CN110446791B

CN110446791B - 多核苷酸衔接子及其使用方法

Info

Publication number: CN110446791B
Application number: CN201880020535.1A
Authority: CN
Inventors: M·安德森; M·艾伦
Original assignee: Life Technologies Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2018-03-22
Publication date: 2024-04-16
Anticipated expiration: 2038-03-22
Also published as: EP3601611B1; CN110446791A; EP3601611A1; EP4053294A1; WO2018175798A1; US20200377935A1

Abstract

提供了用于减少不利的二聚体形成并由此改善文库制备(例如用于测序)的方法和组合物。组合物和方法包括衔接子，其包含延伸的5'突出端序列和平端或T突出端3'序列至靶核酸的末端，以促进这些序列的扩增和分析。

Description

多核苷酸衔接子及其使用方法

相关申请

本申请要求2017年3月24日提交的美国临时申请62/476,541的优先权和权益。将上述申请的全部内容通过引用整体并入。

在本申请中，引用各种公开案、专利案和/或专利申请案。所述公开案、专利案和/或专利申请案的公开内容在此以全文引用的方式并入本申请案中以便更充分地描述本发明所涉及的目前最先进的水平。

序列表

本申请在此以引用的方式并有与此同时提交的电子序列表材料。电子序列表中的材料以创建于2018年2月28日的标题为“LT01237US_ST25.txt”的文本(.txt)文件提交，且通过引用完整并入本文。

技术领域

本发明涉及用于文库制备和测序方法的新型多核苷酸衔接子。

发明内容

已经开发了用于产生用于分析(例如，测序)的核酸分子文库的改进方法。提供了用于减少不利的二聚体形成并由此改善文库制备(例如用于测序)的方法和组合物。方法包括向靶核酸的末端添加衔接子(即序列)以促进这些序列的扩增和分析。

例如，含有引物序列的衔接子可以连接到靶核酸序列的末端。在连接反应中可以使用单个衔接子或两个不同的衔接子。这些方法使得相同或不同、已知或未知序列的多个靶核酸分子能够在单个扩增反应中扩增。然后，此类靶分子可用于例如分析方法，例如测序技术。制备常规文库的一个缺点包括衔接子-二聚体的形成，其在包括使用本文提供的组合物的采用方法中减少。

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。将通过参考阐述其中使用本发明原理的说明性实施方案和其附图的以下具体实施方式来获得对本发明特征和优势的更佳理解：

附图说明

图1A描绘了在本文的方法中提供和使用的示例性衔接子。硫代磷酸酯键用星号表示。

图1B描绘了在本文的方法中提供和使用的示例性衔接子。

图1C描绘了在本文的方法中提供和使用的示例性衔接子。

图1D描绘了在本文的方法中提供和使用的示例性衔接子。硫代磷酸酯键用星号表示。

图2是描绘通过qPCR测量的文库产量的图。将全长(Std)衔接子、3'修饰的全长(AA)衔接子、未保护的短(34)衔接子、氨基保护的短(34氨基)衔接子和硫代磷酸酯保护的短(34pT)衔接子一式两份用于扩增子连接反应中。

图3描绘了衔接子的测序性能，如通过均一性、端对端测序和链偏向确定的。将全长(Std)衔接子、3'修饰的全长(AA)衔接子、未保护的短(34)衔接子、氨基保护的短(34氨基)衔接子和硫代磷酸酯保护的短(34pT)衔接子各自连接到扩增子文库，然后进行序列性能评估。

具体实施方式

衔接子二聚体在NGS应用中是有问题的，因为它可以被有效扩增并且将在测序反应中与流动细胞结合，然而，将产生无用的数据。因此，衔接子产生尽可能少的二聚体是很重要的。因此，提供了用于减少二聚体形成和改进的文库制备的改进的组合物和方法。

在一个方面，提供了包含衔接子序列的组合物，所述衔接子序列具有5'延伸的突出端序列和3'平端或T突出端序列，其中所述衔接子在其3'端包含小于长度的60、55、50、45或40百分比的短反向互补序列。5'衔接子序列和3'衔接子序列能够连接到感兴趣的扩增子靶序列。

在一些实施方案中，衔接子包含核酸，包括DNA、RNA、RNA/DNA分子或其类似物。在一些实施方案中，衔接子可包含一个或多个脱氧核糖核苷或核糖核苷残基。在一些实施方案中，衔接子可以是单链或双链核酸，或可以包括单链和/或双链部分。

在一些实施方案中，衔接子可具有任何长度，包括长度小于10个碱基，或长度为约10-20个碱基，或长度为约20-50个碱基，或长度为约25-75个碱基，或更长。

在一些实施方案中，衔接子可包括与靶多核苷酸的任何部分、捕获引物、融合引物、溶液相引物、扩增引物或测序引物相同或互补的核苷酸序列。

在一些实施方案中，衔接子可具有5'突出尾部。在一些实施方案中，尾部可以是任何长度，包括长度为1-50或更多个核苷酸。

在一些实施方案中，5'和3'衔接子在其3'末端各自包含小于长度的65％、60％、55％、50％、45％或40％的短反向互补序列。在一些实施方案中，5'衔接子在其3'末端包含小于长度的60％、55％、50％、45％或40％的短反向互补序列。在其他实施方案中，3’衔接子在其3'末端包含小于长度的60％、55％、50％、45％或40％的短反向互补序列。

在一些实施方案中，衔接子包含单链5'突出端。在特定的实施方案中，5'衔接子包含单链5'突出端。在另外或其他特定实施方案中，3'衔接子包含单链5'突出端。在某些实施方案中，衔接子在长度的至少30％、40％、45％、50％、55％或60％包含5'突出端序列。

在一些实施方案中，衔接子包含修饰序列。在特定的实施方案中，衔接子是3'-硫代磷酸酯保护的衔接子。在另一个特定的实施方案中，衔接子是3'-氨基修饰的衔接子。

在一些实施方案中，衔接子可包括简并序列。在一些实施方案中，衔接子可包括一个或多个肌苷残基。在一些实施方案中，衔接子可包括至少一个易裂开连接(scissilelinkage)。在一些实施方案中，易断开连接可易受酶或化学化合物的裂解或降解。任选地，衔接子包括至少一个尿嘧啶碱基。在一些实施方案中，衔接子可包括至少一个磷代硫醇酯(phosphorothiolate)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、和/或氨基磷酸酯连接。

在一些实施方案中，衔接子可具有平端和/或粘端的任何组合。在一些实施方案中，衔接子的至少一个末端可与核酸片段的至少一个末端相容。在一些实施方案中，衔接子的相容末端可以与核酸片段的相容末端连接。在一些实施方案中，衔接子可具有5'或3'突出端。

在一些实施方案中，5'和3'衔接子是线性的。在一些实施方案中，5'和3'衔接子是平端的。在一些实施方案中，5'和3'衔接子在其3'末端包含T突出端。在某些实施方案中，5'和3'衔接子中的一个是平端的，并且5'和3'衔接子中的一个在其3'末端包含T突出端。

在一些实施方案中，反向互补寡核苷酸衔接子序列选自SEQ ID NO：3、4或5，或选自SEQ ID NO：7、8或9。

在特定实施方案中，正向寡核苷酸衔接子序列包含SEQ ID NO：1，反向互补寡核苷酸衔接子序列选自SEQ ID NO：3、4或5。在特定实施方案中，正向寡核苷酸衔接子序列包含SEQ ID NO：6，反向互补寡核苷酸衔接子序列选自SEQ ID NO：7、8或9。

在某些实施方案中，组合物包含5'衔接子和3'衔接子寡核苷酸中的每一个。

在一些实施方案中，第一和第二衔接子具有通用序列。

在一些实施方案中，衔接子可包括唯一标识符序列(例如，条形码或索引序列)。

在一些实施方案中，条形码衔接子可用于构建靶多核苷酸的多重文库。在一些实施方案中，条形码衔接子可以附加到靶多核苷酸上并用于分选或追踪靶多核苷酸的来源。在一些实施方案中，一个或多个条形码/索引序列可以允许在具有不同条形码序列的不同衔接子的混合物之中鉴别特定衔接子。举例来说，混合物可以包括2个、3个、4个、5个、6个、7-10个、10-50个、50-100个、100-200个、200-500个、500-1000个或更多个具有独特条形码序列的不同衔接子。

在一些实施方案中，衔接子可包括任何类型的限制酶识别序列，包括I型、II型、lIs型、IIB型、III型、IV型限制酶识别序列，或具有回文或非回文识别序列的识别序列。

在一些实施方案中，衔接子可包括细胞调节序列，其包括启动子(诱导型或组成型)、增强子、转录或翻译起始序列、转录或翻译终止序列、分泌信号、Kozak序列、细胞蛋白结合序列等。

另一方面，提供了减少衔接子二聚体形成的方法。在某些实施方案中，该方法包括在形成5'-衔接子-靶-3'-衔接子序列的条件下使包含目的靶核酸序列的样品与本发明的5'和3'衔接子接触。在一些实施方案中，5'和3'衔接子在其3'末端各自包含小于衔接子长度的百分之七十(70％)的短反向互补序列。在这些方法中，与不存在寡核苷酸时的量(例如，在具有全长反向互补序列的衔接子序列的存在下)相比，衔接子二聚体形成的量减少。在一些实施方案中，少于25％、20％、15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的衔接子形成由该方法产生的二聚体。

在一些实施方案中，该方法包括使用5'和3'衔接子，每个衔接子在其3'末端包含小于长度的65％、60％、55％、50％、45％或40％的短反向互补序列。在特定实施方案中，5’衔接子在其3'末端包含小于长度的60％、55％、50％、45％或40％的短反向互补序列。在另外或其他特定实施方案中，3’衔接子在其3'末端包含小于长度的60％、55％、50％、45％或40％的短反向互补序列。

另一方面，提供了制备核酸序列文库的方法。在某些实施方案中，该方法包括使本发明的第一和第二衔接子寡核苷酸与包含靶核酸序列的样品在形成5'-衔接子-靶-3'-衔接子连接产物的条件下接触。在一些实施方案中，衔接子寡核苷酸包含5'和3'衔接子，每个衔接子在其3'末端具有小于衔接子长度的百分之七十(70％)的短反向互补序列并形成连接产物，其中连接产物形成核酸序列文库。在这些方法中，与不存在寡核苷酸时的量(例如，在具有全长反向互补序列的衔接子序列的存在下)相比，衔接子二聚体形成的量减少。在一些实施方案中，少于25％、20％、15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的衔接子形成由该方法产生的二聚体。

在一些实施方案中，提供的方法还包括扩增连接产物以产生核酸序列文库。在一些另外的实施方案中，提供的方法还包括分析连接产物的序列。在特定实施方案中，分析方法包括对连接产物进行测序。

在一些实施方案中，寡核苷酸衔接子不与目标靶核酸序列互补。优选地，靶核酸分子包含两个或更多个并且至多100,000个不同的序列。

另一方面，提供了用于减少衔接子形成的试剂盒和制备核酸序列文库的改进方法，其包含一种或多种本文提供的衔接子组合物。在一些实施方案中，试剂盒包含两种或更多种衔接子。在特定的实施方案中，试剂盒包含5'衔接子和3'衔接子，其用于本文提供的方法中。任选地，试剂盒包含一种或多种选自缓冲液、酶(例如连接酶、聚合酶)、dNTP的组分。

所提供的组合物和组分可以与本文所述的其他组合物和方法结合使用。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。本文(上文和下文)中所提及的所有专利、专利申请、公布的申请、论文和其它公开案都以全文引用的方式并入。如果在本文中阐述的定义和/或描述与以引用的方式并入本文中的专利、专利申请、公布的申请和其它公开案中所阐述的任何定义相反或不一致，那么本文中所阐述的定义和/或描述优先于以引用的方式并入的定义。

注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述”以及任何词语的任何单数使用包含复数指示物，除非明确和确切地限于一个指示物。如本文所用，术语“包含”和其语法变型旨在是非限制性的，使得列表中项目的叙述不排除可以替换或添加到所列项目的其它相似的项目。

如本文中所使用，术语“衔接子”或“衔接子和其补体”以及其派生词通常指可与靶核酸序列连接的本公开的任何线形寡核苷酸。任选地，衔接子包括基本上不与样品内至少一个靶序列的3'端或5'端互补的核酸序列。在一些实施方案中，衔接子基本上不与样品中任何靶序列的3'端或5'端互补。在一些实施方案中，衔接子包括任何基本上不与经扩增的靶序列互补的单链或双链线形寡核苷酸。在一些实施方案中，衔接子基本上不与样品的至少一个、一些或全部核酸分子互补。在一些实施方案中，适合的衔接子长度在约10-100个核苷酸、约12-60个核苷酸和约15-50个核苷酸长度范围内。通常，衔接子可包括核苷酸和/或核酸的任何组合。在一些方面中，衔接子可在一个或多个位置包括一个或多个可裂解基团。在另一个方面中，衔接子可包括与引物(例如通用引物)的至少一部分基本上一致或基本上互补的序列。在一些实施方案中，衔接子可包括条形码或标签以辅助下游编目、鉴别或测序。在一些实施方案中，当与经扩增的靶序列连接时，尤其在存在聚合酶和dNTP的情况下在适合的温度和pH值下，单链衔接子可充当用于扩增的底物。

如本文中所使用，“扩增”或“扩增反应”和其派生词通常指用于将核酸分子(称为模板核酸分子)的至少一部分复写或复制到至少一个其它核酸分子中的任何作用或过程。其它核酸分子任选地包括与模板核酸分子的至少某一部分实质上一致或大体上互补的序列。模板核酸分子可以是单链或双链并且另一个核酸分子可以独立地是单链或双链。在一些实施方案中，扩增包括模板依赖性活体外酶催化反应，其用于制备核酸分子的至少某一部分的至少一个拷贝或制备与核酸分子的至少某一部分互补的核酸序列的至少一个拷贝。扩增任选地包括核酸分子的线性或指数复制。在一些实施方案中，使用等温条件进行这类扩增；在其它实施方案中，这类扩增可包括热循环。在一些实施方案中，扩增是多元扩增，其包括在单次扩增反应中同时扩增多个靶序列。至少一些靶序列可单次扩增反应中所包括的相同核酸分子或不同靶核酸分子上。在一些实施方案中，“扩增”包括单独或呈组合形式的基于DNA和RNA的核酸的至少某一部分的扩增。扩增反应可包括单链或双链核酸底物并且可进一步包括所属领域的一般技术人员已知的扩增方法中的任一种。在一些实施方案中，扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)。

如本文中所使用，“扩增条件”和其派生词通常指适用于扩增一个或多个核酸序列的条件。这类扩增可以是线性或指数的。在一些实施方案中，扩增条件可包括等温条件或可包括热循环条件，或等温和热循环条件的组合。在一些实施方案中，适用于扩增一个或多个核酸序列的条件包括聚合酶链反应(PCR)条件。通常，扩增条件指足以扩增核酸(如一个或多个目标序列)或扩增连接到一个或多个衔接子的经扩增的目标序列(例如衔接子连接的经扩增的目标序列)的反应混合物。通常，扩增条件包括用于扩增或用于核酸合成的催化剂，例如聚合酶；与待扩增的核酸具有一定程度的互补性的引物；以及核苷酸，诸如脱氧核糖核苷酸三磷酸酯(dNTP)，以促进与核酸杂交之后引物的延伸。扩增条件可能需要引物与核酸的杂交或退火，引物的延伸和变性步骤，其中经延伸的引物与经历扩增的核酸序列分离。通常但未必，扩增条件可包括热循环，在一些实施方案中，扩增条件包括多个循环，其中重复退火、延伸和分离步骤。通常，扩增条件包括阳离子，如Mg⁺⁺或Mn⁺⁺(例如MgCl₂等)，并且还可以包括多种离子强度调节剂。

如本文中所使用，“平端连接”和其派生词通常指两个平端双链核酸分子彼此连接。“平端”指其中核酸分子的一个股的末端中的基本上所有核苷酸与同一个核酸分子的另一个股中的相对核苷酸碱基配对的双链核酸分子的末端。如果核酸分子具有包括长度超过两个核苷酸的单链部分的末端(本文中称为“突出”)，那么其不是平端的。在一些实施方案中，核酸分子的末端不包括任何单链部分，使得末端的一个股中的每个核苷酸与同一个核酸分子的另一个股中的相对核苷酸碱基配对。在一些实施方案中，变成彼此连接的两个平端核酸分子的末端不包括任何重叠、共有或互补序列。通常，平端连接不包括使用其它寡核苷酸衔接子帮助双链经扩增的靶序列与双链衔接子的连接，如2010年5月27日公开的Mitra和Varley,US2010/0129874中所描述的补丁寡核苷酸。在一些实施方案中，平端连接包括接口平移反应以密封在连接过程期间产生的接口。

如本文所用，术语“包含(comprises/comprising)”、“包括(includes/including)”、“具有(has/having)”或其任何其它变化形式打算涵盖非排它性的包括。举例来说，包含一列特征的工艺、方法、物件或设备不一定仅限于那些特征，而是可包括没有明确列出或这类工艺、方法、物件或设备所固有的其它特征。另外，除非明确相反地陈述，否则“或”是指包括性的或而不是排它性的或。

如本文所用，“可比较的最大最小解链温度”及其衍生词通常是指切割可切割基团后单个衔接子或靶特异性引物的每个核酸片段的解链温度(Tm)。比较由单个衔接子或靶特异性引物产生的每个核酸片段的杂交温度，以确定防止靶特异性引物或衔接子的任何核酸片段与靶序列杂交所需的最大最小温度。一旦知道最大杂交温度，就可以操作衔接子或靶特异性引物，例如通过沿着引物的长度移动可切割基团的位置，以获得相对于每个核酸片段的可比较的最大最小解链温度。

如本文中所使用，术语“互补”和“补体”以及其派生词指可在反平行定向(如在杂交双螺旋中)的两个或更多个个别相应位置经历累积碱基配对的任何两个或更多个核酸序列(例如部分或全部模板核酸分子、靶序列及/或引物)。这类碱基配对可根据任何现有规则集合进行，例如根据沃森-克里克碱基配对规则(Watson-Crick base pairing rules)或根据一些其它碱基配对范例。任选地，第一与第二核酸序列之间可以存在“完全”或“总体”互补性，其中第一核酸序列中的每个核苷酸可以经历与第二核酸序列上的相应的反平行位置中的核苷酸的稳定化碱基配对相互作用。“部分”互补性描述一个核酸序列的至少20％但少于100％的残基与另一个核酸序列残基互补的核酸序列。在一些实施方案中，一个核酸序列的至少50％但少于100％的残基与另一个核酸序列中的残基互补。在一些实施方案中，一个核酸序列的至少70％、80％、90％、95％或98％但少于100％的残基与另一个核酸序列中的残基互补。当一个核酸序列的至少85％的残基与另一个核酸序列中的残基互补时，序列被称为“基本上互补”。在一些实施方案中，两个互补或基本上互补序列能够在标准或严格杂交条件下彼此杂交。“非互补”描述其中一个核酸序列的少于20％的残基与另一个核酸序列中的残基互补的核酸序列。当一个核酸序列的少于15％的残基与另一个核酸序列中的残基互补时，序列被称为“基本上非互补”。在一些实施方案中，两个非互补或基本上非互补序列无法在标准或严格杂交条件下彼此杂交。“错配”存在于不互补的两个相对核苷酸中的任何位置。互补核苷酸包括在生理条件下在DNA复制期间通过与彼此相对的DNA聚合酶有效并入的核苷酸。在典型实施方案中，在彼此位于反平行位置的核苷酸及/或多核苷酸的核碱基之间，互补核苷酸可彼此形成碱基对，如通过特异性沃森-克里克型氢键形成的A-T/U和G-C碱基对，或通过某种其它类型的碱基配对范例形成的碱基对。其它人工碱基对的互补性可以是基于其它类型的氢键和/或碱基的疏水性和/或碱基之间的形状互补性。

如本文中所使用，当关于两种或更多种组分使用时，“接触”和其派生词通常是指用于促进或实现参考组分的接近、靠近、混合物或共混而未必需要这类组分的物理接触的任何过程，并且包括含有所述参考组分中的任一种或多种的溶液的彼此混合。所提及的组分可以任何具体顺序或组合接触并且组分引述的具体顺序不具限制性。例如，“使A与B和C接触”包括其中A首先与B然后与C接触的实施方案，以及其中C与A然后与B接触的实施方案，以及其中A和C的混合物与B接触的实施方案，等等。此外，这种接触不一定要求接触过程的最终结果是包括所有提及组分的混合物，只要在接触过程中的某些时间点，所有提及组分同时存在或同时包含在同一混合物或溶液中。例如，“使A与B和C接触”可包括C与A首先接触而形成第一混合物、该第一混合物然后与B接触而形成第二混合物、然后将C从第二混合物除去；任选地然后将A也除去的实施方案。当待接触的一个或多个提及组分包括多个(例如，“使靶序列与多个靶特异性引物和聚合酶接触”)时，所述多个中的每个成员可以被视为接触过程的单个组分，使得接触可以包括多个中的任何一个或多个成员与多个中的任何其他成员和/或与任何其他提及组分以任何顺序或组合接触(例如，多个靶特异性引物中的一些但不是全部可以接触靶序列，然后是聚合酶，然后与多个靶特异性引物的其他成员接触)。

如本文中所使用，“DNA条形码”或“DNA标记序列”或“索引”和其派生词通常是指可充当‘用于区分或分离样品中多个经扩增的目标序列'的衔接子内的独特短(6-14个核苷酸)核酸序列。出于本发明的目的，DNA条形码或DNA标记序列或索引序列可以并入衔接子的核苷酸序列中。

如本文中所使用，当关于核酸分子(例如靶序列或经扩增的靶序列)使用时，术语“末端”和其派生词可包括核酸分子的末端30个核苷酸、末端20和甚至更通常末端15个核苷酸。包含一连串相邻核苷酸的线形核酸分子通常包括至少两个末端。在一些实施方案中，核酸分子的一端可包括3’羟基或其等效物，并且可称为“3’端”和其衍生物。任选地，3'端包括未连接到单核苷酸戊糖环的5'磷酸基的3'羟基。典型地，3'端包括经定位与包括未连接的3'羟基的核苷酸相邻的一个或多个5'连接的核苷酸，通常经定位与3'羟基相邻的30个核苷酸，通常末端20个并且甚至更通常末端15个核苷酸。通常，一个或多个连接的核苷酸可表示成寡核苷酸中存在的核苷酸的百分比，或可以与未连接的3'羟基相邻的许多连接的核苷酸形式提供。举例来说，3'端可占寡核苷酸的核苷酸长度的小于50％。在一些实施方案中，3'末端不包括任何未连接的3'羟基，但可包括任何能够充当核苷酸通过引物延伸和/或核苷酸聚合进行的连接的位点的部分。在一些实施方案中，例如当参考靶特异性引物时，术语“3'端”可包括3'端处的末端10个核苷酸、末端5个核苷酸、末端4、3、2或更少个核苷酸。在一些实施例中，当参考目标特异性引物时，术语“3'端”可包括位于核苷酸位置10的核苷酸或更少的来自3'端的核苷酸。

如本文中所使用，“5'端”和其派生词通常指核酸分子(例如目标序列或经扩增的目标序列)的末端，其包括自由5'磷酸基或其等效物。在一些实施例中，5'端包括未连接到相邻单核苷酸戊糖环的3'羟基的5'磷酸基。通常，5'端包括经定位与5'磷酸相邻的一个或多个连接的核苷酸，通常经定位与包括5'磷酸基的核苷酸相邻的30个核苷酸，通常末端20个并且甚至更通常末端15个核苷酸。通常，一个或多个连接的核苷酸可表示成寡核苷酸中存在的核苷酸的百分比，或可以与5'磷酸相邻的许多连接的核苷酸形式提供。举例来说，5'端可小于寡核苷酸的核苷酸长度的50％。在另一个例示性实施例中，5'端可包括与包括末端5'磷酸的核苷酸相邻的约15个核苷酸。在一些实施方案中，5'端不包括任何未连接的5'磷酸基，但可包括任何能够充当与3'羟基或另一个核酸分子的3'端的连接位点的部分。在一些实施方案中，例如当参考靶特异性引物时，术语“5'端”可包括5'端处的末端10个核苷酸、末端5个核苷酸、末端4、3、2或更少个核苷酸。在一些实施方案中，当参考靶特异性引物时，术语“5'端”可包括位于核苷酸位置10的核苷酸或更少的来自5'端的核苷酸。在一些实施方案中，靶特异性引物的5'端可仅包括非可裂解核苷酸，例如不含如本文中所披露的一个或多个可裂解基团的核苷酸，或可由所属领域的一般技术人员容易地测定的可裂解核苷酸。

如本文中所使用，当关于既定引物使用时，术语“延伸”和其派生词包含涉及一个或多个核苷酸在现有核酸分子的末端上的聚合的既定聚合酶的任何体内或体外酶促活性特征。典型地但未必，这类引物延伸以模板依赖性方式进行；在模板依赖性延伸期间，通过既定碱基配对规则进行碱基的排序和选择，所述规则可包括沃森-克里克型碱基配对规则，或(并且尤其在涉及核苷酸类似物的延伸反应的情况下)通过一些其它类型的碱基配对范例进行。在一个非限制性实例中，延伸通过聚合酶经由核酸分子的3'OH端上核苷酸的聚合进行。

如本文中所使用，术语“杂交”符合其在所属领域中的用途，并且通常指用于使两个核酸分子经历碱基配对相互作用的方法。当一个核酸分子的任何部分与另一个核酸分子的任何部分碱基配对时，两个核酸分子分子称为杂交；未必需要两个核酸分子跨越其全部各别长度杂交并且在一些实施方案中，至少一个核酸分子可包括不与另一个核酸分子杂交的部分。在一些实施方案中，适合于核酸杂交和/或洗涤条件的条件包括例如盐、缓冲液、pH、温度、多核苷酸和引物的GC％含量和/或时间等参数。例如，适于杂交或洗涤核酸的条件(例如，多核苷酸和引物)可包括具有钠盐的杂交溶液，例如NaCl、柠檬酸钠和/或磷酸钠。在一些实施方案中，杂交或洗涤溶液可包括甲酰胺(例如，约10-75％)和/或十二烷基硫酸钠(SDS)(例如，约0.01-0.7％)。在一些实施方案中，杂交溶液可以是严格杂交溶液，其可以包括甲酰胺(例如约50％)、5×SSC(例如约0.75M NaCl和约0.075M柠檬酸钠)、磷酸钠(例如在约pH6.8下约50mM)、焦磷酸钠(例如约0.1％)、5X Denhardt溶液、SDS(例如约0.1％)和/或硫酸葡聚糖(例如约10％)的任何组合。在一些实施方案中，杂交或洗涤溶液可包括BSA(牛血清白蛋白)。在一些实施方案中，杂交或洗涤可以在约15-25℃、或约25-35℃、或约35-45℃、或约45-55℃、或约55-65℃、或约65-75℃、或约75-85℃、或约85-95℃、或约95-99℃、或更高的温度范围下进行。在一些实施方案中，杂交或洗涤可以进行约1-10分钟、或约10-20分钟、或约20-30分钟、或约30-40分钟、或约40-50分钟、或大约50-60分钟或更长的时间范围。在一些实施方案中，杂交或洗涤条件可以在约5-10、或约pH 6-9、或约pH 6.5-8、或约pH6.5-7的pH范围内进行。用于核酸杂交和洗涤的方法是本领域熟知的。例如，核酸的热解链温度(Tm)可以是在限定的条件下一半的核酸链是双链并且一半是单链的温度。在一些实施方案中，所述限定的条件可包括水性反应条件下的离子强度和pH。可以通过改变盐(例如钠)的浓度、温度、pH、缓冲液和/或甲酰胺来调节所述限定的条件。通常，计算的热熔温度可低于Tm约5-30℃、或低于Tm约5-25℃、或低于Tm约5-20℃、或低于Tm约5-15℃、或低于Tm约5-10℃。计算Tm的方法是众所周知的，可以在Sambrook(1989，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”，第2版，1-3卷；Wetmur 1966，J.Mol.Biol.，31：349-370；Wetmur1991Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology,26:227-259)中找到。用于计算用于杂交或变性核酸的Tm的其他来源包括OligoAnalyze(来自Integrated DNA Technologies)和Primer3(由Whitehead Institute for BiomedicalResearch分发)。短语“在严格条件下杂交”和其派生词通常指可在存在高杂交温度和低离子强度的条件下进行目标特异性引物与目标序列的杂交的条件。在一个例示性实施方案中，严格杂交条件包括在约60-68℃下含有约30mM硫酸镁、约300mM Tris-硫酸盐(pH 8.9)和约90mM硫酸铵的水性环境或其等效物。如本文中所使用，短语“标准杂交条件”和其派生词通常指可在存在低杂交温度和高离子强度的情况下进行引物与寡核苷酸(即，目标序列)的杂交的条件。在一个例示性实施方案中，标准杂交条件包括在约50-55℃下含有约100mM硫酸镁、约500mM Tris-硫酸盐(pH 8.9)和约200mM硫酸铵的水性环境或其等效物。

如本文所用，术语“同一性”和“相同的”及其派生词，当用于提及两个或更多个核酸序列时，是指两个或更多个序列(例如，核苷酸或多肽序列)的序列相似性。在两个或更多个同源序列的背景下，序列或其子序列的百分比同一性或同源性表示相同的所有单体单元(例如，核苷酸或氨基酸)的百分比(即，约70％同一性，优选75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)。当比较并对齐以在比较窗口上进行最大对应，或者使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动对齐和目视检查测量的指定区域时，百分比同一性可以在整个指定区域上。当在氨基酸水平或核苷酸水平上具有至少85％的同一性时，序列被称为“基本相同”。优选地，同一性存在于长度为至少约25、50或100个残基的区域上，或者在至少一个比较序列的整个长度上。确定序列一致性百分比和序列相似性的典型算法的实例是BLAST算法和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人Nuc.AcidsRes.25:3389-3402(1977)。其他方法包括Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)和Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)等的算法。两个核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或它们的互补序列在严格条件下彼此杂交。

如本文中所使用，术语“连接(ligating,ligation)”和其派生词通常指用于将两个或更多个分子共价连接在一起(例如使两个或更多个核酸分子彼此共价连接)的动作或方法。在一些实施方案中，连接包括核酸的相邻核苷酸之间的结合口。在一些实施方案中，连接包括形成第一核酸分子的末端与第二核酸分子的末端之间的共价键。在一些实施方案中，例如其中待连接的核酸分子包括常规核苷酸残基的实施例，连接可包括形成一个核酸的5'磷酸基与第二核酸的3'羟基之间的共价键，从而形成经连接的核酸分子。在一些实施方案中，可使用任何用于在相邻核苷酸之间使5'磷酸与3'羟基连接或结合的方法。在例示性实施方案中，可使用酶，如连接酶。通常，在本发明中，经扩增的目标序列可与衔接子连接以产生衔接子连接的经扩增的目标序列。

如本文中所使用，“连接酶”和其派生词通常指任何能够催化两个衬底分子的连接的试剂。在一些实施方案中，连接酶包括能够催化核酸的相邻核苷酸之间的接口的连接的酶。在一些实施方案中，连接酶包括能够催化一个核酸分子的5'磷酸与另一个核酸分子的3'羟基之间形成共价键，从而形成经连接的核酸分子的酶。适合的连接酶可包括(但不限于)T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶以及大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶。

如本文所用，“连接条件”及其衍生物通常是指适合于将两个分子彼此连接的条件。在一些实施方案中，连接条件适合于密封核酸之间的切口或间隙。如本文所定义，“切口”或“间隙”是指在核酸序列的内部核苷酸内缺少单核苷酸戊糖环的5'磷酸直接与相邻单核苷酸戊糖环的3'羟基结合的核酸分子。如本文所用，术语切口或间隙与本领域术语的使用一致。通常，切口或间隙可以在适当的温度和pH下在酶例如连接酶的存在下连接。在一些实施方案中，T4 DNA连接酶可在约70-72℃的温度在核酸之间加入切口。

如本文中使用，术语“核苷酸”和其派生词包含任何可选择性结合于聚合酶或可通过聚合酶聚合的化合物，包括(但不限于)任何天然存在的核苷酸或其类似物。典型地但未必，核苷酸与聚合酶的选择性结合后面是核苷酸通过聚合酶聚合成核酸链；然而偶尔，核苷酸可从聚合酶解离而不变得掺入到核酸链中，这是在本文中被称为“非生产性”事件的事件。这类核苷酸不仅包括天然存在的核苷酸，而且包括可以与聚合酶选择性结合或可以通过聚合酶聚合的任何类似物(与其结构无关)。虽然天然存在的核苷酸典型地包含碱基、糖和磷酸酯部分，但本发明的核苷酸可以包括不具有这类部分中的任一个、一些或全部的化合物。在一些实施方案中，核苷酸可以任选地包括包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个磷原子的磷原子链。在一些实施方案中，磷链可以附接到糖环的任何碳，如5’碳。磷链可以用插入的O或S连接到糖。在一个实施方案中，链中的一个或多个磷原子可以是具有P和O的磷酸基的一部分。在另一个实施例中，链中的磷原子可以用插入的O、NH、S、亚甲基、经取代的亚甲基、亚乙基、经取代的亚乙基、CNH₂、C(O)、C(CH₂)、CH₂CH₂或C(OH)CH₂R(其中R可以是4-吡啶或1-咪唑)连接在一起。在一个实施方案中，链中的磷原子可具有含O、BH₃或S的侧基。在磷链中，具有除O以外的侧基的磷原子可以是经取代的磷酸基。在磷链中，具有除O以外的插入原子的磷原子可以是经取代的磷酸基。核苷酸类似物的一些实例描述于Xu的美国专利第7,405,281号中。在一些实施方案中，核苷酸包含标记并且在本文中称为“经标记的核苷酸”；经标记的核苷酸的标记在本文中称为“核苷酸标记”。在一些实施方案中，标记可呈连接到末端磷酸基(即距离糖最远的磷酸基)的荧光染料形式。可以用于所公开的方法和组合物中的核苷酸的一些实例包括(但不限于)核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸聚磷酸、脱氧核糖核苷酸聚磷酸、经修饰的核糖核苷酸聚磷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸聚磷酸、肽核苷酸、经修饰的肽核苷酸、金属核苷酸、膦酸核苷和经修饰的磷酸-糖主链核苷酸，前述化合物的类似物、衍生物或变异体等。在一些实施方案中，核苷酸可包含非氧部分(如硫基或硼烷部分)代替氧部分，所述氧部分桥连核苷酸的α磷酸酯与糖、或核苷酸的α与β磷酸酯、或核苷酸的β与γ磷酸酯、或核苷酸的任何其它两种磷酸酯之间、或其任何组合。“核苷酸5'-三磷酸”指在5'位置具有三磷酸酯基并且有时表示为“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”以具体指出核糖的结构特征的核苷酸。三磷酸酯基可包括多个氧的硫取代，例如α-硫基-核苷酸5'-三磷酸酯。关于核酸化学的综述，参见：Shabarova,Z.和Bogdanov,A.,《核酸的高级有机化学(AdvancedOrganic Chemistry of Nucleic Acids)》,VCH,New York,1994。

如本文所用，术语“核酸”是指天然核酸、人工核酸、其类似物或其组合，其包括多核苷酸和寡核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指核苷酸的单链和双链聚合物，包括但不限于2'-脱氧核糖核苷酸(核酸)和核糖核苷酸(RNA)，其通过核苷酸间磷酸二酯键接例如3'-5'和2'-5'、反向连接例如3'-3'和5'-5'、支链结构或类似物核酸连接。多核苷酸具有相关的抗衡离子，例如H⁺、NH₄ ⁺、三烷基铵、Mg²⁺、Na⁺等。寡核苷酸可完全由脱氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或其嵌合混合物组成。寡核苷酸可由核碱基和糖类似物组成。当它们在本领域中更常被称为寡核苷酸时，多核苷酸的大小通常在几个单体单元的范围内，例如5-40，当它们在本领域中更常被称为多核苷酸时，到数千个单体核苷酸单元；然而，为了本公开的目的，寡核苷酸和多核苷酸都可以具有任何合适的长度。除非另外指出，否则每当呈现寡核苷酸序列时，都应了解，核苷酸从左到右是按5'到3'的顺序并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。寡核苷酸被称为具有“5'末端”和“3'末端”，因为单核苷酸通常通过将5'磷酸或一个核苷酸的等同基团连接到(任选地通过磷酸二酯或其他合适的键)其相邻核苷酸的3'羟基或等同基团而反应形成寡核苷酸。

如本文中使用，“聚合酶”和其派生词通常指可催化核苷酸(包括其类似物)聚合成核酸链的任何酶。典型地但未必，这类核苷酸聚合可以模板依赖性方式进行。这类聚合酶可以包括(但不限于)天然存在的聚合酶和其任何子单元和截断、突变聚合酶、变异聚合酶、重组、融合或以其它方式工程改造的聚合酶、经化学修饰的聚合酶、合成分子或组件以及保留催化这类聚合的能力的任何类似物、衍生物或其片段。任选地，聚合酶可以是包含一个或多个突变的突变型聚合酶，所述突变涉及用其它氨基酸替换一个或多个氨基酸，来自聚合酶的一个或多个氨基酸的插入或缺失或两个或更多个聚合酶的部分的连接。典型地，聚合酶包含可以进行核苷酸结合和/或核苷酸聚合催化的一个或多个活性位点。一些例示性聚合酶包括(但不限于)DNA聚合酶和RNA聚合酶。如本文中所使用，术语“聚合酶”和其变化形式也指包含至少两个彼此连接的部分的融合蛋白，其中第一部分包含可以催化核苷酸聚合成核酸链的肽并且所述第一部分连接到包含第二多肽的第二部分。在一些实施方案中，第二多肽可以包括报导子酶或增强持续合成能力的结构域。任选地，聚合酶可具有5'外切核酸酶活性或末端转移酶活性。在一些实施方案中，聚合酶可任选地再活化，例如通过使用热、化学物质或将新的量的聚合酶再添加到反应混合物中。在一些实施方案中，聚合酶可包括可任选地再活化的热起始聚合酶或基于适体的聚合酶。

如本文所用，术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)是指K.B.Mullis美国专利4,683,195和4,683,202的方法，在此通过引用并入，其描述用于在不进行克隆或纯化的情况下增加基因组DNA的混合物中相关多核苷酸的片段的浓度的方法。这种用于扩增相关多核苷酸的过程由以下组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入含有所需相关多核苷酸的DNA混合物，接着是在DNA聚合酶存在下热循环的精确序列。两种引物与相关双链多核苷酸的其相应股互补。为了实现扩增，使混合物变性，并且然后将引物退火到相关多核苷酸分子内的其互补序列。在退火之后，用聚合酶使引物延伸以形成一对新互补股。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以存在众多“循环”)以获得所需相关多核苷酸的高浓度的扩增的片段。所需相关多核苷酸的扩增的片段(扩增子)的长度通过引物相对于彼此的相对位置测定，并且因此这一长度是可控制参数。借助于重复所述过程，所述方法被称为“聚合酶链反应”(在下文中“PCR”)。因为相关多核苷酸的所需扩增的片段变为混合物中的主要核酸序列(就浓度来说)，所以其被称为“PCR扩增的”。如本文中所定义，包括多种靶核酸分子的样品内的靶核酸分子经由PCR而扩增。在上文所论述的方法的一个改进中，靶核酸分子可以使用多种不同引物对、在一些情况下一种或多种引物对/相关标靶核酸分子而PCR扩增，由此形成多重PCR反应。使用多重PCR，有可能同时从样品扩增多种相关核酸分子以形成经扩增的靶序列。还可能通过数种不同方法(例如，用生物分析仪或qPCR定量，用经标记的探针杂交；并入生物素化的引物，接着进行抗生物素蛋白-酶结合物检测；将经³²P标记的脱氧核苷酸三磷酸酯(例如dCTP或dATP)并入到经扩增的靶序列中)检测扩增的靶序列。任何寡核苷酸序列可用适合的引物集合扩增，从而实现目标核酸分子从基因组DNA、cDNA、福马林固定的链烷烃嵌入型DNA、细针穿刺活检(fine-needlebiopsies)和多种其它来源的扩增。具体来说，由如本文中所披露的多重PCR过程产生的经扩增的靶序列本身是用于后续PCR扩增或多种下游分析或操作的有效底物。

如本文所用，“聚合条件”及其衍生词一般是指适合于核苷酸聚合的条件。在典型的实施方案中，这种核苷酸聚合由聚合酶催化。在一些实施方案中，聚合条件包括引物延伸的条件，任选地以模板依赖性方式，导致合成的核酸序列的产生。在一些实施方案中，聚合条件包括聚合酶链反应(PCR)。通常，聚合条件包括使用足以合成核酸的反应混合物，并包括聚合酶和核苷酸。聚合条件可包括使靶特异性引物与靶序列退火和在聚合酶存在下以模板依赖性方式延伸引物的条件。在一些实施方案中，可以使用热循环实施聚合条件。另外，聚合条件可包括多个循环，其中重复退火、延伸和分离两条核酸链的步骤。通常，聚合条件包括阳离子如MgCl₂。通常，一个或多个核苷酸的聚合以形成核酸链包括核苷酸通过磷酸二酯键彼此连接，然而，在特定核苷酸类似物的背景下，替代连接可能是可能的。

如本文所用，术语“部分”及其派生词，当用于提及给定的核酸分子例如引物或模板核酸分子时，在核酸分子的长度(包括核酸分子的部分或全部长度)内包含任何数目的连续核苷酸。

如本文所用，“保护基团”及其衍生词通常是指可以掺入衔接子或靶特异性引物中的任何部分，其赋予化学选择性或保护靶特异性引物或衔接子免于消化或化学降解。通常但非必要地，保护基团可包括修饰靶特异性引物r衔接子中的现有官能团以实现化学选择性。合适类型的保护基团包括醇、胺、磷酸酯、羰基或羧酸保护基团。在一个示例性实施方案中，保护基团可包括具有碳原子链的间隔化合物。

如本文中所定义，“样品”和其派生词以其最广泛含义使用并且包括任何怀疑包括目标的样品、培养物等。在一些实施例中，样品包含DNA、RNA、PNA、LNA、嵌合、杂交或多重形式的核酸。样品可包括任何含有一个或多个核酸的基于生物、临床、手术、农业、大气压或水生的样本。所述术语还包括任何经分离的核酸样品，如基因组DNA、新鲜冷冻或福尔马林(formalin)固定的石蜡包埋的核酸样本。

如本文所用，“合成”及其衍生词通常是指涉及聚合酶的核苷酸聚合的反应，任选地以模板依赖性方式。聚合酶通过将核苷一磷酸从核苷三磷酸(NTP)、脱氧核苷三磷酸(dNTP)或双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)转移至延伸的寡核苷酸链的3'羟基来合成寡核苷酸。出于本公开的目的，合成包括通过从脱氧核苷三磷酸转移核苷一磷酸来连续延伸杂交的衔接子或靶特异性引物。

如本文中所使用，“靶序列”或“目标靶序列”和其派生词通常指可根据本发明扩增或合成的任何单链或双链核酸序列，包括怀疑或预期样品中存在的任何核酸序列。在一些实施方案中，在添加靶特异性引物或附接衔接子之前，靶序列以双链形式存在并且包括待扩增或合成的具体核苷酸序列的至少一部分或其补体。靶序列可包括可与适用于扩增或合成反应的引物在聚合酶延伸之前杂交的核酸。在一些实施方案中，所述术语指核酸序列。其序列一致性、核苷酸的次序或位置由本发明的方法中的一种或多种测定。

根据所提供的方法制备的文库可以在有或没有进一步纯化或操作的情况下用于许多下游分析或测定。例如，当以足够产量获得时文库产物可以用于单核苷酸多态性(SNP)分析；基因分型；拷贝数变异分析；表观遗传分析；基因表达分析；杂交阵列；基因突变分析，包括(但不限于)疾病病况的检测、预后和/或诊断；罕见或低频等位基因突变的检测和分析；核酸测序，包括(但不限于)从头测序或目标重测序等等。

在一些实施方案中，通过本公开内容的教导产生的文库的产率足以用于各种下游应用。例如，使用Ion Torrent^TMPGM系统的Ion Xpress^TM模板试剂盒(例如，PCR介导的将核酸片段文库添加到Ion Sphere^TM颗粒上)(Life Technologies，部件号4467389)，从扩增子文库制备模板文库的说明可以在Ion Xpress模板试剂盒用户指南(Life Technologies，部件号4465884)中找到。

在一些实施方案中，本公开一般涉及用于制备靶特异性扩增子文库的方法，用于多种下游过程或测定例如核酸测序或克隆扩增中。在一些实施方案中，任选地通过桥式扩增或克隆扩增(例如emPCR)操作或扩增制备的文库，以产生适合于多种下游过程(包括核酸测序)的多种克隆模板。在一些实施方案中，待克隆扩增的至少一个扩增的靶序列可以连接到载体或颗粒上。载体可由任何合适的材料构成，并具有任何合适的形状，包括例如平面、球状或颗粒。在一些实施方案中，载体是如美国公开申请20100304982中所述的支架聚合物颗粒，将其以全文引用的方式并入本文中。还设想本领域普通技术人员在进一步改进或优化本文提供的条件时可以直接进行核酸测序而不进行克隆扩增步骤。

在文库制备后，可以对衔接子-靶-衔接子或核酸文库进行测序。测序可以通过多种已知方法进行，包括但不限于通过合成测序、通过连接测序和/或通过杂交测序。

例如，通过合成测序是一种技术，其中核苷酸连续添加到游离的3'羟基上，通常通过寡核苷酸引物(例如测序引物)的退火提供，导致5'到3'方向中的核酸链的合成。这些和其他测序反应可以在本文描述的带有核酸簇的表面上进行。反应包括一个或多个测序步骤，每个步骤包括确定掺入核酸链中的核苷酸并鉴定掺入的核苷酸在表面上的位置。掺入核酸链中的核苷酸可以描述为测序核苷酸，并且可以包含一种或多种可检测标记。合适的可检测标记包括但不限于半抗原、放射性核苷酸、酶、荧光标记、化学发光标记和/或显色剂。检测荧光标记的核苷酸的一种方法包括使用对标记的核苷酸特异的波长的激光，或使用其他合适的照射源。来自核苷酸上的标记的荧光可以通过CCD相机或其他合适的检测手段来检测。用于记录簇阵列的图像的合适仪器在WO 07/123744中描述，其内容通过引用整体并入本文。

任选地，通过逐步添加可逆终止子核苷酸来完成循环测序，所述可逆终止子核苷酸含有例如可切割或可光漂白的染料标记，例如，如美国专利7,427,673；美国专利7,414,116；WO 04/018497；WO 91/06678；WO 07/123744；和美国专利7,057,026中所述，其公开内容通过引用整体并入本文。其中终止可以被逆转并且荧光标记可以被切割的荧光标记的终止子的可用性促进有效的循环可逆终止(CRT)测序。聚合酶也可以共同工程化以有效地掺入和延伸这些修饰的核苷酸。

或者，可以使用焦磷酸测序技术。焦磷酸测序在特定核苷酸掺入新生链中时检测无机焦磷酸(PPi)的释放(Ronaghi等人,(1996)"Real-time DNA sequencing usingdetection of pyrophosphate release."Analytical Biochemistry 242(1),84-9；Ronaghi,M.(2001)"Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing."Genome Res.1 1(1),3-11；Ronaghi,M.,Uhlen,M.和Nyren,P.(1998)"A sequencing method based onreal-time pyrophosphate."Science 281(5375),363；美国专利6,210,891；美国专利6,258,568；和美国专利6,274,320，其公开内容通过引用整体并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过ATP硫酸化酶立即转化为三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且通过荧光素酶产生的光子检测产生的ATP水平。

另外，基于离子的测序系统通过检测作为核苷酸掺入的副产物产生的离子对核酸模板进行测序。通常，氢离子作为在通过聚合酶的模板依赖性核酸合成期间发生的核苷酸掺入的副产物释放。Ion Torrent PGM^TM测序仪和Ion Proton^TM测序仪通过检测核苷酸掺入物的氢离子副产物来检测核苷酸掺入。Ion Torrent PGM^TM测序仪和Ion Torrent Proton^TM测序仪包括待测序的多个核酸模板，每个模板以阵列形式置于各自的测序反应孔内。阵列的孔各自与至少一个离子传感器耦合，该离子传感器可以检测H+离子的释放或作为核苷酸掺入的副产物产生的溶液pH的变化。离子传感器包括耦合到离子敏感检测层的场效应晶体管(FET)，其可以感测H+离子的存在或溶液pH的变化。离子传感器提供指示核苷酸掺入的输出信号，其可表示为电压变化，其大小与相应的孔或反应室中的H+离子浓度相关。不同的核苷酸类型连续地流入反应室中，并通过聚合酶以由模板序列确定的顺序掺入延伸引物(或聚合位点)中。每个核苷酸掺入伴随着反应孔中H+离子的释放，以及局部pH的伴随变化。H+离子的释放由传感器的FET记录，其产生指示核苷酸掺入发生的信号。在特定核苷酸流动期间未掺入的核苷酸不会产生信号。来自FET的信号的振幅也可以与掺入延伸的核酸分子中的特定类型的核苷酸的数量相关，从而允许分辨均聚物区域。因此，在测序仪运行期间，多个核苷酸流入反应室同时掺入，通过多个孔或反应室监测允许仪器同时分辨许多核酸模板的序列。关于Ion Torrent PGM^TM测序仪的组成、设计和操作的进一步细节可以在例如美国专利公开2009/0026082；美国专利公开2010/0137143；和美国专利公开N2010/0282617中找到，其中每个申请的公开内容通过引用整体并入本文。在离子测序用户指南(部件号4467391)中描述了将后续模板文库加载到Ion Torrent^TM芯片上用于核酸测序的说明。在一些实施方案中，通过本公开内容的教导产生的扩增子文库可以用于配对末端测序(例如，Ion Torrent^TM PGM系统(Life Technologies,部件号MAN0006191)上的配对末端测序)。

可以与本文描述的方法一起使用的另外的示例性合成测序方法包括美国专利公开号2007/0166705；2006/0188901；2006/0240439；2006/0281 109；2005/0100900；美国专利号7057026；WO 05/065814；WO 06/064199；WO07/010251中描述的那些；，其公开内容通过引用整体并入本文。

或者，使用连接技术测序。这些技术使用DNA连接酶掺入寡核苷酸并鉴定这些寡核苷酸的掺入，并描述于美国专利6,969,488；美国专利6,172,218；和美国专利6,306,597中；其公开内容通过引用整体并入本文。其他合适的替代技术包括例如荧光原位测序(FISSEQ)和大规模并行签名测序(MPSS)。

表1：序列表

SEQ ID NO：1-N701(正向衔接子序列)；SEQ ID NO：2-N701_rc(全长反向互补)；SEQ ID NO：3-N701_rc_34(未受保护的3'末端)；SEQ ID NO：4-N701_rc_34Am(氨基修饰的3'末端)；SEQ ID NO：5-N701_rc_34PT(硫代磷酸酯修饰的3'末端)；SEQ ID NO：6-S502(正向衔接子序列)；SEQ ID NO：7-S502_rc(全长反向互补)；SEQ ID NO：8-S502_rc_33(未受保护的3'末端)；SEQ ID NO：9-S502_rc_33Am(氨基修饰的3'末端)；SEQ ID NO：10-S502_rc_33PT(硫代磷酸酯修饰的3'末端)

例证说明

将通用反向互补序列设计到Nextera XT v2衔接子结构的条形码的3'区域。例如，一条链与N701互补，一条与S502(Illumina,Inc.)互补。为每种制备三种配置形式：未受保护的3'末端、不可延伸的3'氨基修饰物和2个3'碱基的硫代磷酸酯保护。参见表1，图1。制备的较短互补结构导致衔接子二聚体形成减少约10倍，相当于更高的文库产量，并且相当于更好的测序性能。

Illumina Nextera XT v2衔接子使用双指数系统，其由2个条形码i7(索引读段1，在此示例为N701)和i5(索引读段2，在此示例为S502)组成。参见，例如表2。我们设计了具有3'硫代磷酸酯保护的突出端的全长反向互补序列，以及短反向互补序列，例如，我们使用未修饰的全长序列与34碱基(N701)或33碱基(S502)互补配对。虽然本文使用了N701和S502索引，但是任何i7和/或i5索引可以与本文提供的组合物和方法结合使用。34/33碱基序列分别对于Nextera家族中的所有N7xx和S5xx序列是共同的，允许我们为每种索引类型合成单个反向互补序列。制备未修饰的、3'氨基修饰的和3'硫代磷酸酯保护形式的缩短的互补序列。在未修饰的和3'硫代磷酸酯形式的情况下，衔接子可能被残留的聚合酶活性钝化，导致产生增加的二聚体形成，而3'氨基修饰的形式是不可延伸的。当与34/33反向补体一起使用时，全长正向衔接子具有32或37碱基的未受保护的5'突出端。

表2：Nextera XT索引试剂盒v2序列-

PCR引物

读段1：5’TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO:11)

索引1读段：5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCGG(SEQ ID NO:12)

读段2L 5’GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO:13)

索引2读段：5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGGCAGCGTC(SEQ IDNO:14)

B索引1(i7)和索引2(i5)

为了评估衔接子配置，使用现有的退火方案对条形码进行退火，该方案包括90℃变性5分钟，然后缓慢冷却(30秒/1℃)至25℃。将退火的衔接子稀释至工作浓度(10uM)，并将1uL各索引用于与扩增子池的连接反应中以产生文库。根据制造商的说明将制备的衔接子连接到使用Ion AmpliSeqTM Exome RDY试剂盒(Thermo Fisher Scientific)制备的扩增子池中。如AmpliSeqTM工作流程方案中所述进行连接反应。根据制造商的说明，通过qPCR、生物分析仪和MiSeq(Illumina Inc.)上的测序，评估性能。

如上所述，通过qPCR、生物分析仪和测序评估了衔接子配置的性能。通过qPCR进行的文库定量显示，与全长相比，短衔接子的产量提高了30-40％。参看图2。

在生物分析仪上分析衔接子二聚体形成，并且当使用短反向互补序列时，在连接过程中产生的二聚体量减少80-90％。见表2。峰强度的定量表明，对于所有短序列，这种减少几乎是10倍。与标准全长衔接子(std)相比，修饰的全长衔接子(AA)显示出类似的高二聚体形成。见表3。

表3：二聚体形成

外显子组池(Exome Pool)	衔接子	二聚体(pM)	文库(pM)	二聚体％	Δ二聚体vs STD
						1	std	1853	9562	16.2％	0％
2	AA	1700	5817	22.6％	39％
						3	34	283	13415	2.1％	-87％
4	34氨基酸	297	15894	1.8％	-89％
						5	34pT	129.7	13949	0.9％	-94％
6	std	1395	7210	16.2％	0％
						7	AA	1734	7759	18.3％	13％
8	34	419.9	10757	3.8％	-77％
						9	34氨基酸	259.8	13642	1.9％	-88％
10	34pT	98.3	5639	1.7％	-89％

短衔接子结构导致长的5'未受保护的突出物，其具有降解的可能性。我们开发了一些分析方法，以确认突出物不会被连接反应中存在的试剂消化。例如，为了检测降解，将反应酶活性在60℃下加热杀死20分钟，加入衔接子，然后在37℃下消化60分钟。通过凝胶电泳测量的降解证实，在缓冲液、酶和温度的各种条件下，未修饰的5'末端不被消化。

将制备的文库在MiSeq上测序，性能指标与较短的序列相当。参看图3。提供的修饰的衔接子具有与标准衔接子相同的测序性能。我们没有发现这些测序指标(均匀性、端到端测序、链偏向)的显著差异。

虽然已经在本文中显示和描述本发明的优选实施方案，但本领域的技术人员应清楚这类实施方案仅是作为例子而提供的。本领域的技术人员现在将在不脱离本发明的情况下想到众多变化、改变和替代。应理解，本文所描述的本发明的实施方案的各个替代方案都可以用于实践本发明。预期随附权利要求界定本发明的范围，并且因此涵盖这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。

序列表

<110> LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION

ANDERSEN, Mark

ALLEN, Michael

<120> 多核苷酸衔接子及其使用方法

<130> LT01237US

<150> US 62/476,541

<151> 2017-03-24

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: N701 (正向衔接子序列)

<400> 1

caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

<210> 2

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: N701_rc (全长反向互补序列)

<400> 2

ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agactaaggc gaatctcgta tgccgtcttc 60

tgcttgtt 68

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: N701_rc_34 (未保护的3 末端)

<400> 3

ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agac 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: N701_rc_34Am (氨基修饰的3 末端)

<400> 4

ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agac 34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: N701_rc_34PT (硫代磷酸酯修饰的3 末端)

<400> 5

ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agac 34

<210> 6

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: S502 (正向衔接子序列)

<400> 6

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctattcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 7

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: S502_rc (全长反向互补序列)

<400> 7

ctgtctctta tacacatctg acgctgccga cgaatagaga ggtgtagatc tcggtggtcg 60

ccgtatcatt tt 72

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: S502_rc_33 (未保护的3 末端)

<400> 8

ctgtctctta tacacatctg acgctgccga cga 33

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: S502_rc_33Am (氨基修饰的3 末端)

<400> 9

ctgtctctta tacacatctg acgctgccga cga 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: S502_rc_33PT (硫代磷酸酯修饰的3 末端)

<400> 10

ctgtctctta tacacatctg acgctgccga cga 33

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: 读段1

<400> 11

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: 索引 1 读段

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(25)

<223> i7 索引位点

<400> 12

caagcagaag acggcatacg agatgtctcg tgggctcgg 39

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: 读段2L

<400> 13

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: 索引 2 读段

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(30)

<223> i5 索引位点

<400> 14

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtc 43

Claims

1.一种减少衔接子二聚体形成的方法，包括在形成5'-衔接子-靶-3'-衔接子序列的条件下使包含靶核酸序列的样品与5'和3'衔接子接触，其中与在5'和3'衔接子是单链寡核苷酸或者5'和3'衔接子是具有全长反向互补序列的双链寡核苷酸的情况下衔接子二聚体形成的量相比，衔接子二聚体形成的量减少；其中所述5'和3'衔接子各自在其3'末端在衔接子长度的小于百分之七十(70%)上包含短反向互补序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中少于25%、20%、15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的衔接子形成二聚体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述5'和3'衔接子各自在其3'末端在长度的小于65%、60%、55%、50%、45%或40%上包含短反向互补序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述5'衔接子在其3'末端在长度的小于60%、55%、50%、45%或40%上包含短反向互补序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述3'衔接子在其3'末端在长度的小于60%、55%、50%、45%或40%上包含短反向互补序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子包括单链5'突出端。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子在长度的至少30%、40%、45%、50%、55%或60%上包含5'突出端序列。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子包含修饰序列。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子是3'-硫代磷酸酯保护的衔接子。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子是3'-氨基修饰的衔接子。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述5'和3'衔接子是线性的。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述5'和3'衔接子在其3'末端是平端或在其3'末端包含T突出端。

13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述短反向互补序列选自SEQ ID NO：3、4或5，或选自SEQ ID NO：8、9或10。

14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子的正向序列包含SEQ ID NO：1，并且其中所述衔接子的反向互补序列选自SEQ ID NO：3、4或5。

15. 根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子的正向序列包含SEQ ID NO：6，并且其中所述衔接子的反向互补序列选自SEQ ID NO：8、9或10。

16.一种包含衔接子序列的组合物，所述衔接子序列包含具有5'延伸的突出端序列的正向寡核苷酸和在其3'末端在长度的小于60、55、50、45或40%上的反向互补寡核苷酸，其中所述衔接子序列具有3'平端或T突出端序列，并且其中所述反向互补寡核苷酸是经3'-硫代磷酸酯保护的或经3'-氨基修饰的。

17.根据权利要求16所述的组合物，其包含能够连接到目标扩增子靶序列的5'衔接子序列和3'衔接子序列，其中所述5'衔接子序列和所述3'衔接子序列是不同的。

18. 根据权利要求16所述的组合物，其中所述反向互补寡核苷酸序列选自SEQ ID NO：4或5，或选自SEQ ID NO：9或10。

19. 根据权利要求16所述的组合物，其中所述正向寡核苷酸序列包含SEQ ID NO：1，并且其中所述反向互补寡核苷酸序列选自SEQ ID NO：4或5。

20. 根据权利要求16所述的组合物，其中所述正向寡核苷酸序列包含SEQ ID NO：6，并且其中所述反向互补寡核苷酸序列选自SEQ ID NO：9或10。

21.一种制备核酸序列文库的方法，包括：使第一和第二衔接子与包含靶核酸序列的样品在形成5'-衔接子-靶-3'-衔接子连接产物的条件下接触，其中所述衔接子包含5'和3'衔接子，每个衔接子在其3'末端在衔接子长度的小于百分之七十(70%)上具有短反向互补序列，并且形成连接产物，其中连接产物形成核酸序列文库。

22.根据权利要求21所述的方法，还包括扩增所述连接产物以产生核酸序列文库。

23.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括对所述连接产物测序。

24.根据权利要求21所述的方法，其中与在各自具有全长反向互补序列的5'和3'衔接子存在下衔接子二聚体形成的量相比，衔接子二聚体的形成减少。

25.根据权利要求21所述的方法，其中少于25%、20%、15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的衔接子形成二聚体。

26.根据权利要求21所述的方法，其中所述5'和3'衔接子各自在其3'末端在长度的小于65%、60%、55%、50%、45%或40%上包含短反向互补序列。

27.根据权利要求21所述的方法，其中所述5'衔接子在其3'末端在长度的小于60%、55%、50%、45%或40%上包含短反向互补序列。

28.根据权利要求21所述的方法，其中所述3'衔接子在其3'末端在长度的小于60%、55%、50%、45%或40%上包含短反向互补序列。

29.根据权利要求21所述的方法，其中所述衔接子包括单链5'突出端。

30.根据权利要求21所述的方法，其中所述衔接子在长度的至少30%、40%、45%、50%、55%或60%上包含5'突出端序列。

31.根据权利要求21所述的方法，其中所述衔接子包含修饰序列。

32.根据权利要求21所述的方法，其中所述衔接子是3'-硫代磷酸酯保护的衔接子。

33.根据权利要求21所述的方法，其中所述衔接子是3'-氨基修饰的衔接子。

34.根据权利要求21所述的方法，其中所述5'和3'衔接子是线性的。

35.根据权利要求21所述的方法，其中所述5'和3'衔接子在其3'末端是平端或在其3'末端包含T突出端。

36. 根据权利要求21所述的方法，其中所述短反向互补序列选自SEQ ID NO：3、4或5，或选自SEQ ID NO：8、9或10。

37. 根据权利要求21所述的方法，其中所述衔接子的正向序列包含SEQ ID NO：1，并且其中所述衔接子的反向互补序列选自SEQ ID NO：3、4或5。

38. 根据权利要求21所述的方法，其中所述衔接子的正向序列包含SEQ ID NO：6，并且其中所述衔接子的反向互补序列选自SEQ ID NO：8、9或10。

39.根据权利要求21所述的方法，其中所述衔接子不与靶核酸序列互补，并且其中靶核酸分子包含不同的序列。

40.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一和第二衔接子具有通用序列。