CN107556361A - 裂环羽扇豆烷衍生物及其抗肿瘤用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类裂环羽扇豆烷衍生物、含其的药物组合物及其在抗肿瘤中的用途。本发明通过半合成的方法，改变了以往天然产物的结构限制，设计并合成了一系列裂环羽扇豆烷衍生物，并通过体外和体内抗肿瘤试验验证具有良好的抗肿瘤活性，可以通过进一步的实验研究将此类化合物应用于抗肿瘤药物的研发。

Description

裂环羽扇豆烷衍生物及其抗肿瘤用途

技术领域

本发明涉及中药领域，特别涉及一类裂环羽扇豆烷衍生物、含其的药物组合物及其在抗肿瘤中的用途。

背景技术

肿瘤（tumour）是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物（neogrowth），因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物（neoplasm）。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，而癌症即为恶性肿瘤的总称。癌症是严重威胁人类生命和社会发展的重大疾病，运用科学的方法对癌症进行预防控制已成为全球最重要的公共卫生问题之一。近几十年来，随着疾病模式的转变和人口老龄化趋势，我国癌症负担日益增加，癌症防治面临严峻的形势。我国三次全国范围内的死因调查数据显示，近30年，中国癌症在死因中的构成比由20世纪70年代的10.13%上升至22.32%，死亡率由73.99/10万上升至135.88/10万。在城市地区，癌症列居全死因的第一位，而在农村地区，列居全死因的第二位。癌症死亡率升高的主要原因与人口老龄化、微生物感染、吸烟、饮食变化、活动减少及肥胖增加等相关。位居我国癌症发病前十位的癌症依次是肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌、女性乳腺癌、胰腺癌、淋巴瘤、膀胱癌和甲状腺癌，占全部癌症发病的76.39%。位居我国癌症死亡前十位的癌症依次是：肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病、脑瘤和淋巴瘤，占全部癌症死亡的84.27%。因此，提高肿瘤的治疗能力，寻找有效的治疗药物意义重大。

羽扇豆烷型（lupane type）三萜及其皂苷主要分布于豆科、五加科、葫芦科、石竹科、伞形科、桦木科、木犀科、卫矛科等植物中。现代药理研究表明，该类化合物具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗菌、提高免疫力等作用，对脂多糖诱导的肝炎、肺炎等亦具有很好的保护作用。近年来，越来越多结构复杂、新颖的羽扇豆烷型三萜被发现。骨架上不同位置的取代、环裂解、降碳、重排等类型的新三萜化合物及多个糖连接的复杂三萜皂苷的发现及活性研究，已经成为天然产物研究的研究热点。尤其是20世纪80年代以来，随着提取分离技术的不断进步和波谱技术的快速发展，羽扇豆烷型三萜化合物的结构研究取得了突飞猛进的发展，1991-2010年二十年间共发现新羽扇豆烷型三萜化合物200余个，其中糖苷类化合物50余个。

本发明所涉及的裂环羽扇豆烷衍生物既是上述羽扇豆烷型三萜类化合物中的一种特殊的3,4-裂环3,11-环合羽扇豆烷型三萜类衍生物，在此结构基础上，运用化学手段进行结构修饰和改造，形成了一类具有优秀抗肿瘤活性的裂环羽扇豆烷衍生物。本发明涉及了该类裂环羽扇豆烷衍生物、含其的药物组合物及其在抗肿瘤中的用途。

发明内容

基于以上原因及理由，本发明的目的之一是合成一系列3,4-裂环3,11-环合羽扇豆烷衍生物，为开发抗肿瘤药物奠定基础。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

裂环羽扇豆烷衍生物，结构如通式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ所示：

其中，R1为H或1-10个碳的烷基或1-12个碳的芳基或1-3个糖；R2为H或1-10个碳的烷基或1-10个碳的酰基或1-3个糖；R3为H或1-10个碳的烷基或1-10个碳的酰基或1-3个糖。

以及上述裂环羽扇豆烷衍生物或其在药学上可以接受的盐。

本发明进一步优选包括以下具体的化合物或其药学上可接受的盐：

术语说明：1.本文所用术语“芳基”是指5到12个碳原子的全碳单环或稠合多环基团，或含有N、O、S等杂原子的单环或稠合多环基团，具有完全共轭的π电子系统；芳环的非限制性实例有：苯环、萘环和蒽环；芳环可以是无取代或取代的；芳环的取代基选自卤素、硝基、氨基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、卤代C3-C6环烷基。2.本文所用术语“糖”是指五碳糖、六碳糖及其衍生物。3.本文所用术语“烷基”是指直链、支链或环状的饱和程度不等的烷烃基团、烯烃基团、炔烃基团；烷基可以是无取代或取代的；烷基的取代基选自卤素、硝基、氨基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、卤代C3-C6环烷基。4.本文所用术语“酰基”是指直链、支链或环状的饱和程度不等的酰基基团；酰基可以是无取代或取代的；酰基的取代基选自卤素、硝基、氨基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、卤代C3-C6环烷基。

本发明的第二个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种活性组分以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述的活性组分可以是本发明的裂环羽扇豆烷衍生物、所述衍生物的光学异构体、所述衍生物或其光学异构体在药学上可接受的盐、所述衍生物或其光学异构体的溶剂合物中的任意一种或任意多种。

所述载体包括药学领域的常规稀释剂，赋形剂，填充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体，润滑剂等，必要时还可以加入香味剂，甜味剂等。本发明药物可以制成片剂，粉剂，粒剂，胶囊，口服液及注射用药等多种形式，上述各剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明还提供所述的衍生物、及其光学异构体或其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备抗肿瘤药物中的用途。所述的肿瘤为肝癌、乳腺癌、肉瘤、肺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胰腺癌、血癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、头癌、颈癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、睾丸癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌、颊癌、口腔癌、胃肠道间质瘤、皮肤癌、多发性骨髓瘤。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

运用半合成的方式得到了一系列具有优秀抗肿瘤活性的裂环羽扇豆烷衍生物，并在体外和体内验证了其抗肿瘤活性，可以通过进一步的实验将此类化合物应用于抗肿瘤药物研究。

附图说明

图1：裂环羽扇豆烷衍生物的10个结构类型；

图2：裂环羽扇豆烷衍生物的14个具体化合物；

图3：裂环羽扇豆烷衍生物的合成路线图。

具体实施方式

为了更详细的说明本发明，给出下述制备实例。但本发明的范围并不局限于此。

实施例1：裂环羽扇豆烷衍生物的合成

1.1仪器与试剂

¹HNMR核磁共振谱采用Bruker AVII 500型超导核磁共振仪；HRMS质谱采用UPLC-XevoG₂-S QTOF-MS/MS。衍生物1实验室自制（纯度≥98%），其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2衍生物的合成

1.2.1衍生物2的合成

将衍生物1（484.0mg, 1.0mmol）溶于50mL二氯甲烷中，加入乙酰丙酮氧钒（26.0mg，0.1mmol），搅拌均匀后加入70%叔丁基过氧化氢水溶液（413μL，3mmol），室温下反应3小时，加入30mL碳酸氢钠水溶液，搅拌15分钟，用乙酸乙酯30mL萃取3次，合并有机层，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂得到衍生物2 (收率95%) 490mg。

1.2.2衍生物4的合成

将衍生物2（412.0mg, 0.8mmol）溶于含10mL 5%盐酸85%乙醇水溶液中，搅拌反应4h，减压回收溶剂，得到固体粉末，硅胶柱层析分离，得到衍生物4 (收率85%) 375mg。

1.2.3衍生物5、7、8、9的合成

将衍生物4（332.0mg, 0.8mmol）溶于含35%醋酐的10mL乙醇溶液中，加热回流6h，加入碳酸氢钠中和反应液使pH6-7，减压回收溶剂，得到固体粉末，硅胶柱层析分离，分别得到衍生物5 (收率24%) 76mg，衍生物7 (收率45%) 145mg，衍生物8 (收率15%) 47mg，衍生物9(收率10%) 32mg。

1.2.4衍生物3的合成

将衍生物1（484.0mg, 1.0mmol）溶于20mL的10%氢氧化钠甲醇中，加热回流2h，加入盐酸中和反应液使pH6-7，减压回收溶剂，得到固体粉末，硅胶柱层析分离，得到衍生物3 (收率93%) 467mg。

1.2.5衍生物6、10的合成

将衍生物3（352.0mg, 0.7mmol）溶于含35%醋酐的10mL乙醇溶液中，加热回流10h，加入碳酸氢钠中和反应液使pH6-7，减压回收溶剂，得到固体粉末，硅胶柱层析分离，分别得到衍生物6 (收率60%) 231mg，衍生物10 (收率33%) 125mg。

1.2.6衍生物1a的合成

将衍生物1（484.0mg，1.0mmol）溶于10mL二氯甲烷中，加入EDCI（287.5mg，1.5mmol）和DMAP（18.3mg，0.15mmol），搅拌溶解，加入对羟基苯甲醇（148.8mg，1.2mmol），加热回流3h，减压回收溶剂，得到固体粉末，硅胶柱层析分离，得主产物28-对羟基苯甲醇基-1酯519.2mg（收率88%）；将28-对羟基苯甲醇基-1酯（354.0mg，0.6mmol）溶于10mL二氯甲烷中，加入EDCI（172.5mg，0.9mmol）和DMAP（0.6mg，0.09mmol），搅拌溶解，加入三氯乙酸（129.6mg，0.8mmol），加热回流3h，减压回收溶剂，得到固体粉末，硅胶柱层析分离，得主产物28-对羟基苯甲醇基-1酯367.0mg（收率83%）。

1.2.7衍生物2a的合成

将衍生物2（516.0mg，1.0mmol）溶于10mL无水乙醇中，加入EDCI（287.5mg，1.5mmol）和DMAP（18.3mg，0.15mmol），加热回流3h，减压回收溶剂，硅胶柱层析分离，得主产物28-乙基-2酯540 mg（收率99.3%）；将28-乙基-2酯（435.2mg，0.8mmol）溶于10mL二氯甲烷中，加入EDCI（230.0mg，1.2mmol）和DMAP（14.6mg，0.12mmol），搅拌溶解，加入N-乙酰甘氨酸（117.0mg，1.0mmol），加热回流4h，减压回收溶剂，得到固体粉末，硅胶柱层析分离，得主产物2a 498.0mg（收率87.3%）。

1.2.8衍生物3a的合成

将衍生物3（502.0mg，1.0mmol）和氢氧化钠（48mg，1.2mmol）加入5mL水中，搅拌1h，过滤，滤液加入45无水乙醇中，搅拌10min，过滤，滤液浓缩至干，得3a 523 mg（收率95.8%）。

1.2.9衍生物4a的合成

将衍生物4（552.0mg，1.0mmol）溶于10mL DMSO中，加入葡萄糖（540.0mg，3.0mmol）和对甲苯磺酸（5.2mg，0.03mmol），130℃反应5h，冷却至室温，反应液过大孔吸附树脂柱色谱，水洗，醇洗，收集醇洗脱液，减压回收溶剂，硅胶柱层析分离，得4a 685 mg（收率76.6%）。

部分合成衍生物的结构及波谱数据如下：

衍生物1：分子式：C₃₀H₄₄O₅. MS：[M]⁺ 484.31969. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ3.85(1H, d,8.0, 1-H), 2.95(1H, dd, 8.0,14.5, 2α-H), 3.18 (1H, d, 14.4, 2β-H), 2.93(1H,d, 8.5, 9-H), 4.71(1H, ddd, 8.9,8.9,8.9, 11-H), 3.62(1H, ddd, 4.5,8.9,11.0,19-H), 5.10(1H, s, 23a-H), 5.24(1H, s, 23b-H), 1.85(3H, s, 24-H), 1.05(3H, s,25-H), 1.08(3H, s, 26-H), 1.18(3H, s, 27-H), 4.83(1H, s, 29a-H), 5.02(1H, s,29b-H), 1.73(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物2：分子式：C₃₀H₄₄O₇. MS：[M]⁺ 516.30658. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ3.83(1H, d,8.1, 1-H), 2.94(1H, dd, 8.1,14.3, 2α-H), 3.15 (1H, d, 14.2, 2β-H), 2.95(1H,d, 8.3, 9-H), 4.73(1H, ddd, 8.6,8.6,8.6, 11-H), 3.65(1H, ddd, 4.3,8.5,11.0,19-H), 3.13(1H, s, 23-H), 1.98(3H, s, 24-H), 1.06(3H, s, 25-H), 1.09(3H, s,26-H), 1.21(3H, s, 27-H), 3.03(1H, s, 29-H), 1.89(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物3：分子式：C₃₀H₄₆O₆. MS：[M]⁺ 502.32782. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ4.35(1H, d,8.2, 1-H), 3.25(1H, dd, 8.0,14.7, 2α-H), 3.98 (1H, d, 14.8, 2β-H), 2.98(1H,d, 8.5, 9-H), 4.41(1H, ddd, 8.4,8.4,8.4, 11-H), 3.56(1H, ddd, 4.5,8.9,11.0,19-H), 5.13(1H, s, 23a-H), 5.26(1H, s, 23b-H), 1.84(3H, s, 24-H), 1.07(3H, s,25-H), 1.09(3H, s, 26-H), 1.21(3H, s, 27-H), 4.89(1H, s, 29a-H), 5.12(1H, s,29b-H), 1.77(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物4：分子式：C₃₀H₄₈O₉. MS：[M]⁺ 552.33012. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ3.89(1H, d,8.1, 1-H), 2.87(1H, dd, 8.1,14.3, 2α-H), 3.25 (1H, d, 14.2, 2β-H), 2.83(1H,d, 8.3, 9-H), 4.72(1H, ddd, 8.6,8.6,8.6, 11-H), 3.68(1H, ddd, 4.3,8.5,11.0,19-H), 3.78(1H, s, 23-H), 1.93(3H, s, 24-H), 1.03(3H, s, 25-H), 1.04(3H, s,26-H), 1.17(3H, s, 27-H), 3.63(1H, s, 29-H), 1.91(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物5：分子式：C₃₀H₄₆O₈. MS：[M]⁺ 534.31918. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ3.81(1H, d,8.1, 1-H), 2.82(1H, dd, 8.1,14.3, 2α-H), 3.23 (1H, d, 14.2, 2β-H), 2.81(1H,d, 8.3, 9-H), 4.73(1H, ddd, 8.6,8.6,8.6, 11-H), 3.64(1H, ddd, 4.3,8.5,11.0,19-H), 3.77(1H, s, 23-H), 1.95(3H, s, 24-H), 1.05(3H, s, 25-H), 1.07(3H, s,26-H), 1.15(3H, s, 27-H), 3.66(1H, s, 29-H), 1.93(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物6：分子式：C₃₀H₄₈O₉. MS：[M]⁺ 552.32871. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ3.89(1H, d,8.1, 1-H), 2.85(1H, dd, 8.1,14.3, 2α-H), 3.27 (1H, d, 14.2, 2β-H), 2.85(1H,d, 8.3, 9-H), 4.91(1H, ddd, 8.6,8.6,8.6, 11-H), 3.63(1H, ddd, 4.3,8.5,11.0,19-H), 3.71(1H, s, 23-H), 1.95(3H, s, 24-H), 1.07(3H, s, 25-H), 1.09(3H, s,26-H), 1.17(3H, s, 27-H), 3.67(1H, s, 29-H), 1.95(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物7：分子式：C₃₀H₄₆O₈. MS：[M]⁺ 534.31958. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ3.83(1H, d,8.1, 1-H), 2.85(1H, dd, 8.1,14.3, 2α-H), 3.23 (1H, d, 14.2, 2β-H), 2.82(1H,d, 8.3, 9-H), 4.74(1H, ddd, 8.6,8.6,8.6, 11-H), 3.65(1H, ddd, 4.3,8.5,11.0,19-H), 1.96(3H, s, 24-H), 1.06(3H, s, 25-H), 1.08(3H, s, 26-H), 1.16(3H, s,27-H), 3.69(1H, s, 29-H), 1.92(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物8：分子式：C₃₀H₄₆O₈. MS：[M]⁺ 534.32015. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ3.87(1H, d,8.1, 1-H), 2.88(1H, dd, 8.1,14.3, 2α-H), 3.24 (1H, d, 14.2, 2β-H), 2.84(1H,d, 8.3, 9-H), 4.73(1H, ddd, 8.6,8.6,8.6, 11-H), 3.46(1H, ddd, 4.3,8.5,11.0,19-H), 3.78(1H, s, 23-H), 1.95(3H, s, 24-H), 1.04(3H, s, 25-H), 1.05(3H, s,26-H), 1.19(3H, s, 27-H), 3.69(1H, s, 29-H), 1.95(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物9：分子式：C₃₀H₄₄O₇. MS：[M]⁺ 516.30934. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ3.84(1H, d,8.1, 1-H), 2.84(1H, dd, 8.1,14.3, 2α-H), 3.25 (1H, d, 14.2, 2β-H), 2.84(1H,d, 8.3, 9-H), 4.76(1H, ddd, 8.6,8.6,8.6, 11-H), 3.47(1H, ddd, 4.3,8.5,11.0,19-H), 3.79(1H, s, 23-H), 1.94(3H, s, 24-H), 1.03(3H, s, 25-H), 1.04(3H, s,26-H), 1.21(3H, s, 27-H), 3.71(1H, s, 29-H), 1.97(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物10：分子式：C₃₀H₄₆O₈. MS：[M]⁺ 534.32075. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ3.91(1H,d, 8.1, 1-H), 2.87(1H, dd, 8.1,14.3, 2α-H), 3.29 (1H, d, 14.2, 2β-H), 2.87(1H, d, 8.3, 9-H), 4.98(1H, ddd, 8.6,8.6,8.6, 11-H), 3.48(1H, ddd, 4.3,8.5,11.0, 19-H), 3.73(1H, s, 23-H), 1.97(3H, s, 24-H), 1.06(3H, s, 25-H), 1.08(3H, s, 26-H), 1.15(3H, s, 27-H), 3.73(1H, s, 29-H), 1.98(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物1a：分子式：C₃₉H₄₉Cl₃O₇. MS：[M]⁺ 734.25439. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ4.75(1H, d, 8.0, 1-H), 2.66(1H, dd, 8.0,14.5, 2α-H), 3.05 (1H, d, 14.4, 2β-H),2.95(1H, d, 8.5, 9-H), 4.73(1H, ddd, 8.9,8.9,8.9, 11-H), 3.64(1H, ddd, 4.5,8.9,11.0, 19-H), 5.12(1H, s, 23a-H), 5.23(1H, s, 23b-H), 1.87(3H, s, 24-H),1.06(3H, s, 25-H), 1.09(3H, s, 26-H), 1.19(3H, s, 27-H), 4.89(1H, s, 1’-H),7.33(2H, d, 12.4, 2’’,6’’-H), 6.86(2H, d, 12.4, 3’’,5’’-H), 4.85(1H, s, 29a-H), 5.05(1H, s, 29b-H), 1.75(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物2a：分子式：C₃₀H₄₄O₇. MS：[M]⁺ 516.30658. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ3.83(1H,d, 8.1, 1-H), 2.94(1H, dd, 8.1,14.3, 2α-H), 3.15 (1H, d, 14.2, 2β-H), 2.95(1H, d, 8.3, 9-H), 4.73(1H, ddd, 8.6,8.6,8.6, 11-H), 3.65(1H, ddd, 4.3,8.5,11.0, 19-H), 3.13(1H, s, 23-H), 1.98(3H, s, 24-H), 1.06(3H, s, 25-H), 1.09(3H, s, 26-H), 1.21(3H, s, 27-H), 3.03(1H, s, 29-H), 1.89(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物3a：分子式：C₃₀H₄₄O₆Na₂. MS：[M]⁺ 546.29561. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ4.37(1H, d, 8.2, 1-H), 3.29(1H, dd, 8.0,14.7, 2α-H), 3.95 (1H, d, 14.8, 2β-H),2.91(1H, d, 8.5, 9-H), 4.43(1H, ddd, 8.4,8.4,8.4, 11-H), 3.58(1H, ddd, 4.5,8.9,11.0, 19-H), 5.15(1H, s, 23a-H), 5.29(1H, s, 23b-H), 1.86(3H, s, 24-H),1.09(3H, s, 25-H), 1.11(3H, s, 26-H), 1.23(3H, s, 27-H), 4.91(1H, s, 29a-H),5.14(1H, s, 29b-H), 1.78(3H, s, 30-H), 及其它信号.

衍生物4a：分子式：C₄₂H₇₀O₂₀. MS：[M]⁺ 894.45509. ¹HNMR（500MHz，MeOD）：δ5.46(1H,d, 9.8, glc-1), 5.35(1H, d, 9.5, glc-1’), 4.37(1H, d, 8.2, 1-H), 3.24(1H, dd,8.0,14.7, 2α-H), 3.95 (1H, d, 14.8, 2β-H), 2.92(1H, d, 8.5, 9-H), 4.44(1H,ddd, 8.4,8.4,8.4, 11-H), 3.68(1H, ddd, 4.3,8.5,11.0, 19-H), 3.89(1H, s, 23-H), 1.93(3H, s, 24-H), 1.03(3H, s, 25-H), 1.04(3H, s, 26-H), 1.17(3H, s, 27-H), 3.85(1H, s, 29-H), 1.91(3H, s, 30-H), 及其它信号.

实施例2：裂环羽扇豆烷衍生物的体外抗肿瘤活性

2.1仪器与试剂：

胎牛血清，0.25％胰酶-EDTA，PBS：美国Life Technologies公司；RMPI-1640培养基：吉诺生物医药技术有限公司；CO₂培养箱：美国Thermo scientific公司；Spectramax M3酶标仪：美国Molecular Devices公司；细胞培养板：美国corning公司。

2.2实验步骤：

2.2.1消化肿瘤细胞，调整细胞浓度为6×10⁴/mL，96孔板中每孔加100μL(每孔含6000个细胞)，37℃、5％CO2培养24h后进行下一步试验；

2.2.2分组:空白对照；缬草素阳性对照；0.5μM、5μM和50μM药物处理组；

2.2.3用含不同浓度药物的培养基预处理肿瘤细胞，48h后，吸弃含药培养基；

2.2.4每孔加入60μL预冷的10％三氯乙酸置于4℃冰箱固定1h。用水洗5遍后烘干，加入由1％冰醋酸配制的4mg/mL的SRB溶液50μL，染色20min。弃去SRB染液用1％冰醋酸洗5遍，烘干后加入150μL 10mM Tris-base，轻微振荡使晶体完全溶解，用酶标仪于515nm处测定每孔的吸光度(OD值)，计算3个复孔的平均值和标准差。

2.3实验结果：通过在乳腺癌、胃癌、肺癌和胰腺癌共4个细胞株上得到的结果，所制备的裂环羽扇豆烷衍生物1-10,1a-4a对以上细胞株均表现出了较好的抗肿瘤活性，如表1所示。

表1 裂环羽扇豆烷衍生物的IC₅₀值（μmol/L）

实施例3：裂环羽扇豆烷衍生物的体内抗肿瘤活性

3.1仪器与试剂：ICR雄性小鼠，SPF级，体质量18～22 g，由长春市亿斯实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（吉）-2011-0004。H₂₂肝癌细胞株（中国科学院上海细胞所），经本实验室传代保存。注射用环磷酰胺，江苏盛迪医药；其他试剂均为国产分析纯。电子天平（AE224型），上海舜宇恒平科学仪器；-80 ℃超低温冰箱（DW-HL398S型），中科美菱低温科技；超净工作台，美国BEKMAN公司。

3.2 造模、分组及给药：取冻存的H₂₂肝癌细胞，复苏，0.9%NaCl溶液混悬，小鼠腹腔注射，连续传两代。无菌条件下吸取肝癌种鼠腹水，用0.9%NaCl溶液稀释，调整至细胞数为的1×10⁷（个/ml）的H₂₂肝癌细胞悬液，0.2%台盼蓝染色检查活细胞数，活细胞率大于95%时用于实验。于小鼠左前肢腋窝皮下接种0.2 ml，完成H₂₂荷瘤小鼠模型的建立。全程严格无菌操作。

小鼠自由饮水、进食，适应性喂养1周。接种后第2天，将所有小鼠随机分为6组，空白组、模型组、环磷酰胺(CTX)组、裂环羽扇豆烷衍生物低、高剂量组，每组10只。每日给药1次，连续给药10天。阳性药：CTX 25 μg/g，静脉注射给药；裂环羽扇豆烷衍生物给药剂量：低30 μg/g、高120 μg/g，静脉注射给药；空白组和模型组：医用0.9%NaCl溶液，静脉注射给药；各组均按每10 g体质量0.1 ml的剂量给药。

3.3 取材及指标检测

3.3.1 H₂₂肝癌小鼠一般状况 观察小鼠的自主活动、精神状态、毛发光泽、饮食，并比较各组小鼠肿块大小和体重的变化。

3.3.2 瘤重及抑瘤率 末次给药后，禁食不禁水12 h，称重，摘眼球采全血后，颈椎脱臼处死小鼠，并完整剥离出移植瘤，称重，计算肿瘤抑制率=（模型组平均瘤质量－实验组平均瘤质量）/模型组平均瘤重×100%。

3.4 结果

3.4.1对小鼠一般状况的影响 与模型组比较，CXT组小鼠瘤体增长较缓慢，但体质量下降明显，精神、食量较模型组差，皮毛稀疏脱落，无光泽，少动；裂环羽扇豆烷各衍生物组瘤体增长慢，活跃，毛色柔顺有光泽。

3.4.2对小鼠肿瘤及抑瘤率的影响 与模型组比较，CXT组和裂环羽扇豆烷各衍生物组平均瘤质量均显著降低，其抑瘤率可达75%。见表2。

表2 裂环羽扇豆烷衍生物的抑瘤率

实施例4：裂环羽扇豆烷衍生物2a注射液的制备

4.1制备工艺：取裂环羽扇豆烷衍生物2a原料200.0g，加丙二醇2000mL，80℃水浴加热溶解，滤过，灌封，121℃×15min湿热灭菌，分装1000支，即得。

4.2适应症：抗肿瘤药物。用于各类型肿瘤的治疗。

4.3用法与用量：一次200～400mg，一日2次，临用前以0.9%生理盐水或5%、10%葡萄糖溶液250、500mL稀释后静脉滴注。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.裂环羽扇豆烷衍生物，结构如通式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ所示：

其中，R1为H或1-10个碳的烷基或1-12个碳的芳基或1-3个糖；R2为H或1-10个碳的烷基或1-10个碳的酰基或1-3个糖；R3为H或1-10个碳的烷基或1-10个碳的酰基或1-3个糖。

2.权利要求1所述的裂环羽扇豆烷衍生物或其在药学上可以接受的盐。

3.药物组合物，其含有权利要求1或2中任一项所述的裂环羽扇豆烷衍生物或其在药学上可以接受的盐。

4.根据权利要求1所述的裂环羽扇豆烷衍生物，进一步包括以下具体化合物：

。

5.如权利要求1-4所述的裂环羽扇豆烷衍生物或其在药学上可以接受的盐或其药物组合物在抗肿瘤方面的应用。