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CN106535653A - 可溶性葡聚糖纤维的酶促合成 - Google Patents

可溶性葡聚糖纤维的酶促合成 Download PDF

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CN106535653A
CN106535653A CN201580039840.1A CN201580039840A CN106535653A CN 106535653 A CN106535653 A CN 106535653A CN 201580039840 A CN201580039840 A CN 201580039840A CN 106535653 A CN106535653 A CN 106535653A
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CN
China
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glucanses
alpha
fiber
seq
enzyme
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Withdrawn
Application number
CN201580039840.1A
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English (en)
Inventor
程琼
R.迪科斯莫
A.奥维汉德
游正
M.S.帕伊内
J.C.普拉萨德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EIDP Inc
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical EI Du Pont de Nemours and Co
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Abstract

本发明提供酶促制备的可溶性α‑葡聚糖纤维组合物，其适用于用作食品和饲料应用中的耐消化纤维。所述可溶性α‑葡聚糖纤维组合物可与一种或多种附加的食品成分共混以制备包含纤维的组合物。本发明还提供了包含所述可溶性α‑葡聚糖纤维的组合物的制备和使用方法。

Description

可溶性葡聚糖纤维的酶促合成
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2014年5月29日提交的，标题为“Enzymatic Synthesis ofSoluble Glucan Fiber(可溶性葡聚糖纤维的酶促合成)”的美国临时专利申请号62/004308的优先权，其公开内容以引用方式全文并入本文。
以引用方式并入的序列表
在2015年5月11日形成并且与本文一起提交的，以大小为433,860字节的名称为“20150515_CL6056WOPCT_SequenceListing_ST25.txt”文件提供的序列表以引用的方式全文并入本文。
技术领域
本公开涉及可溶性α-葡聚糖纤维，包含该可溶性纤维的组合物，以及制备和使用该可溶性α-葡聚糖纤维的方法。所述可溶性α-葡聚糖纤维是在上胃肠道中高度耐消化的，在下胃肠道中表现出可接受的产气率，作为膳食纤维具有良好的耐受性，并且具有一种或多种通常与可溶性膳食纤维相关联的有益特性。
背景技术
膳食纤维(可溶性和不可溶性两者)是对于健康、消化和预防病症诸如心脏病、糖尿病、肥胖症、憩室炎和便秘而言重要的营养物质。然而，大多数人不食用每日推荐摄入的膳食纤维。2010年美国人膳食纤维指南(美国农业部和美国卫生和人类服务部，Dietary Guidelines for Americans，2010，第7版，Washington，DC：美国政府印刷局，2010年12月)报道了膳食纤维摄入不足是成人和儿童的公共健康问题。因此，仍然需要增加每日膳食纤维摄入量，尤其是适用于多种食品应用的可溶性膳食纤维。
历史上，膳食纤维被定义为植物中固有的和完整的非可消化性碳水化合物和木质素。该定义已经扩展为包括具有不被人类上胃肠道中的内源性酶显著水解并通过普遍接受的科学证据证明具有有益生理效应的三个或更多个单体单元的碳水化合物聚合物。可溶性低聚糖纤维产品(诸如果糖、葡聚糖的低聚物等)当前用于多种食品应用中。然而，许多可商购获得的可溶性纤维具有不可取的特性诸如低耐受性(造成不可取的效应诸如腹部胃气胀或气体、痢疾等)、缺乏耐消化性、在低pH(例如pH 4或更低)下的不稳定性、高成本或制备方法需要至少一个酸催化的热处理步骤以将更易消化的糖苷键(例如葡聚糖中的α-(1，4)键)随机重排为具有更耐消化性的键的更高度支化的化合物。仅使用天然存在的酶以由安全和容易获得的底物诸如蔗糖合成适宜的葡聚糖纤维的方法可能对消费者更具吸引力。
各种菌种具有由蔗糖合成右旋糖酐低聚物的能力。Jeanes等人(JACS(1954)76：5041-5052)描述了由96种细菌菌株制备的右旋糖酐。右旋糖酐被报道包含显著百分比(50％-97％)的α-(1，6)糖苷键与不同量的α-(1，3)和α-(1，4)糖苷键。未报道存在于单独菌株内的酶(数量和类型两者)，并且在某些菌株中的右旋糖酐特征表现出可变性，其中由每种菌种产生的右旋糖酐可以是由每种菌种产生的多于一种酶的产物。
属于葡糖苷水解酶家族70的葡糖基转移酶(葡聚糖蔗糖酶；GTF)能够聚合蔗糖的D-葡糖基单元以形成同寡糖或同多糖。葡聚糖蔗糖酶通过形成的糖低聚物的类型进一步分类。例如，右旋糖酐蔗糖酶是产生主要具有α-(1，6)糖苷键的糖低聚物(“右旋糖酐”)的那些，并且变聚糖蔗糖酶是趋于产生具有富含α-(1，3)糖苷键的主链的不溶性糖低聚物的那些。变聚糖蔗糖酶由常见氨基酸来表征。例如，A.Shimamura等人(J.Bacteriology，(1994)176：4845-4850)研究了GTF与变异链球菌(Streptococcus mutans)GS5的结构-功能关系，并且识别了影响由GTF合成的葡聚糖产物的性质的多个氨基酸位置，其中产生α-(1，3)-和α-(1，6)-异头键的相对量的变化。罗伊糖蔗糖酶(Reuteransucrases)趋于产生富含α-(1，4)、α-(1，6)和α-(1，4，6)糖苷键的糖低聚物，并且交替糖蔗糖酶是趋于产生具有由交替的α-(1，3)和α-(1，6)糖苷键组成的线性主链的糖低聚物的那些。这些酶中的一些能够在不同程度上引入其它糖苷键，常常作为支化点。V.Monchois等人(FEMS Microbiol Rev.，(1999)23：131-151)讨论了提出的多种葡聚糖蔗糖酶的作用机制和结构-功能关系。H.Leemhuis等人(J.Biotechnol.，(2013)163：250-272)描述了葡聚糖蔗糖酶的特征性三维结构、反应、机制和α-葡聚糖分析。
描述使用葡聚糖蔗糖酶(野生型、截短型或其变体)制备糖低聚物的专利和公布的专利申请的非限制性列表已被报道用于右旋糖酐(美国专利4,649,058和7,897,373；以及美国专利申请公布2011-0178289A1)、罗伊糖(reuteran)(美国专利申请公布2009-0297663A1和美国专利6,867,026)、交替糖和/或麦芽交替糖低聚物(“MAO”)(美国专利7,402,420和7,524,645；美国专利申请公布2010-0122378A1；和欧洲专利EP1151085B1)、α-(1，2)支链右旋糖酐(美国专利7,439,049)、和包含α-(1，3)、α-(1，6)和α-(1，3，6)键的混合物的混合键糖低聚物(缺乏交替糖样主链)(美国专利申请公布2005-0059633A1)。授予Kol-Jakon等人的美国专利申请公布2009-0300798A1公开了表达产生改性淀粉的变聚糖蔗糖酶的基因改性的植物细胞。
已经报道了使用葡糖基转移酶和α-葡聚糖水解酶的组合来酶促制备异麦芽糖、异麦芽低聚糖和右旋糖酐。美国专利2,776,925描述了用于酶促制备中间分子量的右旋糖酐的方法，该方法包括右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的同时作用。美国专利4,861,381A描述了使用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的组合酶促制备包含39％-80％异麦芽糖的组合物。Goulas等人(Enz.Microb.Tech(2004)35：327-338)描述了使用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶由蔗糖批量合成异麦芽低聚糖(IMO)。美国专利8,192,956公开了使用重组表达的杂交基因酶促制备用于临床应用的异麦芽低聚糖(IMO)和低分子量右旋糖酐，所述杂交基因包含融合在一起的编码α-葡聚糖酶的基因和编码右旋糖酐蔗糖酶的基因，其中葡聚糖酶基因是来自节杆菌属(Arthrobacter sp.)的基因，其中右旋糖酐蔗糖酶基因是来自明串珠菌属(Leuconostoc sp.)的基因。
Hayacibara等人(Carb.Res.(2004)339：2127-2137)描述了突变酶和右旋糖酐酶对由来自牙斑中蔗糖的糖基转移酶形成的葡聚糖的产生和结构的影响。报道的研究目的在于评估在突变酶和右旋糖酐酶存在下(单独的或组合的)由GTF合成的葡聚糖的产生和结构，试图阐明在牙斑形成期间可发生一些相互作用。
突变酶(葡聚糖内切-1，3-α-葡聚糖水解酶)由一些真菌(包括木霉属、曲霉属、青霉属和枝孢菌属)以及一些细菌(包括链霉菌属、黄杆菌属、拟杆菌属、芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属)产生。W.Suyotha等人(Biosci，Biotechnol.Biochem.，(2013)77：639-647)描述了结构域结构和结构域缺失对来自环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)KA-304的α-1，3-葡聚糖水解酶的活性的影响。Y.Hakamada等人(Biochimie，(2008)90：525-533)描述了多种突变酶的结构域结构分析，并且提出了突变酶的系统发育树。I.Shimotsuura等人(Appl.Environ.Microbiol.，(2008)74：2759-2765)报道了来自类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)菌株RM1的突变酶的生物化学和分子特征，其中N-端结构域具有强突变结合活性但不具有突变酶活性，然而C端结构域负责突变酶活性但具有显著低于完整蛋白的突变结合活性。C.C.Fuglsang等人(J.Biol.Chem.，(2000)275：2009-2018)描述了重组真菌突变酶(内切葡聚糖酶)的生物化学分析，其中所述真菌突变酶由NH2-端催化结构域和假定的COOH-端多糖结合结构域构成。
右旋糖酐酶(α-1，6-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶)是水解右旋糖酐的α-1，6-键的酶。N.Suzuki等人(J.Biol.Chem.(2012)287：19916-19926)描述了变异链球菌(Streptococcusmutans)右旋糖酐酶的晶体结构，并且识别了三个结构域，包括含有酶的催化模块的结构域A，和右旋糖酐结合结构域C；还相对于酶结构描述了催化机制。A.M.Larsson等人(Structure，(2003)11：1111-1121)报道了来自朱黄青霉(Penicillium minioluteum)的右旋糖酐酶的晶体结构，其中所述结构用于限定反应机制。H-K Kang等人(Yeast，(2005)22：1239-1248)描述了来自斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)的右旋糖酐酶的特征。T.Igarashi等人(Microbiol.Immunol.，(2004)48：155-162)描述了来自大鼠链球菌(Streptococcus rattus)的右旋糖酐酶的分子特征，其中氨基酸序列的保守区包含两个功能结构域，催化位点和右旋糖酐结合位点。
本领域中已经报道了各种糖低聚物组合物。例如，美国专利6,486,314公开了α-葡聚糖，其包含至少20个，至多达约100,000个α-葡糖酐单元，其中38％-48％为4-连接的葡糖酐单元，17％-28％为6-连接的葡糖酐单元，并且7％-20％为4，6-连接的葡糖酐单元，和/或葡萄糖-低聚糖，其包含至少两个4-连接的葡糖酐单元、至少一个6-连接的葡糖酐单元和至少一个4，6-连接的葡糖酐单元。美国专利申请公布2010-0284972A1公开了用于改善受试者的健康的组合物，其包含α-(1，2)-支化α-(1，6)低聚右旋糖酐。美国专利申请公布2011-0020496A1公开了支链糊精，所述糊精具有以下结构，其中葡萄糖或异麦芽低聚糖通过α-(1，6)糖苷键连接至糊精的非还原端，并且具有10至52的DE。美国专利6,630,586公开了支链麦芽糖糊精组合物，其包含22％-35％的(1，6)糖苷键；还原糖含量为＜20％；高分散性指数(Mp/Mn)＜5；并且数均分子量(Mn)为4500g/mol或更小。美国专利7,612,198公开了可溶性、高度支化的葡萄糖聚合物，其具有小于1％的还原糖含量，介于13％和17％之间的α-(1，6)糖苷键的含量和具有介于0.9×105和1.5×105道尔顿之间的值的分子量，其中所述可溶性高度支化的葡萄糖聚合物具有以下支链长度分布曲线：70％至85％的聚合度(DP)小于15，10％至14％的DP介于15和25之间，并且8％至13％的DP大于25。
糖低聚物和/或包含所述低聚物的碳水化合物组合物已经被描述为适用于用作食品应用中的可溶性纤维的来源(美国专利8,057,840和美国专利申请公布2010-0047432A1和2011-0081474A1)。美国专利申请公布2012-0034366A1公开了低糖、包含纤维的碳水化合物组合物，其被报道为适用于用作食物产品中的传统玉米糖浆、高果糖玉米糖浆和其它甜味剂的替代物。
仍然需要开发新的可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其耐消化，表现出下胃肠道中气体形成的相对较低含量和/或较慢速率、耐受良好、具有低粘度、并且适用于食品和其它应用中。优选地，α-葡聚糖纤维组合物可使用已经与在人类中安全使用相关联的酶由蔗糖酶促制备。
发明内容
本发明提供一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其适用于多种应用，包括但不限于，食品应用、改善胃肠健康的组合物和个人护理组合物。可溶性纤维组合物可直接用作食品中的成分或可掺入适用于食品应用的碳水化合物组合物中。
本发明还提供了用于制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法。
本发明还提供了在食品应用中使用可溶性纤维组合物或包含所述可溶性纤维组合物的碳水化合物组合物的方法。在某些方面，提供了用于改善受试者的健康的方法，所述方法包括以有效量将本发明可溶性纤维组合物施用于受试者，以有效发挥通常与可溶性膳食纤维相关联的至少一种健康有益效果，诸如改变食品的含热量、降低食品的血糖指数、改变粪便重量和支持肠功能、改变胆固醇代谢、通过结肠发酵提供能量生成代谢物、并且可提供益生元效应。
本发明提供一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，基于干固体，其包含以下物质：
a.10％-30％的α-(1，3)糖苷键；
b.65％-87％的α-(1，6)糖苷键；
c.少于5％的α-(1，3，6)糖苷键；
d.小于5000道尔顿的重均分子量；
e.在20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
f.在4至40范围内的右旋糖当量(DE)；以及
g.小于12％的可消化性，如分析化学师协会(Association of AnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所测量；
h.在25℃下，pH 7水中至少20％(重量/重量)的溶解度；以及
i.小于5的多分散指数。
在另一个实施方案中，提供了一种制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii至少一种具有葡糖基转移酶活性的多肽，所述多肽包含与选自SEQ ID NO：1和3的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；
iii.至少一种具有α-葡聚糖水解酶活性的多肽；以及
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并，由此制备包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的产物；以及
c.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物与步骤(b)的产物分离。
在另一个实施方案中，提供了一种制备上述可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii至少一种多肽，其具有葡糖基转移酶活性并且包含与选自SEQ ID NO：13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及
iii.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并以形成单一反应混合物，由此形成包含葡萄糖低聚物的产物混合物；
c.任选地将上述可溶性α-葡聚糖纤维组合物与包含葡萄糖低聚物的产物混合物分离；以及
d.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
在另一个实施方案中，提供一种用于制备共混碳水化合物组合物的方法，所述方法包括将上述可溶性α-葡聚糖纤维组合物与下列物质合并：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、乙酰磺胺酸钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麦芽糖糊精、淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糖糊精、支链麦芽糖糊精、菊粉、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龙胆糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、低聚异麦芽糖、填料、赋形剂、粘结剂或它们的任意组合。
在另一个实施方案中，提供制备食物产品的方法，所述方法包括将一种或多种可食用食品成分与本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物、或包含本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物、或它们的组合混合。
在另一个实施方案中，提供减小食品或饮料的血糖指数的方法，所述方法包括将本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物掺入食品或饮料中。
在另一个实施方案中，提供用于在哺乳动物中抑制血糖含量升高的方法，所述方法包括将本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤。
在另一个实施方案中，提供用于减少哺乳动物活体中脂质的方法，所述方法包括将本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤。
在另一个实施方案中，提供用于治疗哺乳动物便秘的方法，所述方法包括将本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤。
在另一个实施方案中，提供改变哺乳动物结肠中脂肪酸产生的方法，所述方法包括将本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤；优选地其中短链脂肪酸产生增加，支链脂肪酸产生减少，或上述两者。
在另一个实施方案中，提供包含本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物和至少一种多元醇的低生龋性组合物。
在另一个实施方案中，提供一种组合物，其包含0.01重量％至99重量％(基于干固体)的本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物：合生素、肽、肽水解产物、蛋白质、蛋白质水解产物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、维生素、矿物质、草药、草药提取物、脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)、植物甾类、甜菜碱、类胡萝卜素、消化酶、益生菌生物或它们的任意组合。
在另一个实施方案中，还提供由本文所述方法中任一种制备的产品；优选地，其中所述产品为本发明的可溶性α-葡聚糖组合物。
生物序列简述
下面的序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”)，并且符合世界知识产权组织(WIPO)ST.25标准(2009)以及欧洲专利公约(EPC)和专利合作条约(PCT)的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政规程的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。
SEQ ID NO：1为变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025 Gtf-B葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于 gi：290580544中。
SEQ ID NO：2为编码截短的变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025 Gtf-B( gi：290580544)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：3为截短的变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025 Gtf-B葡糖基转移酶(本文中也称为“0544葡糖基转移酶”或“GTF0544”)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4为腐殖质类芽孢杆菌(Paenibacillus humicus)突变酶的氨基酸序列，如存在于 gi：257153264)中。
SEQ ID NO：5为编码用于在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的腐殖质类芽孢杆菌突变酶( gi：257153265，其中 gi：257153264为对应的多核苷酸序列)的核酸序列。
SEQ ID NO：6为用于在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的成熟腐殖质类芽孢杆菌突变酶( gi：257153264；本文中称为“3264突变酶”或“MUT3264”)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7为用于表达载体中的枯草芽孢杆菌AprE信号肽的氨基酸序列，所述表达载体偶联到各种酶以在枯草芽孢杆菌中表达。
SEQ ID NO：8为编码用于在枯草芽孢杆菌宿主BG6006中表达的腐殖质类芽孢杆菌突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：9为用于在枯草芽孢杆菌宿主BG6006中表达的成熟腐殖质类芽孢杆菌突变酶的氨基酸序列。如本文所用，该突变酶还可在本文中称为“MUT3264”。
SEQ ID NO：10为编码马尔尼菲青霉18224TM突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：11为编码马尔尼菲青霉18224TM突变酶( gi：212533325；本文中也称为“3325突变酶”或“MUT3325”)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12为质粒pTrex3的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：13为变异链球菌(Streptococcus mutans)葡糖基转移酶的氨基酸序列，如在 gi：3130088中所提供的葡糖基转移酶。
SEQ ID NO：14为编码变异链球菌(Streptococcus mutans)葡糖基转移酶的截短型式的核酸序列。
SEQ ID NO：15为质粒pMP69的核酸序列。
SEQ ID NO：16为截短的变异链球菌(Streptococcus mutans)葡糖基转移酶的氨基酸序列，本文中称为“GTF0088”。
SEQ ID NO：17为变异链球菌(Streptococcus mutans)LJ23葡糖基转移酶的氨基酸序列，如以 gi：387786207提供的(也称为“6207”葡糖基转移酶或“GTF6207”)。
SEQ ID NO：18为编码截短的变异链球菌(Streptococcus mutans)LJ23葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：19为变异链球菌(Streptococcus mutans)LJ23葡糖基转移酶的截短型式的氨基酸序列，本文中也称为“GTF6207”。
SEQ ID NO：20为实施例8中使用的1630bp核酸序列。
SEQ ID NO：21-22为引物。
SEQ ID NO：23为质粒p6207-1的核酸序列。
SEQ ID NO：24为终止序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：25为接头序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：26为GTF0088的天然核苷酸序列。
SEQ ID NO：27为GTF5330的天然核苷酸序列。
SEQ ID NO：28为由SEQ ID NO：27编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29为GTF5318的天然核苷酸序列。
SEQ ID NO：30为由SEQ ID NO：29编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：31为GTF5326的天然核苷酸序列。
SEQ ID NO：32为由SEQ ID NO：31编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：33为GTF5312的天然核苷酸序列。
SEQ ID NO：34为由SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35为GFT5334的天然核苷酸序列。
SEQ ID NO：36为由SEQ ID NO：35编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：37为GTF0095的天然核苷酸序列。
SEQ ID NO：38为由SEQ ID NO：37编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：39为GTF0074的天然核苷酸序列。
SEQ ID NO：40为由SEQ ID NO：39编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41为GT5320的天然核苷酸序列。
SEQ ID NO：42为由SEQ ID NO：41编码的氨基酸序列。
SEQID NO：43为GTF0081的天然核苷酸序列。
SEQ ID NO：44为由SEQ ID NO：43编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：45为GTF5328的天然核苷酸序列。
SEQ ID NO：46为由SEQ ID NO：45编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：47为GTF0088的T1 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：48为由SEQ ID NO：47编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：49为GTF5318的T1C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：50为由SEQ ID NO：49编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：51为GTF5328的T1C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：52为由SEQ ID NO：51编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：53为GTF5330的T1C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：54为由SEQ ID NO：53编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：55为GTF0088的T3C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：56为由SEQ ID NO：55编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：57为GTF5318的T3C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：58为由SEQ ID NO：57编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：59为GTF5328的T3C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：60为由SEQ ID NO：59编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：61为GTF5330的T3C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：62为由SEQ ID NO：61编码的氨基酸序列。
具体实施方式
在本公开中，使用了大量术语和缩写。除非另外特别说明，应用下述定义。
如本文所用，在本发明的元件或组分之前的冠词“一个”、“一种”和“所述”旨在表明元件或组分的实例的数量(即发生率)为非限制性的。因此，应将“一个”、“一种”和“所述”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且元件或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“包含”是指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或组分的存在，但它不预先排除一种或多种其它特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施方案。类似地，术语“基本由……组成”旨在包括由术语“由……组成”所涵盖的实施方案。
如本文所用，用术语“约”修饰所用的成分或反应物的数量时是指数值量的变化，该变化可能发生在例如典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理过程中；这些过程中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中等等。术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求都包括量的等同量。
当存在时，所有的范围均包括端值以及其中的组合。例如，当列出范围“1至5”时，所列范围应视为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等等。
如本文所用，术语“可得自”应当是指源材料(例如，蔗糖)，其能够得自特定来源，但不必须限于所述特定来源。
如本文所用，术语“有效量”将是指适于实现期望效应的所用的或所施用的物质量。物质的有效量可根据应用变化。本领域技术人员将通常能够在不进行实验的情况下确定特定应用或受试者的有效量。
如本文所用，术语“分离的”是指物质呈自然界中不存在的形式或环境。分离的物质的非限制性示例包括：(1)任何非天然存在的物质，(2)从一种或多种或所有所述物质在自然界中与之缔合的天然存在的成分中至少部分地去除的任何物质，包括但不限于，任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于存在于自然界中的物质，通过人工改性的任何物质；或者(4)通过相对于与所述物质天然缔合的其它组分，增加所述物质的量来改性的任何物质。
如本文所用，术语“非常低至没有可消化性”、“很少或没有可消化性”、和“低至无可消化性”将是指如通过国际官方分析化学家协会(AOAC)方法2009.01(“AOAC 2009.01”，McCleary等人，(2010)J.AOAC Int.，93(1)，221-233)所测量的可溶性葡聚糖纤维的可消化性的相对水平；其中很少或没有可消化性将是指基于干固体(d.s.b.)，少于12％的可溶性葡聚糖纤维组合物是可消化的，优选地小于5％可消化，更优选地小于1％可消化。在另一方面，可消化性的相对水平可另选地使用AOAC 2011.25(综合总膳食纤维测定，IntegratedTotal Dietary Fiber Assay)(McCleary等人，2012，J.AOAC Int.，95(3)，824-844)测定。
如本文所用，术语“水溶性”将是指由在25℃下在pH 7的水中可以20重量％或更高溶解的纤维构成的本发明的葡聚糖纤维组合物。
如本文所用，术语“可溶性纤维”、“可溶性葡聚糖纤维”、“α-葡聚糖纤维”、“甘蔗糖纤维”、“葡萄糖纤维”、“甜菜糖纤维”、“可溶性膳食纤维”和“可溶性葡聚糖纤维组合物”是指由水溶性葡萄糖低聚物构成的本发明纤维组合物，所述葡萄糖低聚物具有3或更大的葡萄糖聚合度，其为耐消化的(即表现出非常低至没有可消化性)，在人小肠中具有很少或没有吸收，并且在下胃肠道中至少部分地可发酵。可溶性葡聚糖纤维组合物的可消化性使用AOAC方法2009.01测量。本发明可溶性葡聚糖纤维组合物由可得自例如甘蔗和/或糖周甜菜的蔗糖(α-D-吡喃葡糖基β-D-呋喃果糖苷；CAS#57-50-1)酶促合成。在一个实施方案中，本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物不是交替糖或麦芽交替低聚糖。
如本文所用，“重均分子量”或“Mw”计算为Mw＝∑NiMi 2/∑NiMi；其中Mi为链的分子量并且Ni为所述分子量的链数。重均分子量可通过诸如静态光散射、小角中子散射、X射线散射和沉降速度的技术来测定。
如本文所用，“数均分子量”或“Mn”是指样品中所有聚合物链的统计平均分子量。数均分子量计算为Mn＝∑NiMi/∑Ni；其中Mi为链的分子量并且Ni为所述分子量的链数。聚合物的数均分子量可通过如下技术来测定：诸如凝胶渗透色谱法，通过(Mark-Houwink方程)测定粘度，和依数法诸如蒸气压渗透压、端基测定或质子NMR。
如本文所用，“多分散指数”、“PDI”、“不均匀性指数”、和“分散性”是指给定聚合物(诸如葡萄糖低聚物)样品中分子质量分布的量度，并且可通过将重均分子量除以数均分子量来计算(PDI＝Mw/Mn)来计算。
应当注意，如本文所用，术语“葡萄糖”和“吡喃葡萄糖”被认为是同义词并可互换使用。类似的，用于本文的术语“葡糖基”和“吡喃葡糖基”被认为是同义词并可互换使用。
如本文所用，“糖苷键(glycosidic linkage)”或“糖苷键(glycosidic bond)”是指连接糖低聚物(低聚糖和/或多糖)内的糖单体的共价键。糖苷键的示例可包括具有以下键的α-连接的葡萄糖低聚物：1，6-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1，6)键或简称为“α-(1，6)”键)；1，3-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1，3)键或简称为“α-(1，3)”键)；1，4-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1，4)键或简称为“α-(1，4)”键)；1，2-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1，2)键或简称为“α-(1，2)”键)；以及通常与支链糖低聚物缔合的此类键的组合。
如本文所用，术语“葡聚糖蔗糖酶”、“葡糖基转移酶”、“葡糖苷水解酶70型”、“GTF”和“GS”是指分类为通常存在于乳酸菌诸如链球菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属或乳杆菌属中的糖苷-水解酶家族70的转葡糖苷酶(参见，Carbohydrate Active Enzymes database；“CAZy”；Cantarel等人，(2009)Nucleic Acids Res 37：D233-238)。GTF酶能够聚合蔗糖的D-葡糖基单元以形成同寡糖或同多糖。葡糖基转移酶可通过特征性结构特征识别，诸如Leemhuis等人(J.Biotechnology(2013)162：250-272)和Monchois等人(FEMS Micro.Revs.(1999)23：131-151)中所述的那些。取决于GTF酶的特异性，可形成包含各种糖苷键诸如α-(1，2)、α-(1，3)、α-(1，4)和α-(1，6)的直链和/或支链葡聚糖。葡糖基转移酶还可将D-葡糖基单元转移到羟基受体基团上。受体的非限制性列表包括碳水化合物、醇、多元醇和类黄酮。特异性受体还可包括麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。所得葡糖基化产物的结构取决于酶特异性。葡糖基转移酶序列的非限制性列表以氨基酸SEQ ID NO：1、3、13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62提供。在一个方面，葡糖基转移酶以截短形式和/或成熟形式表达。在另一个实施方案中，具有葡萄基转移酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：1、3、13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62具有至少90％同一性，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“异麦芽低聚糖”或“IMO”是指基本上由通常具有DP 2至20的平均大小的α-D-(1，6)糖苷键构成的葡萄糖低聚物。异麦芽低聚糖商业上可由α-淀粉酶、普鲁兰酶、β-淀粉酶和α-葡糖苷酶对玉米淀粉或淀粉衍生物产物的酶促反应制成。可商购获得的产品包括异麦芽低聚糖(DP的范围是从3到8，例如异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽五糖、异麦芽六糖、异麦芽七糖、异麦芽八糖)的混合物，并且还可包括潘糖。
如本文所用，术语“右旋糖酐”是指包含至少95％α-D-(1，6)糖苷键(通常具有在支化点处的多达5％的α-D-(1，3)糖苷键)的水溶性α-葡聚糖，如通过国际官方分析化学家协会(AOAC)方法2009.01(“AOAC 2009.01”)所测量的，其多于10％是可消化的。右旋糖酐常常具有大于1000kDa的平均分子量。如本文所用，能够由蔗糖合成右旋糖酐的酶可被描述为“右旋糖酐蔗糖酶”(EC 2.4.1.5)。
如本文所用，术语“变聚糖”是指水不溶性α-葡聚糖，其主要包含(存在50％或更多的糖苷键)的1，3-α-D糖苷键并且通常具有常常大于9的聚合度(DP)。能够由蔗糖合成包含大于50％的1，3-α-D糖苷键的变聚糖或α-葡聚糖低聚物的酶可被描述为“变聚糖蔗糖酶”(EC 2.4.1.-)，前提条件是所述酶不产生交替糖。
如本文所用，术语“交替糖”是指在至少50％的直链低聚糖主链内具有交替的1，3-α-D糖苷键和1，6-α-D糖苷键的α-葡聚糖。能够由蔗糖合成交替糖的酶可被描述为“交替糖蔗糖酶”(EC 2.4.1.140)。
如本文所用，术语“罗伊糖”是指在支化点处包含1，4-α-D-糖苷键(通常＞50％)；1，6-α-D-糖苷键；以及4，6--二取代的α-葡糖基单元的可溶性α-葡聚糖。能够由蔗糖合成罗伊糖的酶可被描述为“罗伊糖蔗糖酶”(EC 2.4.1.-)。
如本文所用，术语“α-葡聚糖水解酶”和“葡聚糖水解酶”将是指能够水解α-葡聚糖低聚物的酶。如本文所用，葡聚糖水解酶可由针对某些α-D-糖苷键的内切水解活性来定义。示例可包括但不限于，右旋糖酐酶(EC 3.2.1.1；能够内切水解α-(1，6)-连接的糖苷键)、突变酶(EC 3.2.1.59；能够内切水解α-(1，3)-连接的糖苷键)和交替糖酶(alternanases)(EC3.2.1.-；能够内切水解裂解交替糖(alternan))。各种因素包括但不限于某些α-葡聚糖内的支化程度、支化类型和相对分支长度，可不利地影响α-葡聚糖水解酶内切水解一些糖苷键的能力。
如本文所用，术语“右旋糖酐酶”(α-1，6-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶；EC 3.2.1.11)是指能够内切水解1，6-α-D-糖苷键(主要存在于右旋糖酐中的键)的酶。已知右旋糖酐酶可用于多种应用中，包括用作用于预防龋齿、牙斑和/或牙垢的牙粉中的成分和用于水解原糖果汁或甘蔗和糖用甜菜的糖浆。已知多种微生物能够产生右旋糖酐酶，其中为青霉属、拟青霉属、曲霉属、镰孢霉属、穗孢属、轮枝孢属、蠕孢菌属和毛壳霉属的真菌；乳酸菌属、链球菌属、纤维弧菌属、噬细胞菌属、枯草芽孢杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、节杆菌属和黄杆菌属的细菌，以及酵母诸如斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)。食品级右旋糖酐酶是可商购获得的。食品级糊精酶的示例为 Plus L，由Novozymes A/S(Bagsvaerd，Denmark)出售的来自毛壳菌(Chaetomium erraticum)的酶。
如本文所用，术语“突变酶”(葡聚糖内切-1，3-α-葡糖苷酶；EC 3.2.1.59)是指水解裂解1，3-α-D-糖苷键(主要存在于变聚糖中的键)的酶。突变酶可得自多种细菌和真菌源。突变酶的非限制性列表以氨基酸序列4、6、9和11提供。在一个实施方案中，具有突变酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：4、6、9或11具有至少90％的同一性，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“交替糖酶”(EC 3.2.1.-)是指内切水解裂解交替糖的酶(授予Cote等人的U.S.5,786,196)。
如本文所用，术语“野生型酶”将是指包含氨基酸序列的酶(其全长和活性截短形式)，如在获得和/或注释的生物体中存在的。所述酶(其全长或催化活性截短形式)可在微生物宿主细胞中重组产生。所述酶通常在用作制备本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物中的加工助剂之前纯化。在一个方面，使用同时存在于反应体系中的至少两种野生型酶的组合以便获得本发明的可溶性葡聚糖纤维组合物。在一个实施方案中，同时存在的至少两种酶的组合包含至少一种具有葡糖基转移酶活性的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：1或3具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，以及至少一种具有突变酶活性的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：4、6、9或11具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，同时存在的至少两种酶的组合包含至少一种具有葡糖基转移酶活性的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：1或3具有至少90％，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，以及至少一种具有突变酶活性的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：4或6具有至少90％，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“底物”或“合适的底物”将是指包含蔗糖的组合物。在一个实施方案中，底物组合物还包含一个或多个合适的受体，诸如麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。在一个实施方案中，能够形成葡萄糖低聚物的至少一种葡糖基转移酶的组合与至少一种α-葡聚糖水解酶组合用于相同反应混合物中(即，它们同时存在并且在反应混合物中是活性的)。因此，α-葡聚糖水解酶(当存在时)的“底物”是由蔗糖通过葡糖基转移酶在反应混合物中同时合成的葡萄糖低聚物。在一个实施方案中，其中酶不在反应混合物中同时使用的双酶法(即，至少一种葡糖基转移酶(GTF)和至少一种α-葡聚糖水解酶)通过前提条件从本文所公开的方法中排除。
如本文所用，术语“合适的酶促反应混合物”、“合适的反应组分”、“合适的含水反应混合物”和“反应混合物”是指反应物与一种或多种酶在其中发生接触的材料(一种或多种合适的物质)和水。合适的反应组分可由多种酶构成。在一个方面，合适的反应组分包含至少一种葡聚糖蔗糖酶。在另一个方面，合适的反应组分包含至少一种葡聚糖蔗糖酶和至少一种α-葡聚糖水解酶；优选地至少一种具有突变酶活性的多肽。
如本文所用，“一个单位的葡聚糖蔗糖酶活性”或“一个单位的葡糖基转移酶活性”定义为当在pH 5.5和37℃下与200g/L蔗糖温育时，转换1μmol蔗糖/分钟所需的酶量。蔗糖浓度使用HPLC测定。
如本文所用，“一个单位的右旋糖酐酶活性”定义为当在pH 5.5和37℃下与0.5mg/mL右旋糖酐底物温育时，形成1μmol还原糖/分钟的酶量。所述还原糖使用PAHBAH测定法测定(Lever M.，(1972)，A New Reaction for Colorimetric Determination ofCarbohydrates，Anal.Biochem.47，273-279)。
如本文所用，“一个单位的突变酶糖酶活性”定义为当在pH 5.5和37℃下与0.5mg/mL变聚糖底物温育时，形成1μmol还原糖/分钟的酶量。所述还原糖使用PAHBAH测定法测定(Lever M.，同上)。
如本文所用，术语“酶催化剂”是指包含酶或酶的组合的催化剂，其具有获得期望的可溶性葡聚糖纤维组合物的必要活性。在某些实施方案中，可需要酶催化剂的组合以获得期望的可溶性葡聚糖纤维组合物。一种或多种酶催化剂可以呈完整的微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分、部分纯化的酶、或纯化的酶的形式。在某些实施方案中，一种或多种酶催化剂还可以是化学改性的(诸如通过聚乙二醇化或通过与交联剂反应)。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将一种或多种酶催化剂固定到可溶性或不溶性支撑体上；参见例如，Immobilization of Enzymes and Cells；GordonF.Bickerstaff，编辑；Humana出版社，Totowa，NJ，USA；1997。
如本文所用，“药学上可接受的”是指所考虑的化合物或组合物适用于与人和其它动物的组织接触，但不具有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、过敏反应等，与合理的有益效果/风险比相称。
如本文所用，术语“低聚糖”是指包含介于3和约30个由α-糖苷键连接的单糖单元的均聚物。
如本文所用，术语“多糖”是指包含大于30个由α-糖苷键连接的单糖单元的均聚物。
如本文所用，术语“食品”广义地用于本文以包括多种物质，所述物质可被人类消化，其包括但不限于，饮料、乳制品、烘焙食品、能量棒、果冻、果酱、谷物、膳食补充剂和药周胶囊或片剂。
如本文所用，术语“宠物食品”或“动物饲料”广义地用于本文以包括多种物质，其可被非人类动物消化，并且可包括例如狗粮、猫粮和牲畜饲料。
“受试者”一般是指人类，虽然如将由本领域技术人员理解的，受试者可以为非人类动物。因此，其它受试者可包括哺乳动物，诸如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、牛、马、山羊、绵羊、猪和灵长类动物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)。
如本文所用，术语“胆固醇相关疾病”包括但不限于涉及胆固醇，具体地讲血浆中的非高密度脂质(非HDL)胆固醇的含量升高的病症，例如LDL胆固醇的含量升高和HDL/LDL比率升高，高胆固醇血症和高甘油三酯血症等。在具有高胆固醇血症的患者中，降低LDL胆固醇是治疗的主要目标之一。在具有高甘油三酯血症的患者中，降低高血清甘油三酯浓度是治疗的主要目标之一。具体地，如本文所定义的治疗胆固醇相关的疾病包括通过施用本发明的葡聚糖纤维或包含本发明葡聚糖纤维的组合物来控制血液胆固醇水平、血液甘油三酯水平、血液脂蛋白水平、血糖和胰岛素敏感性。
如本文所用，“个人护理产品”是指用于美容护理毛发、皮肤、头皮和牙齿的产品，其包括但不限于洗发剂、爽身水、沐浴凝胶、局部保湿剂、牙膏、牙胶、漱口剂、漱口水、抗牙斑漱口液和/或其它局部治疗物。在一些特别优选的实施方案中，这些产品用于人体，而在其它实施方案中，这些产品用于由非人类动物美容使用(例如在某些兽医应用中)。
如本文所用，术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”和“分离的核酸片段”将可以互换使用，并指单链或双链RNA或DNA的聚合物，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用下列缩写来表示具体氨基酸：
本领域普通技术人员将认识到，可以进行本文公开的氨基酸序列的改性，同时保留与所公开的氨基酸序列相关联的功能。例如，在本领域中熟知的是，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸但可不影响编码蛋白的功能性质的基因改变。例如，本文所公开的氨基酸序列中的任何特定氨基酸可以置换另一功能等同的氨基酸。为了本发明目的，将置换定义为在以下五组中的一组内的互换：
1.小的脂族、非极性或弱极性的残基：Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；
2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
3.极性的、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；
4.大的脂族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及
5.大的芳族残基：Phe、Tyr和Trp。
因此，氨基酸中丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(诸如甘氨酸)或疏水性较强的残基(诸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子置换。类似地，导致一个带负电荷的残基置换为另一个带负电荷的残基(诸如，天冬氨酸置换谷氨酸)或一个带正电荷的残基置换为另一个带正电荷的残基(诸如，赖氨酸置换精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N-端和C-端部分改变的核苷酸变化也预计不会改变蛋白的活性。所提出的修饰中的每一者均完全在本领域常规技术内，由所编码的产物的生物活性的保留决定。
如本文所用，术语“密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物典型的密码子使用情况。
如本文所用，“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位组装而成。将这些基本单位进行连接并退火以形成基因区段，该基因区段随后在酶促作用下组装而构建成完整的基因。当涉及DNA序列时，“化学合成的”是指体外组装组分核苷酸。可以采用完善建立的方法来完成DNA的人工化学合成，或者可使用许多可商购获得的机器中的一种来完成自动化学合成。因此，基于优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚性，可以定制基因用以优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员能预期成功的基因表达的可能。优选密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中可获得序列信息)的检测。
如本文所用，“基因”是指能够表达特定蛋白质的核酸分子，其包括编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”是指与其自身调控序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含不同时天然可见的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”是指在生物体基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，但是它通过基因转移引入到宿主生物中。外来基因可包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法引入基因组的基因。
如本文所用，“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上核酸序列的缔合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，即，该编码序列处于该启动子的转录控制下时，该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接到调控序列。
如本文所用的，术语“表达”指源于本发明的核酸分子的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文所用，“转化”指将核酸分子转移至宿主生物的基因组内，导致在基因上稳定遗传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(例如质粒)基因。含有转化的核酸分子的宿主生物被称为“转基因”、“重组”或“转化”生物体。
如本文所用，术语“序列分析软件”是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，Accelrys Software Corp.，San Diego，CA)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol215：403-410(1990))和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228S.Park St.Madison，WI 53715 USA)、CLUSTALW(例如，1.83版；Thompson等人，Nucleic Acids Research，22(22)：4673-4680(1994))以及并入了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，开会日期1992，111-20。编辑：Suhai、Sandor.出版社：Plenum，New York，NY)、Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher v.4.05。在本申请的上下文中，应理解，在使用序列分析软件进行分析的情况中，除非另有指明，否则分析的结果将基于所提到的程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”将指在首次初始化时由软件制造商为软件最初加载的任何值或参数集。
本文所公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的结构和功能特性
人胃肠酶容易识别和消化具有大量α-(1，4)糖苷键的直链α-葡聚糖低聚物。用交替的键诸如α-(1，2)、α-(1，3)和α-(1，6)替代这些键通常减小α-葡聚糖低聚物的可消化性。增加支化度(使用交替键)也可降低相对的可消化性水平。
本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物使用一种或多种酶促加工助剂由甘蔗糖(蔗糖)制备，所述酶促加工助剂具有来自微生物的基本上与存在于自然界中的氨基酸序列相同的氨基酸序列(或其催化活性截短形式)，所述微生物具有长期暴露于人类的历史(天然存在于口腔中或存在于食品诸如啤酒、发酵的大豆等中的微生物等)和/或酶公认为是安全的(GRAS)。可溶性纤维具有低可消化性至没有可消化性，表现出高耐受性(即，如由可接受的气体形成量所测量的)、低粘度(能够在宽范围食品应用中使用)、和至少部分地可被肠道菌群发酵，提供可能的益生元效应(例如，增加据报道与提供潜在的益生元效应相关的双歧杆菌和乳酸菌的数量和/或活性)。
本文所公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的特征在于以下参数的组合：
a.10％至30％的α-(1，3)糖苷键；
b.65％至87％的α-((1，6)糖苷键；
c.少于5％的α-(1，3，6)糖苷键；
d.小于5000道尔顿的重均分子量(Mw)；
e.在20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
f.在4至40、优选地10至40范围内的右旋糖当量(DE)；以及
g.小于12％的可消化性，如分析化学师协会(Association of AnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所测量；
h.在25℃下，在pH 7水中至少20％(重量/重量)的溶解度；以及
i.小于5的多分散指数(PDI)。
本文所公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含10％至30％，优选地10％至25％的α-(1，3)糖苷键。
在某些实施方案中，除了上述α-(1，3)糖苷键实施方案之外，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物还包含65％至87％，优选地70％至85％，更优选地75％至82％的α-(1，6)糖苷键。
在某些实施方案中，除了上述α-(1，3)和α-(1，6)糖苷键含量之外，可溶性α-葡聚糖纤维组合物还包含小于5％，优选地小于4％、3％、2％或1％的α-(1，3，6)糖苷键。
在某些实施方案中，除了以上提及的糖苷键含量之外，可溶性α-葡聚糖纤维组合物还包含小于5％，优选地小于1％，并且最优选地小于0.5％的α-(1，4)糖苷键。
在另一个实施方案中，除了以上提及的糖苷键含量之外，α-葡聚糖纤维组合物包括小于5000道尔顿、优选地小于2500道尔顿、更优选地介于500道尔顿和2500道尔顿之间，并且最优选地约500道尔顿至约2000道尔顿的重均分子量(Mw)。
在另一个实施方案中，除了以上特征的任意组合之外，在20℃下和水中12重量％下，α-葡聚糖纤维组合物还包括小于250厘泊(cP)(0.25帕斯卡秒(Pa·s))、优选地小于10厘泊(cP)(0.01帕斯卡秒(Pa·s))、优选地小于7cP(0.007Pa·s)、更优选地小于5cP(0.005Pa·s)、更优选地小于4cP(0.004Pa·s)、并且最优选地小于3cP(0.003Pa·s)的粘度。
如分析化学师协会(Association of Analytical Communities，AOAC)方法2009.01所测量，可溶性α-葡聚糖组合物具有小于10％的可消化性，优选地小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的可消化性。在另一方面，可消化性的相对水平可另选地使用AOAC 2011.25(综合总膳食纤维测定，Integrated Total Dietary Fiber Assay)(McCleary等人，2012，J.AOAC Int.，95(3)，824-844)测定。
除了上述实施方案中任一个之外，在某些实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物在25℃下在pH 7水中具有至少20％(重量/重量)，优选地至少30％、40％、50％、60％或70％的溶解度。
在某些实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含的还原糖的含量小于10重量％、优选地小于5重量％、并且最优选地1重量％或更少。
在某些实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含介于400g/摩尔和2000g/摩尔之间，优选地500g/摩尔至1500g/摩尔的数均分子量(Mn)。
在某些实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含少于4kcal/g，优选地少于3kcal/g，更优选地少于2.5kcal/g，并且最优选地约2kcal/g或更少的含热量。
包含葡聚糖纤维的组合物
取决于期望的应用，可溶性α-葡聚糖纤维/纤维组合物可与适用于食品、个人护理产品和/或药物的一种或多种其它材料一起配制(例如，共混、混合、掺入等)。因此，本公开包括含有可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物。在该上下文中，术语“包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物”可包括例如，营养或食品组合物，诸如食物产品、食品补充剂、膳食补充剂(例如，呈粉末、液体、凝胶、胶囊、香囊或片剂的形式)或功能性食品。在某些实施方案中，“包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物”包括个人护理产品、化妆品和药物。
可直接包括可溶性α-葡聚糖纤维/纤维组合物作为期望的产品(例如食品、个人护理产品等)中的成分，或可以与一种或多种附加的食品级材料共混以形成用于期望的产品(例如食品、个人护理产品等)中的碳水化合物组合物。掺入碳水化合物组合物中的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的量可根据应用改变。因此，本发明包括含有可溶性α-葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物。在某些实施方案中，碳水化合物组合物包含0.01重量％至99重量％(基于干固体)，优选地0.1重量％至90重量％，更优选地1重量％至90重量％，并且最优选地5重量％至80重量％的上述可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
如本文所用，术语“食品”旨在涵盖人类食用以及动物食用的食品。所谓“功能性食品”，是指声称具有除供应营养物的基础营养功能之外的健康促进和/或疾病预防和/或疾病(风险)降低特性的任何新鲜的或经加工的食品。功能性食品可包括例如，经加工的食品或利用健康促进添加剂强化的食品。功能性食品的示例为利用维生素强化的食品，或具有活的培养物的发酵食品。
包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物可包含本领域已知的包括在营养组合物中的某些其它材料，诸如水或其它含水溶液、脂肪、糖、淀粉、粘结剂、增稠剂、着色剂、风味剂、增味剂、酸化剂(诸如乳酸或苹果酸等)、稳定剂、或高强度甜味剂或矿物质等。
适宜的食物产品的示例包括面包、早餐谷类食物、饼干、蛋糕、曲奇、梳打饼、酸乳、开菲尔、味噌、纳豆、豆豉、泡菜、酸菜、水、牛奶、果汁、蔬菜汁、碳酸软饮料、非碳酸软饮料、咖啡、茶、啤酒、葡萄酒、烈酒、酒精饮料、小吃、汤、冷冻甜点、油炸食品、比萨、意面制品、土豆制品、大米制品、玉米制品、小麦制品、乳制品、硬糖、营养棒、谷物、生面团、加工肉类和奶酪、酸奶、冰淇淋甜点、基于牛奶的饮料、沙拉酱、酱汁、浇头、甜点、糖果产品、基于谷物的干棒小吃、制备的菜肴等。包含本发明α-葡聚糖纤维的碳水化合物组合物可以呈液体、粉末、片剂、立方体、颗粒、凝胶或糖浆的形式。
在某些实施方案中，根据本发明的碳水化合物组合物包含至少两种纤维源(即，可溶性α-葡聚糖纤维组合物之外的至少一种附加的纤维源)。在某些实施方案中，一种纤维源为可溶性α-葡聚糖纤维并且第二纤维源为低聚糖或多糖，其选自抗性/支链麦芽糖糊精/纤维糊精(诸如得自Roquette Freres(Lestrem，France)的得自ADM-Matsutani LLC(Decatur，Illinois)的)，聚右旋糖(得自Danisco-DuPontNutrition&Health(Wilmington，DE)的)，可溶性玉米纤维(例如，得自Tate&Lyle(London，UK)的)，异麦芽低聚糖(IMO)、交替糖和/或麦芽交替低聚糖(MAO)(例如，得自Aevotis GmbH(Potsdam，Germany)的FIBERMALTTM；SUCROMALTTM(得自Cargill Inc.(Minneapolis，MN)、普鲁兰多糖、抗性淀粉、菊粉、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龙胆糖、半纤维素和果糖低聚物糖浆。
可溶性α-葡聚糖纤维可作为常规碳水化合物的替代品或补充剂加入食品中。因此，在某些实施方案中，本发明是包含可溶性α-葡聚糖纤维的食物产品。在某些实施方案中，食物产品中的可溶性α-葡聚糖纤维组合物由本文所公开的方法来制备。
可溶性α-葡聚糖纤维组合物可用于碳水化合物组合物和/或食物产品中，所述组合物和/或食物产品包含一种或多种高强度人造甜味剂，包括但不限于甜菊糖、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、乙酰磺胺酸钾、糖精、以及它们的组合。可溶性α-葡聚糖纤维可与糖替代物共混，所述糖替代物诸如甜味蛋白、仙茅甜蛋白、赤藓醇、甘油、甘草甜素、氢化淀粉水解物、菊粉、异麦芽、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、麦芽低聚糖、麦芽交替低聚糖(诸如， SUCROMALTTM，购自Cargill Inc.(Minneapolis，MN)、甘露醇、神奇蛋白、罗汉果苷混合物、莫纳甜、莫内林、osladin、五聚糖、山梨醇、甜菊糖、塔格糖、奇异果甜蛋白、木糖醇以及它们的任意组合。
在某些实施方案中，包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的食物产品将具有比其中使用常规碳水化合物的类似食物产品更低的血糖应答、更低的血糖指数、和更低的血糖负载。另外，因为可溶性α-葡聚糖纤维的特征在于在人类胃或小肠中的非常低的可消化性至没有可消化性，所以在某些实施方案中，降低了食物产品的含热量。本发明的可溶性α-葡聚糖纤维可以粉末的形式使用，共混入具有其它合适的食品成分的干粉末中，或可以包含本发明膳食纤维的液体糖浆(本文中也被称为“可溶性纤维糖浆”、“纤维糖浆”或简称“糖浆”)的形式共混或使用。“糖浆”可作为可溶性纤维源添加到食物产品中。其可增加食物产品的纤维含量，但对风味、口感或质感不具有负面影响。
纤维糖浆可单独地或与增量剂诸如糖醇或麦芽糖糊精组合地用于食物产品中，以减少含热量和/或增强产品的营养特征。纤维糖浆还可用作食物产品中脂肪的部分替代品。
纤维糖浆可作为嫩化剂或调质剂用于食物产品中，以增加脆性或折断性、改善视觉吸引力、和/或改善生面团、奶蛋糊或其它食品组合物的流变性。纤维糖浆还可作为湿润剂用于食物产品中，以增加产品的架藏寿命和/或产生更柔软、更湿润的质地。其还可用于食物产品中以降低水活度或固定和管理水。纤维糖浆的附加用途可包括：替代涂蛋液和或增强食物产品的表面光泽、改变面粉淀粉糊化温度、改性产品的质地以及增强产品的褐变。
纤维糖浆可用于各种类型的食物产品中。其中本发明糖浆可非常有用的一种食物产品类型是烘焙产品(即烘焙食品)，诸如蛋糕、布朗尼、曲奇、曲奇松脆片、松饼、面包和甜面团。常规的烘焙产品可具有相对高的糖和高的总碳水化合物。本发明糖浆用作烘焙产品中的成分可有助于降低糖和碳水化合物含量，以及降低总卡路里，同时增加烘焙产品的纤维含量。
存在烘焙产品的两种主要类型：酵母发酵和化学发酵。在酵母发酵的产品，如甜甜圈、甜面团和面包中，本发明的包含纤维的糖浆可用于替代糖，但少量糖仍然可能是期望的，这是由于酵母或外壳褐变需要发酵底物。纤维糖浆可作为包含非纤维的糖浆或液体甜味剂的直接替代品与其它液体一起添加。然后，生面团可在烘焙行业中常用的条件下加工，包括混合、发酵、分开、成形或挤出为长面包或挤出成型、发面、和烘焙或油炸。可使用类似于传统产品的条件，将产品烘焙或油炸。面包可通常在420°F至520°F(216-271℃)范围内的温度下烘焙20分钟至23分钟，并且甜甜圈可在400-415°F(204-213℃)范围内的温度下油炸，但还可使用其它温度和时间。
化学发酵的产品通常具有更多的糖，并且可包含更高含量的包含本发明可溶性α-葡聚糖纤维的碳水化合物组合物和/或可食用糖浆。成品曲奇可包含30％糖，其可完全地或部分地用包含本发明葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物和/或糖浆替代。这些产品可具有例如4-9.5的pH。水分含量可例如介于2％-40％之间。
在膏化步骤期间在开始混合时，或在类似于糖浆或干甜味剂正在被用于替代的任何方法中，本发明碳水化合物组合物和/或包含纤维的糖浆可容易地掺入并可添加到脂肪中。可将产品混合并且然后例如通过成片、旋转切割、线切割或通过另一成形工艺成形。然后可在典型的烘焙条件下，例如在200-450°F(93-232℃)下，烘焙产品。
其中可使用碳水化合物组合物和/或包含纤维的糖浆的另一食物产品类型是早餐谷类食物。例如，包含纤维的糖浆可用于替代在挤出的谷物片中和/或那些片的外部涂层中的全部或部分的糖。所述涂层通常为成品谷物片的总重量的30％-60％。糖浆可以例如喷雾或洒落形式施用。
其中可使用(任选地以碳水化合物组合物和/或包含纤维的糖浆的形式)本发明α-葡聚糖纤维组合物的另一食物产品类型是乳制品。其中其可使用的乳制品的示例包括酸乳、酸乳饮料、乳饮料、调味乳、冰沙、冰淇淋、奶昔、脱脂乳酸干酪、脱脂乳酸干酪调味品、和乳制品甜点，诸如脱脂凝乳和打发的慕斯型产品。这可包括旨在直接食用的乳制品(诸如包装好的冰沙)以及旨在与其它成分共混的那些(诸如共混的冰沙)。其可用于巴氏灭菌乳制品，诸如在160°F至285°F(71℃-141℃)的温度下巴氏灭菌的乳制品。
其中可使用包含α-葡聚糖纤维组合物的组合物的另一食物产品类型是糖果。其中其可使用的糖果的示例包括硬糖、方旦糖、牛轧糖和棉花糖、明胶果冻糖或胶糖、果冻、巧克力、甘草、口香糖、焦糖和太妃糖、求斯糖、薄荷糖、片状糖果和水果小吃。在水果小吃中，包含本发明α-葡聚糖纤维的组合物可与果汁组合使用。所述果汁可提供大部分甜味，并且包含葡聚糖纤维的组合物可减少总糖含量并增加纤维。可将包含葡聚糖纤维的本发明组合物添加到最初的糖果浆液中并且加热至最终固含量。所述浆液可从200°F至305°F(93℃-152℃)加热以实现最终固含量。可在加热之前或之后添加酸以产生2-7的最终pH。可将包含葡聚糖纤维的组合物用作存在的0％-100％的糖和1％-100％的玉米糖浆或其它甜味剂的替代品。
其中可使用包含α-葡聚糖纤维组合物的组合物的另一食物产品类型是果酱和果冻。果酱和果冻由水果制成。果酱包含水果片，然而果冻由果汁制成。包含本发明纤维的组合物可如下代替糖或其它甜味剂使用：将水果和果汁称入罐中；将糖、含纤维组合物和果胶预混；将干组合物添加到液体中并煮至214°F至220°F(101℃-104℃)的温度；热填充到广口瓶中并干馏5-30分钟。
其中可使用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物(诸如包含纤维的糖浆)的另一食物产品类型是饮料。其中其可使用的饮料的示例包括碳酸饮料、果汁、浓缩果汁混合物(例如玛格丽特混合物)、清水和饮料干混物。使用本发明α-葡聚糖纤维可克服当将其它类型的纤维添加到饮料中时产生的透明度问题。糖的完全替代是可能的(其可以例如为高达总配方的12％或更多)。
另一食物产品类型是高固体填充物。高固体填充物的示例包括干棒小吃、烤酥饼、甜甜圈和曲奇中的填充物。高固体填充物可以为例如酸/水果填充物或有香味的填充物。纤维组合物可加入原样食用的产品中，或加入可通过食品加工机(附加的烘焙)或通过消费者(烘焙稳定填充)进行进一步加工的产品中。在某些实施方案中，高固体填充物可具有介于67％-90％之间的固体浓度。所述固体可被包含本发明α-葡聚糖纤维的组合物完全替代，或其可用于存在的其它甜味剂固体的部分替代(例如，替代5％-100％的现有固体)。通常水果填充物可具有2-6的pH，然而有香味的填充物可介于4-8pH之间。填充物可冷却制备或在高达250°F(121℃)下加热以蒸发至期望的最终固含量。
其中可使用α-葡聚糖纤维组合物或(包含α-葡聚糖纤维组合物)的碳水化合物组合物的另一食物产品类型是挤出和成片的小吃。其可使用的挤出和成片小吃的示例包括膨化小吃、梳打饼、未经发酵的玉米片和玉米薄片。在制备挤出片时，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可与干产品一起直接添加。可在挤出机中添加少量水，并且然后，其可通过在100°F至300°F(38℃-149℃)范围内的各个区。所述干产品可以干产品混合物的0％-50％的含量添加。包含本发明葡聚糖纤维的糖浆还可沿挤出机在液体端口之一处添加。产品可以低水分含量(5％)制出，并且然后烘焙以去除过量水分，或以略高水分含量(10％)制出，并且然后油炸以去除水分并煮出产品。烘焙可以在高达500°F(260℃)的温度下持续20分钟。烘焙可更典型地在350°F(177℃)下持续10分钟。油炸可通常在350°F(177℃)下持续2-5分钟。在片状小吃中，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可用作其它干燥成分(例如，面粉)的部分替代品。其可以为干重的0％-50％。可将产品干混，并且然后加入水以形成粘着面团。产物混合物可具有5至8的pH。然后可将生面团成片并切割，并且然后烘焙或油炸。烘焙可以在高达500°F(260℃)的温度下持续20分钟。油炸可通常在350°F(177℃)下持续2-5分钟。来自使用包含本发明葡聚糖纤维的组合物的另一潜在有益效果是当其作为内部成分添加或作为油炸食品的外部上的涂层添加时，油炸小吃中的脂肪含量减少多达15％。
其中可使用包含纤维的糖浆的另一食物产品类型是明胶状点心。明胶状点心的成分常常作为干混物出售，其中明胶作为胶凝剂。糖固体可利用干混物中包含本发明葡聚糖纤维的组合物部分或完全地替代。然后可将干混物与水混合并加热至212°F(100℃)以溶解明胶，并且然后可加入更多水和/或水果以完成明胶状点心。然后使明胶冷却并固化。明胶还可以架藏稳定的包装出售。在该情况下，稳定剂通常是基于角叉菜胶的。如上所述，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可用于替代高达100％的其它甜味剂固体。可将干燥成分混入液体中并且然后巴氏灭菌并放入杯中，并使其冷却和固化。
其中可使用包含本发明葡聚糖纤维的组合物的另一食物产品类型是干棒小吃。其中其可使用的干棒小吃的示例包括早餐替代棒和代餐棒、营养棒、granola棒、蛋白质棒和谷物棒。其可用于干棒小吃的任一部分中，诸如在高固体填充物、结合糖浆或颗粒部分中。完全或部分替代结合糖浆中的糖是可能的。结合糖浆通常为50％-90％固体，并且以在10％结合糖浆与90％颗粒，至70％结合糖浆与30％颗粒范围内的比率施用。结合糖浆通过将甜味剂、增量剂和其它粘结剂(如淀粉)的溶液加热至160°F-230°F(71℃-110℃)来制备(取决于糖浆中所需的最终固体)。然后将糖浆与颗粒混合以涂覆颗粒，从而提供遍布基质的涂层。包含本发明葡聚糖纤维的组合物还可用于颗粒本身。这可以为直接膨胀或枪式膨化的挤出片。其可以与另一种谷物成分、玉米粗粉、米粉或其它类似成分组合使用。
其中可使用包含本发明葡聚糖纤维糖浆的组合物的另一食物产品类型是奶酪、奶酪酱和其它奶酪产品。其中其可使用的奶酪、奶酪酱和其它奶酪产品的示例包括低乳固体奶酪、低脂奶酪和低卡路里奶酪。在块状奶酪中，其可有助于改善熔融特性，或减小通过其它成分诸如淀粉增加的熔融限制效应。其还可用于奶酪酱中，例如作为增量剂，来替代脂肪、乳固体或其它典型的增量剂。
其中可使用包含本发明葡聚糖纤维的组合物的另一食物产品类型是可食用和/或水溶性的膜。其中其可使用的膜的示例包括用于包封旨在溶解于水中的各种食品和饮料的干混物的膜，或者用于递送着色剂或风味剂的膜，诸如在烹饪之后但仍然热时加入食品中的香料膜。其它膜应用包括但不限于，水果和植物鞣皮，以及其它柔性膜。
在另一个实施方案中，可使用的包含本发明葡聚糖纤维的组合物为汤、糖浆、酱汁、和调味品。典型的调味品可以为0％-50％油，其pH范围为2-7。其可冷加工或热加工。可将其混合，并且然后可添加稳定剂。根据需要，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可容易地以液体形式或干燥形式与其它成分一起添加。调味品组合物可需要加热以活化稳定剂。典型的加热条件可以为170°F-200°F(77℃-93℃)并持续1-30分钟。在冷却之后，添加油以制备预乳液。然后，使用匀化器、胶体磨或其它高剪切工艺将产品乳化。
酱汁可具有0％-10％油和10％-50％总固体，并且可具有2-8的pH。酱汁可冷加工或热加工。将成分混合并且然后热加工。根据需要，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可容易地以液体形式或干燥形式与其它成分一起添加。典型的加热可以为170°F-200°F(77℃-93℃)并持续1-30分钟。
汤更典型地为20％-50％固体并且处于更中性的pH范围(4-8)。它们可以为干混合物，可向其添加包含本发明葡聚糖纤维的干燥组合物，或者为液体汤，将液体汤罐装并且然后干馏。在汤中，可使用高达50％固体的抗性玉米糖浆，但更典型的用途是可以递送5g纤维/份。
其中可使用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物的另一食物产品类型是咖啡奶精。其中其可使用的咖啡奶精的示例包括液体奶精和干奶精两者。干共混的咖啡奶精可与以下脂肪类型的商业奶精粉末共混：大豆油、椰子油、棕榈油、葵花油或卡诺拉油或乳脂。这些脂肪可以为非氢化的或氢化的。包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物可作为纤维源，任选地与果糖低聚糖、聚右旋糖、菊粉、麦芽糖糊精、抗性淀粉、蔗糖和/或常规玉米糖浆固体一起添加。所述组合物还可包含高强度甜味剂，诸如三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、阿斯巴甜或它们的组合。可将这些成分干共混以制备期望的组合物。
喷雾干燥的奶精粉末为脂肪、蛋白质和碳水化合物、乳化剂、乳化盐、甜味剂和抗结块剂的组合。脂肪源可以为大豆油、椰子油、棕榈油、葵花油或卡诺拉油或乳脂中的一种或多种。蛋白质可以为酪蛋白酸钠或酪蛋白酸钙、乳蛋白、乳清蛋白、小麦蛋白或大豆蛋白。碳水化合物可以为单独包含本发明的α-葡聚糖纤维组合物的组合物，或包含本发明的α-葡聚糖纤维组合物与低聚果糖、聚右旋糖、菊粉、抗性淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖、玉米糖浆或它们的任意组合的组合的组合物。乳化剂可以为甘油单酯和甘油二酯、乙酰化甘油单酯和甘油二酯、或丙二醇单酯。所述盐可以为柠檬酸三钠、磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠、焦磷酸四钠、磷酸二氢钾、和/或磷酸二钾。所述组合物还可包含高强度甜味剂，诸如上述那些。适宜的抗结块剂包括硅铝酸钠或二氧化硅。产品可与浆液合并，任选地均化，并且以颗粒状或附聚形式喷雾干燥。
液体咖啡奶精仅是脂肪(乳脂或氢化植物油)、一些乳固体或酪蛋白酸盐、玉米糖浆和香草风味剂或其它风味剂的经匀化和巴氏灭菌的乳液，以及稳定化共混物。产品通常在185°F(85℃)下经由HTST(高温短时)巴氏灭菌30秒，或在285°F(141℃)下UHT(超高温)巴氏灭菌4秒，并且在两塔板均化器中以第一塔板500-3000psi(3.45MPa-20.7MPa)，和第二塔板200psi-1000psi(1.38MPa-6.89MPa)均化。通常将咖啡奶精稳定化使得其在加入咖啡中时不分解。
其中可使用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物(诸如包含纤维的糖浆)的另一食物产品类型是食品涂层诸如糖衣、糖霜、和蛋浆。在糖衣和糖霜中，包含纤维的糖浆可用作甜味剂替代品(完全或部分的)以降低含热量并增加纤维含量。蛋浆通常为约70％-90％的糖，其中剩余的大部分为水，并且包含纤维的糖浆可用于完全或部分替代糖。糖霜通常包含约2％-40％的液体/固体脂肪组合、约20％-75％甜味剂固体、着色剂、风味剂和水。包含纤维的糖浆可用于替代全部或部分的甜味剂固体，或作为低脂肪体系中的增量剂。
其中可使用包含纤维的糖浆的另一食物产品类型是宠物食品，诸如干或湿的狗粮。宠物食品以各种方式制备，诸如挤出、成形、和配制成肉汁。包含纤维的糖浆可以0％-50％的含量用于这些类型的每一种中。
其中可使用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物(诸如糖浆)的另一食物产品类型是鱼和肉。在一些肉中已经使用了常规的玉米糖浆，所以包含纤维的糖浆可用作部分或完全的替代物。例如，糖浆可在其真空翻滚或注入肉中之前，加入盐水中。其可与盐和磷酸盐，以及任选地与水结合成分诸如淀粉、角叉菜胶或大豆蛋白一起添加。这可用于增加纤维，典型的含量可以为5g/次，这可满足对优异纤维源的要求。
包含本发明可溶性纤维的个人护理和/或药物组合物
本发明葡聚糖纤维和/或包含本发明葡聚糖纤维的组合物可用于个人护理产品中。例如，可能够使用此类材料作为湿润剂、水性胶体或可能的增稠剂。如果需要，本发明纤维和/或包含本发明纤维的组合物可与一种或多种其它类型的增稠剂结合使用，诸如在美国专利8,541,041中所公开的那些，该专利的公开内容以引用方式全文并入本文。
本文个人护理产品包括但不限于，护肤组合物、化妆品组合物、抗真菌组合物、和抗菌组合物。本文的个人护理产品可为例如洗剂、霜膏、糊剂、油膏、膏剂、润发油、凝胶、液体以及它们的组合等的形式。本文公开的个人护理产品可包含至少一种活性成分。活性成分通常被视为产生预期药理效应或美容效应的成分。
在某些实施方案中，可将皮肤护理产品施用于皮肤，以解决与缺乏水分相关的皮肤损伤。皮肤护理产品也可用于改善皮肤的视觉外观(例如减少片状、破裂和/或红皮肤的外观)和/或皮肤的触感(例如，降低皮肤的粗糙度和/或干燥度，同时增加皮肤的柔滑度和细腻度)。皮肤护理产品通常可包含至少一种活性成分以治疗或预防皮肤疾病，提供美容效应，或向皮肤提供保湿有益效果，所述活性成分如氧化锌、凡士林、白凡士林、矿物油、鱼肝油、羊毛脂、聚二甲基硅氧烷、硬脂肪、维生素A、尿囊素、炉甘石、高岭土、甘油、或胶状燕麦、以及这些的组合。例如，皮肤护理产品可包含一种或多种天然保湿因子，诸如神经酰胺、透明质酸、甘油、角鲨烷、氨基酸、胆固醇、脂肪酸、甘油三酯、磷脂、糖鞘脂、脲、亚油酸、糖胺聚糖、黏多糖、乳酸钠或吡咯烷酮羧酸钠。可包含在皮肤护理产品中的其它成分包括但不限于甘油酯、杏仁油、卡诺拉油、角鲨烷、角鲨烯、椰油、玉米油、霍霍巴油、霍霍巴蜡、卵磷脂、橄榄油、红花油、芝麻油、牛油树脂、大豆油、甜杏仁油、向日葵油、茶树油、牛油树脂、棕榈油、胆固醇、胆固醇酯、蜡酯、脂肪酸和橙油。
如本文所用，个人护理产品还可以是化妆品或其它产品的形式，包括但不限于例如唇膏、睫毛膏、胭脂、粉底、腮红、眼线膏、唇线笔、唇彩、其它化妆品、防晒霜、防晒剂(sunblock)、指/趾甲油、摩丝、喷发剂、定型凝胶、指/趾甲调理剂、洗浴凝胶、淋浴凝胶、身体洗涤剂、洗脸剂、洗发剂、毛发调理剂(免洗型或洗去型)、营养发水、毛发染料、毛发着色产品、亮发产品、护发精华素、头发防卷曲产品、头发分叉端修复产品、唇香膏、皮肤调理剂、冷霜、保湿剂、身体喷剂、肥皂、身体擦洗剂、剥脱剂、收敛剂、紧肤洗剂、脱毛剂、烫发液、去屑制剂、止汗剂组合物、除臭剂、剃刮产品、剃刮前产品、剃刮后产品、清洁剂、皮肤凝胶、漂洗剂、牙膏或漱口剂。
如本文所用，药学产品可例如呈乳液、液体、酏剂、凝胶、混悬液、溶液、霜膏、胶囊、片剂、香囊或膏剂的形式。此外，本文的药物产品可以是本文所公开的任意个人护理产品的形式。药物产品还可包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或药学上可接受的盐。本发明纤维和/或包含本发明纤维的组合物还可用于胶囊、包封材料、片剂包衣中，并作为赋形剂用于药剂和药物。
可溶性α-葡聚糖纤维组合物的酶促合成
提供酶促制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法。本文描述了两种不同的方法。在一个实施方案中，“单一酶”方法包括使用至少一种葡糖基转移酶(在不存在α-葡聚糖水解酶的情况下)，其属于葡糖苷水解酶70型家族(E.C.2.4.1.-)，并且其能够催化使用蔗糖作为底物的耐消化可溶性α-葡聚糖纤维组合物的合成。在另一个实施方案中，“双酶”法包括至少一种葡糖基转移酶(GH70)与至少一种α-葡聚糖水解酶(诸如内切突变酶)的组合。
葡糖苷水解酶家族70酶是由乳酸菌诸如链球菌、明串珠菌、魏斯氏菌或乳杆菌属产生的转葡糖苷酶(参见Carbohydrate Active Enzymes database；“CAZy”；Cantarel等人，(2009)Nucleic Acids Res 37：D233-238)。重组表达的葡糖基转移酶优选具有与天然存在的氨基酸序列一致的氨基酸序列(即，与存在于源生物体的全长序列或其催化活性截短形式相同)。
GTF酶能够聚合蔗糖的D-葡糖基单元以形成同寡糖或同多糖。取决于GTF酶的特异性，形成包含各种糖苷键诸如α-(1，2)、α-(1，3)、α-(1，4)和α-(1，6)的直链和/或支链葡聚糖。葡糖基转移酶还可将D-葡糖基单元转移到羟基受体基团上。受体的非限制性列表包括碳水化合物、醇、多元醇或类黄酮。所得的葡糖基化产物的结构取决于酶特异性。
在本发明中，D-吡喃葡糖基供体是蔗糖。因此，反应为：
主要形成的糖苷键类型用于命名/分类葡糖基转移酶。示例包括右旋糖酐蔗糖酶(α-(1，6)键；EC 2.4.1.5)、变聚糖蔗糖酶(α-(1，3)键；EC 2.4.1.-)、交替糖蔗糖酶(交替的α(1，3)-α(1，6)主链；EC 2.4.1.140)和罗伊糖蔗糖酶(α-(1，4)和α-(1，6)键的混合物；EC2.4.1.-)。
在一个方面，葡糖基转移酶(GTF)能够形成具有α-(1，3)糖苷键的葡聚糖，前提条件是所述葡聚糖产物不是交替糖(即所述酶不是交替糖蔗糖酶)。
在一个方面，葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：1、3、13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62具有至少90％同一性，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在优选的方面，葡糖基转移酶包含选自SEQ ID NO：1、3、13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62的氨基酸序列。然而，应当注意一些野生型序列可以截短形式存在于自然界中。因此，并且在另一个实施方案中，适用的葡糖基转移酶可以为野生型序列的截短形式。在另一个实施方案中，截短的葡糖基转移酶包含衍生自全长野生型氨基酸序列的序列，所述全长野生型氨基酸序列选自SEQ ID NO：1、13、17、28、30、32、34、36、38、40、42、44和46。在另一个实施方案中，所述葡糖基转移酶可以是截短的并且将具有选自SEQ ID NO：3、16、19、48、50、52、54、56、58、60和62的氨基酸序列。
含水反应制剂中催化剂的浓度取决于催化剂的特定催化活性，对该浓度进行选择以获得所需的反应速率。每种催化剂反应的重量(单一葡糖基转移酶或独立地葡糖基转移酶和α-葡聚糖水解酶)通常在0.0001mg至20mg/mL总反应体积，优选地0.001mmg/ml至10mg/ml范围内。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将催化剂固定到可溶性或不溶性支撑体上；参见例如，Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，编辑；Humana出版社，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化催化剂允许在后续反应中进行回收和重复使用催化剂。酶催化剂可为下列形式：全微生物细胞、透化微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的或纯化的酶以及它们的混合物。
最终反应制剂的pH值为约3至约8，优选地约4至约8，更优选地约5至约8，甚至更优选地约5.5至约7.5，甚至更优选地约5.5至约6.5。可任选地通过添加合适的缓冲液，包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、或柠檬酸盐，来控制反应的pH值。使用缓冲剂时，其浓度通常为0.1mM至1.0M，优选地1mM至300mM，最优选地10mM至100mM。
当将反应组分合并时，最初存在的蔗糖浓度为至少50g/L，优选地50g/L至600g/L，更优选地100g/L至500g/L，更优选地150g/L至450g/L，并且最优选地250g/L至450g/L。α-葡聚糖水解酶(当存在时)的底物将为由葡糖基转移酶形成的葡萄糖低聚物群体的成员。因为存在于反应体系中的葡萄糖低聚物可充当受体，所以存在于反应体系中的每种物质的确切浓度将变化。此外，可将其它受体(即，外部受体)加入初始反应混合物中，诸如举例来说麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。
反应的长度可变化并且可通常通过使用所有可获得的蔗糖底物所花费的时间量来测定。在一个实施方案中，进行反应直至消耗至少90％，优选地至少95％，并且最优选地至少99％的最初存在于反应混合物中的蔗糖。在另一个实施方案中，反应时间为1小时至168小时，优选地1小时至72小时，并且最优选地1小时至24小时。
单一酶方法(葡糖基转移酶)
已经识别两种葡糖基转移酶/葡聚糖蔗糖酶能够在不存在α-葡聚糖水解酶的情况下产生本发明的α-葡聚糖纤维组合物。具体地，来自变异链球菌(Streptococcus mutans)的葡糖基转移酶( gi：3130088(或适用于在重组微生物宿主细胞中表达的其催化活性截短形式)；本文也被称为“0088”葡糖基转移酶或“GTF0088”)可产生本发明α-葡聚糖纤维组合物。在一个方面，变异链球菌(Streptococcus mutans)GTF0088可作为 gi：3130088中报道的全长序列的催化活性片段产生。在一个实施方案中，使用变异链球菌(Streptococcus mutans)GTF0088葡糖基转移酶或其催化活性片段来制备本发明的α-葡聚糖纤维组合物。
在一个实施方案中，提供制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii至少一种多肽，其具有葡糖基转移酶活性并且包含与选自SEQ ID NO：13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；以及
iii.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并以形成单一反应混合物，由此形成包含葡萄糖低聚物的产物混合物；
c.任选地将上述可溶性α-葡聚糖纤维组合物与包含葡萄糖低聚物的产物混合物分离；以及
d.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
在优选的实施方案中，使用葡糖基转移酶制备本发明的α-葡聚糖纤维组合物，所述葡糖基转移酶包含氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：13(全长形式)或SEQ ID NO：16、48或56(催化活性截短形式)具有至少90％，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，其中应当理解此类酶将保留相似的活性并产生与本发明α-葡聚糖纤维组合物一致的产品特征。
在另一个实施方案中，来自变异链球菌(Streptococcus mutans)LJ23 gi：387786207的葡糖基转移酶(或其适用于在重组微生物宿主细胞中表达的催化活性截短形式)；本文中也被称为“6207”葡糖基转移酶或简称“GTF6207”)已经被识别为能够在不存在α-葡聚糖水解酶(例如右旋糖酐酶，突变酶等)的情况下，产生本发明α-葡聚糖纤维组合物。在一个方面，变异链球菌(Streptococcus mutans)GTF6207可作为 gi：387786207中报道的全长序列的催化活性片段产生。在一个实施方案中，使用变异链球菌(Streptococcus mutans)GTF6207葡糖基转移酶或其催化活性片段来制备本发明的α-葡聚糖纤维组合物。在优选的实施方案中，使用葡糖基转移酶制备本发明的α-葡聚糖纤维组合物，所述葡糖基转移酶具有氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：17(全长形式)或SEQ ID NO：19(催化活性截短形式)具有至少90％，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的同一性，其中应当理解此类酶将保留相似的活性并产生与本发明α-葡聚糖纤维组合物一致的产品特征。
在另一个实施方案中，使用葡糖基转移酶制备本发明的α-葡聚糖纤维组合物，所述酶具有氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：13的同系物或同系物的截短形式具有至少90％，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，其中应当理解此类酶将保留相似的活性并产生与本发明α-葡聚糖纤维组合物一致的产品特征。在某些实施方案中，同系物选自SEQ ID NO：28、30、32、34、36、40、42、44和46。在某些实施方案中，同系物的截短形式选自SEQ ID NO：50、52、54、58、60和62。
可溶性葡聚糖纤维合成-包含葡糖基转移酶(Gtf)和α-葡聚糖水解酶的反应体系
本发明提供使用至少一种α-葡聚糖水解酶与至少一种上述葡糖基转移酶的组合(同时在反应混合物中)，酶促制备本发明可溶性葡聚糖纤维的方法。当与相同酶的顺序施用相比时(即，首先使用葡糖基转移酶由蔗糖合成葡聚糖聚合物并且随后利用α-葡聚糖水解酶处理葡聚糖聚合物)，同时使用两种酶产生不同产物特征(即，可溶性纤维组合物的特征)。在一个实施方案中，特别排除了基于葡糖基转移酶与α-葡聚糖水解酶的顺序施用的葡聚糖纤维合成方法。
在一个实施方案中，提供制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，该方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii至少一种具有葡糖基转移酶活性的多肽，所述多肽包含与选自SEQ ID NO：1和3的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；
iii.至少一种具有α-葡聚糖水解酶活性的多肽；以及
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并，由此制备包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的产物；以及
c.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物与步骤(b)的产物分离。
当与具有内切水解活性的α-葡聚糖水解酶组合使用时，来自变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025( GI：290580544；本文中也被称为“0544”葡糖基转移酶或简称为“GTF0544”)的葡糖基转移酶可产生本发明α-葡聚糖纤维组合物。在一个方面，变异链球菌(Streptococcus mutans)GTF0544可作为 gi：290580544中报道的全长序列的催化活性片段产生。在一个实施方案中，使用变异链球菌(Streptococcus mutans)GTF0544葡糖基转移酶(或适用于在重组宿主细胞中表达的其催化活性片段)与至少一种具有内切水解活性的α-葡聚糖水解酶的组合来制备本发明α-葡聚糖纤维组合物。类似于葡糖基转移酶，α-葡聚糖水解酶可通过针对某些α-D-糖苷键的内切水解活性定义。可用于本文所公开的方法的α-葡聚糖水解酶可通过其特征结构域结构来识别，例如那些识别为上述突变酶和右旋糖酐酶的结构域结构。示例可包括但不限于，右旋糖酐酶(能够水解α-(1，6)-连接的糖苷键；E.C.3.2.1.11)、突变酶(能够水解α-(1，3)-连接的糖苷键；E.C.3.2.1.59)、霉菌右旋糖酐酶(能够内切水解包含(1→3)-和(1→4)-键两者的α-D-葡聚糖的(1→4)-α-D-糖苷键；EC 3.2.1.61)、葡聚糖1，6-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.70)和交替糖酶(能够内切水解裂解交替糖；E.C.3.2.1.-；参见U.S.5,786,196)。各种因素包括但不限于某些α-葡聚糖内的支化程度、支化类型和相对分支长度，可不利地影响α-葡聚糖水解酶内切水解一些糖苷键的能力。
在一个实施方案中，α-葡聚糖水解酶为至少一种突变酶(EC 3.1.1.59)。可用于本文所公开的方法的突变酶可通过其特征性结构来识别。参见例如，Y.Hakamada等人，(Biochimie，(2008)90：525-533)。在一个实施方案中，突变酶为可得自青霉菌属(Penicillium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)的突变酶。在另一个实施方案中，突变酶来自马尔尼菲青霉ATCC 18224或Paenibacillus Humicus。在一个实施方案中，突变酶包含选自SEQID NO：4、6、9、11和它们的任意组合的氨基酸序列。在另一个实施方案中，上述突变酶可以为催化活性的截短形式，只要保留突变酶活性即可。在优选的实施方案中，在中识别为gi：257153264的腐殖质类芽孢杆菌突变酶(本文中也称为“3264”突变酶或简称为“MUT3264”)或其催化活性片段可与GTF0544葡糖基转移酶组合使用以产生本发明的α-葡聚糖纤维组合物。MUT3264突变酶可由其天然信号序列、替代信号序列(诸如枯草芽孢杆菌AprE信号序列，SEQ ID NO：7)产生，或可以成熟形式(例如，缺少信号序列的截短形式)产生，只要保留期望的突变酶活性并且所得的产物(当与GTF0544葡糖基转移酶组合使用时)为本发明的α-葡聚糖纤维组合物即可。
在优选的实施方案中，使用葡糖基转移酶和突变酶的组合制备本发明的α-葡聚糖纤维组合物，所述葡糖基转移酶具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1(全长形式)或SEQ ID NO：3(催化活性截短形式)具有至少90％，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述突变酶与SEQ ID NO：4(如gi：257153264中报道的全长形式)或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9具有至少90％，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，其中应当理解酶的组合(GTF0544和MUT3264)将保留相似的活性并产生与本发明α-葡聚糖纤维组合物一致的产品特征。
可对包括同时使用至少一种葡糖基转移酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的酶促反应体系的温度进行选择，来控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性两者。反应温度范围可为仅高于反应制剂的凝固点(约0℃)至约60℃，优选的范围为5℃至约55℃，并且更优选的反应温度范围为约20℃至约47℃。
葡糖基转移酶活性与α-葡聚糖水解酶活性的比率可根据选择的酶变化。在一个实施方案中，葡糖基转移酶与α-葡聚糖水解酶的比率的范围是从1∶0.01至0.01∶1.0。
识别具有期望活性的基本上相似的酶的方法
本领域技术人员认识到，基本上相似的酶序列也可以用于本发明的组合物和方法中，只要保留期望的活性(即，能够形成具有期望的糖苷键的葡聚糖的葡糖基转移酶活性或α-葡聚糖水解酶具有针对一个或多个目标糖苷键的内切水解酶活性)即可。例如，已经展示了可制备和使用催化活性截短形式，只要保留期望的活性(或甚至在特定活性方面改善)即可。在一个实施方案中，基本上类似的序列通过它们在高严格条件下杂交到与本文例示的序列相关联的核酸分子上的能力进行定义。在另一个实施方案中，可基于与本文提供的DNA或氨基酸序列的百分比同一性，使用序列对比算法定义基本上类似的酶。
如本文所用，当第一个分子的单链能够在合适的温度和溶液离子浓度条件下对其它分子退火时，核酸分子对另一个核酸分子诸如cDNA、基因组DNA、或RNA来说是“可杂交的”。杂交和洗涤条件是熟知的并且例示于Sambtook，J.和Russell，D.，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor(2001)。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格条件以筛选中度相似的分子(诸如来自远缘生物的同源序列)到高度相似的分子(诸如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后洗涤通常决定严格条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC，0.5％SDS在室温洗涤15分钟，然后用2X SSC，0.5％SDS在45℃重复30分钟，然后用0.2X SSC，0.5％SDS在50℃重复洗涤两次，每次30分钟。一组更优选的条件使用较高温度，其中洗涤步骤与上述那些步骤相同，不同的是最后两次用0.2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的高度严格的杂交条件是0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％SDS洗涤，之后是0.1X SSC，0.1％SDS，65℃的最终洗涤。
杂交需要包含互补序列的两种核酸，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经导出了用于计算Tm的公式(Sambrook，J.和Russell，D.，T.，同上)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更为重要，而且寡核苷酸的长度确定了其特异性。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交的核酸的最小长度为至少约15个核苷酸，更优选地至少约20个核苷酸，甚至更优选地至少30个核苷酸，甚至更优选地至少300个核苷酸，并且最优选地至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。
如本文所用，术语“百分比同一性”为两条或更多条多肽序列之间或者两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的核苷酸或氨基酸的匹配数确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算，该已知方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.，编辑)，Oxford University出版社，NY(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)，Academic出版社，NY(1993)；Computer Ahalysisof Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humana出版社，NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic出版社(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton出版社，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中被编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可使用LASERGENE生物信息学计算软件包的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)或EMBOSS Open Software Suite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends in Genetics16，(6)：276-277(2000))进行。可使用CLUSTAL比对方法(诸如CLUSTALW；例如版本1.83)利用默认参数来进行序列的多重比对(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.22：4673-4680(1994)；以及Chenna等人，Nucleic Acids Res 31(13)：3497-500(2003)，可通过European Bioinformatics Institute得自EuropeanMolecular Biology Laboratory)。CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括GAP Existencepenalty＝15、GAP extension＝0.2、matrix＝Gonnet(例如Gonnet250)、protein ENDGAP＝-1，protein GAPDIST＝4、以及KTUPLE＝1。在一个实施方案中，使用默认设置进行快速或慢速比对，其中优选慢速比对。另选地，可将使用CLUSTALW方法(例如1.83版)的参数修改为也使用KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝10、GAP extension＝1、matrix＝BLOSUM(例如BLOSUM64)、WINDOW＝5以及TOP DIAGONALS SAVED＝5。
在一个方面，合适的分离的核酸分子编码具有下述氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与本文报道的氨基酸序列具有至少约20％，优选地至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一方面，合适的分离的核酸分子编码具有下述氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与本文报道的氨基酸序列具有至少约20％，优选地至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；前提条件是所述多肽保留了相应活性(即葡糖基转移酶或α-葡聚糖水解酶活性)。
气体产生
在下胃肠道中的快速气体产生速率引起胃肠道不适，诸如肠胃气胀和胃气胀，然而如果气体产生是渐进的和少的，则身体可以更容易地应付。例如，当在当量剂量(可溶性纤维克数)下与本发明葡聚糖纤维组合物相比时，菊粉产生快速且高的气体产生增加，然而在当量剂量下本发明葡聚糖纤维组合物优选具有低于菊粉的气体释放速率。
在一个实施方案中，包含本文所公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的食物产品的食用产生对于食品应用而言良好耐受的气体产生速率。在一个实施方案中，在当量剂量下，气体产生的相对速率不大于在类似条件下对于菊粉所观察到的速率，优选地与菊粉相同或小于菊粉，更优选地小于菊粉，并且最优选地远小于菊粉。在另一个实施方案中，使用本文所用的方法，经过3小时或24小时，测量气体形成的相对速率。在优选的方面，在相同反应条件下，气体形成速率比对于菊粉所观察到的速率小至少1％，优选地2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或至少30％。
有益的生理特性
短链脂肪酸产生
使用根据本发明的化合物可有利于通过结肠发酵产生产能代谢物。使用根据本发明的化合物可有利于制备短链脂肪酸(SCFA)，诸如丙酸盐和/或丁酸盐。已知SCFA降低胆固醇。因此，本发明的化合物可降低形成高胆固醇的风险。在发酵研究中，本发明的葡聚糖纤维组合物可以促进SCFA，尤其是丙酸盐和/或丁酸盐的产生。因为SCFA的产生或SCFA与乙酸盐的比例的增加有利于在对其有需要的哺乳动物中控制胆固醇含量，所以本文所公开的纤维组合物对营养学家和消费者用于预防和/或治疗心血管风险可以是特别有意义的。因此，另一方面，本公开提供用于改善受试者的健康的方法，所述方法包括以对所述受试者的健康施加有益效果，诸如治疗胆固醇相关疾病的有效量将包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物施用于受试者。此外，通常已知SCFA降低肠道中的pH，并且这有助于钙吸收。因此，根据本公开的化合物还可影响矿物质吸收。这是指通过由于肠道中SCFA增加而降低pH，它们还可改善骨骼健康，或预防或治疗骨质疏松症。产生SCFA可增加小肠中的粘度，这减少了胆汁酸的再吸收；增加由胆固醇合成胆汁酸并减少了低密度脂蛋白(LDL)胆固醇循环。
如本文所定义的，化合物或组合物的“有效量”是指在各种剂量下并对于必要的时间段而言，有效实现期望的有益生理效应，诸如降低血液胆固醇、增加短链脂肪酸产生或者预防或治疗胃肠道疾病的量。例如，施用于受试者的组合物的量将根据各种因素而变化，诸如受试者的病症、受试者的体重、受试者的年龄、以及组合物是否是唯一营养来源。有效量可由执业医师或营养师容易地设定。一般来讲，施用足量的组合物以向受试者提供高达约50g的膳食纤维(不溶性和可溶性)/天；例如约25g至约35g的膳食纤维/天。受试者接收的本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物的量优选地在约0.1g/天至约50g/天的范围内，更优选地以0.5g/天至20g/天，并且最优选地1g/天至10g/天的速率。如本文所限定的，化合物或组合物可以多剂量摄取，例如1至5次，分散于一天中或急性地，或可以单剂量摄取。如本文所定义的化合物或组合物还可在期望的时间段内连续喂食。在某些实施方案中，期望的时间段为至少一周或至少两周或至少三周或至少一个月或至少六个月。
在优选的实施方案中，本公开提供通过将如本文定义的化合物或组合物施用于对其有需要的受试者来降低对其有需要的受试者中血液甘油三酯水平的方法。在另一优选的实施方案中，本公开提供通过将如本文定义的化合物或组合物施用于对其有需要的受试者来降低对其有需要的受试者中的低密度脂蛋白水平的方法。在另一优选的实施方案中，本公开提供通过将如本文定义的化合物或组合物施用于对其有需要的受试者来增加对其有需要的受试者中高密度脂蛋白水平的方法。
餐后血糖浓度/血糖应答的减弱
在本发明α-葡聚糖纤维组合物中存在不是α-(1，4)主链键的键，提供改善的耐消化性，因为人类消化道中的酶可难以水解此类键和/或支化键。支链的存在向葡聚糖纤维提供部分或完全的不可消化性，并且因此实质上没有葡聚糖吸收到体内或葡聚糖更慢地吸收到体内，这导致较低的血糖应答。因此，本公开提供用于制造导致较低血糖应答的食品和饮料组合物的α-葡聚糖纤维组合物。例如，这些化合物可用于替代糖或其它可快速消化的碳水化合物，从而降低食品的血糖负荷、减少卡路里和/或减低食品的能量密度。因此，具有这些类型的键的本发明α-葡聚糖纤维组合物的稳定性使得它们容易地通过而进入大肠中，其中它们可用作对结肠微生物菌群具有特异性的底物。
改善肠道健康
在另一个实施方案中，如本文所公开的化合物可用于治疗和/或改善肠道健康。本发明α-葡聚糖纤维组合物优选在肠道中通过肠道微生物群缓慢发酵。优选地，本发明化合物表现出在体外肠道模型中不差于菊粉或其它可商购获得的纤维诸如(可溶性玉米纤维，Tate&Lyle)、(可溶性玉米纤维或糊精，Roquette)或(耐消化麦芽糖糊精，Archer Daniels Midland Company&MatsutaniChemical)的耐受性，(即相似的气体产生水平)，优选地优于一种或多种可商购获得的纤维的改善的耐受性，即本发明葡聚糖纤维的发酵导致在3小时或24小时内比菊粉更少的气体产生，从而减少由于气体形成导致的不适，诸如肠胃气胀和胃气胀。在一个方面，本公开还涉及通过将如本文所公开的化合物或组合物施用于对其有需要的受试者来缓解受试者胃肠道中气体形成的方法，以便减少由于肠胃气胀和胃气胀导致的肠道疼痛或肠道不适。在另一个实施方案中，如本文所公开的组合物向受试者提供对食品发酵的改善的耐受性，并且可与纤维，诸如菊粉或FOS、GOS或乳果糖组合以通过减少气体产生来改善耐受性。
在另一个实施方案中，可施用本文所公开的化合物以通过增加粪便体积来改善排便或改善排便规律。
益生元和益生菌
一种或多种可溶性α-葡聚糖纤维组合物可用作益生元，或当益生菌组合使用时用作“合生素”，如下所述。所谓“益生元”，是指通过选择性地刺激胃肠道，特别是结肠中的一种或有限数量的细菌的生长和/或活性，从而改善宿主的健康来有益地影响受试者的食品成分。益生元的示例包括低聚果糖、菊粉、聚右旋糖、抗性淀粉、可溶性玉米纤维、低聚葡萄糖和低聚半乳糖、阿拉伯木寡糖、乳糖醇和乳果糖。
在另一个实施方案中，包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物还包含至少一种益生菌生物。所谓“益生菌生物”是指通过它们在消化道中的功能向受试者提供有益效果的活微生物膳食补充剂。为了有效，益生菌微生物必须能够在消化条件下存活，并且它们必须能够至少暂时移植于胃肠道而对受试者没有任何伤害。仅微生物的某些菌株具有这些特性。优选地，益生菌微生物选自：乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、埃希氏菌属(Escherichia spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)和酵母属(Saccharomyces spp.)。特定微生物包括但不限于，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、双歧杆菌(Bifidobacterium bificum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、屎链球菌(Streptococcus faecium)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、球拟酵母(Torulopsia)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和链霉菌(Streptomyces)等，包括它们的营养孢子、非营养孢子(芽孢杆菌)和合成衍生物。更优选的益生菌微生物包括但不限于三种细菌属的成员：乳杆菌属、双歧杆菌属和酵母属。在优选的实施方案中，益生菌微生物是乳杆菌属、双歧杆菌属以及它们的组合。
可将益生菌微生物作为在益生菌保持存活的水或其它液体或半固体培养基中的培养物掺入组合物中。在另一种技术中，可通过混合或共混将包含益生菌生物的冻干粉末掺入特定材料或液体或半固体材料中。
在优选的实施方案中，组合物包含益生菌生物，其含量足以递送至少10亿至2000亿活益生菌生物，优选地10亿至1000亿，并且最优选地10亿至500亿活益生菌生物。如上所述益生菌生物递送量可按剂量和/或按天计，其中多剂量/天可适用于一些应用。可将两种或更多种益生菌生物用于一种组合物中。
获得酶促制备的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法
可将任何数量的常用纯化技术用于从反应体系中获得本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物，纯化技术包括但不限于离心、过滤、分馏、色谱分离、渗析、蒸发、沉淀、稀释或它们的任意组合，优选地通过渗析或色谱分离，最优选地通过渗析(超滤)。
重组微生物表达
本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞尤其是微生物宿主细胞中产生。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞是存在于真菌或细菌家族中并在宽温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长的微生物宿主。例如，预期细菌、酵母和丝状真菌中任何一种均适于作为表达本发明核酸分子的宿主。一种或多种酶可在细胞内、细胞外或者细胞内和细胞外组合表达，其中相比于用于回收通过细胞内表达产生的蛋白的方法，细胞外表达能够从发酵产物中更容易地回收期望蛋白。转录、翻译和蛋白生物合成设备相对于用于生成细胞生物质的细胞原料保持不变；无论如何将表达功能基因。宿主菌株的示例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种，诸如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红发夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)。在一个实施方案中，真菌宿主细胞是木霉属，优选地里氏木霉菌株。在一个实施方案中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)以及假单胞菌属(Pseudomonas)。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
大规模微生物的生长和功能基因的表达可利用各种单一碳水化合物或络合碳水化合物、有机酸和醇或饱和烃(对于光合自养宿主或化能自养宿主而言，诸如甲烷或二氧化碳)，并可利用各种形式和数量的氮、磷、硫、氧、碳或任何微量营养素(包括小无机离子)。可通过向培养物中加入或不加入特定的调节分子(通常不将其视为营养物质或能量源)来影响生长速率的调节。
可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区和控制转录终止的DNA片段3′区。最优选的是当两个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源的基因和/或对生产宿主是天然的基因，尽管它们无需来源于此。
可用于驱动本发明的先锋霉素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所熟悉。实质上能够驱动这些基因的任何启动子均适用于本发明，其包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在酵母属中表达)；AOX1(可用于在毕赤酵母属中表达)；以及lac、araB、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc(可用于在大肠杆菌中表达)以及amy、apr、npr启动子和用于在芽孢杆菌属中表达的各种噬菌体启动子。
终止控制区也可以源于优选宿主细胞的天然的多种基因。在一个实施方案中，包含终止控制区是任选的。在另一个实施方案中，嵌合基因包括源于优选宿主细胞的终止控制区。
工业生产
多种培养方法可用来制备一种或多种酶。例如，从重组微生物宿主过表达的特定基因产物的大规模生产可通过分批、分批补料和连续培养的方法进行。分批和分批补料培养方法在本领域内是常用的且熟知的，并且示例可见于Wulf Crueger和AnnelieseCrueger(作者)的Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology.，第二版，(Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1990))和Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，第三版，Richard H.Baltz、Arnold L..Demain和Julian E.Davis(编辑)，(ASM出版社，Washington，DC(2010))。
所需酶的商业生产也可用连续培养的方法实现。连续培养是一种开放式系统，其中将成分确定的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞保持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。另选地，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养物质，且连续从细胞群中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体支撑体进行，所述固体支撑体由天然材料和/或合成材料组成。
从分批发酵、分批补料发酵或连续培养中回收一种或多种期望的酶可通过本领域技术人员已知的任何方法完成。例如，当在细胞内产生酶催化剂时，通过离心或膜过滤从培养基中分离细胞浆，任选地用水或期望pH的含水缓冲液洗涤，然后将期望pH的含水缓冲液中的细胞浆悬浮液匀化，以产生包含期望酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可任选地通过合适的助滤剂诸如硅藻土或二氧化硅过滤来去除细胞碎片，然后进行热处理步骤，以将不需要的蛋白质从酶催化剂溶液中沉淀出。然后通过膜过滤或离心将含有所需酶催化剂的溶液从沉淀的细胞碎片和蛋白质分离，并且所得的部分纯化的酶催化剂溶液通过另外的膜过滤浓缩，然后任选地与合适的载体(例如，麦芽糖糊精、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其混合物)混合并喷雾干燥以产生含有所需酶催化剂的固体粉末。另选地，可通过添加多元醇诸如麦芽糖糊精、山梨醇或丙二醇，任选向其中添加防腐剂诸如山梨酸、山梨酸钠或苯甲酸钠，将所得的部分纯化的酶催化剂溶液稳定为液体制剂。
可溶性α-葡聚糖纤维的制备可以通过在任何合适的含水反应条件下将所得的一种或多种酶合并来进行，所述反应条件导致可溶性α-葡聚糖纤维的产生，诸如本文所公开的条件。反应可在水溶液中进行，或者在某些实施方案中，反应可在食物产品内原位进行。使用酶催化剂在食物产品中原位产生纤维的方法是本领域所熟知的。在某些实施方案中，将酶催化剂添加到包含蔗糖的液体食物产品中。酶催化剂可减少液体食物产品中蔗糖的量，同时增加可溶性α-葡聚糖纤维和果糖的量。适用于使用多肽材料(即酶催化剂)在食物产品内原位产生纤维的方法可见于WO2013/182686，其内容以引用方式并入本文，用于对使用酶催化剂在食物产品中原位产生纤维的方法的公开。
当含量、浓度或其它值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值中的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点以及在该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不旨在将范围限定于所列举的具体值。
特定实施方案的描述
在第一实施方案中，提供一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含：
a.10％至30％的α-(1，3)糖苷键；
b.65％至87％的α-(1，6)糖苷键；
c.少于5％的α-(1，3，6)糖苷键；
d.小于5000道尔顿的重均分子量；
e.在20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Paπs)的粘度；
f.在4至40范围内的右旋糖当量(DE)；以及
g.小于12％的可消化性，如分析化学师协会(Association of AnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所测量；
h.在25℃下，pH 7水中至少20％(重量/重量)的溶解度；以及
i.小于5的多分散指数。
在对上述实施方案中任一个的另一个实施方案中，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含小于10％的还原糖。
在对上述实施方案中任一个的另一个实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含小于1％的α-(1，4)糖苷键。
在对上述实施方案中任一个的另一个实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物的特征在于介于400g/mol和2000g/mol之间的数均分子量(Mn)。
在一个实施方案中，提供了碳水化合物组合物，其包含：0.01重量％至99重量％，优选地10重量％至90重量％(基于干固体)的根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
在对上述实施方案中任一个的另一个实施方案中，所述碳水化合物组合物包含：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、乙酰磺胺酸钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麦芽糖糊精、淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糖糊精、支链麦芽糖糊精、菊粉、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龙胆糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、低聚异麦芽糖、填料、赋形剂、粘结剂或它们的任意组合。
在对上述实施方案中的任一个的另一实施方案中，碳水化合物组合物呈液体、糖浆、粉末、颗粒、成形球、成形棒、成形板、成形立方体、片剂、胶囊、香囊或它们的任意组合的形式。
在另一个实施方案中，提供食物产品、个人护理产品或药学产品，其包含根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物或包含根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物。
在另一个实施方案中，提供制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，该方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；优选地浓度为至少50g/L，优选地至少200g/L；
ii至少一种多肽，其具有葡糖基转移酶活性，所述多肽包含与SEQ ID NO：1或3具有至少90％的同一性，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
iii.至少一种多肽，其具有α-葡聚糖水解酶活性；优选地内切突变酶活性或内切右旋糖酐酶活性；以及
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并，由此制备包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的产品；
c.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物与步骤(b)的产物分离；以及
d.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
在对上述实施方案中任一个的另一个实施方案中，在反应期间至少一种具有葡糖基转移酶活性的多肽和至少一种具有α-葡聚糖水解酶活性的多肽同时存在。
在对上述实施方案中任一个的另一个实施方案中，所述内切突变酶包含与SEQ IDNO：4、6、9或11具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在对上述实施方案中任一个的另一个实施方案中，至少一种具有α-葡聚糖水解酶活性的多肽为来自毛壳菌(Chaetomium erraticum)的内切右旋糖酐酶形式L。
在对上述实施方案中任一个的另一个实施方案中，葡糖基转移酶活性与α-葡聚糖水解酶活性的比率为0.01∶1至1∶0.01。
在另一个实施方案中，提供制备本发明α-葡聚糖纤维组合物的方法，该方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii至少一种具有葡糖基转移酶活性的多肽，其包含与选自SEQ ID NO：13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62的至少一种序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；以及
iii.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并以形成单一反应混合物，由此形成包含葡萄糖低聚物的产物混合物；
c.任选地，将本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物与包含葡萄糖低聚物的产物混合物分离；以及
d.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物或方法，其中碳水化合物组合物包含：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、乙酰磺胺酸钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麦芽糖糊精、淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糖糊精、支链麦芽糖糊精、菊粉、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龙胆糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、低聚异麦芽糖、填料、赋形剂、粘结剂或它们的任意组合。
根据上述实施方案中任一项所述的组合物或方法，其中所述碳水化合物组合物呈液体、糖浆、粉末、颗粒、成形球、成形棒、成形板、成形立方体、片剂、粉末、胶囊、香囊或它们的任意组合的形式。
根据上述实施方案中任一项所述的组合物或方法，其中所述食物产品为：
a.烘焙产品，其选自：蛋糕、布朗尼、曲奇、曲奇松脆片、松饼、面包和甜面团、挤出谷物片和涂层谷物片(coated cereal pieces)；
b.乳制品，其选自：酸乳、酸乳饮料、乳饮料、调味乳、冰沙、冰淇淋、奶昔、脱脂乳酸干酪、脱脂乳酸干酪调味品、脱脂凝乳和打发的慕斯型产品；
c.糖果，其选自：硬糖、方旦糖、牛轧糖和棉花糖、明胶果冻糖、焦糖、果冻、巧克力、甘草、口香糖、焦糖、太妃糖、求斯糖、薄荷糖、片状糖果和水果小吃；
d.饮料，其选自：碳酸饮料、果汁、浓缩果汁混合物、清水、以及饮料干混合物；
e.干棒小吃、烤酥饼、甜甜圈或曲奇的高固体填充物；
f.挤出和成片的小吃，其选自：膨化小吃、梳打饼、未经发酵的玉米片和玉米薄片；
g.干棒小吃、营养棒、granola棒、蛋白质棒和谷物棒；
h.奶酪、奶酪酱和其它可食用的奶酪制品；
i.可食用膜；
j.水溶性汤、糖浆、酱汁、调味品或咖啡奶精；或者
k.膳食补充剂；优选地呈片剂、粉末、胶囊或香囊的形式。
一种组合物，其包含0.01重量％至99重量％(基于干固体)的本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物以及：合生素、肽、肽水解产物、蛋白质、蛋白质水解产物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、维生素、矿物质、草药、草药提取物、脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)、植物甾类、甜菜碱、类胡萝卜素、消化酶、益生菌生物或它们的任意组合。
根据上述方法中任一项所述的方法，其中分离步骤包括离心、过滤、分馏、色谱分离、渗析、蒸发、稀释或它们的任意组合中的任一个。
根据上述方法中任一项所述的方法，其中当将反应组分的系列合并时，单一反应混合物中的蔗糖浓度最初为至少50g/L。
根据上述方法中任一项所述的方法，其中葡糖基转移酶活性与α-葡聚糖水解酶活性的比率的范围是从0.01∶1至1∶0.01。
根据上述方法中任一项所述的方法，其中合适的含水反应条件包括介于0℃和45℃之间的反应温度。
根据上述方法中任一项所述的方法，其中合适的含水反应条件包括3至8，优选地4至8的pH范围。
根据上述方法中任一项所述的方法，其中合适的含水反应条件包括缓冲液，其选自磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐和柠檬酸盐。
根据上述方法中任一项所述的方法，其中所述至少一种葡糖基转移酶选自SEQ IDNO：1、3、13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62以及它们的任意组合。
根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述至少一种α-葡聚糖水解酶选自SEQ ID NO：4、6、9、11以及它们的任意组合。
根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述至少一种葡糖基转移酶和所述至少一种α-葡聚糖水解酶选自下列的组合：葡糖基转移酶GTF0544(SEQ ID NO：1、3或它们的组合)和突变酶MUT3264(SEQ ID NO：4、6、9或它们的组合)的组合。
通过上述方法实施方案中任一项制备的产物；优选地，其中所述制备的产物为根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
实施例
除非本文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的含义相同。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D编辑，John Wiley和Sons，New York(1994)，和Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，N.Y.(1991)为本领域技术人员提供了用于本发明的许多术语的通用字典。
本发明在以下实施例中进一步限定。应该理解，这些实施例尽管说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围内的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
缩写的含义如下：“sec”或“s”表示秒，“ms”表示毫秒，“min”表示分钟，“h”或“hr”表示小时，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“mL/min”是毫升每分钟，“μg/mL”是微克每毫升；“LB”是Luria肉汤；“μm”是微米，“nm”是纳米；“OD”是光学密度；“IPTG”是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；“g”是重力；“mM”是毫摩尔；“SDS-PAGE”是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺；“mg/mL”是毫克每毫升；“N”是标称；“w/v”是重量/体积；“DTT”是二硫苏糖醇；“BCA”是二喹啉甲酸；“DMAc”是N，N’-二甲基乙酰胺；“LiCl”是氯化锂，“NMR”是核磁共振；“DMSO”是二甲基亚砜；“SEC”是尺寸排阻色谱；“GI”或“gi”表示GenInfo标识符，由和其它序列数据库使用的系统以唯一地识别相应数据库内的多核苷酸和/或多肽序列；“DPx”是指在长度内具有“x”个单元的葡聚糖聚合度；“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，“DSMZ”和“DSM”将是指莱布尼茨研究所-德国微生物菌种保藏中心(Braunschweig，Germany)；“EELA”是芬兰食品安全局(Helsinki，Finland)；“CCUG”是指瑞典哥德堡大学文化收藏中心；“Suc.”是指蔗糖；“Gluc.”是指葡萄糖；“Fruc.”是指果糖；“Leuc.”是指明串珠菌二糖；并且“Rxn”是指反应。
一般方法
本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且描述于Sambrook，J.和Russell，D.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)；以及Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L. W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory Press Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Short Protocols in Molecular Biology，第5版，Current Protocols and John Wiley andSons，Inc.，N.Y.，2002。
适合细菌培养物维持及生长的材料和方法在本领域内也是熟知的。适用于如下实施例的技术可见于如下文献列出的内容中：Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑，American Society forMicrobiology Press，Washington，DC.(1994))，Wulf Crueger和Anneliese Crueger(作者)，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，(SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1990))和Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，第三版，Richard H.Baltz、Arnold L. Demain和Julian E.Davis(编辑)，(American Society of Microbiology Press，Washington，DC(2010))。
除非另外说明，所有用于使细菌细胞生长并维持的试剂、限制性酶和材料均获取自BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)，Invitrogen/Life Technologies Corp.(Carlsbad，CA)，Li允Technologies(Rockville，MD)，QIAGEN(Valencia，CA)，Sigma-Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)或Pierce Chemical Co.(Thermo FisherScientific Inc.的分公司(Rockford，IL)。IPTG(目录号I6758)和三苯基四唑氯化物得自Sigma Co.(St.Louis，MO)。BELLCO旋转烧瓶得自Bellco Co.(Vineland，NJ)。LB培养基得自Becton，Dickinson and Company(Franklin Lakes，New Jersey)。BCA蛋白质测定得自Sigma-Aldrich(St Louis，MO)。
用于生产GTF酶的重组大肠杆菌(E.coli)菌株的生长
在37℃和220rpm下，使用具有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基，使表达功能性GTF酶的大肠杆菌菌株在摇瓶中生长至OD600nm＝0.4-0.5，此时添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至最终浓度为0.5mM，并且在37℃下继续温育2-4小时。通过在5,000×g下离心15分钟收获细胞并且重新悬浮于pH 7.0的50mM磷酸盐缓冲液中(20％-25％湿细胞重量/体积)。使得重悬细胞两次通过弗氏压碎器(SLM Instruments，Rochester，NY)以确保＞95％的细胞裂解。细胞裂解物在12,000×g和4℃下离心30分钟。通过BCA蛋白质测定和SDS-PAGE分析所得的上清液(细胞提取物)以确认GTF酶的表达，并将细胞提取物储存在-80℃。
pHYT载体
pHYT载体主链是包含枯草芽孢杆菌aprE启动子的复制性枯草芽孢杆菌表达质粒。其衍生自大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY320PLK(登录号D00946，并且可从Takara Bio Inc.(Otsu，Japan)商购获得)。大肠杆菌和氨苄青霉素抗性基因的复制起点是从pACYC177( X06402，并且可从New England Biolabs Inc.(Ipswich，MA)商购获得)枯草芽孢杆菌和四环素抗性基因的复制起点是从pAMalpha-1(Francia等人，J Bacteriol.，2002年9月；184(18)：5187-93)。为构建pHYT，在四环素抗性基因之后插入来自噬菌体λ的终止子序列：5’-ATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTAT-3’(SEQ ID NO：24)。使用破坏HindIII位点的BamHI-HindIII接头，将包含aprE启动子-编码感兴趣的酶的编码序列(例如，编码各种GTF的序列)的AprE信号肽序列-BPN’终止子的整个表达盒(EcoRI-BamHI片段)克隆到pHYT的EcoRI和HindIII位点中。接头序列为5’-GGATCCTGACTGCCTGAGCTT-3’(SEQ ID NO：25)中。aprE启动子和AprE信号肽序列(SEQ IDNO：7)对于枯草芽孢杆菌是天然的。BPN′终止子来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的枯草杆菌蛋白酶。在使用天然信号肽的情况下，用经表达基因的天然信号肽替代AprE信号肽。
里氏木霉(T.reesei)的基因枪转化
将里氏木霉孢子悬浮液涂布在直径为的乙酰胺酶转化平板(150μL的5×107-5×108个孢子/mL悬浮液)的中心上。然后将板在生物罩中风干。将停止屏(BioRad 165-2336)和大载体支架(BioRad 1652322)浸泡在70％乙醇中并风干。将干燥剂(硫酸钙干燥剂；W.A.Hammond Company(Xenia，OH))置于小皮氏培养皿(6emPyrex)中并用Whatman滤纸(GE Healthcare Bio-Sciences，Pittsburgh，PA)覆盖。将包含大载体(BioRad 165-2335；Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA))的大载体支架平放在滤纸的顶部上并替代培养皿盖。通过将60mg钨M-10颗粒(微载体，0.7微米，BioRad#1652266，Bio-Rad Laboratories)添加到Eppendorf管中来制备钨颗粒悬浮液。添加乙醇(1mL)(100％)。将钨在乙醇溶液中涡旋并使其浸泡15分钟。将Eppendorf管以最大速度短暂地微离心以使钨成粒状。滗出乙醇并利用无菌蒸馏水洗涤三次。在第三次滗出洗涤水之后，将钨重新悬浮于1mL的无菌50％甘油中。通过向1.5mL-Eppendorf管中添加25μL悬浮的钨来制备转化反应用于每个转化。后续添加按如下顺序进行：2μL DNA pTrex3表达载体(SEQ ID NO：12；参见美国专利6，426，410)、25μL 2.5M CaCl2、10μL0.1M亚精胺。将反应连续涡旋5-10分钟，从而保持钨悬浮。然后将Eppendorf管短暂微离心并且滗出。将钨丸粒利用200uL的70％乙醇洗涤，短暂微离心成粒状并滗出。所述丸粒用200μL的100％乙醇洗涤，短暂微离心成粒状并滗出。将钨丸粒重新悬浮于24μL 100％乙醇中。将Eppendorf管置于超声水浴中并持续15秒，并将8μL等分试样转移到经干燥的大载体的中心上。将大载体保留在经干燥的皮氏培养皿中干燥。
将氦气罐打开至1500psi(～10.3MPa)。将1100psi(～7.58MPa)破裂盘(BioRad165-2329)用于型号PDS-1000/HeTM 颗粒递送体系(BioRad)中。当将钨溶液干燥时，将停止屏和大载体支架插入PDS-1000中。将包含目标里氏木霉孢子的乙酰胺酶平板放置在停止屏下6cm处。对室抽29英寸Hg(～98.2kPa)的真空并保持。将He颗粒递送体系焙烧。将所述室放气，取出乙酰胺酶平板以在28℃下温育，直至出现菌落(5天)。
改性的amdS Biolistic琼脂(MABA)/升
第I部分，在500mL蒸馏水(dH2O)中制备
1000x盐1mL
Noble琼脂20g
pH至6.0，高压釜
第II部分，在500mL dH2O中制备
乙酰胺0.6g
CsCl 1.68g
葡萄糖20g
KH2PO4 15g
MgSO4·7H2O 0.6g
CaCl2·2H2O 0.6g
pH至4.5，0.2微米过滤灭菌；置于50℃烘箱中加热，添加琼脂，混合，倾注平板。在室温下储存(～21℃)
1000x盐/升
FeSO4·7H2O 5g
MnSO4·H2O 1.6g
ZnSO4·7H2O 1.4g
CoCl2·6H2O 1g
达到1L dH2O。
0.2微米过滤灭菌
测定葡糖基转移酶活性
葡糖基转移酶活性测定通过以下过程进行：在存在或不存在25g/L右旋糖酐(MW～1500，Sigma-Aldrich，目录号31394)的情况下，在37℃和125rpm轨道振荡下，用含200g/L蔗糖的25mM或50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5下)温育包含GTF酶的1％-10％(v/v)粗蛋白提取物。在1h、2h和3h时取出一份反应混合物的等分试样并在90℃加热5min以使GTF失活。通过在13,000xg下离心5分钟来去除不溶性材料，之后使其过滤通过0.2μm RC(再生纤维素)膜。在85℃下采用两个串联Aminex HPX-87C柱(Bio-Rad，Hercules，CA)通过HPLC分析所得的滤液来定量蔗糖浓度。相对于反应时间绘出各个时间点的蔗糖浓度并由线性曲线的斜率确定初始反应速率。一个GTF活性单位定义为在测定条件下每分钟消耗一微摩尔的蔗糖所需的酶量。
测定α-葡聚糖水解酶活性
使用由远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)33478TM产生的分泌的酶来制备测定突变酶活性所需的不溶性变聚糖聚合物。具体地，将远缘链球菌33478TM的甘油原液的一个环在BHI琼脂板(Brain Heart Infusion agar，Teknova(Hollister，CA)上划线，并且将板在37℃下温育2天；使用环挑取几个菌落以接种来自Teknova的原始培养基瓶中的2X 100mL BHI液体培养基，并且将培养物在37℃下温育，静置24h。通过离心去除所得的细胞并且通过0.2μm无菌过滤器将所得的上清液过滤；收集2X101mL的滤液。向滤液中添加2X 11.2mL的200g/L蔗糖(最终蔗糖20g/L)。在未搅拌情况下，使反应于37℃温育67h。通过在5000xg下离心10min来收集所得的多糖聚合物。小心地滗出上清液。用40mL的无菌水将不溶性聚合物洗涤4次。使所得的变聚糖聚合物冻干48h。使变聚糖聚合物(390mg)悬浮于39mL的无菌水中以制备10mg/mL悬浮液。通过超声处理(40％幅值直至较大团块消失，总计～10min)均化变聚糖悬浮液。将匀化的悬浮液分成等份并在4℃储存。
通过在pH 5.5和37℃下用含有0.5mg/mL变聚糖聚合物(如上所述制备的)的25mMKOAc缓冲液温育合适量的酶，开始突变酶测定。在各个时间点，取出等分试样的反应混合物并用等体积的100mM甘氨酸缓冲液(pH 10)淬灭。通过在14,000xg下离心5min去除各个经淬灭样品中的不溶性材料。通过对羟基苯甲酸酰肼溶液(PAHBAH)(Lever M.，Anal.Biochem.，(1972)47：273-279)测定对各个时间点产生的低聚糖和多糖聚合物的还原端进行定量，并且初始速率由时间过程中最初三个或四个时间点的线性曲线图的斜率来确定。通过将10μL的反应样品上清液添加至100μL的PAHBAH工作溶液中进行PAHBAH测定并在95℃加热5min。通过混合一份试剂A(0.05g/mL对羟基苯甲酸酰肼和5体积％的浓盐酸)与四份试剂B(0.05g/mL NaOH、0.2g/mL酒石酸钾钠)来制备工作溶液。记录410nm处的吸光度，并且通过减去适当的背景吸收并使用各种浓度的葡萄糖(作为标准物)产生的标准曲线来计算还原端的浓度。
测定糖苷健
在使用高灵敏度冷冻探针以500MHz操作的Varian Unity Inova系统(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)上采集一维1H NMR数据。通过将观测发射器频率小心地置于“普氏(presat)”实验的残余水信号的共振处，并然后使用具有完整相位循环(32多次)和10ms的混合时间的“tnnoesy”实验获得水抑制。
通常，将干燥的样品溶解在1.0mL的D2O中并超声波处理30分钟。从样品的可溶部分中，将100μL连同350μL D2O和包含15.3mM DSS(4，4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸钠盐)作为内标和0.29％NaN3作为杀菌剂的100μL D2O一起添加到5mm NMR管中。通过将相应的化学位移处的峰面积积分来测量每种类型的异头键的丰度。每种类型的异头键的百分比由特定键的丰度和来自低聚糖的异头键总丰度计算。
甲基化分析
葡聚糖中糖苷键的分布通过通常称为“甲基化分析”或“部分甲基化分析”的熟知技术来测定(参见：F.A.Pettolino等人，Nature Protocols，(2012)7(9)：1590-1607)。所述技术具有多个细微变化但常常包括：1.将葡萄糖单元的所有游离羟基基团甲基化，2.将甲基化的葡聚糖水解成独立的单体单元；3.还原开环以消除异头物并形成甲基化的葡萄糖醇；异头碳通常用氘原子标记以形成不同的质谱；4.游离羟基基团乙酰化(通过水解和开环形成)以产生部分甲基化的乙酸葡萄糖醇酯，也被称为部分甲基化产物，5.通过与质谱法和/或火焰离子化检测偶联的气相色谱分析所得的部分甲基化产物。
部分甲基化产物包括非还原性末端葡萄糖单元、连接单元和支化点。单独的产物通过保留时间和质谱来识别。部分甲基化产物的分布是每种产物占所有部分甲基化产物的总峰面积的百分比(面积％)。气相色谱条件如下：RTx-225柱(30m×250μm ID×0.1μm膜厚度，Restek Corporation，Bellefonte(PA，USA)，氦载气(0.9mL/min恒定流量)，烘箱温度程序在80℃下起始(保持2分钟)，然后30℃/min至170℃(保持0分钟)，然后4℃/min至240℃(保持25分钟)，1μL进样体积(分成5∶1)，使用电子轰击质谱(全扫描模式)检测。
粘度测量
使用配备有锥体和板状几何形状的TA Instruments AR-G2受控应力旋转流变仪(TA Instruments-Waters，LLC(New Castle，DE)测量可溶性纤维的12重量％水性溶液的粘度。该几何形状由两者均具有光滑表面的40mm 2°的上锥体和peltier下板组成。在测试期间，配备有经水饱和海绵的环境室用于使溶剂(水)蒸发最小化。在20℃下测量粘度。将peltier设置为期望的温度，并使用Eppendorf移液管(Eppendorf North America，Hauppauge，NY)将0.65mL的样品加载到板上。将锥体降低至锥体底部和板之间50μm的间隙。将样品热平衡3分钟。在500-10s-1的剪切速率范围内进行剪切速率扫描。通过在测试结束时运行重复剪切速率点来确认样品稳定性。
测定蔗糖、葡萄糖、果糖和明串珠菌二糖的浓度
通过利用两个串联的Aminex HPX-87C柱(Bio-Rad，Hercules，CA)的HPLC定量蔗糖、葡萄糖、果糖和明串珠菌二糖。所用的色谱条件为在柱和检测器隔室处85℃，在样品和注射器隔室处40℃，流量为0.6mL/min，并且进样体积为10μL。用于数据还原的软件包是来自Waters(Waters Corp.，Milford，MA)的EMPOWERTM版本3。用各种浓度的标准品对每种单独的糖进行校准。
测定低聚糖的浓度
可溶性低聚糖通过利用两个串联Aminex HPX-42A柱(Bio-Rad)的HPLC来定量。所用的色谱条件为85℃柱温和40℃检测器温度，水作为移动相(流量为0.6mL/min)，并且进样体积为10μL。用于数据还原的软件包为来自Waters Corp.的EMPOWERTM版本3。DP2至DP7的低聚糖样品得自Sigma-Aldrich：麦芽七糖(DP7，目录号47872)、麦芽六糖(DP6，目录号47873)、麦芽五糖(DP5，目录号47876)、麦芽四糖(DP4，目录号47877)、麦芽三糖(DP3，目录号47884)和麦芽糖(DP2，目录号47288)。利用各种浓度的标准品对每种单独的低聚糖进行校准。
测定可消化性
可消化性测试规程改编自Megazyme综合总膳食纤维测定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最终酶浓度保持与AOAC方法相同：50单位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，对于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言为3.4单位/mL。如由AOAC方法所推荐的，每种反应中的底物浓度为25mg/mL。每种反应物的总体积为1mL，而不是由初始规程建议的40mL。在具有或不具有两种消化酶的处理的情况下，一式两份分析每种样品。详细方案过程如下：
通过将来自综合总膳食纤维测定盒的20mg纯化的猪胰腺α-淀粉酶(150,000单位/g；AOAC方法2002.01)溶于29mL的马来酸钠缓冲液(50mM，pH 6.0加2mM CaCl2)中并搅动5分钟，之后添加来自相同试剂盒的60uL淀粉葡糖苷酶溶液(AMG，3300单位/mL)来制备酶原液。然后在玻璃小瓶中将0.5mL酶原液与0.5mL可溶性纤维样品(50mg/mL)混合，并将消化反应混合物在振荡培养箱中以轨道运动在37℃和150rpm下温育恰好16h。对于每种纤维样品平行进行重复反应。通过将0.5mL马来酸盐缓冲液(50mM，pH6.0加上2mM CaCl2)和0.5mL可溶性纤维样品(50mg/mL)混合，并且反应混合物在振荡培养箱中以轨道运动在37℃和150rpm下温育恰好16h，一式两份进行对照反应。在16h之后，从培养箱中移除所有样品并且立即添加75μL的0.75M碱性溶液以终止反应。将小瓶立即置于95℃-100℃的加热块中，并且温育20分钟，偶尔振荡(用手)。淬灭之后，每种反应混合物的总体积为1.075mL。如一般方法中所述，通过利用Aminex HPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量每个反应中释放的葡萄糖量。将麦芽糖糊精(DE4-7，Sigma)用作酶的阳性对照。为计算可消化性，使用下式：
可消化性＝100％*[用酶处理后释放的葡萄糖量(mg)-酶不存在时释放的葡萄糖量(mg)]/1.1*总纤维量(mg)”
可溶性低聚糖纤维的纯化
通过尺寸排阻柱层析(SEC)纯化和分离存在于产物混合物中的可溶性低聚糖纤维，所述产物混合物通过在具有或不具有添加的突变酶的情况下使用葡糖基转移酶转化蔗糖制备，如以下实施例中所述。在典型的过程中，将产物混合物在60℃至90℃下热处理15分钟至30分钟，并且然后在4000rpm下离心10分钟。将所得的上清液注入纯化系统(SEC；GE Healthcare Life Sciences)(10mL-50mL注入量)中，所述纯化系统连接至装填有1.1L的Bio-Gel P2凝胶(Bio-Rad，细，45μm-90μm)的GE HK 50/60柱，其使用水作为洗脱剂以0.7mL/min洗脱。使用Bio-Rad HPX-47A柱，通过HPLC分析低聚糖的SEC级分(～5mL/管)。将包含＞DP2低聚糖的级分合并，并通过旋转蒸发合并的级分来分离可溶性纤维，以产生包含3％至6％(重量/重量)固体的溶液，其中将所得的溶液冻干以产生可溶性纤维作为固体产物。
纯培养物在特定碳源上的生长
为测试微生物在特定碳源(低聚糖或多糖可溶性纤维)上生长的能力，选择的微生物在不含除了研究下的碳源之外的碳源的适当培养基中生长。通过在无氧环境(80％N2、10％CO2、10％H2)中在600nm下定期(每30分钟)测量光学密度来评估生长。生长表示为曲线下面积并且与阳性对照(葡萄糖)和阴性对照(不添加碳源)比较。
低聚糖可溶性纤维的原液(10％重量/重量)在脱矿质水中制备。所述溶液通过UV辐射或过滤(0.2μm)来灭菌。将原液冷冻储存直至使用。适当的不含碳源培养基由单一成分制备。测试生物体在具有标准碳源的测试培养基中厌氧预生长。将20μL原液移入蜂窝孔中，并添加180μL不含碳源的培养基与1％测试微生物。作为阳性对照，将葡萄糖用作碳源，并且作为阴性对照，不使用碳源。为确认原液的无菌性，使用未接种的孔。每次运行使用至少三个平行孔。
将蜂窝板置于Bioscreen中，通过测量600nm下的吸光度来测定生长。每30分钟进行测量，并且在测量之前，将板振荡以确保微生物的均匀悬浮。允许生长24小时。结果计算为曲线下面积(即，OD600/24h)。测试的生物体(以及它们的相应生长培养基)为：产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)3626TM(不具有葡萄糖的厌氧强化梭菌培养基(得自Oxoid Microbiology Products，ThermoScientific)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)DSM 1296(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and ZellkulturenDSMZ，Braunschweig，Germany)(不具有葡萄糖的厌氧强化梭菌培养基(得自OxoidMicrobiology Products，Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham，MA))、大肠杆菌(Escherichia coli)11775TM(不具有葡萄糖的厌氧胰酶解酪蛋白大豆肉汤)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)EELA(购自DSMZ(Brauchschweig，Germany))(不具有葡萄糖的厌氧胰酶解酪蛋白大豆肉汤)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM145(不具有葡萄糖的厌氧(de Man、Rogosa和Sharpe)培养基(得自DSMZ))、动物双歧杆菌乳酸亚种Bi-07(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis Bi-07)(厌氧的DeutscheSammlung vom Mikroorgnismen und Zellkulturen培养基58(得自DSMZ)，不具有葡萄糖)。
体外气体产生
为了测量由肠道微生物群形成气体，将预调理的粪便浆液与测试益生元(低聚糖或多糖可溶性纤维)一起温育，并测量形成的气体体积。新鲜粪便材料通过用3份(重量/体积)厌氧模拟培养基稀释，在厌氧条件下搅动1小时并通过0.3-mm金属网过滤，此后将其在37℃厌氧温育24小时来预调理。
所用的模拟培养基如G.T.Macfarlane等人所述组成(Microb.Ecol.35(2)：180-7(1998))，其包含在蒸馏水中的以下成分(g/L)：淀粉(BDH Ltd.)，5.0；蛋白胨，0.05；胰蛋白胨，5.0；酵母提取物，5.0；NaCl，4.5；KCl，4.5；粘蛋白(猪胃III型)，4.0；酪蛋白(BDHLtd.)，3.0；果胶(柑橘)，2.0；木聚糖(oatspelt)，2.0；阿拉伯半乳聚糖(落叶松木)，2.0；NaHCO3，1.5；MgSO4，1.25；瓜耳胶，1.0；菊粉，1.0；半胱氨酸，0.8；KH2PO4，0.5；K2HPO4，0.5；胆汁盐3号，0.4；CaCl2×6H2O，0.15；FeSO4×7H2O，0.005；血红素，0.05；和Tween 80，1.0；半胱氨酸盐酸盐，6.3；Na2S×9H2O和作为持续厌氧条件的指示的0.1％刃天青。将模拟培养基通过0.3mm金属网过滤，并分入密封的血清瓶中。
将测试益生元从10％(重量/重量)原液添加至最终浓度为1％。在37℃下进行温育，同时维持厌氧条件。在使用带刻度的气密玻璃注射器，在24小时温育后手动测量由于微生物活性导致的气体产生，从而也从模拟单元释放过压。
实施例1
在大肠杆菌TOP10中制备GTF-B GI：290580544
使用优化用于在大肠杆菌中表达的密码子(DNA 2.0)合成编码在中识别为GI：290580544的葡糖基转移酶的截短型式(SEQ ID NO：1；来自变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025)的Gtf-B)的多核苷酸。将编码蛋白质“GTF0544”(SEQ IDNO：3)的核酸产物(SEQ ID NO：2)亚克隆到中以生成识别为pMP67的质粒。质粒pMP67用于转化大肠杆菌TOP10以生成识别为TOP10/pMP67的菌株。表达Gtf-B酶“GTF0544”(SEQ ID NO：3)的大肠杆菌菌株TOP10/pMP67的生长和GTF0544活性的测定按照上述方法。
实施例2
在大肠杆菌BL21(DE3)中产生突变酶MUT3264GI：257153264
编码在中识别为GI：257153264(SEQ ID NO：4)的来自腐殖质类芽孢杆菌(Paenibacillus Humicus)NA1123的突变酶的基因由GenScript(GenScript USAInc.，Piscataway，NJ)合成。将编码蛋白质序列(“MUT3264”，SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)亚克隆到pET24a中(Novagen；Merck KGaA，Darmstadt，Germany)。将所得的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中以产生识别为SGZY6的菌株。在以220rpm振荡的情况下，使菌株在37℃下生长至OD600为～0.7，然后使温度降低至18℃并添加IPTG至0.4mM的最终浓度。在通过在4000g下离心收获之前，使培养物生长过夜。将来自600mL培养物的细胞沉淀物悬浮在22mL 50mM KPi缓冲液(pH7.0)中。通过French细胞压碎器(2通道@15,000psi(103.4MPa))破碎细胞；通过离心(SORVALLTMSS34转子，@13,000rpm；ThermoFisher Scientific，Inc.(Waltham，MA))40分钟去除细胞碎片。通过SDS-PAGE分析上清液以确认“mut3264”突变酶的表达并且将粗提取物用于活性测定。不具有突变酶基因的对照菌株通过利用pET24a载体转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞产生。
实施例3
在枯草芽孢杆菌菌株BG6006菌株SG1021-1中产生突变酶MUT3264 GI：257153264
枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株BG6006菌株SG1021-1SG1021-1为枯草芽孢杆菌突变酶表达菌株，其表达来自从发酵的大豆纳豆分离的Paenibacillus humicus NA1123的突变酶。就枯草芽孢杆菌中的重组表达而言，用芽孢杆菌属AprE信号肽(登录号AFG28208；SEQ ID NO：7)替代天然信号肽。将编码MUT3264(SEQ ID NO：8)的多核苷酸可操作地连接在编码芽孢杆菌属表达的MUT3264(如以SEQ ID NO：9提供的)的AprE信号肽(SEQ ID NO：7)的下游。缺失C-端赖氨酸以在编码聚组氨酸标签的序列之前提供终止密码子。
枯草芽孢杆菌宿主BG6006菌株包含9个蛋白酶缺失(amyE：：xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoIIE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)。野生型mut3264(如以 GI：257153264存在)具有1146个氨基酸，其中N端33个氨基酸由SignalP 4.0程序(Nordahl等人，(2011)Nature Methods，8：785-786)推导为天然信号肽。不具有天然信号肽的成熟mut3264由GenScript合成并且可在aprE启动子下克隆到复制性芽孢杆菌pHYT表达载体的NheI和HindIII位点中，并与载体上枯草芽孢杆菌AprE信号肽融合(SEQ ID NO：7)融合。首先将构建体转化到大肠杆菌DH10B中并在含氨苄青霉素(100ug/mL)的LB平板上进行选择。然后将确认的构建体pDCQ931转化到枯草芽孢杆菌BG6006中，并在具有四环素(12.5μg/mL)的LB平板上选择。将所得的枯草芽孢杆菌表达菌株SG1021纯化并将单菌落分离物SG1021-1用作突变酶mut3264的来源。SG1021-1菌株首先在包含10ug/mL四环素的LB中生长，然后传代培养到包含12.5μg/mL四环素的GrantsII培养基中，在37℃下生长2-3天。在15,000g和4℃下使培养物离心30分钟并使上清液过滤通过0.22μm过滤器。将包含MUT3264的经过滤上清液分成等份并在-80℃冷冻。
实施例4
制备突变酶MUT3325 GI：212533325
编码马尔内菲青霉(Penicillium marneffei)18224TM突变酶(中识别为GI：212533325))的基因由GenScript(Piscataway，NJ)合成。将编码蛋白质序列(MUT3325；SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)在SacII和AscI限制性位点处亚克隆进质粒pTrex3(SEQ ID NO：12)，被设计成在CBHI启动子和终止子的控制下，用黑曲霉乙酰胺酶进行选择，在里氏木霉中表达感兴趣的基因的载体。如上文一般方法部分所述，通过基因枪注射将所得的质粒转化到里氏木霉中。基因枪转化的具体方法描述于国际PCT专利申请公布WO2009/126773 A1中。使用具有来自稳定克隆的孢子的1cm2琼脂棒TRM05-3来接种制备培养基(以下所述)。在28℃和220rpm下，使培养物在摇瓶中生长4-5天。为了收获得到分泌的蛋白质，首先通过在4000g下离心10分钟去除细胞群，并使上清液过滤通过0.2μM无菌过滤器。突变酶MUT3325的表达通过SDS-PAGE确认。
以下列出了制备培养基组分。
限定的NREL-Trich乳糖
里氏木霉痕量元素
实施例5
通过发酵制备MUT3325
通过在2L带挡板的烧瓶中用1.0mL的MUT3325表达菌株TRM05-3(实施例4)的冷冻孢子悬浮液接种0.5L的基本培养基来制备发酵种子培养物(基本培养基由5g/L硫酸铵、4.5g/L磷酸二氢钾、1.0g/L七水硫酸镁、14.4g/L无水柠檬酸、1g/L二水氯化钙、25g/L葡萄糖，以及痕量元素(包括0.4375g/L柠檬酸、0.5g/L七水硫酸亚铁、0.04g/L七水硫酸锌、0.008g/L五水硫酸铜、0.0035g/L一水合硫酸锰和0.002g/L硼酸)组成。pH为5.5)。在转移到14L发酵罐中的8L制备培养基之前，使培养物在32℃和170rpm下生长48小时。制备培养基由75g/L葡萄糖、4.5g/L磷酸二氢钾、0.6g/L二水合氯化钙、1.0g/L七水硫酸镁、7.0g/L硫酸铵、0.5g/L无水柠檬酸、0.5g/L七水硫酸亚铁、0.04g/L七水硫酸锌、0.00175g/L五水硫酸铜、0.0035g/L一水合硫酸锰、0.002g/L硼酸和0.3mL/L foam blast 882组成。
对于在34℃和500rpm下于葡萄糖上生长24h的批次，首先运行发酵。在24h结束时，使温度降低至28℃并使搅拌速度增大至1000rpm。然后在0.030g葡萄糖-槐糖固体/g生物质/小时的特定进料速率下，用葡萄糖和槐糖的混合物(62％w/w)进料发酵罐。在运行结束时，通过离心去除生物质，并且使用10-kD分子量截留超滤芯(UFP-10-E-35；GEHealthcare，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)通过超滤将含有突变酶的上清液浓缩约10倍。使浓缩蛋白质于-80℃储存。
实施例6
分离通过GTF-B和MUT3264的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的200mL反应物在37℃下搅动24小时，然后加热至90℃并持续15分钟以使酶失活：100g/L蔗糖，含有来自变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025的GTF-B(GI：290580544；实施例1)的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)，以及含有来自腐殖质类芽孢杆菌(MUT3264，GI：257153264；实施例2)的突变酶的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)在蒸馏的去离子H2O中的溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析可溶性单糖、二糖和低聚糖的所得的上清液，然后通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化132mL的上清液。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩用于通过HPLC进行分析(表1)。
表1：由GTF-B/mut3264突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例7
在大肠杆菌BL21中制备GTF-C GI：3130088
使用优化用于在大肠杆菌中表达的密码子(DNA 2.0，Menlo Park，CA)合成编码在中识别为GI：3130088的葡糖基转移酶(gft)截短型式(SEQ ID NO：13；来自变异链球菌(Streptococcus mutans)MT-4239的GtfC)的基因。将编码变异链球菌GTF0088葡糖基转移酶的截短型式(SEQ ID NO：14)的核酸产物亚克隆到(DNA2.0，Menlo Park CA)中以生成识别为pMP69的质粒(SEQ ID NO：15)。质粒pMP69用于转化大肠杆菌BL21(EMD Millipore，Billerica，MA)以产生识别为BL21-GI3130088的菌株，从而产生变异链球菌 gi：3130088葡糖基转移酶的截短形式；本文也称为“GTF0088”(SEQ ID NO：16)。将来自转化板的单个菌落在含有LB琼脂与100ug/ml氨苄青霉素的平板上划线，并在37℃下温育过夜。将来自平板的单个菌落接种到包含100ug/mL氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃下在220rpm振荡情况下生长3.5小时。将培养物稀释1250倍到包含总计2L的具有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的8个烧瓶中，并在37℃下在220rpm振荡情况下生长4小时。添加IPTG至终浓度为0.5mM，并且使培养物生长过夜，然后通过在9000×g下离心收获。将细胞沉淀物以5ml缓冲液每克湿细胞重量的比率悬浮于50mM KPi缓冲液(pH 7.0)中。细胞通过French细胞压碎器(2通道@16,000psi)破碎，并且通过在25,000×g下离心去除细胞碎片。将不含细胞的提取物储存在-80℃下。
实施例8
在大肠杆菌TOP10中制备变异链球菌LJ23 GTF GI：387786207
如在作为387786207描述的变异链球菌LJ23葡糖基转移酶(gtf)的氨基酸序列以SEQ ID NO：17提供。编码来自变异链球菌LJ23的在中识别为387786207(“GTF6207”)的葡糖基转移酶(gtf)的截短型式(SEQ ID NO：19)的编码序列(SEQID NO：18)通过实施例7中所述的pMP69质粒的诱变来制备。编码GI：387786207(SEQ ID NO：20)的一部分的1630bp DNA片段从GenScript(Piscataway，NJ)订购。所得的质粒(pUC57中的6207f1)用作具有引物8807f1(5’-AATACAATCAGGTGTATTCGACGGATGC-3’；SEQ ID NO：21)和8807r1(5’-TCCTGATCGCTGTGATACGCTTTGATG-3’；SE Q ID NO：22)的PCR的模板。用于扩增的PCR条件如下：1.95℃下2分钟，2.95℃下40秒，3.48℃下30秒，4.72℃下1.5分钟，5.回到步骤2并进行30个循环，6.4℃无限期。反应样品包含0.5uL的在pUC57中6207f1的质粒DNA(90ng)，引物8807f1和8807r1的4uL的混合物(各自40pmol)，5uL的10X缓冲液，2uL 10mMdNTPs混合物，1uL的Pfu Ultra AD(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)和37.5uL去离子水。PCR产物利用GFX PCR DN和凝胶带纯化试剂盒(GE Healthcare Bio-SciencesCorp.，Piscataway，NJ)凝胶纯化。纯化产品用作利用QuikChange Lightning定点诱变试剂盒(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)诱导pMP69的大引物。用于诱导反应的条件如下：1.95℃下2分钟，2.95℃下30秒，3.60℃下30秒，4.68℃下12分钟，5.回到步骤2并进行18个循环，6.68℃下7分钟，7.4℃无限期。反应样品包含1uL的pMP69(50ng)、17uL的PCR产物(500ng)、5uL的10X缓冲液、1.5uL QuikSolution试剂、1uL的dNTP混合物、1uL的QuikChangeLightning酶以及23.5uL去离子水。添加2uL的DpnI并且将混合物在37℃下温育1小时。然后将所得的产物转化到ONE TOP10化学性组分大肠杆菌中(Life Technologies，Grand Island，NY)。来自转化的菌落在包含100ug/mL氨苄青霉素的LB培养基中生长过夜，并用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiaqen，Valencia，CA)分离质粒。进行序列分析以确认编码gi：387786207的基因的存在。将所得的质粒p6207-1(SEQ ID NO：22)转化到大肠杆菌BL21(EMD Millipore，Billerica，MA)中以产生识别为BL21-6207的菌株。将来自平板的单个菌落接种到含有100ug/mL氨苄青霉素的5mL LB培养基中，并在37℃下在220rpm振荡情况下生长8小时。将培养物稀释200倍到包含总计1L的具有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的LB培养基的4个烧瓶中。培养物在通过以9000xg离心收获之前，在33℃下生长过夜。将细胞沉淀物以5mL缓冲液每克湿细胞重量的比率悬浮于50mM KPi缓冲液(pH 7.0)中。细胞通过French细胞压碎器(2通道@16,000psi)破碎，并且通过在25,000×g下离心去除细胞碎片。将不含细胞的提取物储存在-80℃下
实施例9
分离由GTF-C GI：3130088产生的可溶性低聚糖纤维
将包含200g/L蔗糖、大肠杆菌浓缩粗蛋白提取物(10.0％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液的600mL反应物在30℃下搅动22小时，然后加热至90℃并持续10分钟以使酶失活，所述大肠杆菌浓缩粗蛋白提取物包含来自变异链球菌MT-4239 GTF-C的GTF GI：3130088(实施例7)。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖，然后通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化上清液。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩用于通过HPLC进行分析(表2)。
表2：由GTF GI：3130088产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例10
分离由GTF GI：：387786207产生的可溶性低聚糖纤维
将包含200g/L蔗糖、大肠杆菌浓缩粗蛋白提取物(10.0％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液的600mL反应物在37℃下搅动72h，然后加热至90℃并持续10分钟以使酶失活，所述大肠杆菌浓缩粗蛋白提取物包含来自变异链球菌LJ23的GTF6207(SEQ ID NO：19)(实施例8)。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖，然后通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化580mL的上清液。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩用于通过HPLC进行分析(表3)。
表3：由GTF GI：387786207产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例11
由GTF-C和GTF-6207产生的可溶性低聚糖纤维的异头键分析
如实施例6、9和10中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且通过1H NMR谱并通过GC/MS分析所得的固体，如一般方法部分中所述(上文)。这些可溶性低聚糖纤维混合物中每一种的异头键记录在表4和表5中。
表4：通过 1 H NMR谱对可溶性低聚糖的异头键进行分析。
实施例12
由GTF-C和GTF-6207产生的可溶性低聚糖纤维的粘度
将如实施例6、9和10中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且将所得的固体用于制备可溶性纤维的12重量％蒸馏去离子水溶液。如一般方法部分中所述，在20℃下测量可溶性纤维溶液的粘度(以厘泊(cP)为单位记录，其中1cP＝1毫帕斯卡-秒(mPa-s))(表6)。
表6：在20℃下测量的12％(重量/重量)可溶性低聚糖纤维溶液的粘度(ND＝未测 定)。
实施例编号 GTF 粘度(cP)
6 GTF0544/MUT3264 6.7
9 GTF-C GI：3130088 1.8
10 GTF GI：387786207 1.7
实施例13
由GTF-C和GTF-6207产生的可溶性低聚糖纤维的可消化性
将如实施例6、9和10中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量。可消化性测试规程改编自Megazyme综合总膳食纤维测定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最终酶浓度保持与AOAC方法相同：50单位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，对于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言为3.4单位/mL。如由AOAC方法所推荐的，每种反应中的底物浓度为25mg/mL。每种反应物的总体积为1mL。在具有或不具有两种消化酶的处理的情况下，一式两份分析每种样品。如一般方法中所述，通过利用Aminex HPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量释放的葡萄糖量。将麦芽糖糊精(DE4-7，Sigma)用作酶的阳性对照(表7)。
表7：可溶性低聚糖纤维的可消化性。
实施例编号 GTF 可消化性(％)
6 GTF0544/MUT3264 9.0
9 GTF-C GI：3130088 5.6
10 GTF GI：387786207 6.9
实施例14
通过GTF-C或通过GTF-B和MUT3264的组合产生的低聚糖纤维的分子量
如一般方法部分中所述，将如实施例9和实施例6中所述制备的色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且通过SEC色谱分析所得固体的数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、峰值分子量(Mp)、z均分子量(Mz)、和多分散性指数(PDI＝Mw/Mn)(表8)。
表8：通过SEC表征可溶性低聚糖纤维。
实施例14A
构建表达GTF0088的同源基因的枯草芽孢杆菌菌株
将GTF0088酶的氨基酸序列(GI 3130088)用作用BLAST搜索NR数据库(NCBI蛋白数据库的非冗余版本)的查询物。从BLAST搜索中，识别超过60个序列在至少1000个氨基酸的比对长度范围内具有至少80％的同一性。然后使用CLUSTALW比对这些序列。使用DiscoveryStudio，还生成系统发育树。该系统发育树具有三个主要的分支。多于二十几个同系物属于与GTF0088相同的分支。这些序列在～1455残基的比对区中具有介于91.5％-99.5％之间的氨基酸序列同一性，其从GTF0088中的位置1延伸至1455。如实施例10-13中所述，评估同系物之一，GTF6207。通过Genscript合成10个附加的同系物，连同天然密码子中的GTF0088(表9)，其具有N端可变区截短形式。在aprE启动子下将合成基因克隆到枯草芽孢杆菌整合表达质粒p4JH的NheI和HindIII位点中，并且在载体上与枯草芽孢杆菌AprE信号肽融合。在一些情况下，在不具有信号肽的情况下，在aprE启动子下将它们克隆到枯草芽孢杆菌整合表达质粒p4JH的SpeI和HindIII位点中。首先将构建体转化到大肠杆菌DH10B中并在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板上进行选择。然后将经确认的表达特定GTF的构建体转化到包含九个蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌宿主中(amyE：：xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoHE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)并在含氯霉素(5ug/ml)的LB平板上选择。使在含有5ug/ml氯霉素的LB平板上生长的菌落在含25ug/ml氯霉素的LB平板上划线接种几次。使所得的枯草芽孢杆菌表达菌株首先在含5ug/ml氯霉素的LB培养基上生长并然后传代培养到GrantsII培养基中，在30℃下生长2-3天。在4℃下以15,000g使培养物离心30分钟并使上清液过滤通过0.22um过滤器。将过滤后的上清液分成等份并在-80℃下冷冻。
表9：在该应用中测试的具有N端截短形式的GTF0088同系物
在蔗糖转化测定中，测试包含具有N端截短形式的GTF0088同源酶的上清液的活性。三天之后，通过HPLC分析样品。下表示出所有N端截短的同源酶在转化蔗糖时的活性，并且产生的小分子糖和低聚物的特征相似。
实施例14B
构建表达GTF0088的同源基因的C端截短形式的枯草芽孢杆菌菌株
葡糖基转移酶通常包含N-端可变结构域、中间催化结构域、之后是在C端的多个葡聚糖结合结构域。实施例14A中测试的GTF0088同系物全部包含N端可变区截短形式。还制备并评估具有葡聚糖结合结构域的部分的附加C端截短形式的同系物。该实施例描述了表达GTF0088同系物的C端截短形式中的两种的枯草芽孢杆菌菌株的构建体。
将C端T1或T3截短形式制成实施例14A的表中所列的GTF0088、GTF5318、GTF5328和GTF5330。这些T1菌株的核苷酸序列以SEQ ID NO：47-53(奇数)示出；这些T1菌株的氨基酸序列以SEQ ID NO：48-54(偶数)示出。T3菌株的核苷酸序列以SEQ ID NO：55-61(奇数)示出；T3菌株的氨基酸序列以SEQ ID NO：56-62(偶数)示出。编码T1或T3截短形式的DNA片段为从由Genscript提供的合成基因质粒扩增的PCR并且在不具有信号肽的情况下在aprE启动子下克隆到枯草芽孢杆菌整合表达质粒p4JH的SpeI和HindIII位点中。首先将构建体转化到大肠杆菌DH10B中并在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板上进行选择。然后将经确认的表达特定GTF的构建体转化到包含9个蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌宿主菌株中(amyE：：xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoIIE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)并在含氯霉素(5ug/ml)的LB平板上选择。使在含有5ug/ml氯霉素的LB平板上生长的菌落在含25ug/ml氯霉素的LB平板上划线接种几次。使所得的枯草芽孢杆菌表达菌株首先在含5ug/ml氯霉素的LB培养基上生长并然后传代培养到GrantsII培养基中，在30℃下生长2-3天。在4℃下以15,000g使培养物离心30分钟并使上清液过滤通过0.22um过滤器。将过滤后的上清液分成等份并在-80℃下冷冻。
实施例14C
分离通过C-端截短的GTF0088T1产生的可溶性低聚糖纤维
将包含450g/L蔗糖和枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动22h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活，所述枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物包含来自变异链球菌(Streptococcus mutans)MT4239(GI：3130088；实施例14A)的GTF0088的型式，其具有葡聚糖结合结构域的部分的附加C端截短形式(GTF0088-T1，实施例14B)。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表11)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表11)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表11：由GTF0088-T1产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例14D
分离通过C-端截短的GTF5318-T1产生的可溶性低聚糖纤维
将包含450g/L蔗糖和枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动4h，然后加热至90℃并持续30分钟以使酶失活，所述枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物包含来自变异链球菌(Streptococcus mutans)BZ15的GTF5318的型式(GI：440355318；实施例14A)，其具有葡聚糖结合结构域的部分的附加C端截短形式(GTF5318-T1，实施例14A和14B)。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表12)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表12)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表12：由GTF5318-T1产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例14E
分离通过C-端截短的GTF5328-T1产生的可溶性低聚糖纤维
将包含450g/L蔗糖和枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动4h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活，所述枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物包含来自Streptococcus troglodytae Mark的GTF5328的型式(GI：440355328；实施例14A)，其具有葡聚糖结合结构域的部分的附加C端截短形式(GTF5328-T1，实施例14A和14B)。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表13)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表13)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表13：由GTF5328-T1产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例14F
分离通过C-端截短的GTF5330-T1产生的可溶性低聚糖纤维
将包含450g/L蔗糖和枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动4h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活，所述枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物包含来自变异链球菌(Streptococcus mutans)UA113的GTF5330的型式(GI：440355330；实施例14A)，其具有葡聚糖结合结构域的部分的附加C端截短形式(GTF5330-T1，实施例14A和14B)。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表14)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表14)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表14：由GTF5330-T1产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例14G
分离通过C-端截短的GTF5330-T3产生的可溶性低聚糖纤维
将包含450g/L蔗糖和枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅拌4h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活，所述枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物包含来自变异链球菌(Streptococcus mutans)UA113的GTF5330的型式(GI：440355330；实施例14A)，其具有葡聚糖结合结构域的部分的附加C端截短形式(GTF5330-T3，实施例14A和14B)。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表15)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表15)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表15：由GTF5330-T3产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例14H
由C-端截短的GTF-0088同系物产生的可溶性低聚糖纤维的异头键分析
如实施例14C-14G中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且通过1H NMR谱并通过GC/MS分析所得的固体，如一般方法部分中所述(上文)。这些可溶性低聚糖纤维混合物中每一种的异头键记录在表16和表17中，并且与使用非C端截短的GTF0088制备的可溶性低聚糖纤维(实施例9)进行比较。
表16：通过 1 H NMR谱对可溶性低聚糖的异头键进行分析。
实施例14I
可溶性低聚糖纤维的粘度
将如实施例6、9和10中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻千干燥至恒定重量，并且将所得的固体用于制备可溶性纤维的12重量％蒸馏去离子水溶液。如一般方法部分中所述，在20℃下测量可溶性纤维溶液的粘度(以厘泊(cP)为单位记录，其中1cP＝1毫帕斯卡-秒(mPa-s))(表18)。
表18：在20℃下测量的12％(重量/重量)可溶性低聚糖纤维溶液的粘度(ND＝未测 定)。
实施例编号 GTF 粘度(cP)
6 GTF0544/MUT3264 6.7
9 GTF-C GI：3130088 1.8
10 GTF GI：387786207 1.7
14D GTF5318-T1 4.1
14E GTF5328-T1 4.1
14F GTF5330-T1 4.1
14G GTF5330-T3 1.7
实施例14J
由C-端截短的GTF-0088同系物产生的可溶性低聚糖纤维的可消化性
将如实施例14C-14G中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量。可消化性测试规程改编自Megazyme综合总膳食纤维测定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最终酶浓度保持与AOAC方法相同：50单位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，对于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言为3.4单位/mL。如由AOAC方法所推荐的，每种反应中的底物浓度为25mg/mL。每种反应物的总体积为1mL。在具有或不具有两种消化酶的处理的情况下，一式两份分析每种样品。如一般方法中所述，通过使用Aminex HPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量释放的葡萄糖量，并且与使用非C端截短的GTF0088制备的可溶性低聚糖纤维(实施例9)的可消化性进行比较(表19)。
表19：可溶性低聚糖纤维的可消化性。
实施例15
使用可溶性低聚糖/多糖纤维作为碳源的体外气体产生
将通过色谱法纯化的可溶性低聚糖/多糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量。随后，使用如一般方法中所述的方法，评估作为碳源的单独的可溶性低聚糖/多糖可溶性纤维样品的体外气体产生。包括如下物质作为对照碳源：85(可溶性玉米纤维，Tate&Lyle)、 FM06(可溶性玉米纤维或糊精，Roquette)、600F(耐消化麦芽糖糊精，Archer Daniels Midland Company&Matsutani Chemical)、 GR(菊粉，得自Beneo(Mannheim，Germany))、 UltraTM(聚右旋糖，Danisco)、GOS(低聚半乳糖，Clasado Inc.(Reading，UK))、 P95(低聚果糖(果糖低聚糖，FOS，Beneo)，LACTITOL MC(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖醇一水合物，Danisco)和葡萄糖。表20列出了在3h和24h下由肠道微生物群产生的体外气体产量。表21列出了在消化之后3小时、24.5小时和/或26小时时，由使用截短的酶制备的肠道微生物群饲养纤维的体外气体产量对来自对照物质的微生物群摄取的气体产量。
表20：由肠道微生物群产生的体外气体产量。
表21：由肠道微生物群产生的体外气体产量。
实施例16
结肠发酵建模和脂肪酸的测量
使用半连续结肠模拟器对结肠发酵建模，如由等人所述(Nutri.Cancer(2005)52(1)：94-104)；简单来说，结肠模拟器由包含模拟回肠液的四个玻璃容器组成，如Macfarlane等人所述(Microb.Ecol.(1998)35(2)：180-187)。模拟器用新鲜的人粪便微生物群接种，并且每三个小时用新的回肠液喂养，内容物的部分从一个容器转移到下一个容器。回肠液包含浓度为1％的所述测试组分中的一种。所述模拟持续48h，此后收获四个容器的内容物用于进一步分析。进一步分析涉及微生物代谢物诸如短链脂肪酸(SCFA)(也称为挥发性脂肪酸(VFA))和支链脂肪酸(BCFA)的测定。分析如Holben等人(Microb.Ecol.(2002)44：175-185)所述进行；简单来说，将模拟器内容物离心并且将上清液用于SCFA和BCFA分析。将新戊酸(内标)和水与上清液混合并离心。离心后，向上清液中添加草酸溶液，并且然后将混合物在4℃下温育，并且然后再次离心。通过使用火焰离子化检测器和氦气作为载气的气相色谱来分析所得的上清液。还提供由 ULTRATM(聚右旋糖，Danisco)、 P95(低聚果糖；果糖低聚糖，“FOS”，Beneo)、乳糖醇(Lactitol MC(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖醇一水合物，Danisco)、和阴性对照的样品产生的比较数据。测定乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸和乳酸的浓度(表22)。
实施例17
制备酸乳-可饮用沙冰
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备酸乳-可饮用沙冰。
表23：
成分 wt％
蒸馏水 49.00
Supro XT40大豆蛋白分离物 6.50
果糖 1.00
Grindsted ASD525，Danisco 0.30
苹果汁浓缩物(70Brix) 14.79
草莓果泥，单一强度 4.00
香蕉果泥，单一强度 6.00
简单的低脂酸乳-希腊风格，Cabot 9.00
1％Red 40Soln 0.17
草莓风味剂(DD-148-459-6) 0.65
香蕉风味剂(#29513) 0.20
75/25苹果酸/柠檬酸共混物 0.40
本发明可溶性纤维样品 8.00
总计 100.00
实施例18
纤维水制剂的制备
以下实施例描述了利用本发明纤维制备纤维水。
表24：
成分 wt％
水，去离子的 86.41
淡黄绿色号06509 0.00
本发明可溶性纤维样品 8.00
蔗糖 5.28
柠檬酸 0.08
风味剂(M748699M) 0.20
维生素C，抗坏血酸 0.02
总计 100.00
实施例19
可勺性酸奶制剂的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备可勺性酸奶。
表25：
成分 wt％
脱脂乳 84.00
糖 5.00
酸乳(6051) 3.00
培养物(添加至pH断点)
本发明可溶性纤维 8.00
总计 100.00
实施例20
模型干棒小吃的制剂的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备模型干棒小吃。
表26：
实施例21
高纤维片的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备高纤维片。
表27：
1-Danisco.
实施例22
软巧克力碎片曲奇的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备软巧克力碎片曲奇。
表28：
实施例23
减脂油酥松饼(REDUCED FAT SHORT-CRUST PASTRY)的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备减脂油酥松饼。
表29：
成分 wt％
面粉，清蛋白液 56.6
水 15.1
人造黄油 11.0
酥油 11.0
本发明纤维 6.0
盐 0.3
实施例24
低糖谷物簇(LOW SUGAR CEREAL CLUSTER)的制备
以下实施例描述了利用本发明纤维中的一种制备低糖谷物簇。
表30：
成分 wt％
糖浆粘结剂 30.0
乳糖醇，MC 50％
本发明纤维溶液(70Brix)25％
水25％
谷物混合物 60.0
燕麦片70％
片状燕麦10％
酥脆米10％
燕麦片10％
植物油 10.0
实施例25
果胶冻的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备果胶冻。
表31：
实施例26
橡皮糖(CHEWY CANDY)的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备橡皮糖。
表32：
成分 wt％
本发明葡聚糖纤维 35
木糖醇 35
水 10
植物脂肪 4.0
甘油单硬脂酸酯(GMS) 0.5
卵磷脂 0.5
明胶180块(40％溶液) 4.0
木糖醇，CM50 10.0
风味剂、着色剂和酸 q.s.
实施例27
咖啡-樱桃冰淇淋的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备咖啡-樱桃冰淇淋。
表33：
1-Danisco.

Claims (15)

1.一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其包含：
a.至少75％的α-(1，3)糖苷键；
b.少于25％的α-(1，6)糖苷键；
c.少于10％的α-(1，3，6)糖苷键；
d.小于5000道尔顿的重均分子量；
e.在20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
f.在4至40范围内的右旋糖当量(DE)；以及
g.小于12％的可消化性，如由分析化学师协会(Association of AnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所测量的；
h.在25℃下，在水中至少20％(w/w)的溶解度；以及
i.小于5的多分散指数。
2.一种碳水化合物组合物，其包含：0.01重量％至99重量％(基于干固体)的根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
3.一种食物产品，其包含根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物或根据权利要求2所述的碳水化合物组合物。
4.一种制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii至少一种葡糖基转移酶，所述葡糖基转移酶能够催化具有至少75％的α-(1，3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；
iii.至少一种α-葡聚糖水解酶，所述α-葡聚糖水解酶能够水解具有一个或多个α-(1，3)糖苷键或者一个或多个α-(1，6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并，由此制备包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的产物；以及
c.任选地，将所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物与步骤(b)的所述产物分离。
5.一种制备根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii至少一种葡糖基转移酶，所述葡糖基转移酶能够催化具有至少75％的α-(1，3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；
iii.至少一种α-葡聚糖水解酶，所述α-葡聚糖水解酶能够水解具有一个或多个α-(1，3)糖苷键或者一个或多个α-(1，6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并以形成单一反应混合物，由此形成包含葡萄糖低聚物的产物混合物；
c.将根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与包含葡萄糖低聚物的产物混合物分离；以及
d.任选地，将所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并包括将食物产品内的反应组分的系列合并。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述至少一种葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：153具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述至少一种α-葡聚糖水解酶为突变酶，并且所述至少一种葡糖基水解酶和至少一种突变酶包含氨基酸序列以及它们的截短形式，所述氨基酸序列与选自以下序列的组合的序列具有至少90％的同一性：
a.葡糖基转移酶GTF7527(SEQ ID NO：3、5或它们的组合)和突变酶MUT3325(SEQ IDNO：27)；
b.葡糖基转移酶GTF7527(SEQ ID NO：3、5或它们的组合)和突变酶MUT3264(SEQ IDNO：21、22、24或它们的任意组合)；
c.葡糖基转移酶GTF0459(SEQ ID NO：17、19或它们的组合)或它们的同系物(SEQ IDNO：88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112或它们的组合)和突变酶MUT3325(SEQ ID NO：27)；以及
d.葡糖基转移酶GTF0459(SEQ ID NO：17、19或它们的组合)或它们的同系物(SEQ IDNO：88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112或它们的组合)和突变酶MUT3264(SEQ ID NO：21、22、24或它们的任意组合)。
9.一种制备根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii至少一种葡糖基转移酶，所述葡糖基转移酶能够催化具有一个或多个α-(1，3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；以及
iii.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并以形成单一反应混合物，其中所述反应条件包括大于45℃并且小于55℃的反应温度，由此形成包含葡萄糖低聚物的产物混合物；
c.将根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与包含葡萄糖低聚物的产物混合物分离；以及
d.任选地，将所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
10.一种用于制备共混碳水化合物组合物的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与下列物质合并：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、乙酰磺胺酸钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麦芽糖糊精、淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糖糊精、支链麦芽糖糊精、菊粉、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龙胆糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、低聚异麦芽糖、填料、赋形剂、粘结剂或它们的任意组合。
11.一种减小食品或饮料的血糖指数的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物掺入食品或饮料中。
12.一种在哺乳动物中抑制血糖水平升高、降低脂质水平、治疗便秘、或改变脂肪酸产生的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤。
13.一种化妆品组合物、药物组合物或低生龋性组合物，其包含根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
14.根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物在适用于被动物、包括人类食用的食品组合物中的用途。
15.一种组合物，其包含0.01重量％至99重量％(基于干固体)的根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物以及：合生素、肽、肽水解产物、蛋白质、蛋白质水解产物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、维生素、矿物质、草药、草药提取物、脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)、植物甾类、甜菜碱、类胡萝卜素、消化酶、益生菌生物或它们的任意组合。
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