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CN107533071A - 血液受试体的凝固能力的评价方法、以及用于在该方法中使用的试剂、试剂盒及装置 - Google Patents

血液受试体的凝固能力的评价方法、以及用于在该方法中使用的试剂、试剂盒及装置 Download PDF

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CN107533071A
CN107533071A CN201680022989.3A CN201680022989A CN107533071A CN 107533071 A CN107533071 A CN 107533071A CN 201680022989 A CN201680022989 A CN 201680022989A CN 107533071 A CN107533071 A CN 107533071A
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CN
China
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reagent
blood
mentioned
coagulation
fviii
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CN201680022989.3A
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岛绿伦
野上惠嗣
松本智子
北泽刚久
添田哲弘
池田有香
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Sysmex Corp
Nara Medical University PUC
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Sysmex Corp
Nara Medical University PUC
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Abstract

本发明涉及从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的评价方法。另外，本发明涉及血液凝固分析用试剂、血液凝固分析用试剂盒及血液凝固分析用装置。再者，本发明涉及用于血液受试体的凝固能力的评价的装置及计算机程序。

Description

血液受试体的凝固能力的评价方法、以及用于在该方法中使 用的试剂、试剂盒及装置
【技术领域】
本发明涉及从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的评价方法。另外，本发明涉及血液凝固分析用试剂、血液凝固分析用试剂盒及血液凝固分析用装置。再者，本发明涉及用于血液受试体的凝固能力的评价的装置及计算机程序。
【背景技术】
血友病是起因于第VIII凝血因子(FVIII)或第IX凝血因子(FIX)的先天的缺损或功能不全的出血性疾病。FVIII是原因时称为血友病A，FIX是原因时称为血友病B。在血友病患者中，在关节内、肌肉内等的深部组织见到出血症状，在重度的例中还发生颅内出血。
血友病的重症度基于血液中的FVIII活性或FIX活性而分类。具体而言，将健康者的FVIII活性或FIX活性设为100％，将活性不足1％的患者分类为重症，将活性1％以上不足5％的患者分类为中等症，将活性5％以上不足40％的患者分类为轻症。重症血友病患者以与中等症及轻症的患者比显著地高的频度呈现出血症状。但是，通过由FVIII或FIX的补充疗法使患者的血液中的FVIII活性或FIX活性维持在1％以上，可使出血的频度大大减少。
在补充疗法中，主要使用从血浆纯化或由基因重组技术制作的凝血因子制剂。在近年，开发了有FVIII替代活性的双特异性抗体。此双特异性抗体替代作为活化第VIII凝血因子(FVIIIa)的辅因子的功能。即，此双特异性抗体通过与活化第IX凝血因子(FIXa)和第X凝血因子(FX)双方结合，可促进由FIXa的FX的活化。由此，促进血液凝固。一方面，由上述的双特异性抗体促进的血液凝固的过程与利用FVIII的通常的过程不同，不要求从FVIII向FVIIIa的活化。
在使用FVIII等的凝血因子制剂的补充疗法中，施用的凝血因子的药效由活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测定或凝固曲线解析等监测。但是，如上所述，由于由双特异性抗体的血液凝固与由FVIII的通常的血液凝固过程不同，在监测凝血因子制剂的药效的既有的方法中，难以取得反映双特异性抗体的实际的药效的数据。
在这样的状况下，本发明人至此发现，将血液试样中的凝血酶生成量用于指标，可以适合的灵敏度评价有FVIII替代活性的物质的药效(参照专利文献1)。但是，由于此方法要求特殊的测定机器，达不到作为临床检查普及。另外，本发明人发现，由使用市售的APTT测定试剂的凝固曲线解析能测定上述的双特异性抗体的第VIII因子替代活性(参照非专利文献1)。但是，在此方法中，无法以适合的灵敏度评价双特异性抗体的药效。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：国际公开第2014/050926号单行本
【非专利文献】
非专利文献1：Matsumoto T.等,A novel bispecific antibody(ACE910)againstcoagulation factors IXa and X improves procoagulant activity ofpatients with hemophilia A ex vivo to hemostatic level,ISTH,Abstract,OC37.3.July 2,2013
非专利文献2：Muto A.等,Anti-factor IXa/X bispecific antibody(ACE910)：hemostatic potency against ongoing bleeds in a hemophilia A model and thepossibility of routine supplementation,J Thromb Haemost.2014Feb；12(2):206-13
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
为了将上述的如双特异性抗体一样的有FVIII替代活性的物质在血友病等的治疗中使用，确立可适合地评价所述物质的药效的方法是重要的。从而，期望适合地评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力的手段的开发。另外，也期望这样的用于评价血液受试体的凝固能力的新的手段的开发。本发明人发现能适合地评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力的条件、及用于评价那样的血液受试体的凝固能力的新的方法而完成本发明。
【解决课题的技术方案】
本发明的第1实施方式提供血液受试体的凝固能力的评价方法。此方法的特征在于，包括：由自施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体、第XII凝血因子活化剂、磷脂和含有钙离子的水溶液调制测定试样的工序，向此测定试样照射光，从测定试样取得关于光量的光学信息的工序，基于取得的光学信息而取得至少1种关于凝固曲线的微分的参数的工序，基于取得的参数的值而评价上述血液受试体的凝固能力的工序，在上述测定试样中的第XII因子活化剂的终浓度是1μM以上22μM以下μM以下，并且磷脂的终浓度是1.4μM以上33μM以下，或者，在上述测定试样中的第XII凝血因子活化剂的终浓度是1μM以上2.9μM以下，并且磷脂的终浓度是1.4μM以上43μM以下。
本发明的第2实施方式提供血液受试体的凝固能力的评价方法。此方法包括：由自施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体、第XII凝血因子活化剂、磷脂、组织因子和含有钙离子的水溶液调制测定试样的工序，向此测定试样照射光，从测定试样取得关于光量的光学信息的工序，基于取得的光学信息而评价上述血液受试体的凝固能力的工序。
本发明的第3实施方式提供用于评价从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的试剂，其以3μM以上66μM以下的浓度含第XII凝血因子活化剂，并且以4.2μM以上99μM以下的浓度含磷脂，或者，以3μM以上8.7μM以下的浓度含第XII凝血因子活化剂，并且以4.2μM以上129μM以下的浓度含磷脂。
本发明的第4实施方式提供用于评价从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的试剂盒，其具备第1试剂和由含有钙离子的水溶液组成的凝固开始试剂，第1试剂以3μM以上66μM以下的浓度含第XII凝血因子活化剂，并且以4.2μM以上99μM以下的浓度含磷脂，或者，第1试剂以3μM以上8.7μM以下的浓度含第XII凝血因子活化剂，并且以4.2μM以上129μM以下的浓度含磷脂。
本发明的第5实施方式提供用于评价从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的试剂，其含第XII凝血因子活化剂、磷脂、及组织因子。
本发明的第6实施方式提供用于评价从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的试剂盒，其具备含第XII凝血因子活化剂、磷脂、及组织因子的第1试剂和由含有钙离子的水溶液组成的凝固开始试剂。
本发明的第7实施方式提供用于评价从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的试剂盒，其具备第1试剂、第2试剂和由含有钙离子的水溶液组成的凝固开始试剂，第1试剂含第XII凝血因子活化剂及磷脂，并且第2试剂含组织因子，第1试剂含第XII凝血因子活化剂及磷脂，并且第2试剂含组织因子及磷脂，或者第1试剂含第XII凝血因子活化剂及组织因子，并且第2试剂含磷脂。
本发明的第8实施方式提供血液受试体分析装置。此装置的特征在于，具备：调制测定试样的测定试样调制部，向调制的测定试样照射光，从测定试样取得关于光量的光学信息的光学信息取得部和控制部，此控制部以如下方式控制上述测定试样调制部：将含第XII凝血因子活化剂及磷脂的活化部分促凝血酶原激酶时间测定用试剂用稀释液稀释为指定的倍率，由稀释的试剂、从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体和含有钙离子的水溶液调制测定试样，基于光学信息而取得至少1种关于凝固曲线的微分的参数，基于取得的参数的值而输出关于上述血液受试体的凝固能力的参考信息。
本发明的第9实施方式提供血液受试体分析装置。此装置的特征在于，具备：调制测定试样的测定试样调制部，向调制的测定试样照射光，从测定试样取得关于光量的光学信息的光学信息取得部和控制部，此控制部以如下方式控制上述测定试样调制部：由自施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体、第XII凝血因子活化剂、磷脂、组织因子和含有钙离子的水溶液调制测定试样，基于光学信息而输出关于上述血液受试体的凝固能力的参考信息。
本发明的第10实施方式提供用于血液受试体的凝固能力的评价的装置，其具备含处理器及处于此处理器的控制下的存储器的计算机。在上述的存储器中记录有用于使上述计算机执行下列步骤的计算机程序：由自施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体、第XII凝血因子活化剂、磷脂和含有钙离子的水溶液调制的测定试样取得关于光量的光学信息的步骤，基于此光学信息而取得至少1种关于凝固曲线的微分的参数的步骤，基于取得的参数的值而输出关于上述血液受试体的凝固能力的参考信息的步骤。
本发明的第11实施方式提供在计算机能读取的介质中记录的、用于血液受试体的凝固能力的评价的计算机程序。此计算机程序的特征在于在上述计算机中执行下列步骤：从由自施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体、第XII凝血因子活化剂、磷脂和含有钙离子的水溶液调制的测定试样取得关于光量的光学信息的步骤，基于此光学信息而取得至少1种关于凝固曲线的微分的参数的步骤，基于取得的参数的值而输出关于上述血液受试体的凝固能力的参考信息的步骤。
本发明的第12实施方式提供用于评价从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的试剂盒，其具备第1试剂和第2试剂，第1试剂含第XII凝血因子活化剂及磷脂，并且第2试剂含组织因子及钙离子。
【发明效果】
由本发明能适合地评价从施用了有第VIII因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力。
【附图说明】
【图1】是正常血浆的凝固曲线和其1阶求导及2阶求导的坐标图的一例。
【图2】是显示本实施方式涉及的试剂的一例的图。
【图3A】是显示本实施方式涉及的试剂盒的一例的图。
【图3B】是显示本实施方式涉及的试剂盒的一例的图。
【图4】是显示血液受试体分析装置的外观的构成的斜视图。
【图5】是血液受试体分析装置的测定部的内部的俯视平面图。
【图6】是显示血液受试体分析装置的测定部的构成的图。
【图7】是显示测定装置所具备的灯单元的构成的图。
【图8A】是显示测定装置所具备的检测部的构成的图。
【图8B】是显示测定装置所具备的检测部的构成的图。
【图8C】是显示测定装置所具备的检测部的构成的图。
【图8D】是显示测定装置所具备的检测部的构成的图。
【图9】是显示血液受试体分析装置的控制装置的功能构成的图。
【图10】是显示血液受试体分析装置的控制装置的硬件构成的图。
【图11】是显示利用血液受试体分析装置的血液受试体的测定处理的流程图。
【图12】是显示利用血液受试体分析装置的血液受试体的分析处理的流程图。
【图13】是显示利用血液受试体分析装置的分析结果的画面的一例的图。
【图14A】是从含ACE910的血液受试体及含rhFVIII的血液受试体各自得到的凝固时间的坐标图。
【图14B】是从含ACE910的血液受试体的凝固时间换算的FVIII活性值的坐标图。
【图15A】是从含ACE910的血液受试体及含rhFVIII的血液受试体各自得到的|Min1|的坐标图。
【图15B】是从含ACE910的血液受试体的|Min1|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图16A】是从含ACE910的血液受试体及含rhFVIII的血液受试体各自得到的|Min2|的坐标图。
【图16B】是从含ACE910的血液受试体的|Min2|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图17A】是从含ACE910的血液受试体及含rhFVIII的血液受试体各自得到的Max 2的坐标图。
【图17B】是从含ACE910的血液受试体的Max 2换算的FVIII活性值的坐标图。
【图18A】是由稀释3倍的APTT测定用试剂得到的，从含ACE910的血液受试体的凝固时间换算的FVIII活性值的坐标图。
【图18B】是由稀释3倍的APTT测定用试剂得到的，从含ACE910的血液受试体的|Min1|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图18C】是由稀释3倍的APTT测定用试剂得到的，从含ACE910的血液受试体的|Min2|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图18D】是由稀释3倍的APTT测定用试剂得到的，从含ACE910的血液受试体的Max2换算的FVIII活性值的坐标图。
【图19A】是从ACE910及含rhFVIII的血液受试体得到的|Min1|的坐标图。
【图19B】是从ACE910及含rhFVIII的血液受试体的|Min1|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图20A】是从ACE910及含rhFVIII的血液受试体得到的|Min2|的坐标图。
【图20B】是从ACE910及含rhFVIII的血液受试体的|Min2|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图21A】是从ACE910及含rhFVIII的血液受试体得到的Max2的坐标图。
【图21B】是从ACE910及含rhFVIII的血液受试体的Max 2换算的FVIII活性值的坐标图。
【图22A】是显示使用血液凝固分析用试剂1～3，从各自含ACE910及rhFVIII的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min1|的坐标图。
【图22B】是显示使用血液凝固分析用试剂1～3，从各自含ACE910及rhFVIII的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min2|的坐标图。
【图22C】是显示使用血液凝固分析用试剂1～3，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min1|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图22D】是显示使用血液凝固分析用试剂1～3，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min2|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图23A】是显示使用血液凝固分析用试剂1～3，从各自含ACE910及rhFVIII的FVIII人缺乏血浆(LotNo.895-2757)得到的|Min1|的坐标图。
【图23B】是显示使用血液凝固分析用试剂1～3，从各自含ACE910及rhFVIII的FVIII人缺乏血浆(LotNo.895-2757)得到的|Min2|的坐标图。
【图23C】是显示使用血液凝固分析用试剂1～3，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.895-2757)得到的|Min1|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图23D】是显示使用血液凝固分析用试剂1～3，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.895-2757)得到的|Min2|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图24A】是显示使用血液凝固分析用试剂1～3，从各自含ACE910及rhFVIII的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-2847)得到的|Min1|的坐标图。
【图24B】是显示使用血液凝固分析用试剂1～3，从各自含ACE910及rhFVIII的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-2847)得到的|Min2|的坐标图。
【图24C】是显示使用血液凝固分析用试剂1～3，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-2847)得到的|Min1|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图24D】是显示使用血液凝固分析用试剂1～3，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-2847)得到的|Min2|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图25A】是显示使用血液凝固分析用试剂4，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的凝固时间的坐标图。
【图25B】是显示使用血液凝固分析用试剂4，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min1|的坐标图。
【图25C】是显示使用血液凝固分析用试剂4，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min2|的坐标图。
【图26A】是显示使用血液凝固分析用试剂6～9，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的凝固时间的坐标图。
【图26B】是显示使用血液凝固分析用试剂10，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的凝固时间的坐标图。
【图26C】是显示使用血液凝固分析用试剂11～13，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的凝固时间的坐标图。
【图26D】是显示使用血液凝固分析用试剂6～9，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min1|的坐标图。
【图26E】是显示使用血液凝固分析用试剂10～13，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min1|的坐标图。
【图26F】是显示使用血液凝固分析用试剂14及15，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min1|的坐标图。
【图26G】是显示使用血液凝固分析用试剂6～9，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min2|的坐标图。
【图26H】是显示使用血液凝固分析用试剂10～13，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min2|的坐标图。
【图26I】是显示使用血液凝固分析用试剂14及15，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min2|的坐标图。
【图27A】是显示使用血液凝固分析用试剂5，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的凝固时间的坐标图。
【图27B】是显示使用血液凝固分析用试剂6～9，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的凝固时间的坐标图。
【图27C】是显示使用血液凝固分析用试剂12及13，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的凝固时间的坐标图。
【图27D】是显示使用血液凝固分析用试剂5，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min1|的坐标图。
【图27E】是显示使用血液凝固分析用试剂6～9，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min1|的坐标图。
【图27F】是显示使用血液凝固分析用试剂10～13，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min1|的坐标图。
【图27G】是显示使用血液凝固分析用试剂5，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min2|的坐标图。
【图27H】是显示使用血液凝固分析用试剂6～9，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min2|的坐标图。
【图27I】是显示使用血液凝固分析用试剂11～13，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min2|的坐标图。
【图28】是显示使用血液凝固分析用试剂4，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min1|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图29】是显示使用血液凝固分析用试剂6、11、12或15，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min1|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图30A】是显示使用血液凝固分析用试剂3，从以1U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min1|的坐标图。
【图30B】是显示使用血液凝固分析用试剂3，从以1U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min2|的坐标图。
【图30C】是显示使用血液凝固分析用试剂3，从以5U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min1|的坐标图。
【图30D】是显示使用血液凝固分析用试剂3，从以5U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min2|的坐标图。
【图30E】是显示使用血液凝固分析用试剂3，从以20U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3062)得到的|Min2|的坐标图。
【图31A】是显示使用血液凝固分析用试剂12，从以1U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min1|的坐标图。
【图31B】是显示使用血液凝固分析用试剂12，从以1U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min2|的坐标图。
【图31C】是显示使用血液凝固分析用试剂12，从以5U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min1|的坐标图。
【图31D】是显示使用血液凝固分析用试剂12，从以5U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min2|的坐标图。
【图31E】是显示使用血液凝固分析用试剂12，从以20U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min2|的坐标图。
【图31F】是显示使用血液凝固分析用试剂12，从以50U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min1|的坐标图。
【图31G】是显示使用血液凝固分析用试剂12，从以50U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min2|的坐标图。
【图31H】是显示使用血液凝固分析用试剂12，从以100U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min1|的坐标图。
【图31I】是显示使用血液凝固分析用试剂12，从以100U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min2|的坐标图。
【图31J】是显示使用血液凝固分析用试剂12，从以200U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min1|的坐标图。
【图31K】是显示使用血液凝固分析用试剂12，从以200U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆(LotNo.899-3394)得到的|Min2|的坐标图。
【图32A】是显示使用血液凝固分析用试剂16，从以0U/dL(未添加)、100U/dL、或者200U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的凝固时间的坐标图。
【图32B】是显示使用血液凝固分析用试剂16，从以0U/dL(未添加)、100U/dL、或者200U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图32C】是显示使用血液凝固分析用试剂16，从以0U/dL(未添加)、100U/dL、或者200U/dL的浓度添加rhFVIII的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min2|的坐标图。
【图33A】是显示使用血液凝固分析用试剂盒17～21，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的凝固时间的坐标图。
【图33B】是显示使用血液凝固分析用试剂盒22～24，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的凝固时间的坐标图。
【图33C】是显示使用血液凝固分析用试剂盒25及26，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的凝固时间的坐标图。
【图33D】是显示使用血液凝固分析用试剂盒27～31，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的凝固时间的坐标图。
【图33E】是显示使用血液凝固分析用试剂盒32～34，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的凝固时间的坐标图。
【图34A】是显示使用血液凝固分析用试剂盒17～21，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图34B】是显示使用血液凝固分析用试剂盒22～24，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图34C】是显示使用血液凝固分析用试剂盒25及26，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图34D】是显示使用血液凝固分析用试剂盒27～31，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图34E】是显示使用血液凝固分析用试剂盒32～34，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图35A】是显示使用血液凝固分析用试剂盒17～21，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min2|的坐标图。
【图35B】是显示使用血液凝固分析用试剂盒22～24，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min2|的坐标图。
【图35C】是显示使用血液凝固分析用试剂盒25及26，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min2|的坐标图。
【图35D】是显示使用血液凝固分析用试剂盒27～31，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min2|的坐标图。
【图35E】是显示使用血液凝固分析用试剂盒32～34，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min2|的坐标图。
【图36A】是显示使用血液凝固分析用试剂盒19、20、23及24，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到从的|Min1|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图36B】是显示使用血液凝固分析用试剂盒28、30、32、33及34，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图37A】是显示使用血液凝固分析用试剂盒22及23，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min2|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图37B】是显示使用血液凝固分析用试剂盒34，从含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min2|换算的FVIII活性值的坐标图。
【图38A】是显示使用血液凝固分析用试剂盒20，从以0.5U/mL的浓度添加作为旁路制剂的APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图38B】是显示使用血液凝固分析用试剂盒20，从以1U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图38C】是显示使用血液凝固分析用试剂盒20，从以0.25μg/mL的浓度添加作为旁路制剂的FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图38D】是显示使用血液凝固分析用试剂盒20，从以1.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图39A】是显示使用血液凝固分析用试剂盒21，从以0.5U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图39B】是显示使用血液凝固分析用试剂盒21，从以1U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图39C】是显示使用血液凝固分析用试剂盒21，从以0.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图39D】是显示使用血液凝固分析用试剂盒21，从以1.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图40A】是显示使用血液凝固分析用试剂盒28，从以0.5U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图40B】是显示使用血液凝固分析用试剂盒28，从以1U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图40C】是显示使用血液凝固分析用试剂盒28，从以0.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图40D】是显示使用血液凝固分析用试剂盒28，从以1.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图41A】是显示使用血液凝固分析用试剂盒30，从以0.5U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图41B】是显示使用血液凝固分析用试剂盒30，从以1U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图41C】是显示使用血液凝固分析用试剂盒30，从以0.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图41D】是显示使用血液凝固分析用试剂盒30，从以1.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图42A】是显示使用血液凝固分析用试剂盒33，从以0.5U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图42B】是显示使用血液凝固分析用试剂盒33，从以1U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图42C】是显示使用血液凝固分析用试剂盒33，从以0.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图42D】是显示使用血液凝固分析用试剂盒33，从以1.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图43A】是显示使用血液凝固分析用试剂盒35，从以0.5U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图43B】是显示使用血液凝固分析用试剂盒35，从以1U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图43C】是显示使用血液凝固分析用试剂盒35，从以0.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图43D】是显示使用血液凝固分析用试剂盒35，从以1.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图44A】是显示使用血液凝固分析用试剂盒36，从以0.5U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图44B】是显示使用血液凝固分析用试剂盒36，从以1U/mL的浓度添加APCC的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图44C】是显示使用血液凝固分析用试剂盒36，从以0.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【图44D】是显示使用血液凝固分析用试剂盒36，从以1.25μg/mL的浓度添加FVIIa的、含ACE910的FVIII人缺乏血浆得到的|Min1|的坐标图。
【实施方式】
[1.血液受试体的凝固能力的评价方法]
在第1实施方式涉及的血液受试体的凝固能力的评价方法(以下，也称为“第1实施方式涉及的方法”)中，首先，由含具有第VIII凝血因子(FVIII)替代活性的物质的血液受试体、第XII凝血因子活化剂、磷脂和含有钙离子的水溶液调制测定试样。在第1实施方式涉及的方法中，基于活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的测定原理而评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力。
在本实施方式中，血液受试体只要是来源于含具有FVIII替代活性的物质的血液，就不特别限定。作为受试体的种类，可举出全血及血浆。在它们之中也优选血浆，特别优选血小板除去血浆。血小板可由离心分离或滤器分离等的公知的方法除去。在本实施方式中，作为血液受试体，也可使用向市售的血浆添加有FVIII替代活性的物质的混合物。作为这样的市售的血浆，例如，可举出凝血因子缺乏血浆等。在血液受试体中，也可根据需要添加FVIII等的凝血因子制剂。
在优选的实施方式中，作为含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体，使用从施用了有FVIII替代活性的物质的受试者采集的血液或由此血液调制的血浆。作为这样的受试者，例如，可举出以凝血因子的缺损或功能异常作为原因的出血性疾病的患者。作为出血性疾病，例如，可举出血友病A、血友病B、后天性血友病、冯·威利布兰德病等。更优选为，受试者是FVIII及FVIIIa的任一方或两方的活性降低或它们缺损的出血性疾病的患者。作为这样的患者的FVIII的活性值，以健康者的FVIII活性值设为100％，可举出例如低于40％、30％或20％，优选为低于10％、9％、8％、7％或6％，更优选为低于5％、4％、3％或2％，特别优选为低于1％。再者，对在血液受试体中的FVIII的活性值进行测定的方法本身是在现有技术中公知的，例如可举出合成底物法等。
在本实施方式中，有FVIII替代活性的物质只要是在血液中有与FVIIIa同样的辅因子活性的物质，就不特别限定。但是，在有FVIII替代活性的物质中，不含FVIII及FVIIIa。作为有FVIII替代活性的物质，优选可与FIX或FIXa、及FX的双方特异性地结合，并且可促进由FIXa的FX的活化(即，FXa的产生)的物质。作为这样的物质，例如，可举出与FIX或FIXa、及FX的双方特异性地结合的双特异性抗体。再者，这样的双特异性抗体本身是在现有技术中公知的，例如在WO2005/035756、WO2006/109592及WO2012/067176中公开。更具体而言，作为有FVIII替代活性的物质，可举在专利文献(WO2012/067176)中记载的作为抗FIXa/FX双特异性抗体的ACE910(Q499-z121/J327-z119/L404-k)(Emicizumab)。
在本实施方式中，上述的双特异性抗体的来源不特别限定，可为来源于人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、马、骆驼等的任何的哺乳动物的抗体，优选为人抗体。再者，取得人抗体的方法本身是在现有技术中公知的，例如，已知利用具有人抗体基因的非人转基因动物的方法等。在本实施方式中，也可使用双特异性抗体的片段及其衍生物，例如，可举出Fab片段、F(ab')2片段、双抗体、线状抗体、单链抗体等。另外，双特异性抗体也可为嵌合抗体或人源化抗体等的基因改变抗体。
在本实施方式中，第XII凝血因子(FXII)活化剂只要是已知活化FXII而促进活化第XII因子(FXIIa)的生成，促进在体外的血液凝固的公知的物质，就不特别限定。作为这样的活化剂，可举出有阴性荷电的物质。作为这样的物质，例如，可举出鞣花酸、高岭土、硅藻土及氧化硅等。在这些之中，也优选鞣花酸。再者，作为鞣花酸，也可添加与金属离子形成鳌合物的状态的鞣花酸。在本实施方式中，FXII活化剂优选处于溶解于适合的溶剂的液体的形态。
在第1实施方式涉及的方法中，为了以适合的灵敏度评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力，将测定试样中的FXII活化剂的终浓度设为通常1μM以上22μM以下，优选为2.9μM以上14μM以下。
在本实施方式中，作为磷脂，可举出磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)及磷脂酰丝氨酸(PS)。在本实施方式中，可添加选自PE、PC及PS的1种、优选为2种、更优选为全部种类的磷脂。磷脂可为天然来源磷脂，也可为合成磷脂。在它们之中，也优选合成磷脂或纯化到纯度99％以上的天然来源磷脂。再者，PE、PC及PS的脂肪酸侧链不特别限定，例如，可举出棕榈酸、油酸、硬脂酸等。在它们之中也优选油酸。在本实施方式中，磷脂优选处于溶解于适合的溶剂的液体的形态。
在第1实施方式涉及的方法中，为了以适合的灵敏度评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力，将测定试样中的磷脂的终浓度设为通常1.4μM以上33μM以下，优选为4.3μM以上22μM以下。当作为磷脂含PE、PC及PS之时，在测定试样中的PE、PC及PS的各浓度的合计在上述的范围内即可。
在第1实施方式涉及的方法中，当将测定试样中的FXII活化剂的终浓度设为1μM以上2.9μM以下时，可将在测定试样中的磷脂的终浓度的上限设定为高于33μM而43μM以下的范围内。从而，在本实施方式中，为了以适合的灵敏度评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力，将测定试样中的FXII活化剂的终浓度设为1μM以上2.9μM以下时，也可将测定试样中的磷脂的终浓度通常设为1.4μM以上43μM以下。
在测定试样的调制中，将血液受试体、FXII活化剂和磷脂混合的顺序不特别限定。例如，也可将血液受试体和FXII活化剂混合后，将磷脂混合。另外，也可将血液受试体和磷脂混合后，将FXII活化剂混合。另外，也可将FXII活化剂和磷脂混合后，将血液受试体混合。或者，也可将血液受试体、FXII活化剂和磷脂基本上同时混合。
由于第1实施方式涉及的方法基于APTT测定的原理，在本实施方式中，也可使用含FXII活化剂及磷脂的市售的APTT测定用试剂。此时，以在测定试样中的FXII活化剂及磷脂的各自的终浓度达到上述的范围内的方式使用APTT测定用试剂即可。但是，一般的市售的APTT测定用试剂不旨在使在测定试样中的FXII活化剂及磷脂的各自的终浓度在上述的范围内而使用。从而，在本实施方式中，也可根据需要，对市售的APTT测定用试剂进行稀释而使用。作为稀释液，例如，可举出生理盐水、pH6～8的缓冲液、水等。另外，也可使用市售的缓冲液，例如，可举出Owren's Veronal缓冲液(Sysmex株式会社)、TC缓冲液(Sysmex株式会社)、咪唑缓冲液(HYPHENBioMed公司)等。
在本实施方式中，优选将血液受试体、FXII活化剂和磷脂混合，在指定的条件下温育后，添加后述的含有钙的水溶液。这样的指定的条件是促进血液受试体中的凝血因子及有FVIII替代活性的物质和FXII活化剂及磷脂的反应的公知的条件即可，例如可举出于35℃以上40℃以下的温度温育2分钟以上5分钟以下的时间的条件。
在本实施方式中，作为使血液凝固开始的试剂，使用含有钙离子的水溶液。含有钙离子的水溶液只要是可在测定试样中提供对于血液凝固必要的钙离子，就不特别限定。作为含有钙离子的水溶液，优选钙盐的水溶液，例如，可举出氯化钙水溶液等。作为测定试样中的钙离子含量，对于使凝固发生充分的量即可，例如，以氯化钙的浓度表示，通常2mM以上20mM以下，优选为4mM以上10mM以下。再者，含有钙离子的水溶液在以下也称为“钙溶液”。
在本实施方式中，将血液受试体、FXII活化剂和磷脂混合之后，添加钙溶液而得到测定试样。进而，以添加钙溶液之时作为测定开始点，从测定试样取得后述的关于光量的光学信息。
在本实施方式中，测定试样的调制可用手动方法进行，也可用全自动测定装置进行。作为这样的装置，例如，可举出CS-5100(Sysmex株式会社)、CS-2400(Sysmex株式会社)、CS-2000i(Sysmex株式会社)等。
在第1实施方式涉及的方法中，向如上所述得到的测定试样照射光，从此测定试样取得关于光量的光学信息。在本实施方式中，照射到测定试样的光是通常在凝固时间的测定中使用的光即可，例如，可举出波长是660nm附近、优选为660nm的光。光源不特别限定，例如，可举出发光二极管、卤素灯等。
通过从上述的光源向测定试样照射光，从该测定试样发生散射光及透射光。在本实施方式中，作为关于光量的光学信息，例如，优选可举出关于散射光量或透射光量的信息，散射光强度、透过度、吸光度等。
在本实施方式中，测定条件不特别限定，光的照射和关于光量的光学信息的取得优选从测定的开始(钙溶液的添加时)至凝固反应的结束(纤维蛋白块的至形成)连续或断续地进行。这样，基于经凝固的全过程而连续或断续地测定的关于光量的光学信息(例如，散射光强度、透过度或吸光度)，则在凝固过程的任意的时间点或时间，取得后述的关于凝固曲线的微分的参数变得可能。再者，光的照射和关于光量的光学信息的取得也可由全自动测定装置进行。作为这样的装置，例如，可举出全自动血液凝固测定装置的CS-5100(Sysmex株式会社)、CS-2400(Sysmex株式会社)、CS-2000i(Sysmex株式会社)等。
在本实施方式中，凝固曲线是表示关于光量的光学信息(例如，散射光量、透过度或吸光度)的经时变化的曲线。参照图1，对于凝固曲线及其曲线解析进行说明。在图1的凝固曲线(上段的坐标图)中，a点是测定开始点，b点是纤维蛋白析出(凝固的开始)点，a-b表示凝固时间。c点是凝固的中点，d点是凝固的终点，e点是测定的终点。对凝固曲线进行微分(1阶求导)，则算出凝固速度(参照图1的中段的坐标图)。再者，凝固曲线的c点相当于1阶求导的最大值。对凝固速度进行微分(2阶求导)，则算出凝固加速度(参照图1的下段的坐标图)。再者，在本实施方式涉及的方法中，凝固时间及凝固曲线的取得是任选的。
在第1实施方式涉及的方法中，基于取得的光学信息而取得至少1种关于凝固曲线的微分的参数。关于凝固曲线的微分的参数只要是示基于取得的光学信息而得到的，凝固速度、凝固加速度及凝固减速度中的至少1者的值，就不特别限定。示凝固速度的值相当于可从凝固曲线的一阶求导得到的值，示凝固加速度的值及示凝固减速度的值相当于可从凝固曲线的二阶求导得到的值。
作为关于凝固曲线的微分的参数，例如，可举出|Min1|、|Min2|、Max 2、AUC及斜率(Slope)。|Min1|是指凝固曲线的一阶求导的最小值的绝对值，表示最大凝固速度。|Min2|是指凝固曲线的二阶求导的最小值的绝对值，表示最大凝固加速度。Max 2是指凝固曲线的二阶求导的最大值，表示最大凝固减速度。AUC是指用对凝固曲线或凝固曲线进行一阶求导或二阶求导的曲线包围的区域的面积。斜率(Slope)是指在对凝固曲线或凝固曲线进行一阶求导或二阶求导的曲线的任意的点的切线的斜率的大小。在这些之中，也优选|Min1|、|Min2|及Max 2。再者，|Min1|、|Min2|及Max 2也各自表示为|min1|、|min2|及max2。关于凝固曲线的微分的参数也可为将2个以上这些值组合得到的值。例如，可举出选自|Min1|、|Min2|、Max 2、AUC及斜率(Slope)的至少2个值的和、差、积、比等。
当还取得凝固时间时，关于凝固曲线的微分的参数也可为将从凝固曲线的一阶求导或二阶求导取得的值和凝固时间组合而得到的值。作为这样的值，例如，可举出选自|Min1|、|Min2|及Max 2、AUC及斜率(Slope)的至少1个值和凝固时间的值的和、差、积、比等。
在第1实施方式涉及的方法中，基于取得的参数的值而评价上述的含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力。在本实施方式中，可将由有FVIII替代活性的物质的血液凝固反应的促进的程度基于参数而进行定量评价。从而，可评价所述物质所具有的作为辅因子的活性、即所述物质的药效。
在本实施方式中，优选从取得的参数的值取得显示上述的血液受试体的凝固能力的值。作为显示这样的凝固能力的值，优选反映血液凝固的活性的指标，特别优选FVIII活性值。再者，FVIII活性值可以健康者的活性值设为100％之时的百分率表示，也可以指定量的血浆中的国际单位(IU/dL或U/dL)表示。
例如，从取得的参数的值取得FVIII活性值可如以下一样进行。首先，向市售的FVIII缺乏血浆以各种浓度添加FVIII制剂，调制FVIII活性值已知的受试体。再者，这些受试体的FVIII活性值可由合成基质法等的公知的方法决定，也可从制剂的添加量决定。进而，对于这些受试体，使用上述的FXII活化剂、磷脂及钙溶液，如上所述取得关于凝固曲线的微分的参数。对于各受试体，标绘对于FVIII活性值的参数的值而制成标准曲线。基于得到的标准曲线而将关于含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的参数的值变换为FVIII活性值。再者，这样的标准曲线可每次血液受试体的测定时制成，也可使用指定的标准曲线。或者，也可由数据的蓄积导出用于从参数的值直接换算为显示血液受试体的凝固能力的值的式。
在本实施方式中，可基于取得的显示凝固能力的值而评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力。例如，当从取得的参数的值取得FVIII活性值时，可与FVIII制剂的效力同样地评价有FVIII替代活性的物质的效力。将有FVIII替代活性的物质的效力换算为FVIII活性值时的适当的范围也可定义为每1μg/mLACE910是0.2U/dL以上0.4U/dL以下FVIII。本范围基于食蟹猴血友病模型中的猪FVIII及ACE910的止血效果或药物动态的效果而算出(参照非专利文献2)。用在显示同等的止血活性时的各自的施用量中的最大血中浓度进行比较，ACE910是61μg/mL、猪FVIII是25U/dL，以1μg/mL的ACE910期待的止血效果相当于FVIII制剂的0.4U/dL。一方面，用在显示同等的止血活性时的各自的施用量中的最少血中浓度进行比较，则ACE910是36μg/mL、猪FVIII是7.4U/dL，以1μg/mL的ACE910期待的止血效果相当于FVIII制剂的0.2U/dL。还确认，此换算值的范围也不偏离在血友病A患者中的ACE910的临床试验中的出血次数的结果。
本发明人新发现，除了与内源性凝固途径相关的FXII活化剂及磷脂之外，通过还添加与外源性凝固途径相关的组织因子，可评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力。以下，对于进一步使用组织因子的第2实施方式涉及的血液受试体的凝固能力的评价方法进行说明(以下，也称为“第2实施方式涉及的方法”)。
在第2实施方式涉及的方法中，由含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体(优选为，自施用了有FVIII替代活性的物质的受试者得到的血液受试体)、FXII活化剂、磷脂、组织因子和含有钙离子的水溶液调制测定试样。在本实施方式中，对于血液受试体、有FVIII替代活性的物质、FXII活化剂、磷脂、及含有钙离子的水溶液与第1实施方式涉及的方法中所述的同样。
在第2实施方式涉及的方法中，通过进一步使用组织因子，即使血液受试体是从联用了旁路制剂和有FVIII替代活性的物质的受试者得到的受试体，凝固能力的监测仍变得可能。再者，旁路制剂是指即使在血液中不以充分的量存在FVIII及/或FIX，仍可促进血液凝固(即，可迂回FVIII及/或FIX相关的凝固途径)制剂的总称。作为旁路制剂，例如，已知活化第VII凝血因子(FVIIa)制剂、活性型凝血酶原复合物制剂(activated prothombincomplex concentrate：APCC)等。
组织因子可为来源于兔脑、人胎盘等的天然的组织因子，也可为由基因重组技术制作的组织因子。在本实施方式中，在测定试样中的组织因子的终浓度不特别限定，例如是0.002ng/mL以上7.3ng/mL以下，优选为0.002ng/mL以上0.49ng/mL以下。在本实施方式中，将血液受试体、FXII活化剂、磷脂和组织因子混合的顺序不特别限定。例如，可将FXII活化剂、磷脂及组织因子的任一种和血液受试体混合后，将其余的2者同时或依次混合。另外，也可将选自FXII活化剂、磷脂及组织因子的2种和血液受试体混合后，将其余之一混合。另外，也可将FXII活化剂、磷脂及组织因子混合后，将血液受试体混合。
在第2实施方式涉及的方法中，在测定试样中的FXII活化剂的终浓度不特别限定，例如是0.1μM以上26μM以下，优选为0.1μM以上9.6μM以下。另外，在测定试样中的磷脂的终浓度也不特别限定，例如是0.39μM以上43μM以下，优选为0.39μM以上13μM以下。
在第2实施方式涉及的方法中，向如上所述得的测定试样照射光，从此测定试样取得关于光量的光学信息。进而，在第2实施方式涉及的方法中，基于取得的光学信息而评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力。在本实施方式中，从取得的光学信息，取得选自凝固时间、及关于凝固曲线的微分的参数的至少1个，优选基于取得的值而评价血液受试体的凝固能力。其中，对于光学信息及关于凝固曲线的微分的参数的种类及取得的顺序与第1实施方式涉及的方法中所述的同样。另外，对于血液受试体的凝固能力的评价的顺序，也与第1实施方式涉及的方法中所述的同样。
[2.用于评价血液受试体的凝固能力的试剂及试剂盒]
在本发明的范围中，也含用于评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力的试剂(以下，也简称为“试剂”)。第3实施方式涉及的试剂适宜于在上述的第1实施方式涉及的方法中使用，各自以指定的浓度含FXII活化剂及磷脂。在图2中，作为本实施方式的试剂的外观的一例，显示收容到第1容器111中的试剂。再者，对于FXII活化剂及磷脂的种类与对于上述的本实施方式的方法而叙述的相同。
在第3实施方式涉及的试剂中，试剂中的FXII活化剂的浓度只要是能将测定试样中的终浓度调整到上述的第1实施方式涉及的方法中所述的范围，就不特别限定。由全自动凝固时间测定装置调制测定试样时，考虑该装置能抽吸的试剂量，例如是3μM以上66μM以下。
在本实施方式中，试剂中的磷脂的浓度只要是能将在测定试样中的终浓度调整到上述的第1实施方式涉及的方法中所述的范围，就不特别限定。当由全自动凝固时间测定装置调制测定试样时，考虑该装置能抽吸的试剂量，例如是4.2μM以上99μM以下。当作为磷脂含PE、PC及PS之时，在试剂中的PE、PC及PS的各浓度的合计在上述的范围内即可。
在本实施方式中，将试剂中的FXII活化剂的浓度设为3μM以上8.7μM以下时，也可将试剂中的磷脂的浓度设为例如4.2μM以上129μM以下。
另外，在本发明的范围中，也含用于评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力的试剂盒(以下，也简称为“试剂盒”)。第4实施方式涉及的试剂盒适宜于在上述的第1实施方式涉及的方法中使用，具备各自以指定的浓度含FXII活化剂及磷脂的第1试剂和由含有钙离子的水溶液组成的凝固开始试剂。在图3A中，作为第4实施方式涉及的试剂盒的外观的一例，显示含收容到第1容器111中的第1试剂和收容到第2容器112中的凝固开始试剂的试剂盒。再者，对于FXII活化剂及磷脂的种类，与对于上述的本实施方式的方法而叙述的相同。另外，试剂中的FXII活化剂及磷脂的各浓度如上所述。
在本实施方式中，凝固开始试剂与上述的第1实施方式涉及的方法中使用的含有钙离子的水溶液相同。作为凝固开始试剂中的钙离子含量，能调整到能发生凝固的终浓度即可，例如，以氯化钙的浓度表示，通常2.5mM以上40mM以下，优选为10mM以上30mM以下。
在进一步的实施方式中，用于评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力的试剂除了FXII活化剂及磷脂之外，也可还含组织因子。以下，对于进一步使用组织因子的第5实施方式涉及的试剂进行说明。
第5实施方式涉及的试剂适宜于在上述的第2实施方式涉及的方法中使用，含FXII活化剂、磷脂、及组织因子。本实施方式的试剂的外观与第3实施方式涉及的试剂同样，例如示于图2。具体而言，含FXII活化剂、磷脂、及组织因子的试剂收容到第1容器111中。再者，对于FXII活化剂、磷脂及组织因子的种类，与对于上述的第1及第2实施方式涉及的方法而叙述的相同。另外，第5实施方式涉及的试剂中的FXII活化剂及磷脂的各自的浓度不特别限定，例如，也可与对于第3实施方式涉及的试剂而叙述的相同。在第5实施方式涉及的试剂中，试剂中的组织因子的浓度不特别限定，例如是0.006ng/mL以上21.9ng/mL以下。
在进一步的实施方式中，用于评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力的试剂盒除了FXII活化剂及磷脂之外，也可还含组织因子。以下，对于进一步使用组织因子的第6及第7实施方式涉及的试剂盒进行说明。
第6及第7实施方式涉及的试剂盒适宜于在上述的第2实施方式涉及的方法中使用。第6实施方式涉及的试剂盒具备含FXII活化剂、磷脂、及组织因子的第1试剂和由含有钙离子的水溶液组成的凝固开始试剂。第6实施方式涉及的试剂盒的外观与第4实施方式涉及的试剂盒同样，例如示于图3A。具体而言，含FXII活化剂、磷脂、及组织因子的第1试剂收容到第1容器111中，由含有钙离子的水溶液构成的凝固开始试剂收容到第2容器112中。
第7实施方式涉及的试剂盒具备第1试剂、第2试剂和由含有钙离子的水溶液组成的凝固开始试剂。在图3B中，作为第7实施方式涉及的试剂盒的外观的一例，显示含收容到第1容器111中的第1试剂、收容到第2容器112中的第2试剂和收容到第3容器113中的凝固开始试剂的试剂盒。在本实施方式中，FXII活化剂、磷脂、及组织因子各自含在第1试剂及第2试剂之任一者中即可。例如，第1试剂可含FXII活化剂及磷脂，并且第2试剂可含组织因子，第1试剂可含FXII活化剂及磷脂，并且第2试剂可含组织因子及磷脂，或者，第1试剂可含FXII活化剂及组织因子，并且第2试剂可含磷脂。
在第6及第7实施方式涉及的试剂盒中，FXII活化剂、磷脂及组织因子的种类及试剂中的浓度不特别限定，例如，也可与上述的对第3及第5实施方式涉及的试剂所述的浓度相同。再者，在第7实施方式涉及的试剂盒中，在第1试剂及第2试剂的两方含磷脂时，在各试剂中的磷脂的浓度也可为对于第3实施方式涉及的试剂而叙述的浓度的一半。另外，由含有钙离子的水溶液构成的凝固开始试剂与对于上述的第4实施方式涉及的试剂盒而叙述的相同。
第12实施方式涉及的试剂盒适宜于在上述的第2实施方式涉及的方法中使用。第12实施方式涉及的试剂盒具备第1试剂和第2试剂。在本实施方式中，第1试剂含FXII活化剂及磷脂，第2试剂含组织因子及钙离子。第2试剂也可还含磷脂。第12实施方式涉及的试剂盒的外观与第4实施方式涉及的试剂盒同样，例如示于图3A。具体而言，含FXII活化剂及磷脂的第1试剂收容到第1容器111中，含组织因子及钙离子的第2试剂收容到第2容器112中。
在第12实施方式涉及的试剂盒中，在各试剂中的FXII活化剂、磷脂及组织因子的种类及浓度不特别限定，例如，也可与上述的对第3及第5实施方式涉及的试剂所述的浓度相同。再者，在第12实施方式涉及的试剂盒中，当第1试剂及第2试剂的两方含磷脂时，在各试剂中的磷脂的浓度也可为对于第3实施方式涉及的试剂而叙述的浓度的一半。另外，在第2试剂中的钙离子的含量与对于上述的第4实施方式涉及的试剂盒的凝固开始试剂而叙述的相同。在本实施方式中，在第2试剂中含作为凝固开始试剂的钙离子。从而，首先，将第1试剂和含具有第VIII凝血因子替代活性的物质的血液受试体混合，接下来，向得到的混合物添加第2试剂。
[3.血液受试体分析装置、用于血液受试体的凝固能力的评价的装置及计算机程序]
接下来，参照附图说明本实施方式涉及的血液受试体分析装置的一例。但是，本实施方式不仅限定于此例。如图4所示，血液受试体分析装置10具备进行测定试样的调制及光学测定的测定装置50和对由测定装置50取得的测定数据进行分析的同时给测定装置50指示的控制装置40。测定装置50具备取得来自测定试样的关于光量的光学信息的测定部20和配置在测定部20的前方的受试体搬送部30。
测定部20中设有盖20a及20b、盖20c和电源按钮20d。使用者开盖20a，将设置于试剂台11及12(参照图5)的试剂容器103更换为新的试剂容器103，或另外，可新追加别的试剂容器103。在试剂容器103上贴附印刷含收容的试剂的种类和由赋予试剂的序列号组成的试剂ID的条码的条码标记103a。
使用者可开盖20b而更换灯单元27(参照图5)。另外，使用者可开盖20c而更换穿孔器17a(参照图5)。受试体搬送部30将在受试体架102上支持的受试体容器101搬送至由穿孔器17a的抽吸位置。受试体容器101由橡胶制的盖101a密封。
使用血液受试体分析装置10时，使用者，首先，按下测定部20的电源按钮20d而使测定部20启动，按下控制装置40的电源按钮439而使控制装置40启动。控制装置40启动，则在显示部41显示登录画面。使用者向登录画面输入使用者名及密钥而登录到控制装置40，开始血液受试体分析装置10的使用。
接下来对于测定装置的构成而进行说明。如图5所示，测定部20具备试剂台11及12、比色杯台13、条码读取器14、比色杯供给部15、捕集器16、受试体分注臂17、试剂分注臂18、紧急受试体设置部19、光纤21、检测部22、比色杯移送部23、加温部24、废弃口25、流体部26和灯单元27。
(测定试样调制部)
试剂台11及12和比色杯台13各自有圆环形状，能旋转地构成。试剂台11及12相当于试剂收纳部，其上载置试剂容器103。在试剂台11及12上载置的试剂容器103的条码由条码读取器14读取。从条码读取的信息(试剂的种类、试剂ID)输入控制装置40，储存到硬盘434(参照图10)。
在第8实施方式涉及的装置中，在试剂台11及/或12上载置各自收容有含FXII活化剂及磷脂的APTT测定用试剂、用于稀释该试剂的稀释液、钙溶液等的试剂容器103。在第9实施方式涉及的装置中，在试剂台11及/或12上载置各自收容有FXII活化剂、磷脂、组织因子、钙溶液等的试剂容器103。或者，也可载置各自收容有第5实施方式涉及的试剂、或者第6或第7实施方式涉及的试剂盒的各试剂的试剂容器103。另外，在任何的装置中，也可在试剂台11及/或12上载置各自收容有FVIII制剂、及FVIII缺损血浆的试剂容器103。
在比色杯台13上形成了由能支持比色杯104的多个孔构成的支持部13a。由使用者投入比色杯供给部15的新的比色杯104由比色杯供给部15依次移送，由捕集器16设置到比色杯台13的支持部13a。
在受试体分注臂17和试剂分注臂18上可以各自上下移动及旋转移动的方式连接步进电机。在受试体分注臂17的尖端，以可穿刺受试体容器101的盖101a的方式设置有尖端锐利地形成的穿孔器17a。试剂分注臂18的尖端设置有移液器18a。移液器18a的尖端与穿孔器17a不同而平坦地形成。另外，在移液器18a上，连接静电容量式的液面检测传感器213(参照图6)。
由受试体搬送部30(参照图4)而受试体容器101被搬送到指定位置，则穿孔器17a由受试体分注臂17的旋转移动而位于受试体容器101的正上方。进而，受试体分注臂17向下方移动，穿孔器17a贯通受试体容器101的盖101a，收容到受试体容器101中的血液受试体由穿孔器17a抽吸。在紧急受试体设置部19设置要求紧急的血液受试体时，穿孔器17a剌入从受试体搬送部3供给的受试体，抽吸要求紧急的血液受试体。由穿孔器17a抽吸的血液受试体吐出到比色杯台13上的空的比色杯104。
吐出血液受试体的比色杯104由比色杯移送部23的捕集器23a，从比色杯台13的支持部13a移送到加温部24的支持部24a。加温部24将收容到设置于支持部24a的比色杯104中的血液受试体以指定的温度(例如37℃)加温一定时间。由加温部24的血液受试体的加温结束，则此比色杯104由捕集器23a再把持。进而，此比色杯104在由捕集器23a把持的状态下位于指定位置，在此状态下，由移液器18a抽吸的试剂吐出到比色杯104内。
在由移液器18a的试剂的分注中，首先，旋转试剂台11及12，收容对应于测定项目的试剂的试剂容器103搬送到由移液器18a的抽吸位置。进而，基于用于检测原点位置的传感器而移液器18a的上下方向的位置位于原点位置之后，移液器18a下降至由液面检测传感器213检测到移液器18a的下端与试剂的液面接触。移液器18a的下端与试剂的液面接触，则移液器18a进一步下降至可抽吸必要的量的试剂的程度。进而，移液器18a的下降被停止，由移液器18a抽吸试剂。由移液器18a抽吸的试剂吐出到由捕集器23a把持的比色杯104。进而，由捕集器23a的振动功能搅拌比色杯104内的血液受试体和试剂。由此，进行测定试样的调制。其后，收容测定试样的比色杯104由捕集器23a，移送到检测部22的支持部22a。
(光学信息取得部)
灯单元27供给在由检测部22的光学信号的检测中使用的多种波长的光。参照图7而说明灯单元27的构成的一例。灯单元27相当于光源，具备卤素灯27a、灯罩27b、聚光透镜27c～27e、圆盘形状的滤器部27f、电机27g、光透过型的传感器27h和光纤偶联器27i。
参照图5，来自灯单元27的光经光纤21供给于检测部22。检测部22中设有多个孔状的支持部22a，使得在各支持部22a上能插入比色杯104。在各支持部22a上，各自安装光纤21的端部，使得能向在支持部22a上支持的比色杯104照射来自光纤21的光。检测部22经光纤21，向比色杯104照射从灯单元27供给的光，检测透过比色杯104的光(或者来自比色杯104的散射光)的光量。
参照图8A～D而显示配置在检测部22的多个支持部22a之中之一的构成的例，其他支持部22a也有同样的构成。参照图8A，在检测部22上形成了插入有光纤21的尖端的圆形的孔22b。再者，在检测部22上形成了使孔22b连通到支持部22a的圆形的连通孔22c。孔22b的径大于连通孔22c的径。在孔22b的端部配置有使来自光纤21的光聚光的透镜22d。再者，在支持部22a内壁面，在面对连通孔22c的位置上形成了孔22f。此孔22f的里面配置有光检测器22g。光检测器22g相当于光接收部，输出对应于光接收光量的电信号。透过透镜22d的光经连通孔22c、支持部22a及孔22f，在光检测器22g的光接收面聚光。光纤21在端部插入孔22b的状态下，由片簧22e保持。
参照图8B，在支持部22a上支持比色杯104，则由透镜22d聚光的光透过比色杯104及收容到比色杯104中的试样，入射到光检测器22g。在试样中进行血液凝固反应，则试样的浊度升高。伴随其而透过试样的光的光量(透射光量)减少，光检测器22g的检测信号的水平降低。
参照图8C而说明使用散射光时的检测部22的构成。在支持部22a的内侧面，与连通孔22c相同的高度的位置设有孔22h。此孔22h的里面配置有光检测器22i。在支持部22a上插入比色杯104，从光纤21发射光，则由比色杯104内的测定试样散射的光经孔22h照射到光检测器22i。在此例中，来自光检测器22i的检测信号显示由测定试样的散射光的强度。另外，如图8D所示，也可使成为可检测透过测定试样的透射光和由测定试样散射的散射光的两方。
如上所述，检测部22向比色杯104照射从灯单元27供给的光，取得来自测定试样的光学信息。取得的光学信息发送到控制装置40。控制装置40基于光学信息而进行分析，将分析结果显示于显示部41。
测定结束后，不要的比色杯104由比色杯台13搬送，由捕集器16废弃到废弃口25。再者，在测定动作时，穿孔器17a和移液器18a由从流体部26供给的清洗液等的液体，适宜清洗。
接下来对于测定装置的硬件构成而进行说明。如图6所示，测定部20含控制部200、步进电机部211、旋转编码器部212、液面检测传感器213、传感器部214、机构部215、光学信息取得部216和条码读取器14。
参照图6，控制部200含CPU201、存储器202、通信接口203和I/O接口204。CPU201执行存储到存储器202中的计算机程序。存储器202由ROM、RAM、硬盘等构成。另外，CPU201经通信接口203，使受试体搬送部30驱动的同时，在控制装置40之间进行指示信号及数据的发送接收。另外，CPU201经I/O接口204而控制测定部20内的各部的同时，接收从各部输出的信号。
步进电机部211含用于各自驱动试剂台11及12、比色杯台13、捕集器16、受试体分注臂17、试剂分注臂18和比色杯移送部23的步进电机。旋转编码器部212含输出对应于步进电机部211中所含的各步进电机的旋转变位量的脉冲信号的旋转编码器。
液面检测传感器213与设置在试剂分注臂18的尖端的移液器18a连接，检测移液器18a的下端与试剂的液面接触。传感器部214含检测移液器18a的上下方向的位置位于原点位置的传感器和检测按下电源按钮20d的传感器。机构部215以由比色杯供给部15、紧急受试体设置部19、用于驱动加温部24和流体部26的机构、穿孔器17a和移液器18a的分注动作变得可能的方式含向穿孔器17a和移液器18a供给压力的空压源。光学信息取得部216，参照图5，至少含灯单元27、光纤21和检测部22。
接下来对于控制装置40的构成而进行说明。如图4所示，控制装置40由显示部41、输入部42和计算机本体43构成。控制装置40从测定部20接收光学信息。进而，控制装置40的处理器基于光学信息而算出关于凝固曲线的微分的参数。另外，控制装置40的处理器也可基于光学信息而算出凝固时间。进而，控制装置40的处理器执行用于血液受试体的凝固能力的评价的计算机程序。从而，控制装置40也作为用于血液受试体的凝固能力的评价的装置发挥功能。
对于控制装置40的功能构成，如图9所示，控制装置40具备取得部401、存储部402、算出部403和输出部404。取得部401与测定部20能经网络通信地连接。输出部404与显示部41能通信地连接。
取得部401取得从测定部20发送的光学信息。存储部402存储用于算出关于凝固曲线的微分的各种参数的值的式等。另外，存储部402也可存储用于算出凝固时间的式、及将关于凝固曲线的微分的参数换算为FVIII活性值等的式、该参数的值或对于其换算值的阈值。算出部403使用在取得部401中取得的信息，根据存储于存储部402中的式而算出各种参数的值。另外，算出部403也可将算出的参数的值换算为FVIII活性值。输出部404以由算出部403算出的参数的值或其换算值作为对于血液受试体的参考信息输出。
如图10所示，控制装置40的计算机本体43具备CPU431、ROM432、RAM433、硬盘434、读取装置435、输入输出接口436、通信接口437、图像输出接口438和电源按钮439。CPU431、ROM432、RAM433、硬盘434、读取装置435、输入输出接口436、通信接口437、图像输出接口438及电源按钮439由总线440能通信地连接。
CPU431执行存储到ROM432上的计算机程序及加载到RAM433上的计算机程序。CPU431通过执行应用程序，实现上述的各功能块。由此，计算机系统作为用于评价血液受试体的凝固能力的判断装置的终端发挥功能。
ROM432由掩模型ROM、PROM、EPROM、EEPROM等构成。在ROM432上，记录由CPU431执行的计算机程序及在其中使用的数据。
RAM433由SRAM、DRAM等构成。RAM433在ROM432及硬盘434中记录的计算机程序的读取中使用。另外，RAM433，在执行这些计算机程序之时，也被作为CPU431的作业区域利用。
硬盘434安装操作系统、用于使CPU431执行的应用程序(用于血液受试体的凝固能力的评价的计算机程序)等的计算机程序、在所述计算机程序的执行中使用的数据、及控制装置40的设定内容。
读取装置435由软盘驱动器、CD-ROM驱动器、DVD-ROM驱动器等构成。读取装置435可读取在CD、DVD等的可移动型记录介质441中记录的计算机程序或数据。
输入输出接口436，例如，由USB、IEEE1394、RS-232C等的串行接口，SCSI、IDE、IEEE1284等的并行接口和由D/A变换器、A/D变换器等构成的模拟接口构成。在输入输出接口436上，连接键盘、鼠标等的输入部42。使用者经输入部42而输入指示，输入输出接口436接受经输入部42而输入的信号。
通信接口437是例如，Ethernet(注册商标)接口等。控制装置40能由通信接口437向打印机发送印刷数据。通信接口437与测定部20连接，CPU431经通信接口437，在测定部20之间进行指示信号及数据的发送接收。
图像输出接口438与由LCD、CRT等构成的显示部41连接。图像输出接口438将对应于图像数据的影像信号输出到显示部41，显示部41基于从图像输出接口438输出的影像信号而显示图像。
参照图6，测定动作时、测定部20的CPU201将使从检测部22(参照图5)输出的检测信号数字化的数据(光学信息)暂时储存到存储器202中。存储器202的存储区域对每个支持部22a区分割。在各区中依次储存在对于在对应的支持部22a上支持的比色杯104照射指定波长的光之时取得的数据(光学信息)。由此，经指定的测定时间而依次、数据储存到存储器202。经过测定时间，则CPU201中止对于存储器202的数据的储存，将储存的数据经通信接口203发送到控制装置40。控制装置40处理接收的数据而进行解析，将解析结果显示于显示部41。
在测定部20中的处理主要在测定部20的CPU201的控制之下进行，在控制装置40中的处理主要在控制装置40的CPU431的控制之下进行。参照图11，开始测定处理，则测定部20从由受试体搬送部搬送的受试体容器101抽吸指定量的受试血浆，将其分注到比色杯台13上的空的比色杯104中。再者，作为对照还测定FVIII缺损血浆时，测定部20从收容于试剂收容部的放入FVIII缺损血浆的试剂容器103抽吸指定量的FVIII缺损血浆，将其分注到空的比色杯104中。另外，在也测定添加FVIII制剂的FVIII缺损血浆时，测定部20从收容有FVIII缺损血浆的试剂容器103抽吸指定量的FVIII缺损血浆，将其分注到空的比色杯104中。进而，测定部20从收容有FVIII制剂的试剂容器103抽吸指定量的FVIII制剂，将其分注到放入有FVIII缺损血浆的比色杯104中而进行搅拌。
接下来，测定部20向加温部24移送分注了血浆的比色杯104，将比色杯104内的血浆加温到指定温度(例如37℃)。其后，测定部20向比色杯104添加试剂及钙溶液，调制测定试样(步骤S11)。其中，在第8实施方式涉及的装置中，当载置含FXII活化剂及磷脂的通常的APTT测定用试剂时，测定部20可用稀释液以指定的倍率稀释该APTT测定用试剂，调制血液凝固分析用试剂。具体而言如下。测定部20从收容有通常的APTT测定用试剂的试剂容器103抽吸指定量的试剂，将其分注到空的试剂容器103中。进而，测定部20从收容有稀释液的试剂容器103抽吸指定量的稀释液，将其添加到分注了通常的APTT测定用试剂的试剂容器104中而进行搅拌。稀释倍率可根据使用的APTT测定用试剂适宜决定，如果是一般的市售的APTT测定用试剂，例如是1.3倍以上30倍以下，优选为2倍以上10倍以下。在第8实施方式涉及的装置中，将对一般的市售的APTT测定用试剂进行稀释而得到的试剂作为血液凝固分析用试剂使用。
在优选的实施方式中，测定部20使用上述的稀释的APTT测定用试剂而调制测定试样，至在测定试样中的FXII活化剂的终浓度成为1μM以上22μM以下，并且磷脂的终浓度成为1.4μM以上33μM以下，或者，在测定试样中的FXII活化剂的终浓度成为1μM以上2.9μM以下，并且磷脂的终浓度成为1.4μM以上43μM以下。
其后，测定部20向检测部22移送添加了试剂的比色杯104，向比色杯104照射光而对测定试样进行测定(步骤S12)。测定部20从向比色杯104添加钙溶液的时间点起开始时间的测量。在此测定中，基于波长660nm的光的数据(散射光量或透射光量)在测定时间之间，依次储存到存储器202。此时，数据在对应于从钙溶液的添加时间点起的经过时间的状态下储存于存储器202。进而，经过测定时间，则测定部20中止测定，将存储器202中储存的测定结果(数据)发送到控制装置40(步骤S13)。由此，控制装置40从测定部20接收测定结果(数据)(步骤S21：YES)，则控制装置40对于接收的测定结果执行分析处理(步骤S22)。即，控制装置40对于测定试样，从关于凝固曲线的微分的参数(|Min1|、|Min2|、Max 2、AUC及斜率)换算为显示血液受试体的凝固能力的值(例如，FVIII活性值)。再者，控制装置40也可还算出测定试样的凝固时间及凝固曲线。进行分析处理之后，控制装置40执行分析结果的显示处理(步骤S23)。
参照图12说明使用一种关于凝固曲线的微分的参数的情况的处理的流程。其中，以从来自测定试样的关于光量的光学信息，作为关于凝固曲线的微分的参数的值取得|min1|的值，将取得的值换算而取得FVIII值，以此FVIII值作为关于血液受试体的凝固能力的参考信息输出的情况作为例进行说明。但是，本实施方式不仅限定于此例。在此例中，也可代替|min1|而取得|min2|、max 2、AUC或斜率(Slope)的值。或者，也可取得多个参数，从各自的参数的值取得FVIII值。此时，作为参考信息，也可输出从多个参数的值换算的FVIII值的平均值、最小值、最大值等。
首先，在步骤S101中，控制装置40的取得部401基于从测定部20接收的数据(散射光量或透射光量)而取得光学信息(散射光强度、或者透过度或吸光度)。接下来，在步骤S102中，算出部403根据用于从取得部401取得的光学信息算出存储于存储部402的关于凝固曲线的微分的参数的式而算出|min1|的值。再者，虽然凝固时间及凝固曲线不在后述的判断的处理中利用，但算出部403也可从取得部401取得的光学信息还算出凝固时间及凝固曲线。
在步骤S103中，算出部403从算出的|min1|的值，根据存储于存储部402的换算式算出FVIII活性值。在步骤S103中，算出部403将取得的FVIII活性值发送到输出部404。在步骤S104中，输出部404输出FVIII活性值，显示于显示部41，或用打印机打印。或者，也可用声音输出。由此，可将FVIII活性值作为关于受试血浆的凝固能力的参考信息提供于使用者。
作为显示分析结果的画面的一例，参照图13，对于显示使用含FXII活化剂及磷脂的试剂分析受试血浆的凝固过程的结果的画面进行说明。画面D1含显示受试体编号的区域D11、显示测定项目名的区域D12、用于显示详细画面的按钮D13、用于显示测定日期的区域D14、显示测定结果的区域D15、显示解析信息的区域D16和显示凝固曲线及对其进行微分的坐标图的区域D17。
在区域D15中，显示测定项目和测定值。在区域D15中，“APTT sec”是活化部分促凝血酶原激酶时间。在区域D15中，作为关于凝固曲线的微分的参数的值，也可显示|Min1|、|Min2|、Max 2等。
在区域D16中，表示解析项目和参考信息。在区域D16中，“Index”是在FVIII活性值的算出中使用的关于凝固曲线的微分的参数的值。“FVIII换算值(参考)”是从Index的值换算的FVIII活性值的值。再者，有FVIII替代活性的物质的药效的评价不仅是此结果，优选还考虑其他检查结果或受试者的身体见解等的信息而进行。从而，为了显示利用本实施方式涉及的血液受试体分析装置的FVIII换算值是参考信息，表示为“(参考)”。
接下来，将本发明由实施例详细地说明，本发明不限定于这些实施例。
【实施例】
【实施例1】
探讨通过对市售的APTT测定试剂进行稀释而作为调整FXII活化剂及磷脂的浓度的血液凝固分析用试剂使用而可适合地评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力与否。
(1)试剂
作为市售的APTT测定试剂，使用ThromboCheckAPTT-SLA(Sysmex株式会社)。此试剂由作为FXII活化剂的鞣花酸(86.4μM)和合成磷脂(130μM)构成。将此APTT测定试剂和Owren's Veronal缓冲液(Sysmex株式会社)用体积比表示，以试剂:缓冲液＝3:1、1:1、1:2、1:9、及1:29的比例混合，调制血液凝固分析用试剂(各自相当于将ThromboCheckAPTT-SLA稀释1.33倍、2倍、3倍、10倍及30倍的试剂)。作为含钙离子的凝固开始试剂，使用20mM氯化钙液(Sysmex株式会社)。另外，作为对照，将ThromboCheckAPTT-SLA不稀释而使用。
(2)有第VIII凝血因子替代活性的物质
作为有FVIII替代活性的物质，使用在专利文献(WO2012/067176)中记载的作为抗FIXa/FX双特异性抗体的ACE910(Q499-z121/J327-z119/L404-k)。此抗体由WO2005/035756、WO2006/109592及WO2012/067176中记载的方法取得。具体而言，如以下一样地取得抗体。首先，将在WO2012/067176中记载的抗体基因整合到动物细胞表达用载体，将得到的构建物转染到HEK293细胞中，使抗FIXa/FX双特异性抗体表达。进而，将该细胞的培养上清中所含的双特异性抗体由蛋白A及凝胶过滤纯化。再者，得到的双特异性抗体有产生FXa的促进活性用在WO 2012/067176、WO2014/050926等中记载的方法确认。
(3)血液受试体
向FVIII缺乏人血浆(George King Bio-Medical)添加双特异性抗体ACE910至成为0、10、30、100或300μg/mL的浓度，调制含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体。另外，作为用于制成标准曲线的受试体，调制向FVIII缺乏人血浆(George King Bio-Medical)添加重组体人FVIII(rhFVIII、Bayer株式会社)至成为0、1、3、10、30、100或200IU/dL的浓度的血液受试体。
(4)测定试样的调制及测定
在测定试样的调制及测定中，使用全自动血液凝固测定装置CS-5100(Sysmex株式会社)。向血液受试体(50μL)添加血液凝固分析用试剂(50μL)，于37℃温育3分钟。进而，添加20mM氯化钙液(50μL)而调制测定试样。将测定试样的透过度从氯化钙液的添加时起连续测定420秒钟。再者，在测定试样中的鞣花酸及磷脂的各自的终浓度如表1所示。
【表1】测定试样中的终浓度
稀释倍率 鞣花酸(μM) 磷脂(μM)
无稀释 28.8 43.3
1.33倍 21.6 32.5
2倍 14.4 21.6
3倍 9.6 14.4
10倍 2.9 4.3
30倍 1.0 1.4
(5)解析结果
基于得到的透过度的经时变化而作为凝固时间和关于凝固曲线的微分的参数算出|Min1|、|Min2|及Max 2，标绘于坐标图。将从含ACE910的血液受试体及含rhFVIII的血液受试体得到的凝固时间、|Min1|、|Min2|及Max 2的坐标图各自示于图14A、图15A、图16A及图17A。以含rhFVIII的血液受试体的坐标图作为标准曲线，将含ACE910的血液受试体的凝固时间、|Min1|、|Min2|及Max 2换算为FVIII活性值，从得到的换算值制成坐标图。将得到的坐标图各自示于图14B、图15B、图16B及图17B。
本发明人预先从血友病的动物模型发现ACE910血中浓度和FVIII活性值的关系。具体而言定义，基于由抗FVIII中和抗体的施用而呈现与后天性血友病A同样的症状的食蟹猴中的ACE910及rhFVIII的止血效果，ACE910换算为每1μg/mL0.2～0.4IU/dL的FVIII活性值。再者，本发明人确认，此换算值也不偏离在血友病A患者中的临床试验的结果(出血次数)。图14B、图15B、图16B及图17B中的2条的虚线显示将ACE910浓度换算为每1μg/mL而0.2或0.4IU/dL的FVIII活性值的坐标图。将夹在此2条的虚线之间的区域定为理想范围，探讨从各参数换算的FVIII在此理想范围内，上述的血液凝固分析用试剂使含ACE910的血液受试体的凝固能力的适合的评价成为可能与否。特别是，作为ACE910的血中浓度，探讨被认为临床上重要的10～100μg/mL的范围的结果。
如图14B所示，从凝固时间换算的FVIII活性值在使用任何的试剂时都从理想范围大大脱离。这表示，从凝固时间换算的FVIII活性值从自动物模型预测的活性值偏离。从而显示，即使基于凝固时间，也无法适合地评价含ACE910的血液受试体的凝固能力。如图15B、图16B及图17B所示，在使用未稀释的APTT试剂时，从|Min1|、|Min2|及Max 2的各自换算的FVIII活性值未在理想范围内。从而表示，在市售的APTT试剂中，无法适合地评价含ACE910的血液受试体的凝固能力。一方面，使用稀释为1.33～30倍的试剂时，从|Min1|换算的FVIII活性值在ACE910浓度10～100μg/mL的范围内，至少1分的FVIII活性值含在理想范围内。另外，使用稀释为2～3倍的试剂时，从|Min2|换算的FVIII活性值在ACE910浓度10～100μg/mL的范围内，至少1分的FVIII活性值含在理想范围内。另外，使用稀释为1.33～10倍的试剂时，从Max 2换算的FVIII活性值在ACE910浓度10～100μg/mL的范围内，至少1分的FVIII活性值含在理想范围内。从而表示，通过由稀释调整APTT测定试剂的活化剂及磷脂的浓度，可适合地评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力。
【实施例2】
对于与在实施例1中使用的试剂不同的市售的APTT测定试剂，也通过稀释使用而可适合地评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力的同样的探讨。
(1)试剂
作为市售的APTT测定试剂，使用ThromboCheckAPTT-SLA(Sysmex株式会社)、肌动蛋白FSL(Sysmex株式会社)、及Dade Actin(データファイ)·APTT(FS)(Sysmex株式会社)。肌动蛋白FSL由鞣花酸和大豆及兔脑来源的磷脂构成。Dade Actin(データファイ)·APTT(FS)由鞣花酸和大豆来源的磷脂构成。将各APTT测定试剂和Owren's Veronal缓冲液(Sysmex株式会社)用体积比表示，以试剂:缓冲液＝1:2的比例混合，调制血液凝固分析用试剂(相当于将各试剂稀释3倍的试剂)。作为含钙离子的凝固开始试剂，使用20mM氯化钙液(Sysmex株式会社)。另外，作为对照，将各试剂不稀释而使用。
(2)血液受试体
向FVIII缺乏人血浆(George King Bio-Medical)添加双特异性抗体ACE910至成为0、0.3、1、3、10、30、100或300μg/mL的浓度，调制含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体。另外，作为用于制成标准曲线的受试体，调制向FVIII缺乏人血浆(George King Bio-Medical)添加重组体人FVIII(rhFVIII、Bayer株式会社)至成为0、1、3、10、30、100或200IU/dL的浓度的血液受试体。
(3)测定试样的调制及测定
测定试样的调制及测定与实施例1同样地进行。
(4)解析结果
基于得到的透过度的经时变化而作为凝固时间和关于凝固曲线的微分的参数算出|Min1|、|Min2|及Max 2，标绘于坐标图。以含rhFVIII的血液受试体的坐标图作为标准曲线，将含ACE910的血液受试体的凝固时间、|Min1|、|Min2|及Max 2换算为FVIII活性值，从得到的换算值制成坐标图。将由稀释3倍的试剂得到的各参数的换算值各自示于图18A～D。在这些图中，以虚线表示的坐标图与实施例1同样、是从动物模型定义的理想范围。
从使用未稀释的各试剂而得到的凝固时间换算的FVIII活性值从理想范围大大脱离。另外，如图18A所示，从使用稀释3倍的各试剂而得到的凝固时间换算的FVIII活性值也从理想范围大大脱离。另外，使用未稀释的各试剂得到的来自|Min1|、|Min2|及Max 2的FVIII活性值在ACE910浓度10～100μg/mL中而多从理想范围脱离。从而表示，在市售的APTT试剂中，难以适合地评价含ACE910的血液受试体的凝固能力。一方面，如图18B～D所示，使用稀释3倍的各试剂得到的来自|Min1|、|Min2|及Max 2的FVIII活性值在ACE910浓度10～100μg/mL中而多含在理想范围内。从而表示，通过对市售的APTT试剂进行稀释，可适合地评价含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体的凝固能力。
【实施例3】
探讨即使是含具有FVIII替代活性的物质及FVIII的两方的血液受试体，仍可由稀释的APTT测定试剂适合地评价凝固能力与否。
(1)试剂
作为市售的APTT测定试剂，使用ThromboCheckAPTT-SLA(Sysmex株式会社)。将此APTT测定试剂和Owren's Veronal缓冲液(Sysmex株式会社)用体积比表示，以试剂:缓冲液＝1:2的比例混合，调制血液凝固分析用试剂(相当于将ThromboCheckAPTT-SLA稀释3倍的试剂)。作为含钙离子的凝固开始试剂，使用20mM氯化钙液(Sysmex株式会社)。
(2)血液受试体
向FVIII缺乏人血浆(George King Bio-Medical)添加双特异性抗体ACE910至成为0、0.3、1、3、10、30、100或300μg/mL的浓度，调制含具有FVIII替代活性的物质的血液受试体。进一步调制3组此以各种浓度含ACE910的血液受试体的系列，向各组添加重组体人FVIII(rhFVIII、Bayer株式会社)至成为1或5IU/dL的浓度，调制含ACE910及FVIII的两方的血液受试体。另外，作为用于制成标准曲线的受试体，调制向FVIII缺乏人血浆(GeorgeKing Bio-Medical)添加重组体人FVIII(rhFVIII、Bayer株式会社)至成为0、1、3、10、30、100或200IU/dL的浓度的血液受试体。
(3)测定试样的调制及测定
测定试样的调制及测定与实施例1同样地进行。再者，在测定试样中的鞣花酸的终浓度是9.6μM，磷脂的终浓度是14.4μM。
(4)解析结果
基于得到的透过度的经时变化而作为关于凝固曲线的微分的参数算出|Min1|、|Min2|及Max 2，标绘于坐标图。将得到的坐标图各自示于图19A、图20A及图21A。以含rhFVIII的血液受试体的坐标图作为标准曲线，将各血液受试体的|Min1|、|Min2|及Max 2换算为FVIII活性值，从得到的换算值制成坐标图。将得到的坐标图各自示于图19B、图20B及图21B。如这些坐标图所示，在FVIII存在下，也见到ACE910浓度依赖性的参数值的变化。从而表示，通过由稀释调整APTT测定试剂的活化剂及磷脂的浓度，即使是含具有FVIII替代活性的物质及FVIII的两方的血液受试体，仍可适合地评价凝固能力。
【实施例4】
【(1)在使用由鞣花酸和磷脂构成的凝固开始试剂的FVIII缺乏血浆中的双特异性抗体的凝固曲线解析】
向添加双特异性抗体ACE910或重组体人FVIII(rhFVIII、Bayer株式会社)的第VIII因子(FVIII)缺乏人血浆(George King Bio-Medical,Lot No.899-3062,895-2757,899-2847)50μL各自添加50μL的由鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂1～3。温育3分钟后，添加0.02mol/L氯化钙溶液50μL而开始凝固反应，用血液凝固自动测定装置CS-2000i(Sysmex株式会社)测定。将在测定试样中的鞣花酸及磷脂的各自的终浓度示于以下的表2。再者，血液凝固分析用试剂1～3在图22～图24中，各自显示为试剂1～试剂3。
【表2】由鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂
鞣花酸 磷脂
血液凝固分析用试剂1 29μM 43μM
血液凝固分析用试剂2 29μM 4.3μM
血液凝固分析用试剂3 2.9μM 43μM
再者，表2中的鞣花酸及磷脂的各浓度用将血浆、血液凝固分析用试剂、及氯化钙溶液混合之后的终浓度(测定试样中的终浓度)记载。
【(2)在使用由组织因子、鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂的FVIII缺乏血浆中的双特异性抗体的凝固曲线解析】
向添加ACE910或重组体人FVIII(rhFVIII、Bayer株式会社)的FVIII缺乏人血浆(George King Bio-Medical,Lot No.899-3062,895-3394)50μL各自添加50μL的由组织因子、鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂4～16。温育3分钟后，添加0.02mol/L氯化钙溶液50μL而开始凝固反应，用血液凝固自动测定装置CS-2000i(Sysmex株式会社)进行测定。将在测定试样中的组织因子、鞣花酸及磷脂的各自的终浓度示于以下的表3。再者，血液凝固分析用试剂4～15在图25～图29中，各自显示为试剂4～试剂15。
【表3】由组织因子、鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂
组织因子 鞣花酸 磷脂
血液凝固分析用试剂4 7.3ng/mL 26μM 43μM
血液凝固分析用试剂5 0.13ng/mL 0.86μM 13μM
血液凝固分析用试剂6 0.044ng/mL 0.86μM 13μM
血液凝固分析用试剂7 0.015ng/mL 0.86μM 13μM
血液凝固分析用试剂8 0.0049ng/mL 0.86μM 13μM
血液凝固分析用试剂9 0.002ng/mL 0.86μM 13μM
血液凝固分析用试剂10 0.044ng/mL 0.29μM 13μM
血液凝固分析用试剂11 0.015ng/mL 0.29μM 13μM
血液凝固分析用试剂12 0.0049ng/mL 0.29μM 13μM
血液凝固分析用试剂13 0.002ng/mL 0.29μM 13μM
血液凝固分析用试剂14 0.0049ng/mL 0.10μM 13μM
血液凝固分析用试剂15 0.002ng/mL 0.10μM 13μM
血液凝固分析用试剂16 0.0049ng/mL 0.15μM 13μM
再者，表3中的组织因子、鞣花酸、及磷脂的各浓度用将血浆、血液凝固分析用试剂、及氯化钙溶液混合之后的终浓度(测定试样中的终浓度)记载。
【(3)在使用含鞣花酸及磷脂的血液凝固分析用药的FVIII存在下的FVIII缺乏血浆中的双特异性抗体的凝固曲线解析】
向将ACE910添加到添加了1、5、或者20U/dL的重组体人FVIII(rhFVIII、Bayer株式会社)的FVIII缺乏人血浆(George King Bio-Medical,Lot No.899-3062)而得到的样品50μL添加50μL的由鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂(表2的血液凝固分析用试剂3)。温育3分钟后，添加0.02mol/L氯化钙溶液50μL而开始凝固反应，用血液凝固自动测定装置CS-2000i(Sysmex株式会社)进行测定。
【(4)在使用含组织因子、鞣花酸及磷脂的血液凝固分析用药的FVIII存在下的FVIII缺乏血浆中的双特异性抗体的凝固曲线解析】
向将ACE910添加到添加了1、5、20、50、100、或者200U/dL的重组体人FVIII(rhFVIII、Bayer株式会社)的FVIII缺乏人血浆(George King Bio-Medical,Lot No.899-3394)而得到的样品50μL添加50μL的由组织因子、鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂(表3的血液凝固分析用试剂12或16)。温育3分钟后，添加0.02mol/L氯化钙溶液50μL而开始凝固反应，用血液凝固自动测定装置CS-2000i(Sysmex株式会社)进行测定。
【结果】
<由鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂>
血液凝固分析用试剂1中所含的鞣花酸及磷脂的各浓度与作为市售的APTT测定试剂的ThromboCheck中所含的鞣花酸及磷脂相同。血液凝固分析用试剂2是不变更鞣花酸浓度而将磷脂浓度稀释为1/10的试剂，血液凝固分析用试剂3是将鞣花酸浓度稀释为1/10，不变更磷脂浓度的试剂。在血液凝固分析用试剂1、2及3之任一者中均使在各自含rhFVIII及ACE910的FVIII缺乏血浆中的凝固速度、及凝固加速度升高(参照图22A及B、图23A及B、以及图24A及B)。一方面，从含rhFVIII的受试体的|Min1|及|Min2|的标准曲线将含10、30、或者100μg/mL的ACE910的受试体的|Min1|及|Min2|各自换算为FVIII活性的值进入从止血效果期待的理想的范围(ACE910每1μg/mLFVIII 0.2～0.4U/dL)是仅使用血液凝固分析用试剂3的情况(图22C及D、图23C及D、以及图24C及D参照。图中，夹在两条虚线之间的区域表示理想范围)。再者，使用血液凝固分析用试剂3时，从含ACE910的受试体的|Min1|换算的FVIII活性值在10、30、或者100μg/mL之中2点以上进入理想的范围。这些结果表示，市售的APTT试剂(血液凝固分析用试剂1)过大评价ACE910的药效，与此相对，血液凝固分析用试剂3可适当监测ACE910的药效。
再者，有一例，当使用血液凝固分析用试剂3评价在含FVIII制剂的FVIII缺乏血浆中的ACE910的效果时，由ACE910的添加升高凝固速度及凝固加速度(参照图30A～E)。这些结果表示，通过使用如血液凝固分析用试剂3一样的浓度的由鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂，即使在FVIII存在下，仍可监测ACE910的药效。
<由组织因子、鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂>
血液凝固分析用试剂4～16是将组织因子、鞣花酸和磷脂调制至各自成为各种浓度的试剂。即使使用血液凝固分析用试剂4～16的任何的条件，ACE910的凝固时间、凝固速度及加速度升高(参照图25A～C、图26A～I、图27A～I及图32A～C)。以上表示，通过使用由组织因子、鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂，可监测ACE910的药效。再者，有一例显示，通过使用血液凝固分析用试剂4、6、11、12及15，从含rhFVIII的受试体的|Min1|的标准曲线将10、30、或者100μg/mL的ACE910的凝固速度换算为FVIII活性的值进入从止血效果期待的理想的范围(ACE910每1μg/mLFVIII 0.2～0.4U/dL)(图28及图29参照。图中，夹在两条虚线之间的区域表示理想范围)。
再者，有一例，当各自使用血液凝固分析用试剂12及16而评价在含FVIII制剂的FVIII缺乏血浆中的ACE910的效果时，由ACE910的添加升高凝固速度及凝固加速度(参照图31A～K及图32A～C)。这些结果表示，通过使用由组织因子、鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂，即使在FVIII存在下，仍可监测ACE910的药效。
【实施例5】
【在使用含组织因子、鞣花酸和磷脂的血液凝固分析用试剂盒的FVIII缺乏血浆中的双特异性抗体的凝固曲线解析】
在实施例5中，使用由含鞣花酸及磷脂的第1试剂和含组织因子及氯化钙溶液(0.02mol/L)的第2试剂构成的血液凝固分析用试剂盒17～34。向添加ACE910或重组体人FVIII(rhFVIII、Bayer株式会社)的FVIII缺乏人血浆(George King Bio-Medical)50μL添加50μL的第1试剂。温育3分钟后，添加50μL的第2试剂而开始凝固反应，用血液凝固自动测定装置CS-5100(Sysmex株式会社)进行测定。将使用血液凝固分析用试剂盒17～34调制的测定试样中的组织因子、鞣花酸及磷脂的各自的终浓度示于以下的表4。再者，血液凝固分析用试剂盒17～34在图33～图37中，各自显示为试剂17～试剂34。
【表4】由含鞣花酸及磷脂的第1试剂和含组织因子及氯化钙的第2试剂构成的血液凝固分析用试剂盒
再者，表4中的组织因子、鞣花酸、及磷脂的各浓度用将血浆、第1试剂、及第2试剂混合之后的终浓度(测定试样中的终浓度)记载。
即使是使用血液凝固分析用试剂盒17～34的任何的条件，ACE910的凝固速度及加速度仍升高(参照图33A～E、图34A～E及图35A～E)。以上表示，通过使用由组织因子、鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂，可监测ACE910的药效。再者，有一例显示，通过使用血液凝固分析用试剂盒19、20、23、24、28、30、32、33及34，从含rhFVIII的受试体的|Min1|的标准曲线将10、30、或者100μg/mL的ACE910的凝固速度换算为FVIII活性的值进入从止血效果期待的理想的范围(ACE910每1μg/mLFVIII 0.2～0.4U/dL)(图36A及B参照。图中，夹在两条虚线之间的区域表示理想范围)。
另外，有一例显示，通过使用血液凝固分析用试剂盒22、23及34，从含rhFVIII的受试体的|Min2|的标准曲线将10、30、或者100μg/mL的ACE910的凝固速度换算为FVIII活性的值进入从止血效果期待的理想的范围(ACE910每1μg/mLFVIII 0.2～0.4U/dL)(图37A及B参照。图中，夹在两条虚线之间的区域表示理想范围)。
【实施例6】
【使用含组织因子、鞣花酸和磷脂的血液凝固分析用试剂盒的旁路制剂存在下的FVIII缺乏血浆中的双特异性抗体的凝固曲线解析】
在实施例6中，使用由含鞣花酸及磷脂的第1试剂和含组织因子及氯化钙溶液(0.02mol/L)的第2试剂构成的血液凝固分析用试剂盒20、21、28、30、33、35及36。试剂盒20、21、28、30及33与实施例5相同。向将ACE910添加到添加0.5或1.0U/mL的APCC(FEIBA(注册商标)、Baxter株式会社)的FVIII缺乏人血浆(George King Bio-Medical)、或者添加0.25或1.0μg/mL的FVIIa(NovoSeven(注册商标)、Novo Nordisk Pharma)的FVIII缺乏人血浆(George King Bio-Medical)而得到的样品50μL添加50μL的第1试剂。温育3分钟后，添加50μL的第2试剂而开始凝固反应，用血液凝固自动测定装置CS-2000i(Sysmex株式会社)进行测定。将使用上述的各试剂盒调制的测定试样中的组织因子、鞣花酸及磷脂的各自的终浓度示于以下的表5。
【表5】由含鞣花酸及磷脂的第1试剂和含组织因子及氯化钙的第2试剂构成的血液凝固分析用试剂盒
鞣花酸(第1试剂) 磷脂(第1试剂) 组织因子(第2试剂)
血液凝固分析用试剂盒20 2.9μM 13μM 0.49ng/mL
血液凝固分析用试剂盒21 9.6μM 13μM 0.49ng/mL
血液凝固分析用试剂盒28 0.26μM 0.39μM 0.044ng/mL
血液凝固分析用试剂盒30 0.78μM 1.2μM 0.15ng/mL
血液凝固分析用试剂盒33 2.9μM 4.3μM 0.49ng/mL
血液凝固分析用试剂盒35 0.26μM 13μM 0.044ng/mL
血液凝固分析用试剂盒36 0.78μM 13μM 0.15ng/mL
再者，表5中的组织因子、鞣花酸、及磷脂的各浓度用将血浆、第1试剂、及第2试剂混合之后的终浓度(测定试样中的终浓度)记载。
当使用血液凝固分析用试剂盒20、21、28、30、33、35及36而评价在含旁路制剂的FVIII缺乏血浆中的ACE910的效果时，由ACE910的添加升高凝固速度(对于试剂盒20参照图38A～D、对于试剂盒21参照图39A～D、对于试剂盒28参照图40A～D、对于试剂盒30参照图41A～D、对于试剂盒33参照图42A～D、对于试剂盒35参照图43A～D、及对于试剂盒36参照图44A～D)。这些结果表示，通过使用由组织因子、鞣花酸和磷脂构成的血液凝固分析用试剂，即使在旁路制剂的存在下，仍可监测ACE910的药效。
【符号的说明】
10：血液受试体分析装置
11、12：试剂台(试剂收容部)
20：测定部
22g、22i：光检测器(光接收部)
27：灯单元(光源)
30：受试体搬送部
40：控制装置(控制部)
41：显示部
42：输入部
43：计算机本体
50：测定装置(测定试样调制部及光学信息取得部)
111：第1容器
112：第2容器
113：第3容器

Claims (23)

1.血液受试体的凝固能力的评价方法，其包括：
由下列物质调制测定试样的工序：
从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体、
第XII凝血因子活化剂、
磷脂、和
含有钙离子的水溶液，
向上述测定试样照射光，从上述测定试样取得关于光量的光学信息的工序，
基于取得的光学信息而取得至少1种关于凝固曲线的微分的参数的工序，及
基于取得的参数的值而评价上述血液受试体的凝固能力的工序，其中
在上述测定试样中的第XII因子活化剂的终浓度是1μM以上22μM以下，并且磷脂的终浓度是1.4μM以上33μM以下，或者
在上述测定试样中的第XII凝血因子活化剂的终浓度是1μM以上2.9μM以下，并且磷脂的终浓度是1.4μM以上43μM以下。
2.权利要求1所述的方法，其中在上述评价工序中，
从取得的参数的值取得显示含具有上述第VIII凝血因子替代活性的物质的血液受试体的凝固能力的值，
基于取得的显示凝固能力的值而评价上述血液受试体的凝固能力。
3.权利要求2所述的方法，其中上述显示凝固能力的值是第VIII凝血因子活性值。
4.权利要求1～3之任一项所述的方法，其中上述光学信息是连续或断续地测定的散射光量、透过度或吸光度，上述凝固曲线是表示上述散射光量、透过度或吸光度的经时变化的曲线。
5.权利要求1～4之任一项所述的方法，其中上述关于凝固曲线的微分的参数是选自最大凝固速度(|Min1|)、最大凝固加速度(|Min2|)、最大凝固减速度(Max 2)、曲线下部面积(AUC)及斜率(Slope)的至少1个。
6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中上述第XII凝血因子活化剂是选自鞣花酸、高岭土、硅藻土及氧化硅的至少1种。
7.血液受试体的凝固能力的评价方法，其包括：
由下列物质调制测定试样的工序：
从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体、
第XII凝血因子活化剂、
磷脂、
组织因子、和
含有钙离子的水溶液，
向上述测定试样照射光，从上述测定试样取得关于光量的光学信息的工序，及
基于取得的光学信息而评价上述血液受试体的凝固能力的工序。
8.用于评价从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的试剂，其中
以3μM以上66μM以下的浓度含第XII凝血因子活化剂，并且以4.2μM以上99μM以下的浓度含磷脂，或者
以3μM以上8.7μM以下的浓度含第XII凝血因子活化剂，并且以4.2μM以上129μM以下的浓度含磷脂。
9.用于评价从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的试剂盒，其具备第1试剂和由含有钙离子的水溶液构成的凝固开始试剂，
上述第1试剂以3μM以上66μM以下的浓度含第XII凝血因子活化剂，并且以4.2μM以上99μM以下的浓度含磷脂，或者
上述第1试剂以3μM以上8.7μM以下的浓度含第XII凝血因子活化剂，并且以4.2μM以上129μM以下的浓度含磷脂。
10.用于评价从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的试剂，其含第XII凝血因子活化剂、磷脂、及组织因子。
11.用于评价从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的试剂盒，其具备含第XII凝血因子活化剂、磷脂、及组织因子的第1试剂和由含有钙离子的水溶液构成的凝固开始试剂。
12.用于评价从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的试剂盒，其具备第1试剂、第2试剂和由含有钙离子的水溶液构成的凝固开始试剂，
上述第1试剂含第XII凝血因子活化剂及磷脂，并且上述第2试剂含组织因子，
上述第1试剂含第XII凝血因子活化剂及磷脂，并且上述第2试剂含组织因子及磷脂，或者
上述第1试剂含第XII凝血因子活化剂及组织因子，并且上述第2试剂含磷脂。
13.用于评价从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体的凝固能力的试剂盒，其具备第1试剂和第2试剂，
上述第1试剂含第XII凝血因子活化剂及磷脂，并且
上述第2试剂含组织因子及钙离子。
14.权利要求13所述的试剂盒，其中上述第2试剂还含磷脂。
15.血液受试体分析装置，其具备：
调制测定试样的测定试样调制部，
向调制的测定试样照射光，从上述测定试样取得关于光量的光学信息的光学信息取得部，及
控制部，
其中上述控制部
以如下方式控制上述测定试样调制部：将含第XII凝血因子活化剂及磷脂的活化部分促凝血酶原激酶时间测定用试剂用稀释液稀释为指定的倍率，由下列物质调制测定试样：
稀释的上述试剂、
从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体、和
含有钙离子的水溶液，
基于上述光学信息而取得至少1种关于凝固曲线的微分的参数，
基于取得的参数的值而输出上述关于血液受试体的凝固能力的参考信息。
16.权利要求15所述的血液受试体分析装置，其中上述参考信息是第VIII凝血因子活性值。
17.权利要求15或16所述的血液受试体分析装置，其中上述控制部以如下方式控制上述测定试样调制部：将上述活化部分促凝血酶原激酶时间测定用试剂以1.3倍以上30倍以下的倍率稀释。
18.权利要求15～17之任一项所述的血液受试体分析装置，其中上述控制部以如下方式控制上述测定试样调制部：
在上述测定试样中的第XII凝血因子活化剂的终浓度成为1μM以上22μM以下，并且磷脂的终浓度成为1.4μM以上33μM以下，或者
在上述测定试样中的第XII凝血因子活化剂的终浓度成为1μM以上2.9μM以下，并且磷脂的终浓度成为1.4μM以上43μM以下。
19.权利要求15～18之任一项所述的血液受试体分析装置，其中上述光学信息是连续或断续地测定的散射光量、透过度或吸光度。
20.血液受试体分析装置，其具备：
调制测定试样的测定试样调制部，
向调制的测定试样照射光，从上述测定试样取得关于光量的光学信息的光学信息取得部，及
控制部，
其中上述控制部
以由下列物质调制测定试样的方式控制上述测定试样调制部：
从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体、
第XII凝血因子活化剂、
磷脂、
组织因子、和
含有钙离子的水溶液，
基于上述光学信息而输出上述关于血液受试体的凝固能力的参考信息。
21.权利要求20所述的血液受试体分析装置，其中上述参考信息是第VIII凝血因子活性值。
22.用于血液受试体的凝固能力的评价的装置，其具备含处理器及处于上述处理器的控制下的存储器的计算机，
在上述存储器中记录有用于使上述计算机执行下述的步骤的计算机程序：
从由下列物质调制的测定试样取得关于光量的光学信息的步骤：
从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体、
第XII凝血因子活化剂、
磷脂、和
含有钙离子的水溶液，
基于上述光学信息而取得至少1种关于凝固曲线的微分的参数的步骤，及
基于取得的参数的值而输出上述关于血液受试体的凝固能力的参考信息的步骤。
23.用于血液受试体的凝固能力的评价的计算机程序，其为在计算机能读取的介质中记录的计算机程序，其使上述计算机执行下述的步骤：
从由下列物质调制的测定试样取得关于光量的光学信息的步骤：
从施用了有第VIII凝血因子替代活性的物质的受试者得到的血液受试体、
第XII凝血因子活化剂、
磷脂、和
含有钙离子的水溶液，
基于上述光学信息而取得至少1种关于凝固曲线的微分的参数的步骤，及
基于取得的参数的值而输出上述关于血液受试体的凝固能力的参考信息的步骤。
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