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CN107541546B - 用于标靶核酸富集的组合物、方法、系统和试剂盒 - Google Patents

用于标靶核酸富集的组合物、方法、系统和试剂盒 Download PDF

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CN107541546B
CN107541546B CN201710445226.6A CN201710445226A CN107541546B CN 107541546 B CN107541546 B CN 107541546B CN 201710445226 A CN201710445226 A CN 201710445226A CN 107541546 B CN107541546 B CN 107541546B
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Abstract

本发明提供适用于从样品分离一种或多种标靶核酸分子的方法、组合物、试剂盒、系统和设备。具体来说，所述方法大体上涉及使标靶核酸分子的量从样品正规化。在一个方面，本发明涉及使用引物从引物延伸反应混合物纯化引物延伸产物，所述引物具有在第一解链温度下互补并且在第二解链温度下不互补的第一引物序列和第二引物序列。在一些方面，使用所公开的方法、试剂盒、系统和设备获得的标靶核酸分子可以用于各种下游过程，包括核酸测序和模板库制备。

Description

用于标靶核酸富集的组合物、方法、系统和试剂盒
本申请是申请号201380062039.X的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2012年10月15日提交的美国临时申请第 61/714,206号和2013年2月13日提交的标题是“用于标靶核酸富集的组合物、方法、系统和试剂盒(COMPOSITIONS,METHODS,SYSTEMS AND KITS FOR TARGET NUCLEIC ACID ENRICHMENT)”的美国临时申请第61/764,122号的优先权益，所述临时申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本文中提供用于使标靶核酸分子从样品富集的方法、试剂盒、组合物和设备。还提供用于从样品分离核酸分子的方法、试剂盒、组合物和设备。本发明大体上涉及用于使核酸分子正规化的方法、试剂盒、组合物和设备。
背景技术
在下游应用(例如克隆和核酸测序)之前，经常需要包括使标靶核酸分子从样品或反应混合物富集的样品制备。典型地，此类下游应用以高通量形式执行，增加用于在此类技术之前的样品制备的劳动、时间和试剂成本。此类应用经常需要核酸分子样品输入的起始量和/或浓度在最优工作范围内正规化(或标准化)。举例来说，许多应用需要在分析可以执行之前使核酸样品正规化，此类正规化的目的是使每个样品内的核酸分子的数目(或核酸分子的浓度)与彼此实质上相等。这些定量和正规化步骤极其耗时并且冗长；并且滥用实验室资源，因为待定量和/或正规化的标靶核酸库的数目增加。典型地，为了定量标靶核酸库，稀释每个样品的等分试样，并且测定核酸浓度。如果任一个或两个样品的浓度与可接受的工作范围显著不同，那么可以将样品稀释或以其它方式调节到可接受的起始量或浓度。在一些情况下，在正规化过程期间将核酸浓度调节为与彼此实质上相等。此过程称为“正规化”，导致产生具有实质上相等数目(或浓度)的核酸分子的正规化样品。此类定量和/或正规化过程，除了是劳动密集的之外，还妨碍其它下游过程可以开始的速度。在一些情况下，定量并且正规化数千个标靶核酸库所需的时间可以最终影响测序数据可以由此类下游过程获得的速度。因此，需要的是一种改进的使一个或多个样品内的核酸分子的起始数目和/或浓度正规化的方法。还需要的是一种从引物延伸反应混合物纯化延伸的引物产物的方法。此外，需要一种用于从样品分离特定量的核酸的方法。
附图说明
并入到说明书中并且形成说明书的一部分的随附图式说明一个或多个例示性实施例并且用以解释各个例示性实施例的原理。图式仅是例示性并且解释性的，并且不应理解为以任何方式限制或约束。
图1是描绘标靶核酸分子富集方法的非限制性实施例的示意图。
图2是描绘使用标靶核酸分子富集方法的非限制性实施例获得的例示性结果的示意图。
图3是描绘使用标靶核酸分子富集方法的非限制性实施例获得的例示性结果的示意图。
图4是描绘使用标靶核酸分子富集方法的非限制性实施例获得的例示性结果的示意图。
图5是描绘使用标靶核酸分子富集方法的非限制性实施例获得的例示性结果的示意图。
具体实施方式
本文中提供用于使标靶核酸分子从样品富集的方法、试剂盒、组合物、系统和设备。在一些实施例中，本发明大体上涉及一种用于使反应物中的一种或多种标靶核酸分子的浓度正规化的方法，其包含：通过使包括一群标靶核酸分子的样品与固定并且有限量的捕获寡核苷酸在其中所述捕获寡核苷酸与所述标靶核酸分子中的至少一些杂交的条件下接触，来产生一群结合的标靶核酸分子；和通过捕获相当大部分的所述结合的标靶核酸分子群体，来形成一群捕获的标靶核酸分子，其中捕获的标靶核酸分子的数目与捕获寡核苷酸的所述固定并且有限量成正比。在一些实施例中，所述用于使一种或多种标靶核酸分子的浓度正规化的方法包括引物，所述引物具有由不可复制部分间隔开的第一引物序列和第二引物序列；捕获寡核苷酸；和结合剂。在一些实施例中，所述方法、试剂盒、组合物和设备可以用以正规化宽输入范围的核酸分子，使得富集的核酸分子的数目与捕获寡核苷酸的数目成正比。在一些实施例中，本发明涉及使标靶核酸富集的方法，其通过消除当前富集方法中所存在的一个或多个清除步骤、洗涤和/或萃取步骤来进行。
在一些实施例中，本发明涉及一种简单、快速、流线型的从样品反应物或混合物分离标靶核酸的方法，其包含通过使包括一群标靶核酸分子的样品与固定并且限制量的捕获寡核苷酸在其中所述捕获寡核苷酸与所述标靶核酸分子中的至少一些杂交的条件下接触，来产生一群结合的标靶核酸分子；和通过捕获相当大部分的所述结合的标靶核酸分子群体，来形成一群捕获的标靶核酸分子，其中捕获的标靶核酸分子的数目与捕获寡核苷酸的所述固定并且限制量成正比。
在一些实施例中，本发明涉及一种试剂盒，其包含引物，所述引物具有第一引物序列和第二引物序列，任选地具有间隔开所述第一引物序列与所述第二引物序列的不可复制部分；捕获寡核苷酸；和结合剂。在一些实施例中，所述引物包括第一引物序列和第二引物序列，其中所述第一引物序列与第二引物序列由间隔子或聚乙二醇间隔开。在一些实施例中，所述第一引物序列与所述捕获寡核苷酸的至少一部分实质上互补，使得所述第一引物序列与所述捕获寡核苷酸杂交。在一些实施例中，所述第一引物序列与所述捕获寡核苷酸互补。在一些实施例中，所述第一引物序列和第二引物序列在第一解链温度下与彼此实质上互补。在另一个实施例中，所述第一引物序列和第二引物序列在第二解链温度下与彼此实质上互补但不与彼此杂交。在一些实施例中，所述第一引物序列在所述第二解链温度下与所述捕获寡核苷酸杂交。
在一些实施例中，所述捕获寡核苷酸与所述具有不可复制部分的引物和/或所述结合剂相比以限制浓度提供。在一些实施例中，所述结合剂和具有不可复制部分的引物以比所述反应物中所存在的捕获寡核苷酸的量多约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或的量存在。在一些实施例中，所述捕获寡核苷酸以有限浓度存在于所述反应物中，由此驱动所述捕获寡核苷酸与所述一种或多种待富集的标靶核酸分子杂交。
在一些实施例中，本发明大体上涉及一种引物延伸反应混合物纯化引物延伸产物的方法，其包含使引物与模板核酸杂交，其中所述引物包括由不可复制部分间隔开的第一引物序列和第二引物序列，并且其中所述第一和第二引物序列与彼此实质上互补并且具有第一解链温度；使所述引物以模板依赖性方式延伸以形成引物延伸产物，其具有包括所述第一引物序列的单链区；使所述引物延伸产物与捕获寡核苷酸杂交，所述捕获寡核苷酸包括捕获部分；和使用结合剂选择性捕获所述引物延伸产物，所述结合剂与所述捕获部分选择性结合。在一些实施例中，所述引物包括发夹、茎环或分叉引物。在一些实施例中，所述引物包括一个或多个不可复制部分。在一些实施例中，所述延伸的引物产物可以包括天然存在的核苷酸、核苷酸类似物或经标记的核苷酸。在一些实施例中，所述捕获寡核苷酸以限速浓度存在。在一些实施例中，所述结合剂与所述捕获寡核苷酸相比以过量至少2倍存在。在一些实施例中，所述引物在所述第一解链温度下主要以二级结构形式存在于所述反应物中，由此抑制所述第一引物序列与所述捕获寡核苷酸杂交。在一些实施例中，所述二级结构包括发夹或茎环结构。在一些实施例中，所述引物在所述第二解链温度下主要以线性结构形式存在于所述反应物中，由此使得所述第一引物序列能够与所述捕获寡核苷酸杂交。在一些实施例中，所述捕获寡核苷酸以限速浓度存在于所述反应物中。在一些实施例中，所述引物和所述结合剂两者与所述捕获寡核苷酸相比都以过量至少2倍存在于所述反应物中。
在一些实施例中，本发明大体上涉及一种组合物，其包含引物，所述引物具有任选地由不可复制部分与彼此间隔开的第一引物序列和第二引物序列。在一些实施例中，所述组合物包括引物，所述引物具有在第一解链温度下与彼此实质上互补或互补的第一引物序列和第二引物序列。在一些实施例中，所述组合物包括引物，所述引物具有在第二解链温度下不与彼此实质上互补的第一引物序列和第二引物序列。在一些实施例中，所述组合物包括引物，所述引物具有在第二解链温度下与捕获寡核苷酸实质上互补或互补的第一引物序列。在一些实施例中，所述捕获寡核苷酸进一步包括与结合剂结合的捕获部分。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于使一种或多种标靶核酸从样品富集的试剂盒(以及相关方法、组合物、设备)，其包含引物，所述引物具有第一引物序列和第二引物序列；捕获寡核苷酸；和结合剂。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括引物，所述引物具有一个或多个间隔开所述第一引物序列与所述第二引物序列的不可复制部分。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括限速浓度的捕获寡核苷酸。在一些实施例中，所述捕获寡核苷酸进一步包括能够与结合剂结合的捕获部分。在一些实施例中，所述结合剂和捕获部分可以是本领域普通技术人员已知的任何适合结合剂或捕获部分。举例来说，所述结合剂和捕获部分可以包括抗生蛋白链菌素和生物素。在一些实施例中，所述试剂盒任选地包括一个或多个条形码。在一些实施例中，所述一个或多个条形码可以用以索引一种反应物中的多种核酸样品。
可以受益于使用本文中所公开的标靶富集方法和正规化方法的一种具体例示性应用是核酸测序，包括下一代测序(NGS)。许多包括离子激流测序仪(Personal GenomeMachineTM和Ion Torrent ProtonTM测序仪(生命技术(Life Technologies),加利福尼亚州(CA)))的NGS平台需要提前制备大量的待测序的标靶核酸分子并且使其富集。关于 IonTorrent PGMTM测序仪的组合物、设计和操作的其它细节可以见于例如现以美国专利公开第2009/0026082号公布的美国专利申请第12/002781号、现以美国专利公开第 2010/0137143号公布的美国专利申请第12/474897号和现以美国专利公开第 2010/0282617号公布的美国专利申请第12/492844号中，所述申请全部以全文引用的方式并入本文中。NGS领域内存在多种库制备方法和试剂盒，其允许从单一来源制备多种标靶核酸分子(Ion AmpliseqTM库制备，公开部件号：MAN0006735或Ion XpressTM加 gDNA片段库制备，公开部件号4471989(生命技术,加利福尼亚州)；用于离子激流的
Figure BDA0001319805220000051
快速DNA库制备套件，新英格兰生物实验室(New England Biolabs)目录编号E6270L)。条形码的出现已经通过允许在单一测序回合中从多个样品或来源索引多种标靶核酸分子而扩展此功能(Ion XpressTM条形码衔接子1-96，用于Ion XpressTM加片段库试剂盒(生命技术,加利福尼亚州)；Access ArrayTM条形码库，富鲁达公司(Fluidigm Corp),加利福尼亚州)。NGS的一些领域，例如靶向重测序典型地利用许多例如在数个96孔板中平行制备的样品。使用已知库制备方法制备的带条形码的与不带条形码的核酸库的起始量大幅变化，并且因此必须在过渡到下游过程中之前个别地定量。标靶核酸库的定量可以使用多种方案来实现，所述方案包括qPCR、
Figure BDA0001319805220000052
荧光计(生命技术, 加利福尼亚州)和BioanalyzerTM(安捷伦技术(Agilent Technologies),加利福尼亚州)。
本文中所用的章节标题仅用于组织目的并且不应理解为以任何方式限制所描述的主题。
本申请中引用的所有文献和类似材料(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和因特网网页)明确以全文引用的方式并入用于任何目的。当并入的参考文献中的术语的定义呈现为与本发明教示中提供的定义不同时，应以本发明教示中提供的定义为准。
应了解，在本发明教示中论述的温度、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，使得微小并且非实质的偏差在本文中本发明教示的范围内。
除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
“包含”、“包含了”、“包含着”、“含有”、“含有了”、“含有着”、“包括”、“包括了”和“包括着”的使用并不打算具限制性。
应理解，以上一般描述和以下详细描述两者仅是例示性和解释性的并且并不限制本发明。
除非另外定义，否则结合本文中所述的本发明教示使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。一般来说，本文中所述的与细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或聚核苷酸化学和杂交结合使用的命名法和其技术是本领域中所熟知并且常用的命名法和技术。标准技术用于例如核酸纯化和制备、化学分析、重组核酸和寡核苷酸合成。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或如本领域中通常所实现或如本文中所述来执行。本文中所述的技术和程序通常根据本领域中所熟知以及如本发明的说明书通篇中所引用和论述的各个一般性和较特定的参考文献中所述的常规方法来执行。参看例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆实验指南(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)(第三版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress),冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约州(N.Y.)2000)。结合本文中所述的实验室程序和技术使用的命名法是本领域中熟知并且常用的命名法。
如根据本文中提供的例示性实施例所用，除非另外指示，否则以下术语应理解为具有以下含义：
如本文中所用，术语“扩增”和其变化形式包括用于产生聚核苷酸的至少某一部分的多个拷贝或互补序列的任何过程，所述聚核苷酸典型地称为“模板”或在一些情况下称为“标靶”。模板(或标靶)聚核苷酸可以是单链或双链的。既定模板的扩增可以导致产生一群统称为“扩增子”的聚核苷酸扩增产物。
如本文中所用，术语“测序”和其变化形式包含典型地通过测定核酸链内的至少一种核苷酸(包括其核碱基组分)的一致性来从核酸链获得序列信息。虽然在一些实施例中，对核酸分子的既定区“测序”包括识别所测序的区内的每一种核苷酸，但“测序”还可以包括如下方法，由此测定一种或多种核苷酸的一致性，而一些核苷酸的一致性保持未测定或不正确地测定。
如本文中所用，术语“一致性”和“一致”和其变化形式，当关于两种或更多种核酸序列使用时，是指两种或更多种序列(例如，核苷酸或多肽序列)的序列类似性。在两种或更多种同源序列的情况下，序列或其子序列的一致性或同源性百分比表示相同(即，约70％一致性，优选地75％、80％、85％、90％、95％或99％一致性)的全部单体单位 (例如，核苷酸或氨基酸)的百分比。一致性百分比可以在规定区内，当出于比较窗内的最大对应而比较和比对时，或在指定区内，如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法用下文所描述的默认参数或通过手动比对和目视检查所测量。当氨基酸水平或核苷酸水平存在至少85％一致性时，序列被称为“实质上一致”。优选地，一致性存在于至少约 25、50或100个残基长的区内或至少一种比较的序列的整个长度上。用于测定序列一致性和序列类似性百分比的一种典型算法是BLAST和BLAST 2.0算法，其描述于阿尔丘尔(Altschul)等人,核酸研究(Nuc.AcidsRes.)25:3389-3402(1977)中。其它方法包括史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman),应用数学进展(Adv.Appl.Math.)2:482(1981) 和尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch),分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443(1970) 的算法等。两种核酸序列实质上一致的另一个指示是，两种分子或其互补序列在严格杂交条件下与彼此杂交。
如本文中关于两种或更多种聚核苷酸或核酸序列所用，术语“互补”和其变化形式是指如下聚核苷酸(或一种或多种聚核苷酸内的序列)，其包括可以在两个或更多个个别对应位置处以反平行定向经历累积碱基配对的任何核酸序列，如在杂交双螺旋体中。任选地，第一与第二核酸序列之间可以存在“完全”或“总体”互补性，其中核酸序列之一中的每个核苷酸可以经历与另一种核酸序列中的对应反平行位置中的核苷酸的稳定碱基配对相互作用(然而，术语“互补”本身可以包括包含一些非互补部分的核酸序列，例如当一种核酸序列长于另一者时)。“部分”互补性描述一种核酸序列的至少20％但少于 100％的残基与另一种核酸序列残基互补的核酸序列。在一些实施例中，一种核酸序列的至少50％但少于100％的残基与另一种核酸序列中的残基互补。在一些实施例中，一种核酸序列的至少70％、80％、90％或95％但少于100％的残基与另一种核酸序列中的残基互补。当一种核酸序列的至少85％的残基与另一种核酸序列中的残基互补时，序列被称为“实质上互补”。“非互补”描述其中一种核酸序列的少于20％的残基与另一种核酸序列中的残基互补的核酸序列。“错配”存在于不互补的两种相对核苷酸中的任何位置。互补核苷酸包括在生理条件下在DNA复制期间通过与彼此相对的DNA聚合酶高效并入的核苷酸。在一个典型实施例中，互补核苷酸可以与彼此形成碱基对，例如在与彼此反平行的位置在核苷酸和/或聚核苷酸的核碱基之间通过特定沃森-克里克(Watson-Crick)型氢键形成的A-T/U和G-C碱基对。其它人工碱基对的互补性可以是基于其它类型的氢键和 /或碱基的疏水性和/或碱基之间的形状互补性。
如本文中关于两种或更多种聚核苷酸所用，术语“杂交”或“退火”和其变化形式是指如下任何过程，由此所述聚核苷酸内的任一种或多种核酸序列(每种序列包含连续核苷酸残基的延伸)在两个或更多个个别对应位置经历碱基配对，例如如在杂交核酸双螺旋体中。
任选地，第一与第二核酸序列之间可以存在“完全”或“总体”杂交，其中第一核酸序列中的每个核苷酸残基可以经历与第二核酸序列上的反平行位置中的对应核苷酸的碱基配对相互作用。在一些实施例中，杂交可以包括在其整个长度内不完全互补或不碱基配对的两种或更多种核酸序列之间的碱基配对。举例来说，当两种核酸序列经历碱基配对，其中一种核酸序列的至少20％但少于100％的残基与另一种核酸序列中的残基碱基配对时，发生“部分”杂交。在一些实施例中，杂交包括两种核酸序列之间的碱基配对，其中一种核酸序列的至少50％但少于100％的残基与另一种核酸序列中的对应残基碱基配对。在一些实施例中，一种核酸序列的至少70％、80％、90％或95％但少于100％的残基与另一种核酸序列中的对应残基碱基配对。当一种核酸序列的至少85％的残基与另一种核酸序列中的对应残基碱基配对时，两种核酸序列被称为“实质上杂交”。在其中一种核酸分子实质上长于另一者(或其中两种核酸分子包括实质上互补和实质上非互补区两者)的情况下，即使当任一种或两种核酸分子的部分可以保持未杂交时，两种核酸分子也可以被描述为“杂交”。“未杂交”描述其中一种核酸序列的少于20％的残基与另一种核酸序列中的残基碱基配对的核酸序列。在一些实施例中，碱基配对可以根据一些常规配对范式发生，例如在与彼此反平行的位置在核苷酸和/或聚核苷酸的核碱基之间通过特定沃森-克里克型氢键形成的A-T/U和G-C碱基对；在其它实施例中，碱基配对可以通过任何其它范式发生，由此碱基配对根据确定并且可预测的规则进行。
两种或更多种聚核苷酸的杂交可以每当所述两种或更多种聚核苷酸在适合杂交条件下接触时发生。杂交条件包括适用于核酸杂交的任何条件；执行杂交的方法和适用于杂交的条件在本领域中是熟知的。杂交的严格度可以受多种参数影响，所述参数包括待杂交的聚核苷酸(或聚核苷酸内的任何标靶序列)之间的一致性和/或互补性程度；待杂交的聚核苷酸和/或标靶序列的解链点，称为“Tm”；聚核苷酸和引物的例如盐、缓冲液、 pH、温度、GC％含量的参数，和/或时间。典型地，杂交在较低温度和/或增加的盐浓度以及降低的有机溶剂浓度中是有利的。高严格度杂交条件将典型地需要两种标靶序列之间的互补程度较高以便杂交得以发生，而低严格度杂交条件即使当两种待杂交的聚核苷酸展现较低互补性水平时也将有利于杂交。杂交条件可以在杂交步骤、或任选并且相继的洗涤步骤、或杂交和任选的洗涤步骤两者期间施加。
高严格度杂交条件的实例包括以下中的任一者或多者：盐浓度(例如，NaCl)是约0.0165到约0.0330M；温度低于待杂交的标靶序列(或聚核苷酸)的解链点(Tm) 约5℃到约10℃；和/或甲酰胺浓度是约50％或更高。典型地，高严格度杂交条件允许具有高同源性、例如≥95％一致性或互补性的序列之间结合。在高严格度杂交条件的一个例示性实施例中，杂交在约42℃下在杂交溶液中执行，所述杂交溶液含有25mM KPO4(pH 7.4)、5×SSC、5×邓哈特溶液(Denhardt's solution)、50μg/mL变性的经声处理的鲑鱼精子DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL双链聚核苷酸(或双链标靶序列)，而洗涤在约65℃下用含有0.2×SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗涤溶液执行。
中等严格度杂交条件的实例可以包括以下中的任一者或多者：盐浓度(例如，NaCl) 是约0.165到约0.330M；温度低于待杂交的标靶序列的解链点(Tm)约20℃到约29℃；和/或甲酰胺浓度是约35％或更低。典型地，此类中等严格度条件允许具有高或中等同源性、例如≥80％一致性或互补性的序列之间结合。在中等严格度杂交条件的一个例示性实施例中，杂交在约42℃下在杂交溶液中执行，所述杂交溶液含有25mM KPO4(pH 7.4)、 5×SSC、5×邓哈特溶液、50μg/mL变性的经声处理的鲑鱼精子DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL双链聚核苷酸(或双链标靶序列)，而洗涤在约50℃下用含有 2×SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗涤溶液执行。
低严格度杂交条件的实例包括以下中的任一者或多者：盐浓度(例如，NaCl)是约0.330到约0.825M；温度低于待杂交的标靶序列的解链点(Tm)约40℃到约48℃；和 /或甲酰胺浓度是约25％或更低。典型地，此类低严格度条件允许具有低同源性、例如≥50％一致性或互补性的序列之间结合。
一些适用于杂交的例示性条件包括在具有钠盐(例如NaCl、柠檬酸钠和/或磷酸钠) 的溶液中孵育待杂交的聚核苷酸。在一些实施例中，杂交或洗涤溶液可以包括约10-75％甲酰胺和/或约0.01-0.7％十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施例中，杂交溶液可以是可以包括以下的任何组合的严格杂交溶液：50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M 柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×邓哈特溶液、0.1％SDS和/ 或10％硫酸葡聚糖。在一些实施例中，杂交或洗涤溶液可以包括BSA(牛血清白蛋白)。在一些实施例中，杂交或洗涤可以在约20-25℃、或约25-30℃、或约30-35℃、或约 35-40℃、或约40-45℃、或约45-50℃、或约50-55℃、或更高的温度范围下进行。
在一些实施例中，杂交或洗涤可以进行持续约1分钟、1-5分钟、1-10分钟、或约10-20分钟、或约20-30分钟、或约30-40分钟、或约40-50分钟、或约50-60分钟、或更久的时间范围。
在一些实施例中，杂交或洗涤条件可以在约5-10、或约pH 6-9、或约pH 6.5-8、或约pH 6.5-7的pH范围下进行。
如本文中所用，当关于既定聚核苷酸(或聚核苷酸内的既定标靶序列)使用时，术语“解链温度”和“Tm”和其变化形式典型地是指在一组规定条件下50％的既定聚核苷酸(或既定标靶序列)以双链形式存在并且50％是单链的温度。在一些实施例中，规定条件组可以包括指示水性反应条件中的离子强度和/或pH的规定参数。规定条件可以通过改变盐(例如，钠)浓度、温度、pH、缓冲液和/或甲酰胺来调节。典型地，计算的热解链温度可以是低于Tm约5-30℃，或低于Tm约5-25℃，或低于Tm约5-20℃，或低于Tm约5-15℃，或低于Tm约5-10℃。既定核酸序列的Tm可以根据任何适合方法(包括实际解链分析以及Tm预测算法两者)计算，只要Tm值的比较使用通过相同计算方法获得的Tm值执行即可。用于计算Tm的方法是熟知的并且可以见于萨姆布鲁克1989 “分子克隆实验指南”,第2版,第1-3卷；维特莫(Wetmur)1966,分子生物学杂志, 31:349-370；维特莫1991生物化学和分子生物学重要评论(Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology),26:227-259中。其它用于计算用于使核酸杂交或变性的Tm的来源包括OligoAnalyze(来自综合DNA技术(Integrated DNA Technologies))、OligoCalc和Primer3(由怀特黑德生物医学研究学院(Whitehead Institute for Biomedical Research)发布)。在本文中提供的方法的一些实施例中，既定核酸序列的Tm根据这些方法中的任一者或多者计算。在一些实施例中，Tm在假定以下条件下计算，核酸序列悬浮于包括50nM核酸序列于包括50nM盐(例如，NaCl)的基于Tris 的缓冲液中的溶液中。在一些实施例中，Tm假定50nM核酸序列在包括0.5M NaCl的溶液中而计算。在一些实施例中，Tm假定核酸序列以100pM浓度存在于含有以下的缓冲液中而计算：10mM Tris pH 8.0；500mM NaCl；0.1mM EDTA和0.05％Tween-20。
如本文中所用，术语“引物”和其变化形式可以包括在与互补核酸序列杂交后可以引发核酸合成的任何单链核酸分子(无关于长度)。典型地，此类核酸合成以模板依赖性方式发生，并且核苷酸在此类核酸合成期间聚合到引物的至少一端上。如本文中所用，当关于既定方法使用时，术语“引物延伸”和其变化形式涉及用于催化核苷酸并入到核酸分子的末端上的任何方法。典型地但未必，此类核苷酸并入以模板依赖性方式发生。在一些实施例中，既定聚合酶的引物延伸活性可以定量为在一组具体反应条件下每单位时间(秒)通过单位量聚合酶(摩尔)并入的核苷酸的总数目(如通过例如辐射测量或其它适合分析所测量)。在一些实施例中，所公开的方法、试剂盒、组合物和设备的一种或多种引物可以包括引物，所述引物具有抑制引物在第一解链温度下与捕获寡核苷酸杂交的二级结构。在一些实施例中，所公开的方法、试剂盒、组合物和设备的一种或多种引物可以包括引物，所述引物使得引物能够在第二解链温度下与捕获寡核苷酸杂交。在一些实施例中，引物可以包括发夹引物、茎环引物、分叉引物等。在一些实施例中，所公开的方法、组合物、设备和试剂盒的一种或多种引物可以包括引物，所述引物具有第一引物序列和第二引物序列。在一些实施例中，第一引物序列与第二引物序列由不可复制部分间隔开。在一些实施例中，不可复制部分可以包括一个或多个非核苷酸基部分或间隔子。在一些实施例中，第一引物序列和第二引物序列与彼此实质上互补。在一些实施例中，第一引物序列和第二引物序列沿着其整个长度的至少一部分与彼此互补。在一些实施例中，引物可以包括引物，所述引物具有在第一解链温度下与彼此实质上互补的第一引物序列和第二引物序列，并且其中第一引物序列与第二引物序列由一个或多个不可复制部分间隔开。在一些实施例中，引物可以包括一个或多个易断键。在一些实施例中，易断键可能易受通过酶、化学或光氧化进行的裂解或降解影响。
在一些实施例中，反应物中所存在的引物的浓度超过捕获寡核苷酸的浓度至少2倍、 3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或更多。在一些实施例中，引物以比反应中所存在的捕获寡核苷酸的量多至少15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％或更多的量存在于反应物中。
在一些实施例中，具有第一引物序列的引物从捕获寡核苷酸的3'端与约5个、10个、 15个、20个、25个、30个、35个、40个或更多个连续核苷酸实质上互补。在一些实施例中，具有第一引物序列和第二引物序列的引物在第一解链温度下与来自第二引物序列的约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个或更多个连续核苷酸实质上互补。在一些实施例中，具有第一引物序列的引物在第二解链温度下与捕获寡核苷酸的约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个或更多个连续核苷酸实质上互补。
如本文中所用，当关于任何寡核苷酸、引物、聚核苷酸或核酸分子使用时，术语“发夹”是指包括两种与彼此至少70％互补的核酸序列(在本文中被称为“第一发夹序列”和“第二发夹序列”)的寡核苷酸、引物、聚核苷酸或核酸分子。在一些实施例中，第一和第二发夹序列与彼此至少75％、77％、80％、85％、90％、95％、97％、99％互补，或完全互补。第一和第二发夹序列任选地能够在适合条件下与彼此杂交。经由第一和第二发夹序列与彼此杂交形成的杂交物可以具有被称为“发夹解链温度”、“第一解链温度”或“发夹Tm”的解链温度(Tm)。典型地，第一和第二发夹序列相对于彼此呈逆向定向，使得第一和第二发夹序列的杂交将导致在低于发夹Tm的温度下形成发夹结构。在一些实施例中，发夹寡核苷酸、引物、聚核苷酸或核酸分子在显著低于发夹解链温度的温度(被称为“第一解链温度”)下主要以发夹形式存在，并且在显著高于发夹解链温度的温度(在本文中被称为“第二解链温度”)下主要以延伸(解链)单链形式存在。第一和第二发夹序列可以具有任何长度，但典型地超过4个核苷酸长，甚至更典型地超过约5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、75或100个核苷酸长。在一些实施例中，当在标准PCR延伸条件下测量时，第一和第二序列的解链温度(Tm)低于约80℃，或低于约70℃，或低于约65℃，或低于约60℃，或低于约55℃。
如本文中所用，术语“核苷酸”和其变化形式包含可以与聚合酶选择性结合或可以通过聚合酶聚合的任何化合物。典型地但未必，核苷酸与聚合酶的选择性结合后面是核苷酸通过聚合酶向核酸链中的聚合；然而偶尔，核苷酸可以从聚合酶解离而不变得并入到核酸链中，这是在本文中被称为“非生产性”事件的事件。此类核苷酸不仅包括天然存在的核苷酸而且包括可以与聚合酶选择性结合或可以通过聚合酶聚合的任何类似物(无关于其结构)。虽然天然存在的核苷酸典型地包含碱基、糖和磷酸酯部分，但本发明的核苷酸可以包括不具有此类部分中的任一者、一些或全部的化合物。在一些实施例中，核苷酸可以任选地包括包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个磷原子的磷原子链。在一些实施例中，磷链可以连接到糖环的任何碳，例如5'碳。磷链可以用介入O或S键联到糖。在一个实施例中，链中的一个或多个磷原子可以是具有P 和O的磷酸酯基的一部分。在另一个实施例中，链中的磷原子可以用介入O、NH、S、亚甲基、经取代的亚甲基、亚乙基、经取代的亚乙基、CNH2、C(O)、C(CH2)、CH2CH2或C(OH)CH2R(其中R可以是4-吡啶或1-咪唑)键联在一起。在一个实施例中，链中的磷原子可以具有具备O、BH3或S的侧基。在磷链中，磷原子与除O之外的侧基一起可以是经取代的磷酸酯基。核苷酸类似物的一些实例描述于许(Xu),美国专利第 7,405,281号中。在一些实施例中，核苷酸包含标记(例如，报告子部分)并且在本文中被称为“经标记的核苷酸”；经标记的核苷酸的标记在本文中被称为“核苷酸标记”。在一些实施例中，标记可以呈连接到末端磷酸酯基(即，距糖最远端的磷酸酯基或替代磷酸酯基)的荧光染料形式。可以用于所公开的方法和组合物中的核苷酸的一些实例包括但不限于核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸聚磷酸酯、脱氧核糖核苷酸聚磷酸酯、经修饰的核糖核苷酸聚磷酸酯、经修饰的脱氧核糖核苷酸聚磷酸酯、肽核苷酸、金属核苷酸、膦酸酯核苷和经修饰的磷酸酯 -糖主链核苷酸，以上化合物的类似物、衍生物或变化形式，等。在一些实施例中，核苷酸可以包含非氧部分(例如硫基或硼烷部分)代替氧部分，所述氧部分桥接核苷酸的α磷酸酯与糖、或核苷酸的α与β磷酸酯、或核苷酸的β与γ磷酸酯、或核苷酸的任何其它两种磷酸酯之间、或其任何组合。
如本文中所用，术语“核酸”是指天然核酸、人造核酸、其类似物或其组合，包括聚核苷酸和寡核苷酸。如本文中所用，术语“聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换地使用并且意指单链和双链核苷酸聚合物，包括但不限于通过核苷酸间磷酸二酯结合键(例如3'-5'和 2'-5'反转键)键联的2'-脱氧核糖核苷酸(核酸)和核糖核苷酸(RNA)，例如3'-3'和5'-5' 支链结构，或类似核酸。聚核苷酸具有相关抗衡离子，例如H+、NH4 +、三烷基铵、Mg2+、 Na+等。寡核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸构成，完全由核糖核苷酸构成，或由其嵌合混合物构成。寡核苷酸可以包含核碱基和糖类似物。聚核苷酸典型地大小从几个、例如5-40个单体单元(当其在本领域中更普遍经常被称为寡核苷酸时)到数千个单体核苷酸单元(当其在本领域中更普遍被称为聚核苷酸时)变动；然而，出于本发明的目的，寡核苷酸和聚核苷酸两者都可以具有任何适合长度。除非另外表示，否则每当表示寡核苷酸序列时，应理解，核苷酸从左到右呈5'到3'顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。寡核苷酸被称为具有“5'端”和“3'端”，因为单核苷酸典型地经由一个核苷酸的5'磷酸酯或等效基团与其相邻核苷酸的3'羟基或等效基团的连接、任选地经由磷酸二酯或其它适合键反应以形成寡核苷酸。
如本文中所用，术语“核苷酸并入”和其变化形式包含使一个或多个核苷酸聚合以形成核酸链，所述核酸链包括至少两个典型地但未必经由磷酸二酯键键联到彼此的核苷酸，但在具体核苷酸类似物的情况下替代性键可以是可能的。
如本文中所用，术语“寡核苷酸”、“聚核苷酸”、“核酸分子”和其变化形式可以可互换地用以指包括一个或多个聚核苷酸区的任何聚合物，而不有关于此类聚合物的相应长度。在一些实施例中，此类聚合物同样可以包括非聚核苷酸区。此类聚合物具有至少2 个端，其为了方便在本文中可以被称为5'和3'端，但此类术语不限制基础端的结构。举例来说，引物、寡核苷酸、聚核苷酸或核酸分子的3'端不必包括游离羟基，并且实际上可以包括可以在核苷酸并入反应期间与引入的核苷酸相互作用或反应的任何其它化学基团。除非上下文另外解释清楚，否则此类寡核苷酸、聚核苷酸或核酸分子可以是双链或单链的。虽然在一些实施例中，寡核苷酸(或引物)比对应聚核苷酸模板(或模板核酸分子)更短，但在一些实施例中，寡核苷酸或引物将不会比对应聚核苷酸模板(或模板核酸分子)更短。
如本文中所用，术语“聚合酶链反应”(“PCR”)是指特此以引用的方式并入的K.B.穆利斯(K.B.Mullis)美国专利第4,683,195号和第4,683,202号的方法，所述专利描述一种用于在不克隆或纯化的情况下增加基因组DNA混合物中的所关注聚核苷酸的片段的浓度的方法。这种用于扩增所关注聚核苷酸的过程由以下组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入到含有所要所关注聚核苷酸的DNA混合物，接着是在DNA聚合酶存在下热循环的精确序列。两种引物与所关注双链聚核苷酸的其相应链互补。为了实现扩增，使混合物变性，并且然后将引物退火到所关注聚核苷酸分子内的其互补序列。在退火之后，用聚合酶使引物延伸以形成一对新互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以存在众多“循环”)以获得所要所关注聚核苷酸的高浓度的扩增的片段。所要所关注聚核苷酸的扩增的片段(扩增子) 的长度通过引物相对于彼此的相对位置测定，并且因此此长度是可控制参数。借助于重复所述过程，所述方法被称为“聚合酶链反应”(在下文中“PCR”)。因为所关注聚核苷酸的所要扩增的片段变为混合物中的主要核酸序列(就浓度来说)，所以其被称为“PCR扩增的”。如本文中所定义，包括多种标靶核酸分子的样品内的标靶核酸分子经由PCR而扩增。在上文所论述的方法的一个改进中，标靶核酸分子可以使用多种不同引物对、在一些情况下一种或多种引物对/所关注标靶核酸分子而PCR扩增，由此形成多重PCR反应。使用多重PCR，有可能同时从样品扩增多种所关注核酸分子以形成扩增的标靶序列。还可能通过数种不同方法(例如，用生物分析仪或qPCR定量，用经标记的探针杂交；并入生物素化的引物，接着进行抗生物素蛋白-酶结合物检测；将经32P标记的脱氧核苷酸三磷酸酯(例如dCTP或dATP)并入到扩增的标靶序列中)检测扩增的标靶序列。任何核酸序列可以用适当引物集扩增，由此允许从基因组DNA、cDNA、福尔马林固定的石蜡包埋的DNA、细针活检体和多种其它来源扩增标靶核酸分子。具体来说，通过PCR 过程产生的扩增的标靶核酸序列本身是用于后续PCR扩增或多种下游分析或操纵的高效底物。
如本文中所定义，“多重扩增”是指样品内的两种或更多种标靶序列使用至少一种标靶特异性引物的选择性并且非随机的扩增。在一些实施例中，多重扩增经执行，使得标靶序列中的一些或全部在单一反应容器内扩增。既定多重扩增的“重数”或“重”通常是指在所述单一多重扩增期间扩增的不同标靶特异性序列的数目。在一些实施例中，重数可以是约12重、24重、48重、96重、192重、384重、768重、1536重、3072重、6144 重或更多重。
如本文中所定义，“样品”和其衍生物以其最广泛含义使用并且包括疑似包括标靶核酸分子的任何样本、培养物等。在一些实施例中，样品包含DNA、RNA、PNA、LNA、嵌合、杂交或多重形式的核酸。样品可以包括含有一种或多种标靶核酸分子的任何基于生物、临床、手术、农业、大气或水生的样本。所述术语还包括任何经分离的核酸样品，例如基因组DNA、新鲜冷冻或福尔马林固定的石蜡包埋的核酸样本。在一些实施例中，标靶核酸分子可以包括来自个体的一种或多种匹配的样品(例如，病态/正常的标靶核酸分子)。在一些实施例中，标靶核酸分子可以包括两种或更多种不同形式的遗传物质，例如从母本受试者获得的母本和胎儿DNA。在一些实施例中，标靶核酸分子可以包括两种或更多种不同形式的遗传物质，例如植物或哺乳动物来源的样品中细菌DNA的存在。在一些实施例中，标靶核酸分子的来源可以包括从初生儿获得的标靶核酸，例如如典型地在初生儿筛检期间以血液样品形式取得。在一些实施例中，标靶核酸分子的来源可以包括从活检体获得的标靶核酸，例如如典型地在肿瘤切除或筛检期间取得。在一个实施例中，标靶核酸分子可以包括cDNA。在另一个实施例中，标靶核酸分子可以包括低分子量物质，例如从FFPE或所存档的DNA样品获得的核酸分子。在另一个实施例中，低分子量物质包括酶促或机械修剪的DNA。在另一个实施例中，标靶核酸分子可以包括无细胞循环DNA。在一些实施例中，样品可以包括从活检体、肿瘤、刮片、拭子、血液、粘液、尿液、血浆、精液、毛发、激光捕获显微解剖、手术切除和其它临床或实验室获得的样品获得的标靶核酸分子。
如本文中所用，“DNA条形码”或“DNA标记序列”和其衍生物通常是指衔接子内的可以充当‘钥匙’以区别或分离样品中的多种扩增的标靶序列的唯一短(6-14核苷酸)核酸序列。出于本发明的目的，DNA条形码或DNA标记序列可以并入到衔接子的核苷酸序列中。
如本文中所用，术语“衔接子”包括包含DNA、RNA、嵌合RNA/DNA分子或其类似物的聚核苷酸或寡核苷酸。在一些实施例中，衔接子可以包括一个或多个核糖核苷残基。在一些实施例中，衔接子可以是单链或双链核酸，或可以包括单链和/或双链部分。在一些实施例中，衔接子可以具有任何结构，包括线性、发夹、分叉或茎环。
在一些实施例中，衔接子可以具有任何长度，包括少于10个碱基长，或约10-20 个碱基长，或约20-50个碱基长，或约50-100个碱基长，或更长。
在一些实施例中，衔接子可以具有钝端和/或粘端的任何组合。在一些实施例中，衔接子的至少一端可以与核酸片段的至少一端相容。在一些实施例中，衔接子的相容端可以接合到核酸片段的相容端。在一些实施例中，衔接子可以具有5'或3'突出端。
在一些实施例中，衔接子可以具有5'或3'突出尾。在一些实施例中，尾可以是任何长度，包括1-50个或更多个核苷酸长。
在一些实施例中，衔接子可以包括内部切口。在一些实施例中，衔接子可以具有至少一个不具有末端5'磷酸酯残基的链。在一些实施例中，不具有末端5'磷酸酯残基的衔接子可以接合到核酸片段以在衔接子与核酸片段之间的接合处引入切口。
在一些实施例中，衔接子可以包括如下核苷酸序列，其是引物的任何部分的一部分、或与引物的任何部分互补、或与引物的整个序列互补、存在于扩增反应混合物中、或是测序引物的任何部分、或是测序引物的整个序列，或其任何部分。
在一些实施例中，衔接子可以包括简并序列。在一些实施例中，衔接子可以包括一个或多个肌苷残基。在一些实施例中，条形码衔接子可以包括可唯一识别的序列。在一些实施例中，条形码衔接子可以用于构筑多重核酸库。
在一些实施例中，衔接子可以包括至少一个易断键。在一些实施例中，易断键可能易受通过酶或化合物进行的裂解或降解影响。在一些实施例中，衔接子可以包括至少一个硫赶磷酸酯、硫代磷酸酯和/或氨基磷酸酯键。
在一些实施例中，衔接子可以包括识别序列。在一些实施例中，识别序列可以用于分选或追踪。在一些实施例中，识别序列可以是单一序列(例如，条形码序列)。在一些实施例中，条形码序列可以允许在具有不同条形码序列的不同衔接子的混合物之中识别具体衔接子。举例来说，混合物可以包括2个、3个、4个、5个、6个、7-10个、10-50 个、50-100个、100-200个、200-500个、500-1000个或更多个具有唯一条形码序列的不同衔接子。
在一些实施例中，衔接子可以包括任何类型的限制酶识别序列，包括I型、II型、lIs型、IIB型、III型或IV型限制酶识别序列。
在一些实施例中，衔接子可以包括细胞调节序列，包括启动子(诱导型或组成型)、增强子、转录或翻译起始序列、转录或翻译终止序列、分泌信号、Kozak序列、细胞蛋白结合序列等。
在一些实施例中，当关于两个或更多个值使用时，术语“实质上相等”和其变化形式是指任两个或更多个值小于彼此的10倍，典型地小于5倍，甚至更典型地小于任何其它值的3倍，甚至更典型地不超过彼此的2倍。举例来说，出于本发明的目的，1和9 的值可以被认为实质上相等，但1和20的值则不。在一些实施例中，术语“实质上相等”用以指两个或更多个输出值，其各自指示来源于样品的分子的数目或分子的最终浓度。在一些实施例中，“实质上相等”是指从两个或更多个样品中分离的标靶核酸分子的输出核酸浓度；举例来说，如果来自第一样品的输出浓度小于来自第二样品的输出浓度的10 倍，那么从第一和第二样品回收的核酸分子的输出浓度被称为“实质上相等”。在一些实施例中，“实质上相等”包括来自两个或更多个样品的在彼此的一个标准差内的任何输出核酸浓度。在一些实施例中，“实质上相等”是指从两个或更多个样品中分离的核酸分子的绝对数。在一些实施例中，第一数目的标靶核酸分子从第一样品中分离，并且第二数目的标靶核酸分子从第二样品中分离，其中第一数目从第二数目变化不超过5％、10％、 15％、20％、25％、50％、75％、100％、200％、250％、500％、750％、900％或990％，或反之亦然。在一些实施例中，“实质上相等”是指从两个或更多个样品中分离的核酸分子的浓度，其中核酸分子的浓度在两个或更多个样品之间变化小于彼此的5倍、更优选地小于3倍、甚至更典型地不超过2倍。在一些实施例中，“实质上相等”是指第二样品中的核酸分子的数目或浓度在第一样品中的核酸分子的平均浓度或平均数目的约1％、 2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％内。在一些实施例中，实质上相等输出核酸浓度可以包括约1pM到约1000pM、例如约10pM、20pM、40pM、 50pM、60pM、70pM、80pM、100pM、200pM、300pM、400pM、500pM、600pM、 700pM、800pM、900pM或更大的任何浓度。在一些实施例中，实质上相等输出可以包括在约2倍、3倍、4倍或5倍范围内的任何输出。
如本文中所用，术语“结合伴侣”包括对于彼此具有特异性结合亲和力并且典型地将优先于与其它分子结合地与彼此结合的两种分子或其部分。典型地但未必，特异性结合对的一种成员的一些或全部结构与由另一成员具有的一些或全部结构互补，两种成员能够借助于互补结构之间的键、任选地借助多个非共价吸引力特异性地结合在一起。
在一些实施例中，充当结合伴侣的分子包括：生物素(和其衍生物)和其结合伴侣抗生物素蛋白部分、抗生蛋白链菌素部分(和其衍生物)；与镍、钴或铜结合的His标签；结合Ni-NTA的半胱氨酸、组氨酸或组氨酸片；与麦芽糖结合蛋白(MBP)结合的麦芽糖；凝集素-碳水化合物结合伴侣；钙-钙结合蛋白(CBP)；乙酰胆碱和受体-乙酰胆碱；蛋白A和结合伴侣抗FLAG抗体；GST和结合伴侣谷胱甘肽；尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和ugi(尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂)蛋白；与抗体或抗体片段结合的抗原或表位标签，特别是抗原例如地高辛、荧光素、二硝基苯酚或溴脱氧尿苷和其相应抗体；小鼠免疫球蛋白和山羊抗小鼠免疫球蛋白；IgG结合和蛋白A；受体-受体激动剂或受体拮抗剂；酶-酶辅因子；酶-酶抑制剂；和甲状腺素-皮质醇。生物素的另一种结合伴侣可以是来自鸡的生物素结合蛋白(海托恩(Hytonen)等人,BMC结构生物学(BMC Structural Biology)7:8)。
抗生物素蛋白部分可以包括抗生物素蛋白蛋白质，以及抗生物素蛋白的可以与生物素部分结合的任何衍生物、类似物和其它非天然形式。抗生物素蛋白部分的其它形式包括天然和重组抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素以及衍生化分子，例如非糖基化抗生物素蛋白、N-酰基抗生物素蛋白和截短的抗生蛋白链菌素。举例来说，抗生物素蛋白部分包括抗生物素蛋白的脱糖基化形式、由链霉菌属(Streptomyces)(例如，阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii))产生的细菌抗生蛋白链菌素、截短的抗生蛋白链菌素、重组抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素，以及天然、脱糖基化和重组抗生物素蛋白以及天然、重组和截短的抗生蛋白链菌素的衍生物，例如N-酰基抗生物素蛋白，例如N-乙酰基、N- 酞酰基和N-琥珀酰基抗生物素蛋白，和商业产品ExtrAvidinTM、CaptavidinTM、 NeutravidinTM和Neutralite AvidinTM。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于分离标靶核酸分子的方法，其使用捕获部分以及相关组合物、试剂盒、系统和设备进行。在一些实施例中，所述方法(和相关组合物、系统、设备和试剂盒)可以包括使包括一群标靶核酸分子的样品与第一数目的捕获寡核苷酸分子接触。在一些实施例中，捕获寡核苷酸能够与所述标靶核酸分子群体的任一种、一些或全部成员选择性结合；此类选择性结合任选地包括捕获寡核苷酸的序列与所述群体的标靶核酸分子的序列之间的序列特异性杂交。在一些实施例中(并且与使用捕获寡核苷酸进行标靶富集的许多常规方法形成对比)，与标靶核酸分子接触的捕获寡核苷酸分子的第一数目可以是限制数目。“限制”意指，捕获寡核苷酸分子的数目显著少于样品内能够与捕获寡核苷酸结合的标靶核酸分子的数目。(此类实施例与使用捕获寡核苷酸进行标靶核酸分子富集的许多常规方法形成对比，在所述常规方法中捕获寡核苷酸的量/数目相对于标靶典型地是过量的)。任选地，捕获寡核苷酸分子的第一数目小于样品中能够与捕获寡核苷酸结合的标靶核酸分子的数目的50％、25％、10％、5％或1％。在一些实施例中，捕获寡核苷酸分子的浓度小于样品中能够与捕获寡核苷酸结合的标靶核酸分子的浓度的50％、25％、10％、5％或1％。在一些实施例中，捕获寡核苷酸分子的浓度小于样品中能够与捕获寡核苷酸结合的延伸的引物产物的浓度的50％、25％、 10％、5％或1％。在一些实施例中，所述捕获寡核苷酸以限速浓度存在于所述反应物中。在一些实施例中，与引物延伸产物和结合剂的浓度相比，捕获寡核苷酸以有限浓度存在。
在一些实施例中，捕获寡核苷酸与样品中的标靶核酸分子中的至少一些选择性结合 (例如，经由序列特异性杂交)，产生一群结合的标靶核酸分子。在一些实施例中，所述方法进一步包括使用与捕获寡核苷酸选择性结合的试剂捕获结合的标靶核酸分子中的至少一些，产生一群捕获的标靶核酸分子。在一些实施例中，捕获的标靶核酸分子群体中的捕获的标靶核酸分子的数目与捕获寡核苷酸分子的第一数目成正比。此特征可以允许从多个样品平行回收实质上相等数目的捕获的标靶核酸分子，而不需要个别地测量此类样品的核酸分子的数目。在一些实施例中，捕获的标靶核酸分子群体中的捕获的标靶核酸分子的浓度与捕获寡核苷酸分子的浓度成正比。此特征可以允许从多个样品平行回收实质上相等浓度的捕获的标靶核酸分子，而不需要个别地测量此类样品的浓度。在一些实施例中，对于每个样品，捕获的标靶核酸分子的浓度或数目变化不超过5倍、4倍、 3倍或2倍，无关于标靶核酸分子的初始输入浓度。
在一些实施例中，捕获寡核苷酸包括与结合剂选择性结合的捕获部分。举例来说，捕获部分可以包括结合对的第一成员，并且结合剂可以包括相同结合对的第二成员。在一些实施例中，捕获寡核苷酸包括生物素捕获部分，并且结合剂是含抗生蛋白链菌素的载体。在一些实施例中，捕获寡核苷酸可以是在溶液中游离的或连接到固体载体。在一些实施例中，结合剂可以连接到基于固体或半固体的载体，例如载玻片、通道、孔、多孔珠子、磁珠等。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于从样品分离特定数目的核酸分子的方法(和相关组合物、系统、设备和试剂盒)，其包含：通过使包括一群标靶核酸分子的样品与限制数目的捕获寡核苷酸在其中捕获寡核苷酸中的至少一些与标靶核酸分子中的至少一些杂交的条件下接触，来产生一群结合的标靶核酸分子。任选地，所述方法进一步包括通过捕获相当大部分的结合的标靶核酸分子群体，来形成一群捕获的标靶核酸分子，其中捕获的标靶核酸分子的数目与捕获寡核苷酸的限制数目成正比。
在一些实施例中，本发明大体上涉及一种用于使两种或更多种核酸样品的浓度正规化的方法，其包含：根据本文中所公开的方法从第一样品形成第一群捕获的标靶核酸分子，和根据相同方法从第二样品形成第二群捕获的标靶核酸分子，其中第一和第二群捕获的标靶核酸分子中的捕获的标靶核酸分子的浓度从彼此变化不超过5倍。在一些实施例中，第一和第二群捕获的标靶核酸分子中的捕获的标靶核酸分子的浓度在约2倍、3 倍或4倍范围内变化。
在一些实施例中，捕获寡核苷酸包括与标靶核酸分子内的对应捕获序列实质上互补的捕获序列。捕获寡核苷酸与标靶核酸分子的捕获序列之间形成的杂交物的Tm(在本文中被称为“捕获Tm”)可以是低于约50℃、45℃、40℃、35℃、30℃、25℃、20℃或更低。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包括使用捕获寡核苷酸，所述捕获寡核苷酸可以在允许条件下捕获标靶核酸分子或与标靶核酸分子杂交，但其在非允许条件下不会显著捕获标靶核酸分子或与标靶核酸分子杂交。允许条件可以包括例如较低温度(例如，温度显著低于捕获Tm)、高盐(例如，NaCl浓度是0.25M、0.3M、0.4M、0.5M、0.75 M、1M或更高)、低水平或不存在变性化学品等。非允许条件可以包括例如较高温度(例如，温度显著高于捕获Tm)、低水平或不存在盐(例如，NaCl浓度是0.2M、0.1M、 0.05M、0.001M或更低)、低水平或不存在变性化学品等。
在一些实施例中，所公开的方法可以包括使样品中的一群标靶核酸分子与限制数目的捕获寡核苷酸在允许条件下杂交以形成一群结合的标靶核酸分子，通过用结合剂捕获结合的标靶核酸分子来捕获结合的标靶分子以形成一群捕获的标靶核酸分子，和然后使捕获的核酸分子经历非允许条件以将捕获的核酸分子从结合剂洗脱，由此形成一群洗脱的标靶核酸分子。洗脱的标靶核酸分子的数目与杂交步骤中所用的捕获寡核苷酸的限制数目成正比。在一些实施例中，对于每个样品使用相同数目的捕获寡核苷酸以此方式平行加工多个样品，并且所述方法进一步包括从每个样品回收实质上相等数目或浓度的洗脱的标靶核酸分子。在一些实施例中，所述方法可以包括一个或多个条形码。举例来说，用以索引反应物内的每个样品。
在包括纯化引物延伸产物(包括经由扩增工艺(例如等温扩增、滚环扩增、桥式PCR和PCR)形成的引物延伸产物)的实施例中，尽管使用具有二级结构的引物(例如发夹引物或茎环引物)来驱动引物延伸，但可能需要避免由捕获寡核苷酸非故意地捕获未延伸的引物。因此，在一些实施例中，本发明大体上涉及用于分离引物延伸产物的组合物，其包含发夹寡核苷酸，所述发夹寡核苷酸具有第一发夹序列和第二发夹序列。在一些实施例中，第一和/或第二发夹序列各自独立地是3与100个之间核苷酸长，例如5与20个之间核苷酸长。在一些实施例中，发夹寡核苷酸包括与发夹寡核苷酸内的第二发夹序列实质上或完全互补的第一发夹序列。第一与第二发夹序列之间形成的杂交物的Tm(在本文中被称为“发夹Tm”)可以是低于约50℃、45℃、40℃、35 ℃、30℃、25℃、20℃或更低。
因此，在一些实施例中，本发明大体上涉及用于分离引物延伸产物的组合物，其包含茎环寡核苷酸，所述茎环寡核苷酸具有第一茎环序列和第二茎环序列。在一些实施例中，第一和/或第二茎环序列各自独立地是3与100个之间核苷酸长，例如5与20个之间核苷酸长。在一些实施例中，茎环寡核苷酸包括与茎环寡核苷酸内的第二茎环序列实质上或完全互补的第一茎环序列。第一与第二茎环序列之间形成的杂交物的Tm(在本文中被称为“茎环Tm”)可以是低于约50℃、45℃、40℃、35℃、30℃、25℃、20℃或更低。
在一些实施例中，发夹引物或茎环引物在允许条件下将主要以杂交或发夹或茎环形式存在，并且在非允许条件下主要以线性或变性形式存在。允许条件可以包括例如较低温度(例如，温度显著低于发夹Tm)、高盐(例如，NaCl浓度是0.25M、0.3M、0.4M、 0.5M、0.75M、1M或更高)、低水平或不存在变性化学品等。非允许条件可以包括例如较高温度(例如，温度显著高于发夹Tm)、低水平或不存在盐(例如，NaCl浓度是 0.2M、0.1M、0.05M、0.001M或更低)、低水平或不存在变性化学品等。在一些实施例中，所述方法可以包括针对发夹或茎环形成的允许条件和针对捕获标靶杂交的非允许条件。在一些实施例中，所述方法可以包括针对发夹或茎环形成的非允许条件和针对捕获-标靶杂交的允许条件。在一些实施例中，所述方法可以包括针对发夹或茎环形成和捕获标靶杂交两者的允许条件。在一些实施例中，所述方法可以包括针对发夹或茎环形成和捕获标靶杂交两者的非允许条件。
在一些实施例中，所公开的方法可以包括使样品中的一群标靶核酸分子与茎环引物在非允许条件下杂交以形成一群茎环引物-标靶复合物，和使茎环引物以模板依赖性方式延伸以形成茎环引物延伸产物。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括使引物延伸混合物经历允许条件以诱导通过实质上全部未延伸的茎环引物形成茎环。这确保未延伸的茎环引物不会在后续捕获步骤期间与捕获寡核苷酸显著(或实质上)结合。
任选地，茎环引物的第一与第二茎环序列由间隔区间隔开。间隔区可以任选地包括一种或多种核苷酸或可以完全由非核苷酸基部分组成。在一些实施例中，间隔区包括无法由聚合酶复制的不可复制部分。此类不可复制部分可以包括无法负载由聚合酶进行的基于模板的核苷酸聚合的任何部分。举例来说，不可复制部分可以包括非核苷酸基部分 (例如，PEG或其它碳基间隔子、氨基酸或不被用以执行引物延伸的聚合酶识别的核苷酸类似物，例如尿嘧啶，结合DNA依赖性DNA聚合酶等)。当茎环引物用作用于通过聚合酶进行的模板依赖性核酸合成的模板时，聚合酶无法使合成的核酸链延伸超出不可复制部分。这典型地导致在茎环寡核苷酸的某一部分已经复制到相对链中之后停止或终止核酸合成，使茎环寡核苷酸的剩余部分保持单链。合成或复制的链可以保持与茎环寡核苷酸碱基配对，形成部分双链并且部分单链的茎环引物延伸产物。单链区任选地包括茎环引物的某一部分。
在一些实施例中，茎环引物延伸产物的单链区包括可以与捕获寡核苷酸中的对应捕获序列结合的捕获序列。任选地，茎环寡核苷酸的捕获序列与捕获寡核苷酸的捕获序列至少70％互补。在一些实施例中，茎环寡核苷酸和捕获寡核苷酸的捕获序列与彼此完全互补。
在一些实施例中，茎环寡核苷酸在高于茎环解链温度的温度(“第二解链温度”)下主要是单链的。在低于茎环解链温度的温度(“第一解链温度”)下，寡核苷酸的茎环形式占绝大多数。
任选地，所述组合物进一步包括标靶核酸分子。标靶核酸分子可以包括与茎环寡核苷酸的序列至少部分互补的序列。
任选地，所述组合物进一步包括捕获寡核苷酸。
在一些实施例中，标靶核酸分子可以包括与茎环寡核苷酸的序列至少部分互补的序列。
在一些实施例中，标靶核酸分子和捕获寡核苷酸各自分别地包括与第一和/或第二茎环序列至少部分互补的序列。
在一些实施例中，所公开的方法可以包括使样品中的一群标靶核酸分子与发夹引物在非允许条件下杂交以形成一群发夹引物-标靶复合物，和使发夹引物以模板依赖性方式延伸以形成发夹引物延伸产物。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括使引物延伸混合物经历允许条件以诱导通过实质上全部未延伸的发夹引物形成发夹。这确保未延伸的发夹引物不会在后续捕获步骤期间与捕获寡核苷酸显著(或实质上)结合。
任选地，发夹引物的第一与第二发夹序列由间隔区间隔开。间隔区可以任选地包括一种或多种核苷酸或可以完全由非核苷酸基部分组成。在一些实施例中，间隔区包括无法由聚合酶复制的不可复制部分。此类不可复制部分可以包括无法负载由聚合酶进行的基于模板的核苷酸聚合的任何部分。举例来说，不可复制部分可以包括非核苷酸基部分 (例如，PEG或其它碳基间隔子、氨基酸或不被用以执行引物延伸的聚合酶识别的核苷酸类似物，例如尿嘧啶，结合DNA依赖性DNA聚合酶等)。当发夹引物用作用于通过聚合酶进行的模板依赖性核酸合成的模板时，聚合酶无法使合成的核酸链延伸超出不可复制部分。这典型地导致在发夹寡核苷酸的某一部分已经复制到相对链中之后停止或终止核酸合成，使发夹寡核苷酸的剩余部分保持单链。合成或复制的链可以保持与发夹寡核苷酸碱基配对，形成部分双链并且部分单链的发夹引物延伸产物。单链区任选地包括发夹引物的某一部分。
在一些实施例中，发夹引物延伸产物的单链区包括可以与捕获寡核苷酸中的对应捕获序列结合的捕获序列。任选地，发夹寡核苷酸的捕获序列与捕获寡核苷酸的捕获序列至少70％互补。在一些实施例中，发夹寡核苷酸和捕获寡核苷酸的捕获序列与彼此完全互补。
在一些实施例中，发夹寡核苷酸在显著高于发夹解链温度(“发夹Tm”)的温度下主要是单链的。在显著低于发夹解链温度(“发夹Tm”)的温度下，寡核苷酸的发夹形式占绝大多数。
任选地，所述组合物进一步包括标靶核酸分子。标靶核酸分子可以包括与发夹寡核苷酸的序列至少部分互补的序列。
任选地，所述组合物进一步包括捕获寡核苷酸。
在一些实施例中，标靶核酸分子可以包括与发夹寡核苷酸的序列至少部分互补的序列。
在一些实施例中，标靶核酸分子和捕获寡核苷酸各自分别地包括与第一和/或第二发夹序列至少部分互补的序列。
在一些实施例中，可以选择捕获Tm以允许两种捕获序列在允许条件下杂交，其中两种捕获序列在非允许条件下变性。允许条件可以包括显著低于捕获Tm的任何温度(例如，室温或更低)。在一些实施例中，允许条件包括高盐浓度(例如，NaCl是0.1M或更高，典型地0.25M，甚至更典型地0.5M或更高)。在允许条件下捕获之后，可以任选地洗涤捕获的产物以去除非特异性结合的污染物。然后可以将经纯化的引物延伸产物经由暴露于非允许条件(例如，显著高于捕获Tm的温度和/或低盐浓度)从捕获寡核苷酸洗脱。因为用以执行捕获的捕获寡核苷酸的量是限制的，所以经纯化的引物延伸产物的量将与用以执行捕获的捕获寡核苷酸分子的数目成正比。当使用相同数目的捕获寡核苷酸对多个样品平行执行此类捕获时，从每个样品获得的经纯化的产物分子的数目应与分析中所用的捕获寡核苷酸分子的数目成正比。在一些实施例中，从每个样品回收的经纯化的产物分子的数目与彼此实质上相等。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于使一种或多种标靶核酸分子从样品正规化的试剂盒，其包含：包括引物的容器，所述引物具有第一引物序列和第二引物序列。任选地，引物可以包括不可复制部分。引物可以任选地包括抑制第一引物序列在第二解链温度下与第二引物序列杂交的任何适合二级结构。在一些实施例中，引物还任选地包括使得第一引物序列能够在第一解链温度下与第二引物序列杂交的任何核酸序列。在一些实施例中，试剂盒进一步包括包含捕获寡核苷酸的相同容器(或不同容器)。任选地，引物包括与捕获寡核苷酸的序列至少85％、90％、95％、98％或更多互补的序列。在一些实施例中，试剂盒可以包括与捕获寡核苷酸的捕获部分选择性结合的任何适合结合剂。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于使核酸样品正规化的试剂盒，其包含：包括发夹寡核苷酸的容器。发夹寡核苷酸可以包括本文中所公开的任何发夹寡核苷酸。在一些实施例中，试剂盒进一步包括包含捕获寡核苷酸的相同容器(或不同容器)。任选地，发夹寡核苷酸包括与捕获寡核苷酸的序列至少85％、90％、95％、98％或更多互补的捕获序列。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于使核酸样品正规化的试剂盒，其包含：包括茎环寡核苷酸的容器。茎环寡核苷酸可以包括本文中所公开的任何茎环寡核苷酸。在一些实施例中，试剂盒进一步包括包含捕获寡核苷酸的相同容器(或不同容器)。任选地，茎环寡核苷酸包括与捕获寡核苷酸的序列至少85％、90％、95％、98％或更多互补的捕获序列。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于从引物延伸反应混合物纯化引物延伸产物的方法(和相关组合物、试剂盒、系统和设备)，其包含：使引物与样品内的标靶核酸(或一群标靶核酸分子)杂交。任选地，引物包括第一引物序列和第二引物序列。第一和第二引物序列可以与彼此实质上或完全互补。第一与第二引物序列之间形成的杂交物的Tm(“发夹Tm”)可以是约50℃或更低。所述方法可以任选地包括形成包括引物和一种或多种标靶核酸分子的引物延伸反应混合物。所述方法可以包括使引物与样品的一种或多种标靶核酸分子在非允许温度下杂交，在所述温度下实质上全部(或显著部分) 的引物呈线性或延伸形式。在一些实施例中，所述方法进一步包括使引物在允许条件下以标靶依赖性方式延伸以形成一种或多种延伸的引物产物。在一些实施例中，所述方法进一步包括使包括一种或多种延伸的引物产物的引物延伸反应混合物经历非允许条件，使得实质上全部(或显著部分)的未延伸的引物呈实质上抑制引物与捕获寡核苷酸杂交的形式。所述方法可以进一步包括使延伸的引物与捕获寡核苷酸在允许捕获寡核苷酸与延伸的引物杂交的条件下接触。在一些实施例中，延伸的引物是部分双链并且部分单链的，并且捕获寡核苷酸与延伸的引物的单链部分内的序列杂交。在一些实施例中，引物可以是发夹或茎环引物。在一些实施例中，引物可以是具有二级结构的引物序列，所述二级结构实质上抑制引物在第一解链温度下与捕获寡核苷酸杂交并且使得引物序列能够在第二解链温度下与捕获寡核苷酸杂交。
在一些实施例中，本发明大体上涉及一种用于从引物延伸反应混合物纯化引物延伸产物的方法(和相关组合物和试剂盒)，其包含：使引物与一种或多种标靶核酸分子杂交。任选地，引物包括由不可复制部分间隔开的第一引物序列和第二引物序列。在一些实施例中，第一与第二引物序列可以由不可复制部分间隔开。在一些实施例中，所述方法进一步包括使引物以模板依赖性方式延伸以形成引物延伸产物，其具有包括第一引物序列的单链区。在一些实施例中，引物可以是发夹或茎环引物。在一些实施例中，引物可以是具备具有二级结构的序列的引物，所述二级结构实质上抑制引物在第一解链温度下与捕获寡核苷酸杂交；同时使得引物序列能够在第二解链温度下与捕获寡核苷酸杂交。
在一些实施例中，所述方法进一步包括使引物延伸产物与捕获寡核苷酸杂交，所述捕获寡核苷酸包括捕获部分。
在一些实施例中，所述方法进一步包括使用结合剂选择性捕获引物延伸产物，所述结合剂与捕获部分选择性结合。
在一些实施例中，捕获寡核苷酸包括与引物延伸产物的单链区的至少一部分实质上互补的序列。
在一些实施例中，捕获寡核苷酸包括与第一引物序列的至少一部分实质上互补的序列。
在一些实施例中，延伸在显著高于引物Tm的温度(“延伸温度”)下执行，使得引物的第一和第二引物序列在延伸温度下不与彼此实质上杂交。在一些实施例中，延伸在显著高于发夹引物的解链温度的温度下执行，使得第一和第二发夹引物序列在延伸温度下不与彼此实质上杂交。在一些实施例中，延伸在显著高于茎环引物的解链温度的温度下执行，使得第一和第二茎环引物序列在延伸温度下不与彼此实质上杂交。
在一些实施例中，引物延伸产物在显著低于引物Tm的温度(“捕获温度”)下与捕获寡核苷酸杂交，使得实质上全部未延伸的引物寡核苷酸在捕获温度下呈未延伸的形式。在一个实施例中，引物延伸产物在显著低于发夹Tm的温度(“捕获温度”)下与捕获寡核苷酸杂交，使得实质上全部未延伸的发夹引物寡核苷酸在捕获温度下呈发夹未延伸的形式。在另一个实施例中，引物延伸产物在显著低于茎环Tm的温度(“捕获温度”) 下与捕获寡核苷酸杂交，使得实质上全部未延伸的茎环寡核苷酸在捕获温度下呈茎环未延伸的形式。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于使用捕获寡核苷酸分离标靶核酸分子的试剂盒，以及相关组合物、方法、系统和设备。在一些实施例中，试剂盒(和相关组合物、系统、设备和方法)包括能够与一群标靶核酸分子的成员中的一者或某一部分选择性结合的捕获寡核苷酸。在一些实施例中，试剂盒可以任选地包括与可以与捕获寡核苷酸选择性结合的标靶核酸分子群体相比有限量或可以经稀释以便以限制数目存在的量的捕获寡核苷酸。在一些实施例中，捕获寡核苷酸可以按小于样品中能够与捕获寡核苷酸结合的标靶核酸分子的数目的50％、25％、20％、10％、5％或1％的量存在。在一些实施例中，捕获寡核苷酸包括与结合剂选择性结合的捕获部分。举例来说，捕获部分可以包括结合对的第一成员，并且结合剂可以包括相同结合对的第二成员。在一些实施例中，试剂盒可以进一步包括一种或多种具有二级结构的引物，所述二级结构实质上抑制引物在第一解链温度下与捕获寡核苷酸杂交；同时使得引物能够在第二解链温度下与捕获寡核苷酸杂交。在一个实施例中，具有如下二级结构的引物包括发夹或茎环引物，所述二级结构实质上抑制引物在第一解链温度下与捕获寡核苷酸杂交；同时使得引物能够在第二解链温度下与捕获寡核苷酸杂交。发夹或茎环引物可以包括本文中所公开的任何发夹或茎环引物。在一些实施例中，发夹引物包括与彼此互补并且在显著低于发夹Tm的温度下将与彼此杂交(形成发夹结构)的第一发夹序列和第二发夹序列。在一些实施例中，茎环引物包括与彼此互补并且在显著低于茎环Tm的温度下将与彼此杂交(形成茎环结构)的第一茎环序列和第二茎环序列。任选地，试剂盒可以进一步包括与捕获寡核苷酸选择性结合的结合剂。
在一些实施例中，所述方法(和相关试剂盒、系统、设备和组合物)可以适用于多种下游过程，例如核酸测序，包括但不限于从头测序、靶向重测序和合成组配；基因分型；法医分析；单核苷酸多态性(SNP)分析；表观遗传分析；拷贝数变异分析；基因表达分析；基因突变分析，包括但不限于检测、预后和/或诊断、检测和分析稀有或低频率等位基因突变。在另一个实施例中，如本文中所描述制备的捕获的标靶核酸分子可以经测序以从一群标靶核酸分子检测和/或识别生殖系或体细胞突变。
在一些实施例中，所述方法(以及相关试剂盒、组合物、设备和系统)可以适用于从一个或多个来源分析标靶核酸分子，所述来源例如基因组DNA或福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)DNA。在另一个实施例中，所述方法(以及相关试剂盒、组合物、设备和系统)可以适用于分析相同样品中的两个或更多个来源的基因组物质。
实例
实例1：图1描绘如实例2中所描述的正规化方法的非限制性例示性实施例，其中将标靶核酸分子使用PCR使用正向引物(对于正向链合成)和反向引物(对于反向链合成)扩增。引物包括与彼此互补并且在允许温度(例如，显著低于引物Tm的温度)下和/或在允许盐浓度下将与彼此杂交的第一引物序列和第二引物序列。引物还包括不可复制间隔子，其包含碳-18(C18)间隔子。扩增产物包括寡核苷酸，其一部分保持单链。扩增产物的单链区包括捕获序列，所述捕获序列与生物素化的捕获寡核苷酸上的对应捕获序列互补。捕获序列在50mM NaCl中具有约36℃的估算Tm。将扩增的产物通过与限制量的捕获寡核苷酸(133pM于75ul中)在允许温度(例如，室温或更低)和/或允许盐浓度(例如，0.5M NaCl或更大)下杂交而捕获。然后可以将捕获寡核苷酸-产物复合物使用结合剂抗生蛋白链菌素、例如经由与经抗生蛋白链菌素涂布的珠子混合而选择性捕获。可以将含有捕获的产物的珠子洗涤以去除非特异性地结合的物质。可以将捕获的扩增的产物通过以下方式从珠子洗脱：使用洗脱溶液(包括非允许(低)盐浓度)和 /或暴露于非允许(升高)温度，以使捕获寡核苷酸的捕获序列与扩增的产物的单链部分的捕获序列之间的杂交产物变性。在图1中，所公开的非限制性例示性方法利用发夹引物，所述发夹引物具有与彼此互补并且在第一解链温度下与彼此杂交的第一发夹引物序列和第二发夹引物序列。发夹引物还含有C-18间隔子。在此实例中，具有第一引物序列和第二引物序列的发夹引物在第二解链温度下将不会与彼此杂交。因此，扩增产物包括保持单链的第一引物序列。扩增产物的单链区包括捕获序列，所述捕获序列与生物素化的捕获寡核苷酸上的对应捕获序列互补。
如本领域普通技术人员将容易看出，本文中所公开的标靶富集方法可以有利地用以通过允许制备大量的含有实质上相等数目(或浓度)的核酸分子的核酸样品，而简化制备大量的用于分析的样品的工作流程并且减少其成本和工作量。
实例2：通过限制捕获寡核苷酸进行核酸库正规化
图2和3是从10个DNA样品(2个匹配的肺正常/肿瘤对，3个福尔马林固定的石蜡包埋的DNA样品(FFPE)，和3个高分子量DNA)获得的例示性代表性数据，使用 5ng、10ng和20ng的DNA输入使所述样品进行207重扩增子库制备工作流程。对于每个样品在每个输入水平下一式三份地制备库。
对这些核酸库的测序未展示对精确性(>99.5％)、扩增子呈现均匀性(>99％)或不具有链偏向的碱基(>99％)的不良作用。
方法和材料
使用Ion AmpliseqTM癌症热点组(Cancer Hotspot Panel)v2(生命技术,加利福尼亚州，目录号4475346)对于每个DNA样品从5ng、10ng或20ng开始，使十个人类DNA 样品(2个匹配的肺正常/肿瘤对，3个FFPE样品，和3个高分子量参考DNA)进行Ion AmpliSeq 2.0库制备工作流程(Ion AmpliseqTM库制备，公开部件号MAN0006735，生命技术,加利福尼亚州)。Ion AmpliseqTM癌症热点组是用以执行多重PCR的207重癌症组引物池，用于从经常在人类癌症基因中突变的基因组“热点”区制备扩增子库。
简单来说，工作流程如下。全部温度孵育都在PCR热循环仪中(除了室温)。除非另外指出，否则试剂来自Ion AmpliSeqTM库试剂盒2.0(生命技术,加利福尼亚州，目录号4480441)。
通过在20μL反应物中“预扩增”产生扩增子，所述反应物由1×Ion AmpliSeqTMHiFi主混合物(以Ion AmpliseqTM库试剂盒2.0，目录号4480441的组分销售)、1×IonAmpliseqTM癌症热点组v2引物(生命技术,加利福尼亚州，目录号4475346)和5ng、 10ng或20ng人类基因组DNA组成。将每个DNA样品在每个输入水平下一式三份地预扩增。将反应物分布到96孔PCR板(
Figure BDA0001319805220000271
光学96孔反应板，生命技术,加利福尼亚州，目录号N8010560)的个别孔中，将板密封并且如下孵育：在99℃下2分钟，然后20个循环(对于FFPE样品)或17个循环的99℃下15秒和60℃下4分钟，其后将热循环仪保持在10℃下。
通过以下方式制备来自预扩增的扩增子用于连接：用Ion FuPa试剂(2μL掺合物/孔)(以Ion AmpliseqTM库试剂盒2.0，目录号4480441的组分销售)在50℃下处理持续 10分钟，在55℃下10分钟，在60℃下10分钟，然后保持在10℃下。
通过以下方式实现测序衔接子的连接：添加4μL开关溶液(Switch Solution)(以Ion AmpliseqTM库试剂盒2.0，目录号4480441的组分销售)、2μL Ion AmpliseqTM衔接子(以Ion AmpliseqTM库试剂盒2.0，目录号4480441的组分销售)和2μL DNA连接酶(以 IonAmpliseqTM库试剂盒2.0，目录号4480441的组分销售)到每个孔中，接着在22℃下孵育30分钟，在72℃下10分钟，然后保持在10℃下。
将连接的扩增子通过以下方式纯化：添加45μL(1.5×体积)AMPure XP试剂盒(贝克曼库尔特(Beckman Coulter)，目录号A63880)到每个孔中，在室温下孵育5分钟，然后通过将PCR板放置在板磁体(DynaMagTM-96侧，生命技术，目录号12331D)上2 分钟将AMPure珠子抽取到球粒中。
通过移液管移出上清液，并且添加150μL的70％乙醇(v/v于水中)到每个孔中。将球粒通过以下方式洗涤：在磁体中拨动板位置两次以使球粒在孔中左右移动。通过移液管去除洗液，并且对于每个孔重复洗涤第二次。在去除第二洗液之后，使球粒在室温下干燥5分钟，然后将其再悬浮于50μL库扩增引物混合物(Platinum PCR SuperMix High Fidelity(以Ion AmpliseqTM库试剂盒2.0，目录号4480441的组分销售)加Equalizer引物(以400pM的浓度提供)的混合物)中。
使板返回到磁体持续2分钟，移出上清液以清洁孔，将板密封并且在98℃下孵育2分钟，接着是八个循环的98℃下15秒和60℃下1分钟，并且然后保持在10℃下。将等分试样(2μL)的每个扩增的核酸库稀释，以便根据说明书使用Ion库定量试剂盒(生命技术,加利福尼亚州，目录号4468802)通过qPCR进行过程内定量。
通过以下方式在不纯化的情况下使扩增的库直接从上文描述的库扩增过程当中正规化：添加25μL Equalizer捕获寡核苷酸(最终浓度133pM)，在室温下孵育5分钟，添加5μL DynaBeads MyOne抗生蛋白链菌素C1珠子(以Ion AmpliseqTM库试剂盒2.0，目录号4480441的组分销售)，洗涤并且再悬浮于二体积Equalizer洗涤缓冲液(10mM Tris pH 8，500mM NaCl，0.1M EDTA，0.05％Tween-20)中，在室温下孵育5分钟，接着如上文所描述使DynaBeads在板磁体上粒化。通过移液管移出上清液，并且添加150 μL/孔Equalizer洗涤缓冲液到每个孔中。将球粒通过以下方式洗涤：在磁体中拨动板位置三次以使球粒在孔中左右移动。通过移液管去除洗液，并且对于每个孔重复洗涤第二次。在去除第二洗液之后，将球粒再悬浮于50μL Equalizer洗脱缓冲液(10mM Tris pH 8，0.1mM EDTA，和0.1μg/μL肝糖)中，并且使板返回到磁体持续2分钟。移出含有正规化库的上清液以清洁孔。将等分试样的每个库稀释，以便根据制造商的说明书使用 Ion库定量试剂盒(生命技术,加利福尼亚州，目录号4468802)通过qPCR进行定量。
结果
在正规化之前通过qPCR定量核酸库.
将等分试样的全部90个库稀释5,000倍，并且一式三份地根据制造商的说明书用Ion 库定量试剂盒(生命技术,加利福尼亚州，目录号4468802)通过qPCR进行分析。
在库扩增之后并且正规化之前总库产量在4-94nM范围中(图2)。
在正规化之后通过qPCR定量核酸库.
将等分试样的全部90个库稀释100倍，并且一式三份地根据制造商的说明书用Ion库定量试剂盒(生命技术,加利福尼亚州，目录号4468802)通过qPCR进行分析。
在正规化之后最后库产量在33-204pM范围中，84/90(93％)库在70-200pM内(图3)。
实例3：通过限制捕获寡核苷酸进行核酸库正规化
图4和5是使用10ng的输入DNA(gDNA)从三个不同预扩增混合物和三个不同消化混合物获得的例示性代表性数据。基本上根据实例2制备库，有以下额外修改。与不含有清洁剂的预扩增混合物2和3(amp mix 2和3)相比，预扩增混合物1(amp mix 1)含有清洁剂。此外，消化物A(Dig'n A)含有来自一个来源的DNA聚合酶，而消化物B和C(Dig'n B和C)含有来自两个不同来源的DNA聚合酶。组1数据是指在30℃下洗脱的equalizer库，而组2数据是指在35℃下洗脱的equalizer库。
对这些核酸库的测序未展示对精确性(>99.5％)、扩增子呈现均匀性(>99％)或不具有链偏向的碱基(>99％)的不良作用。
结果
在正规化之前通过qPCR定量核酸库.
将等分试样的全部库稀释5,000倍，并且一式三份地根据制造商的说明书用Ion库定量试剂盒(生命技术,加利福尼亚州，目录号4468802)通过qPCR进行分析。
在库扩增之后并且正规化之前总库产量在14-15倍变异范围内(图4)。
在正规化之后通过qPCR定量核酸库.
将等分试样的全部库稀释100倍，并且一式三份地根据制造商的说明书用Ion库定量试剂盒(生命技术,加利福尼亚州，目录号4468802)通过qPCR进行分析。
在正规化之后最后库产量在1.5-1.6倍变化范围内(图5)。

Claims (11)

1.用于使所需量的核酸从样品正规化的方法，其包括：
a)在至少一些发夹引物与至少一些标靶核酸分子杂交的条件下，通过使包含标靶核酸分子的群体的样品与发夹引物接触来产生结合的标靶核酸分子的群体，所述发夹引物包括由不可复制部分间隔开的第一引物序列和第二引物序列，其中：
i)所述第一引物序列和第二引物序列实质上彼此互补并且具有第一Tm，其中第一引物序列的至少85％的残基与第二引物序列中的残基互补，
ii)所述第二引物序列结合标靶核酸分子的一部分，并且
iii)所述第一引物序列结合捕获寡核苷酸；
b)在显著高于第一Tm的温度下以模板依赖性方式延伸发夹引物以形成引物延伸产物，所述引物延伸产物具有单链区，所述单链区包括第一引物序列，从而发夹引物的第一和第二引物序列不与彼此实质上杂交，从而第一引物序列的少于85％的残基与第二引物序列中的对应残基碱基配对；
c)在显著低于第一Tm的温度下通过使结合的标靶核酸分子与有限的所需量的捕获寡核苷酸接触来形成捕获的标靶核酸分子的群体，从而未延伸的发夹引物处于发夹形式，其中所述捕获寡核苷酸包括捕获部分，从而捕获结合的标靶核酸分子的群体的所需部分，和
d)使结合的标靶核酸分子与结合至捕获部分的结合剂接触以捕获结合的标靶核酸分子，其中捕获的标靶核酸分子的数目与捕获寡核苷酸的限制数目成正比。
2.用于使两种或更多种核酸样品的浓度正规化的方法，其包括：根据权利要求1所述的方法从第一样品形成第一群捕获的标靶核酸分子，和根据权利要求1所述的方法从第二样品形成第二群捕获的标靶核酸分子，其中第一和第二群捕获的标靶核酸分子中的捕获的标靶核酸分子的数目彼此差异不超过5倍。
3.权利要求1的方法，其中捕获部分包含生物素部分。
4.权利要求1的方法，其中通过与所述引物延伸产物相比和/或与所述结合剂相比以限制浓度提供的捕获寡核苷酸来捕获结合的标靶核酸分子的群体。
5.权利要求1的方法，其中结合剂包括抗生蛋白链菌素。
6.权利要求1的方法，还包括使捕获的核酸分子经历非允许条件以从结合剂洗脱捕获的核酸分子，从而形成洗脱的标靶核酸分子的群体。
7.权利要求1的方法，其中结合剂包括载体。
8.权利要求7的方法，其中载体包括珠子。
9.权利要求1的方法，其中捕获寡核苷酸包括与引物延伸产物的单链区的至少一部分互补的序列。
10.用于使所需量的核酸从样品正规化的方法，其包括：
a)在至少一些发夹引物与至少一些标靶核酸分子杂交的条件下，通过使包含标靶核酸分子的群体的样品与发夹引物接触来产生结合的标靶核酸分子的群体，所述发夹引物包括由不可复制部分间隔开的第一引物序列和第二引物序列，其中所述第二引物序列结合标靶核酸分子的一部分，并且其中所述第一引物序列结合捕获寡核苷酸；
b)在显著高于第一Tm的温度下以模板依赖性方式延伸发夹引物以形成引物延伸产物，所述引物延伸产物具有单链区，所述单链区包括第一引物序列，从而发夹引物的第一和第二引物序列不与彼此实质上杂交，从而第一引物序列的少于85％的残基与第二引物序列中的对应残基碱基配对；
c)在显著低于第一Tm的温度下通过使结合的标靶核酸分子与有限的所需量的捕获寡核苷酸接触来形成捕获的标靶核酸分子的群体，从而未延伸的发夹引物处于发夹形式，其中所述捕获寡核苷酸包括捕获部分，从而捕获结合的标靶核酸分子的群体的所需部分，
d)使结合的标靶核酸分子与结合至捕获部分的结合剂接触以捕获结合的标靶核酸分子，其中捕获的标靶核酸分子的数目与捕获寡核苷酸的限制数目成正比；和
e)使捕获的核酸分子经历非允许条件以从结合剂洗脱捕获的核酸分子，从而形成标靶核酸分子的正规化群体。
11.权利要求10的方法，其中第一和第二群捕获的标靶核酸分子中的捕获的标靶核酸分子的浓度在2倍、3倍或4倍范围内变化。
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