添加碳源)比较。
寡糖可溶性纤维的原液(10重量/重量％)在脱矿质水中制备。所述溶液通过UV辐射或过滤(0.2μm)来灭菌。将原液冷冻储存直至使用。适当的不含碳源培养基由单一成分制备。测试生物体在具有标准碳源的测试培养基中厌氧预生长。将20μL储备溶液移入蜂窝孔中，并加入180μL不含碳源培养基与1％测试微生物。作为阳性对照，将葡萄糖用作碳源，并且作为阴性对照，不使用碳源。为确认原液的无菌性，使用未接种的孔。每次运行使用至少三个平行孔。
将蜂窝板置于Bioscreen中，通过测量600nm下的吸光度来测定生长。每30分钟进行测量，并且在测量之前，将板振摇以确保微生物的均匀悬浮。允许生长24小时。结果计算为曲线下面积(即，OD600/24h)。测试的生物体(以及它们的相应生长培养基)为：产气荚膜梭菌3626TM(不具有葡萄糖的厌氧强化梭菌培养基(得自Oxoid MicrobiologyProducts，ThermoScientific)、艰难梭菌DSM 1296(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen and Zellkulturen DSMZ，Braunschweig，Germany)(不具有葡萄糖的厌氧强化梭菌培养基(得自Oxoid Microbiology Products，Thermo Fisher ScientificInc.，Waltham，MA)、大肠杆菌11775TM(不具有葡萄糖的厌氧胰蛋白酶大豆肉汤)、鼠伤寒沙门氏菌EELA(购自DSMZ，Brauchschweig，Germany)(不具有葡萄糖的厌氧胰蛋白酶大豆肉汤)、嗜酸乳杆菌NCFM 145(不具有葡萄糖的厌氧(de Man、Rogosa和Sharpe)培养基(得自DSMZ))、动物双歧杆菌乳酸亚种Bi-07(厌氧的Deutsche Sammlung vomMikroorgnismen und Zellkulturen培养基58(得自DSMZ)，不具有葡萄糖)。
体外气体产生
为了测量由肠道微生物群形成气体，将预调理的粪便浆料与测试益生元(寡糖或多糖可溶性纤维)一起温育，并测量形成的气体体积。新鲜粪便材料通过用3份(重量/体积)厌氧模拟器培养基稀释，在厌氧条件下搅拌1小时并通过0.3-mm金属网过滤，此后将其在37℃厌氧温育24小时来预调理。
模拟器培养基如G.T.Macfarlane等人所述组成(Microb.Ecol.35(2)：180-7(1998))，其包含在蒸馏水中的以下成分(g/L)：淀粉(BDHLtd.)，5.0；蛋白胨，0.05；胰蛋白胨，5.0；酵母提取物，5.0；NaCl，4.5；KCl，4.5；粘蛋白(猪胃III型)，4.0；酪蛋白(BDHLtd.)，3.0；果胶(柑橘)，2.0；木聚糖(oatspelt)，2.0；阿拉伯半乳聚糖(落叶松木)，2.0；NaHCO3，1.5；MgSO4，1.25；瓜耳胶，1.0；菊粉，1.0；半胱氨酸，0.8；KH2PO4，0.5；K2HPO4，0.5；胆汁盐3号，0.4；CaCl2×6H2O，0.15；FeSO4×7H2O，0.005；血红素，0.05；和Tween 80，1.0；半胱氨酸盐酸盐，6.3；Na2S×9H2O和作为持续厌氧条件的指示的0.1％刃天青。将模拟培养基通过0.3mm金属网过滤，并分入密封的血清瓶中。
将测试益生元从10重量/重量％原液添加至最终浓度为1％。在37℃下进行温育，同时维持厌氧条件。在使用带刻度的气密玻璃注射器，在24小时温育后手动测量由于微生物活性导致的气体产生，从而也释放来自模拟单元的过压。
实施例1
使用氧化葡糖杆菌制备糊精右旋糖酐酶
氧化葡糖杆菌菌株NCIMB 9013(最初作为氧化醋酸单胞菌菌株NCTC 9013沉积)得自NCIMB Ltd.(National Collection of Industrial and Marine Bacteria，Aberdeen，Scotland)。将来自NCIMB的冻干材料重新悬浮于YG液体培养基(20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物)中并在28℃下以225rpm振荡回收。将甘油以15(体积/体积％)最终浓度加入到复苏的培养物中，并将多瓶等分培养物在-80℃冷冻。将NCIMB 9013菌株的培养物从冷冻小瓶接种到10mL含有5g/L酵母提取物、3g/L细菌用蛋白胨和10g/L甘油的培养基中(Yamamoto等人(1993)Biosci Biotech Biochem 57：1450-1453)。在28℃下以225rpm振荡温育过夜后，使用10-mL培养物以将2-L培养物接种在包含5g/L酵母提取物、50g/L葡萄糖和0.5g/L麦芽糊精DE18的培养基中(Suzuki等人，(1999)J.Appl.Glycosci 46：469-473)，不同的是原始培养基使用具有更高DE的麦芽糊精。将培养物在28℃下振荡温育48小时，然后通过离心除去细胞。使用Amicon搅拌压力室使澄清的上清液通过YM-30膜，直到体积为原始体积的10％。通过加入10mM乙酸/乙酸钠缓冲液(pH4.5)将体积恢复至原始量。然后通过第二次通过YM-30膜将体积减少10倍。将该洗涤过程重复两次，并将最终透析的酶浓缩物储存在4℃下。
实施例2
来自氧化葡糖杆菌的糊精右旋糖酐酶在大肠杆菌中的表达
以下实施例描述了来自氧化葡糖杆菌NCIMB4943的糊精右旋糖酐酶(DD酶)在大肠杆菌BL21 DE3中的表达。编码天然大肠杆菌中的淀粉麦芽糖酶的malQ基因(SEQ ID NO：3)主要有助于麦芽糊精转化的背景活性。糊精右旋糖酐酶随后在大肠杆菌BL21 DE3 malQ宿主中表达)。
来自氧化葡糖杆菌NCIMB4943的DD酶编码序列(SEQ ID NO：1)通过PCR扩增并克隆到pET23D载体的NheI和HindIII位点。将确认DD酶编码序列由质粒pDCQ863上的T7启动子表达的序列转化到大肠杆菌BL21DE3宿主中，产生SEQ ID NO：2。所得的菌株连同BL21DE3宿主一起在37℃并以220rpm振荡下生长至OD600为～0.5，并且将IPTG添加至最终浓度0.5mM用于诱导。在通过在4000xg下离心收获之前，使培养物生长附加的2-3小时。将来自1L培养物的细胞团块悬浮在30mL 20mM KPi缓冲液(pH6.8)中。细胞通过French细胞压碎器(2通道@15,000psi(103.4MPa))破碎；通过离心(Sorvall SS34转子，13,000rpm)40分钟除去细胞碎片。将上清液(10％)与16g/L最终浓度的麦芽四糖(DP4)底物(Sigma)的25mM乙酸钠缓冲液(pH4.8)在37℃下温育过夜。在HPLC上分析寡糖特征。麦芽四糖(DP4)底物在没有表达质粒的BL21DE3宿主中转化，表明宿主中利用DP4的背景活性。
为了检查哪种酶主要对背景活性有贡献，在如上所述麦芽四糖测定中，测试具有单个基因缺失的来自“Keio collection”的一组菌株(Baba等人，(2006)Mol.Syst.Biol.，article number 2006.0008；第1-11页)(表1)。BW25113是Keio collection的亲代菌株。JW3543包含编码周质-淀粉酶的malS(SEQ ID NO：4)的缺失。JW1912包含编码细胞质-淀粉酶的amyA(SEQ ID NO：7)的缺失。JW3379包含编码淀粉淀粉麦芽糖酶的malQ(SEQ ID NO：3)的缺失。JW5689包含编码麦芽糊精磷酸化酶的malP(SEQ ID NO：5)的缺失。JW0393包含编码麦芽糊精葡糖苷酶的malZ(SEQ ID NO：6)的缺失。麦芽四糖对照(G4对照)不包含任何细胞提取物，当添加BW35113细胞提取物时，大多数麦芽四糖转化，这指示在BW25113中的背景活性。对于测试的五种Keio缺失菌株而言，其中四个仍然示出作为BW25113亲代菌株的背景活性。只有具有malQ缺失的JW3379示出大部分背景活性被消除，并且麦芽四糖作为G4对照保留。该实验表明malQ主要负责背景活性。通过标准P1转导将JW3379中的malQ：kanR缺失转移到BL21 DE3菌株以制备BL21 DE3ΔmalQ表达宿主。
将表达DD酶的pDCQ863和pET23D载体对照转化到BL21DE3ΔmalQ表达宿主中，产生EC0063表达宿主。制备细胞提取物并且如上所述利用麦芽四糖底物测定。表2中的结果示出pET23D在BL21 DE3中具有用于麦芽四糖转化的背景活性，但在BL21 DE3ΔmalQ宿主中不具有背景活性。当编码DD酶的pDCQ863在BL21 DE3ΔmalQ宿主中表达时，由于DD酶的活性，麦芽四糖被转化。表达DD酶的EC0063用作用于葡聚糖生产的DD酶(SEQ ID NO：2)的来源。
实施例3
通过糊精右旋糖酐酶和右旋糖酐酶的组合产生的可溶性纤维的分离
将包含30g/L麦芽糊精DE13-17(Sigma 419680)和含有糊精右旋糖酐酶(实施例1)的氧化葡糖杆菌透析酶10x浓缩物(120mL)的10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.8)的1200mL反应物在37℃下震荡48小时。通过在90℃加热10分钟使右旋糖酐右旋糖酐酶失活，然后通过离心分离不溶性反应产物，所得固体用蒸馏的去离子水洗涤三次以除去可溶性产物混合物组分，并将洗涤的固体冻干，以产生固体产物。
通过将3.75g如上所述制备的冻干固体溶于10mM乙酸钠缓冲液(pH4.8)中来制备150-mL反应混合物。使用30K MWCO过滤器浓缩右旋糖酐酶(来自毛壳菌的1，6-α-D-葡聚糖6-葡聚糖水解酶，Sigma D-0443)并在10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.8)中稀释至原体积，然后将0.015mL的该透析的右旋糖酐酶溶液在蒸馏水中的1∶100稀释液加入反应混合物中，将混合物在37℃下振荡6小时，然后加热至90℃并持续10分钟以使酶失活。通过旋转蒸发将所得产物混合物浓缩2倍，然后离心并通过HPLC对所得上清液进行可溶性单糖、二糖和寡糖分析。通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化上清液，并且将包含寡糖≥DP3的SEC级分混合，通过旋转蒸发浓缩并冻干，然后通过HPLC分析(表3)。
表3：由糊精右旋糖酐酶和右旋糖酐酶产生的可溶性寡糖纤维。
实施例4
通过糊精右旋糖酐酶和右旋糖酐酶的组合产生的可溶性纤维的分离
将包含30g/L麦芽糊精DE13-17(Sigma 419680)和含有糊精右旋糖酐酶(实施例1)的氧化葡糖杆菌透析酶10x浓缩物(120mL)的10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.8)的1200mL反应物在37℃下震荡48小时。通过在90℃加热10分钟使右旋糖酐右旋糖酐酶失活，然后通过离心分离不溶性反应产物，所得固体用蒸馏的去离子水洗涤三次以除去可溶性产物混合物组分，并将洗涤的固体冻干，以产生固体产物。
通过将3.75g如上所述制备的冻干固体溶于10mM乙酸钠缓冲液(pH4.8)中来制备150-mL反应混合物。使用30K MWCO过滤器浓缩右旋糖酐酶(来自毛壳菌的1，6-α-D-葡聚糖6-葡聚糖水解酶，Sigma D-0443)并在10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.8)中稀释至原体积，然后将0.015mL的该透析的右旋糖酐酶溶液在蒸馏水中的1∶100稀释液加入反应混合物中，将混合物在37℃下振荡42小时，然后加热至90℃并持续10分钟以使酶失活。通过旋转蒸发将所得产物混合物浓缩2倍，然后离心并通过HPLC对所得上清液进行可溶性单糖、二糖和寡糖分析。通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化上清液，并且将包含寡糖≥DP3的SEC级分混合，通过旋转蒸发浓缩并冻干，然后通过HPLC分析(表4)。
表4：由糊精右旋糖酐酶和右旋糖酐酶产生的可溶性寡糖纤维。
实施例5
通过糊精右旋糖酐酶和右旋糖酐酶的组合产生的可溶性纤维的分离
将包含25g/L麦芽糊精DE13-17(Sigma 419680)和含有糊精右旋糖酐酶(实施例1)的氧化葡糖杆菌透析酶10x浓缩物(100mL)的10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.8)的两种1250mL反应物在37℃下震荡44小时。通过离心分离不溶性反应产物，所得固体用蒸馏的去离子水洗涤以除去可溶性产物混合物组分，并将洗涤的固体冻干，以产生18.5g产物。将冻干固体溶于500mL的蒸馏的去离子水中，并加入0.001mL的右旋糖酐酶(来自毛壳菌的1，6-α-D-葡聚糖6-葡聚糖水解酶，Sigma D-0443)，将混合物在37℃下振荡40小时，然后加热至90℃并持续10分钟以使酶失活。通过旋转蒸发将所得产物混合物浓缩2倍，然后离心并通过HPLC对所得上清液进行可溶性单糖、二糖和寡糖分析。通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化上清液，并且将包含寡糖≥DP3的SEC级分混合，通过旋转蒸发浓缩并冻干，然后通过HPLC分析(表5)。
表5：由糊精右旋糖酐酶和右旋糖酐酶产生的可溶性寡糖纤维。
实施例6
由糊精右旋糖酐酶和右旋糖酐酶的组合产生的可溶性纤维的异头键分析
如实施例3、4和5中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性寡糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且通过1H NMR谱并通过GC/MS分析所得的固体，如一般方法部分中所述(上文)。这些可溶性寡糖纤维混合物中每一个的异头键记录在表6和7中。
表6：通过1H NMR谱对糊精右旋糖酐酶/右旋糖酐酶可溶性纤维的异头键分析。
表7：通过GC/MS对糊精右旋糖酐酶/右旋糖酐酶可溶性纤维的异头键分析。
实施例7
通过糊精右旋糖酐酶和右旋糖酐酶的组合产生的可溶性纤维的粘度
将如实施例3和4中所述制备的色谱纯化的可溶性寡糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且将所得的固体用于制备可溶性纤维的12重量％蒸馏去离子水溶液。如一般方法部分中所述，在20℃下测量可溶性纤维溶液的粘度(以厘泊(cP)为单位记录，其中1cP＝1毫帕斯卡-s(mpa-s))(表8)。
表8：在20℃下测量的12重量/重量％糊精右旋糖酐酶/右旋糖酐酶可溶性纤维溶 液的粘度
实施例号 粘度(cP)
3 7.9
4 2.3
实施例8
通过糊精右旋糖酐酶和右旋糖酐酶的组合产生的可溶性纤维的消化度
将如实施例3和4中所述制备的色谱纯化的可溶性寡糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量。消化度测试方案改编自Megazyme总和综膳食纤维测定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最终酶浓度保持与AOAC方法相同：50单位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，对于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言为3.4单位/mL。如由AOAC方法所推荐的，每种反应中的底物浓度为25mg/mL。每种反应的总体积为1mL。在具有或不具有两种消化酶的处理的情况下，一式两份分析每种样本。如一般方法中所述，通过利用Aminex HPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量释放的葡萄糖量。将麦芽糊精(DE4-7，Sigma)用作酶的阳性对照(表9)。
表9：糊精右旋糖酐酶/右旋糖酐酶可溶性纤维的消化度。
实施例号 消化度(％)
3 0.0
4 0.0
实施例9
通过糊精右旋糖酐酶和右旋糖酐酶的组合产生的可溶性纤维的分子量
将如实施例3、4和5中所述制备的色谱纯化的可溶性寡糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且通过SEC色谱分析所得固体的数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、峰值分子量(Mp)、z均分子量(Mz)、和多分散性指数(PDI＝Mw/Mn)。如在一般方法部分中所述分析如实施例5中所述制备的糊精右旋糖酐酶/右旋糖酐酶可溶性纤维。如下分析如实施例3和4中所述制备的糊精右旋糖酐酶/右旋糖酐酶可溶性纤维：柱，Waters Ultrahydrogel 500柱(配备有Waters ultrahydrogel保护柱)；流动相，蒸馏的去离子水；流量，0.5mL/min；柱温，80℃。使用右旋糖酐分子量标准品(Sigma)产生校准曲线，各自以10g/L的浓度。
校准表：
表中组分栏中“dxt”之后的数字表示Mw/1000，即“dxt50”是Mw为50,000的右旋糖酐。作为Mw函数的保留时间通过曲线拟合为：
RT＝-1.3451n(Mw/1000)+23.514
R2＝0.9964来确定。
为了测定样本的平均Mn和Mw，以表格形式(以1s间隔记录数据)提取面积计数，并使用上述拟合的校准曲线将其转化为Mw。然后由表格化数据计算平均Mw和Mn(表10)
表10：通过SEC表征糊精右旋糖酐酶/右旋糖酐酶可溶性纤维(ND＝未测定)。
实施例10
通过与右旋糖酐糊精酶反应由玉米淀粉制备可溶性纤维
在两步反应中由玉米淀粉制备可溶性纤维，其中使用α-淀粉酶将淀粉水解成可溶性多糖(麦芽糊精)，并且在同一反应器中使用右旋糖酐右旋糖酐酶(DD酶)将所得的水解淀粉(主要包含α-1，4-键)转化为可溶性纤维(主要包括α-1，6-键)。
在高温液化反应中使用α-淀粉酶将玉米淀粉水解成可溶性寡糖。反应器是安装有搅拌并且具有监测温度和pH能力的200-mL玻璃树脂釜。将玉米淀粉与自来水混合以形成含有11.1重量％淀粉(基于干淀粉)的135克浆料。将该浆料加热至55℃，并且pH为5.9。以0.10重量％的浓度(基于干淀粉)加入CL(购自E.I.duPont deNemours and Company，Inc.，Wilmington，DE(“DuPont”)的α-淀粉酶)。将温度增加至85℃，并且pH为6.0。使用4重量％硫酸将pH调节至5.7。在85℃下使反应进行2小时。液化结束时的pH为约5.5。在液化结束时，将反应混合物冷却至30℃，并使用4重量％硫酸将pH降低至4.8。在液化中约100％的淀粉水解成可溶性寡糖，导致最终液化淀粉溶液中约11.0重量％的水解淀粉。
通过在同一反应器中与右旋糖酐糊精酶(DD酶)反应，将液化中产生的水解淀粉转化为可溶性纤维。向pH 4.8下的水解玉米淀粉混合物(如上文刚描述的制备)中加入15.0克包含DD酶的大肠杆菌提取物(如实施例2中所述制备)，在150克总反应混合物中产生约10.0重量％DD酶提取物。加入DD酶提取物后水解淀粉底物的初始浓度为约10.0重量％。由于添加提取物，pH增加至约6.0，并且如前所述调节回4.8。将反应温度保持在30℃，并且在由顶置式叶轮提供的恒定搅拌下将pH保持在4.8。表11示出刚添加DD酶之后反应混合物中的水解淀粉的组成(如通过一般方法中所述由HPLC测定)。
表11：在利用DD酶的反应开始时的可溶性水解淀粉(由玉米淀粉液化产生)的组 成。
在与DD酶反应期间，随着水解淀粉转化为可溶性纤维产物，pH随时间缓慢降低。使用4重量％NaOH定期进行调节以将pH维持在4.5-4.8。在30℃下使反应进行24小时。表12示出根据时间，水解淀粉向可溶性纤维产物的转化。在利用10.0重量％水解淀粉底物开始24小时之后，实现约67％的转化率。
表12：根据时间，水解淀粉(主要α-1，4-键)向可溶性纤维产物(主要α-1，6-键)的 转化。
表13示出在与DD酶反应期间，根据时间，反应混合物中纤维产物(主要1，6-连接的右旋糖聚合物)的组成。反应混合物中纤维产物的组成通过使用葡糖淀粉酶将反应样本中的未反应的底物麦芽糊精(主要是1，4-连接的右旋糖聚合物)消化为葡萄糖并通过HPLC分析消化的样本来测定。表14示出，根据水解淀粉的转化，反应混合物中1，6-键量的数据。通过1H NMR测定反应样本中所含产物中包含的1，6-键的量(参见一般方法)。24小时后，约67％的初始水解淀粉转化成可溶性纤维产物，并且反应混合物由约60％的1，6-连接纤维产物组成，这指示约90％的形成的纤维产物由1，6键构成。
表14：根据水解淀粉转化，纤维产物中1，6-键的量。
水解淀粉的转化，％ 反应物中的％1，6-键
8.2 4.7
52.4 48.8
63.8 57.3
66.7 59.7
实施例11
通过与右旋糖酐糊精酶反应由玉米淀粉生产可溶性寡糖
在两步反应中由玉米淀粉制备可溶性纤维，其中使用α-淀粉酶将淀粉水解成可溶性多糖(麦芽糊精)，并且在同一反应器中使用右旋糖酐右旋糖酐酶(DD酶)将所得的水解淀粉(主要包含α-1，4-键)转化为可溶性纤维(主要包括α-1，6-键)。
在高温液化反应中使用α-淀粉酶将玉米淀粉水解成可溶性寡糖。反应器是安装有搅拌并且具有监测温度和pH能力的200-mL玻璃树脂釜。将玉米淀粉与自来水混合以形成含有11.0重量％淀粉(基于干淀粉)的108克浆料。将该浆料加热至55℃，并且pH为5.9。以0.025重量％的浓度(基于干淀粉)加入CL(购自DuPont的α-淀粉酶)。将温度增加至83℃，并且pH为5.6。在83℃下使反应进行2小时。液化结束时的pH为约5.7。在液化结束时，将反应混合物冷却至26℃，并使用4重量％硫酸将pH降低至4.9。在液化中约95％的淀粉水解成可溶性寡糖，导致最终液化淀粉溶液中约10.5重量％的水解淀粉。
通过在同一反应器中与右旋糖酐糊精酶(DD酶)反应，将液化中产生的水解淀粉转化为可溶性纤维。向pH 4.9下的水解玉米淀粉混合物(如上文刚描述的制备)中加入12.1克包含DD酶的大肠杆菌提取物(如实施例2中所述制备)，在120克总反应混合物中产生约10.1重量％DD酶提取物。加入DD酶提取物后水解淀粉底物的初始浓度为约9.5重量％。由于添加提取物，反应器pH增加至约6.5，并且使用4重量％H2SO4调节回4.8。在反应开始时，温度为29℃，并且pH为4.6。表15示出刚添加DD酶之后水解淀粉的组成(如通过一般方法中所述由HPLC测定)。
表15：在利用DD酶的反应开始时的可溶性水解淀粉(由玉米淀粉液化产生)的组 成。
在与DD酶反应期间，随着水解淀粉转化为可溶性纤维产物，pH随时间缓慢降低。使用4重量％NaOH定期进行调节以将pH维持在4.5-4.7。在29℃下使反应进行24小时。表16示出根据时间，水解淀粉向可溶性纤维产物的转化。在利用9.5重量％水解淀粉底物开始24小时之后，实现约45％的转化率。
表16：根据时间，水解淀粉(主要α-1，4-键)向可溶性纤维产物(主要α-1，6-键)的 转化。
表17示出在与DD酶反应期间，根据时间，反应混合物中纤维产物(主要1，6-连接的右旋糖聚合物)的组成。反应混合物中纤维产物的组成(如表S2-3t中所示)通过使用葡糖淀粉酶将反应样本中的未反应的底物麦芽糊精(主要是1，4-连接的右旋糖聚合物)消化为葡萄糖并通过HPLC分析消化的样本来测定。表18示出，根据水解淀粉的转化，反应混合物中1，6-键量的数据。通过1H NMR测定反应样本中所含产物中包含的1，6-键的量(参见一般方法)。24小时后，约45％的初始水解淀粉转化成可溶性纤维产物，并且反应混合物由约52％的1，6-连接纤维产物组成，这指示几乎所有形成的纤维产物均由1，6键构成。
表18：根据水解淀粉转化，纤维产物中1，6-键的量。
水解淀粉的转化，％ 反应物中的％1，6-键
2.1 4.7
9.8 19.0
38.5 48.7
45.4 52.5
实施例12
使用可溶性寡糖/多糖纤维作为碳源的体外气体产生
将经色谱纯化的可溶性寡糖/多糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量。随后，使用如一般方法中所述的方法，评估作为碳源的单独的可溶性寡糖/多糖可溶性纤维样本的体内气体产生。包括如下物质作为对照碳源：85(可溶性玉米纤维，Tate&Lyle)、FM06(可溶性玉米纤维或糊精，Roquette)、600F(耐消化麦芽糊精，Archer Daniels Midland Company&Matsutani Chemical)、GR(菊粉，得自Beneo，Mannheim，Germany)、UltraTM(聚右旋糖，Danisco)、GOS(半乳糖寡糖，Clasado Inc.，Reading，UK)、P95(低聚果糖(果寡糖，FOS，Beneo)，LACTITOL MC(4-O-β-D-吡喃半乳糖-D-葡萄糖醇一水合物，Danisco)、和葡萄糖。表19列出了在3h和24h下由肠道微生物群产生的体外气体产量。
表19：由肠道微生物群产生的体外气体。
实施例13
结肠发酵模拟和脂肪酸的测量
使用半连续结肠模拟器模拟结肠发酵，如由等人所述(Nutri.Cancer(2005)52(1)：94-104)；简单来说，结肠模拟器由包含模拟回肠液的四个玻璃容器组成，如Macfarlane等人所述的(Microb.Ecol.(1998)35(2)：180-187)。模拟器用新鲜的人粪便微生物群接种，并且每三个小时用新的回肠液喂养，内容物中部分从一个容器转移到下一个容器。回肠液包含浓度为1％的所述测试组分中的一种。所述模拟持续48h，此后收获四个容器的内容物用于进一步分析。进一步的分析涉及微生物代谢物诸如短链脂肪酸(SCFA)(也称为挥发性脂肪酸(VFA)和支链脂肪酸(BCFA))的测定。分析如Holben等人(Microb.Ecol.(2002)44：175-185)所述进行；简单来说，将模拟器内容物离心并且将上清液用于SCFA和BCFA分析。将新戊酸(内标)和水与上清液混合并离心。离心后，向上清液中加入草酸溶液，并且然后将混合物在4℃下温育，并且然后再次离心。通过使用火焰离子化检测器和氦气作为载气的气相色谱来分析所得的上清液。还提供由ULTRATM(聚葡聚糖，Danisco)、P95(低聚果糖；果寡糖，“FOS”，Beneo)、乳糖醇(Lactitol MC(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖醇一水合物，Danisco)、和阴性对照的样本产生的比较数据。测定乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸和乳酸的浓度(表20)。
表20：模拟代谢和脂肪酸产生的测量。
实施例14
制备酸奶-可饮用沙冰
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备酸奶-可饮用沙冰。
表21：
成分 重量％
蒸馏水 49.00
Supro XT40大豆蛋白分离物 6.50
果糖 1.00
Grindsted ASD525，Danisco 0.30
苹果汁浓缩物(70Brix) 14.79
草莓果泥，单一强度 4.00
香蕉果泥，单一强度 6.00
简单的低脂酸奶-希腊风格，Cabot 9.00
1％Red40Soln 0.17
草莓风味剂(DD-148-459-6) 0.65
香蕉风味剂(#29513) 0.20
75/25苹果酸/柠檬酸共混物 0.40
本发明可溶性纤维样本 8.00
总计 100.00
实施例15
纤维水制剂的制备
以下实施例描述了利用本发明纤维制备纤维水。
表22：
成分 重量％
水，去离子的 86.41
淡黄绿色#06509 0.00
本发明可溶性纤维样本 8.00
蔗糖 5.28
柠檬酸 0.08
风味剂(M748699M) 0.20
维生素C，抗坏血酸 0.02
总计 100.00
实施例16
可勺性酸奶制剂的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备可勺性酸奶。
表23：
实施例17
模拟小吃棒制剂的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备模拟小吃棒。
表24：
实施例18
高纤维片的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备高纤维片。
表25：
1-Danisco.
实施例19
软巧克力碎片曲奇的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备软巧克力碎片曲奇。
表26：
成分 重量％
塔板1
乳糖醇，C 16.00
糕点用人造奶油 17.70
盐 0.30
烘焙粉末 0.80
鸡蛋，整体干燥 0.80
苏打的碳酸氢盐 0.20
香草风味剂 0.26
焦糖风味剂 0.03
蔗糖素粉末 0.01
塔板2
本发明纤维溶液(70Brix) 9.50
水 4.30
塔板3
面粉，酥皮点心用 21.30
面粉，高比率蛋糕用 13.70
塔板四
巧克力碎片，100％乳糖醇，无糖 15.10
实施例20
减脂油酥松饼的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备减脂油酥松饼。
表27：
步骤号 程序
1.将面粉、盐和本发明葡聚糖纤维(干燥)干共混
2.在脂肪中轻擦直至混合物类似于细面包屑。
3.加入足够的水以形成光滑生面团。
实施例21
低糖谷物簇的制备
以下实施例描述了利用本发明纤维中的一种制备低糖谷物簇。
表28：
成分 重量％
糖浆粘合剂 30.0
乳糖醇，MC50％
本发明纤维溶液(70Brix)25％
水25％
谷物混合物 60.0
燕麦片70％
片状燕麦10％
酥脆米10％
燕麦片10％
植物油 10.0
实施例22
果冻的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备果冻。
表29：
成分 重量％
组分A
木糖醇 4.4
果胶 1.3
组分B
水 13.75
柠檬酸钠 0.3
柠檬酸，无水的 0.3
组分C
本发明纤维溶液(70Brix) 58.1
木糖醇 21.5
组分D
柠檬酸 0.35
风味剂、颜料 适量
实施例23
橡皮糖的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备橡皮糖。
表30：
实施例24
咖啡-樱桃冰淇淋的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备咖啡-樱桃冰淇淋。
表31：
1-Danisco.

Claims (15)

1.一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，包含：
a.10至20％的α-(1，4)糖苷键；
b.60至88％的α-(1，6)糖苷键；
c.0.1至15％的α-(1，4，6)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键；
d.小于50000道尔顿的重均分子量；
e.在水中12重量％下小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
f.如分析化学师协会(Association of Analytical Communities，AOAC)方法2009.01所测量的小于12％的消化度；
g.在25℃下，pH7水中至少20％(w/w)的溶解度；和
h.小于10的多分散性指数。
2.根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其中所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物的特征在于介于1000和5000g/mol之间的数均分子量(Mn)。
3.一种碳水化合物组合物，包含：0.01至99重量％(基于干固体)的权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
4.根据权利要求3所述的碳水化合物组合物，还包含：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、安赛蜜钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、蔗糖素、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲基酯、糖精、麦芽糊精、淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糊精、支链麦芽糊精、菊粉、聚右旋糖、果寡糖、半乳糖寡糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、异麦芽寡糖、填料、赋形剂、粘合剂或它们的任意组合。
5.一种食物产品，包含权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物或权利要求3或4所述的碳水化合物组合物。
6.一种制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，包括：
a.提供一系列的反应组分，其包括：
i.麦芽糊精底物；
ii至少一种具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽(E.C.2.4.1.2)；
iii.至少一种具有内切右旋糖酐酶活性的多肽(E.C.3.2.1.11)，其能够内切水解具有一个或多个α-(1，6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
b.在适当的含水反应条件下在单一反应体系中将所述反应组分的系列混合，从而制备包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的产品；以及
c.任选地，将所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物与步骤(b)的产品分离。
7.根据权利要求6所述的方法，还包括步骤(d)浓缩所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
8.根据权利要求6所述的方法，其中在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列混合包括将食物产品中的反应组分的系列混合。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述至少一种具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列。
10.一种制备共混碳水化合物组合物的方法，包括将权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与以下物质混合：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、安赛蜜钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、蔗糖素、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲基酯、糖精、麦芽糊精、淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糊精、支链麦芽糊精、菊粉、聚右旋糖、果寡糖、半乳糖寡糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、异麦芽寡糖、填料、赋形剂、粘合剂或它们的任意组合。
11.一种减小食物或饮料的血糖指数的方法，包括向食物或饮料中掺入权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物，从而减小所述食物或饮料的血糖指数。
12.一种抑制血糖水平升高、降低脂质、治疗便秘、或改变哺乳动物中脂肪酸产生的方法，包括向所述哺乳动物施用权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的步骤。
13.一种美容组合物、药物组合物或低龋性组合物，包含权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
14.权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物在适于包括人类在内的动物食用的食物组合物中的用途。
15.一种组合物，包含0.01至99重量％(基于干固体)的权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物和以下物质：合生素、肽、肽水解产物、蛋白质、蛋白质水解产物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、维生素、矿物质、草药、草药提取物、脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)、植物甾体、甜菜碱、类胡萝卜素、消化酶、益生生物或它们的任意组合。
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