CN107474120B - 人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mcry1F - Google Patents

Abstract

本发明公开了人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mcry1F。本发明所提供的用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mcry1F编码mCry1F蛋白。mCry1F蛋白为b1)或b2)或b3)：b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；b3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗虫相关的蛋白质。实验表明，mcry1F基因较cry1F基因更容易获得高表达量的转化体，并且与cry1F蛋白相比，mcry1F蛋白对玉米螟、黏虫、棉铃虫和桃蛀螟的杀虫活性明显提高，具有重要的推广价值。

Description

人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mcry1F

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及用于植物表达的Bt mcry1F基因。

背景技术

Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，该菌为革兰氏阳性土壤杆菌，属于芽孢杆菌属，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上)，这些蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种昆虫具有特异性的杀虫活性。

1981年Schenpf和Whiteley从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆了第一个编码δ-内毒素的cry基因Cry1Aa1。1985年Adang,M.J等从苏云金芽孢杆菌

(Bacillus thuringiensis)中克隆了Cry1Ac基因，1986年Wabiko,H.等人从苏云金芽孢杆菌中克隆了cry1Ab基因，该基因编码1155个氨基酸，是目前产业化应用较为广泛的抗虫基因。1991年Chambers,J克隆了cry1Fa基因。截止到目前，已确定千余种苏云金芽孢杆菌菌系及万余种的杀虫晶体蛋白。

1983年美国华盛顿大学宣布成功将卡那霉素抗性基因导入烟草细胞，以及同年4月美国威斯康星大学宣布成功将大豆基因转入向日葵共同标志着植物转基因技术的诞生。1986年，首批转基因植物(抗虫、抗除草剂)被批准进入田间试验。1989年哺乳动物抗体重链和轻链基因在烟草中成功表达并正确组装成有功能的抗体。1990年Gordon-Kamm首次报道用基因枪转化玉米悬浮细胞系获得了可育的转化体。随后，玉米转基因技术开始迅猛发展，大量转基因植物陆续研制开发成功。Koziel(1993)等培育出了抗虫转基因玉米，转基因植株能水平表达Cry1Ab抗虫基因，提升玉米的抗虫性。张秀君(1999)等用基因枪法将两个含高赖氨酸蛋白质基因导入玉米的胚性愈伤组织。刘大文(2000)等将Zm13-Barnase基因转化玉米胚性愈伤组织，经过除草剂筛选得到阳性植株。Ishida(1996)等首次利用超双元载体建立了根癌农杆菌转化玉米自交系的幼胚，Frame(2002)等成功实现了根癌农杆菌利用普通的双元载体转化幼胚。张艳贞(2002)等对根癌农杆菌介导法将Bt杀虫基因导入优良玉米自交系进行了较为系统的研究。Huang和Wei(2005)利用根癌农杆菌成功转化了常规玉米自交系。Frame(2006)等和Lee(2007)等分别利用农杆菌成功转化了常规玉米自交系。

我国在转基因技术研究方面，已经建立了比较成熟的玉米转基因技术体系，在国内，中国农业大学较早的开展了玉米遗传转化的工作，1994在国内外首次用子房注射的方法把抗虫基因Bt转入玉米并获得转基因植株，以自主知识产权基因Bt为代表的抗虫玉米已展示了良好的开发前景。同时，在无选择标记、选择标记基因删除和目标基因产物定时降解、植物组织特异性优势表达等核心技术创新方面已具有较强的创新能力。目前已分离的抗虫基因很多，主要的抗虫基因有：①细菌来源的抗虫基因，主要是Bt毒蛋白基因(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2A、Cry3C等)；②植物来源的蛋白酶抑制剂基因，特点在于抗虫谱广、来源于植物本身易于被公众接受；③细菌来源的营养杀虫蛋白(Vip1、Vip2、Vip3等)，广谱抗鳞翅目，特别是对小地老虎、粘虫和甜菜叶蛾具有较强作用。由于基因抗虫能力及昆虫耐受性的影响，转基因抗虫产品主要通过获得更多更有效的抗虫基因、改造已有基因、双抗植物体等途径获得。

美国已成为世界上种植转基因玉米最大的国家，转基因玉米推广面积占美国玉米总面积的比例由2000年的25％上升至2015年的92％。数据显示，由于Bt玉米的使用，农药和杀虫剂的用量明显下降，大大减少了对环境的污染。既减少了农业生产成本，又可以节省劳动力。玉米抗虫的优良性状为社会带来了巨大的经济和环境效益，而在我国转基因玉米品种培育较美国还有较大差距，为此2008年国家启动了《转基因生物新品种培育科技重大专项》来改善目前状况。我国在转基因抗虫玉米品种培育方面虽有些报道，但是却没有能够最终商品化，主要归结于Bt基因的抗虫效果及转化植株的稳定性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物抗虫性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了mCry1F蛋白。

本发明所提供的mCry1F蛋白，可为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

b3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗虫相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2由600个氨基酸残基组成。

为了使b1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述b3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述b3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述b3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述mCry1F蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码所述mCry1F蛋白的核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：

(a1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

(a2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述mCry1F蛋白的DNA分子；

(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述mCry1F蛋白的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由1803个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述mCry1F蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述mCry1F蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述mCry1F蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的mCry1F蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述表达盒的核苷酸序列如序列表中序列5所示。序列表中序列5中，自5’末端起第1至583位为玉米Gly启动子的核苷酸序列，第589至2392位为mcry1F基因的核苷酸序列，第2399至2652位为nos终止子的核苷酸序列(用于终止转录)。

所述重组载体可为将编码所述mCry1F蛋白的核酸分子(即序列表中序列1所示的DNA分子)插入出发质粒得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒pCAMBIA3301+mCry1F。所述重组质粒pCAMBIA3301+mCry1F为将载体pCAMBIA3301的限制性内切酶HindIII和BstEII识别序列间的小片段替换为序列表中序列5自5’末端起第1至2392位所示的双链DNA分子。重组质粒pCAMBIA3301+mCry1F表达序列表中序列2所示的mCry1F蛋白。

所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。

所述出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。所述根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具体可为根癌农杆菌EHA105。

所述重组微生物具体可为EHA105/pCAMBIA3301+mCry1F。EHA105/pCAMBIA3301+mCry1F是将重组质粒pCAMBIA3301+mCry1F转化根癌农杆菌EHA105得到的重组农杆菌。

所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述mCry1F基因(即mCry1F蛋白的编码基因)转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

所述mCry1F蛋白，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的应用也属于本发明的保护范围；所述mCry1F蛋白，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的应用可为e1)或e2)或e3)：e1)提高植物抗虫性；e2)制备具有抗虫效果的产品；e3)培育抗虫性提高的转基因植物。

上述应用中，所述产品可为药物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：将编码所述mCry1F蛋白的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗虫性增强。

上述方法中，编码所述mCry1F蛋白的核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：

(a1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

(a2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述mCry1F蛋白的DNA分子；

(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述mCry1F蛋白的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由1803个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

上述方法中，所述“将编码所述mCry1F蛋白的核酸分子导入受体植物中”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述mCry1F蛋白的核酸分子得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为所述重组质粒pCAMBIA3301+mCry1F。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种植物育种方法。

本发明所提供的植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述mCry1F蛋白的含量和/或活性，从而增加抗虫性。

上述植物育种方法中，所述“增加植物中所述mCry1F蛋白的含量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加植物中所述mCry1F蛋白的含量和/或活性的效果。

上述任一所述植物可为c1)至c5)中的任一种：c1)单子叶植物；c2)双子叶植物；c3)禾本科植物；c4)玉米；c5)玉米品种X178。

上述任一所述抗虫性可为抗鳞翅目昆虫。所述鳞翅目昆虫可为d1)至d5)中的任一种：d1)玉米螟；d2)东方黏虫；d3)棉铃虫；d4)桃蛀螟；d5)亚洲玉米螟。

Cry1F基因对鳞翅目昆虫(如玉米螟、黏虫和棉铃虫等)有很强的毒性，但是原始的基因不能在植物中高效表达，达不到植物保护的要求。本发明的发明人对Cry1F蛋白的活性区域进行了细致的分析，在保证进一步提高其杀虫活性的前提下，按照单子叶植物编码特征对Cry1F蛋白进行了基因编码框及密码子改造。改造后的Cry1F蛋白命名为mcry1F蛋白。mcry1F蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。编码mcry1F蛋白的基因(即改造后的Cry1F基因，以下简称为mcry1F基因)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。本发明的发明人将改造后的mcry1F基因连在玉米Gly为启动子的表达载体上。通过农杆菌转化的方法，把mcry1F基因转到具有高效转化效率的玉米自交系。实验表明，经过密码子优化的mcry1F基因较密码子优化前更容易获得高表达量的转化体，并且与cry1F蛋白相比，mcry1F蛋白对玉米螟、黏虫、棉铃虫和桃蛀螟的杀虫活性明显提高，具有重要的推广价值。

附图说明

图1为实施例3步骤五的实验结果。

图2为实施例3步骤六的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

N6E培养基的溶质及其浓度为4g/L的N6盐、5mL/L的N6vitamin Stock(200×)、2mg/L的2，4-D、0.1g/L的肌醇、2.76g/L的脯氨酸、30g/L的蔗糖、0.1g/L的酪蛋白水解物、2.8g/L的植物凝胶和3.4mg/L的硝酸银；溶剂为蒸馏水；pH值为5.8。

N6vitamin Stock(200×)：含甘氨酸0.4g/L、烟酸0.1g/L、VB₁ 0.2g/L和VB₆ 0.1g/L的水溶液。

N6E固体平板：将约55℃的N6E培养基倒入培养皿，冷却后得到N6E固体平板。

浸染培养基：将蔗糖68.4g、N6大量(20×)50mL、B5微量(100×)10mL、N6铁盐(100×)10mL、RTV有机(200×)5mL和100μmol的乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.2。

N6大量(20×)：含(NH₄)₂SO₄ 9.26g/L、KNO₃ 56.60g/L、KH₂PO₄ 8.00g/L、MgSO₄·7H₂O 3.70g/L和CaCl₂·2H₂O 3.32g/L的水溶液。

B5微量(100×)：含MnSO₄·H₂O 0.7600g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.2000g/L、H₃BO₃0.3000g/L、KI 0.0750g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.0250g/L、CuSO₄·5H₂O 0.0025g/L和CoCl₂·6H₂O 0.0025g/L的水溶液。

N6铁盐(100×)：含乙二胺四乙酸钠铁盐1.8300g/L的水溶液。

RTV有机(200×)：将氯化胆碱0.0196g、VB₂ 0.0098g、D-生物素0.0200g、烟酸0.0400g、叶酸0.0097g、VB₁ 0.0944g、D-泛酸钙0.0200g、VB₆ 0.0400g、对氨基苯甲酸0.0098g和400μL浓度为0.75mg/100mL的VB₁₂水溶液溶于1L蒸馏水。

共培养培养基：将MS盐4.33g、MS Vitamins(500×)2mL、盐酸硫胺0.5mg、蔗糖30.0g、L-脯氨酸1.38g、2,4-D 0.5mg、6-BA 0.01mg、植物凝胶3.5g和100μmol的AS溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.7。

MS Vitamins(500×)：含甘氨酸1g/L、烟酸0.25g/L、VB₁ 0.05g/L和VB₆ 0.25g/L的水溶液。

恢复培养基：将MS盐4.33g、MS Vitamins(500×)2mL、盐酸硫胺0.5mg、蔗糖30.0g、L-脯氨酸1.38g、2,4-D 0.5mg、6-BA 0.01mg、植物凝胶3.5g、Tim 100mg、双丙氨膦3.0mg和AgNO₃3.4mg溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.7。

一次选择培养基：含1.5mg/L双丙氨磷的MS固体培养基。

二次选择培养基：含3.0mg/L双丙氨磷的MS固体培养基。

再生培养基Ⅰ：将MS盐4.33g、MS Vitamins(500×)2mL、盐酸硫胺0.5mg、蔗糖10.0g、葡萄糖20g、L-脯氨酸0.7g、植物凝胶3.5g、酪蛋白水解物0.2g、甘氨酸0.04g、肌醇0.1g和双丙氨膦3.0mg溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.7。

再生培养基Ⅱ：将MS盐2.165g、蔗糖30.0g、植物凝胶3.5g和双丙氨膦3.0mg溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.7。

原核表达载体pEASY-E1为北京全式金生物技术有限公司的产品。

实施例1、Cry1F基因的改造和mcry1F基因的获得

Cry1F蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。编码Cry1F蛋白的基因(以下简称为Cry1F基因)的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

本发明的发明人对Cry1F蛋白的活性区域进行了细致的分析，在保证进一步提高其表达水平的前提下，按照单子叶植物编码特征对Cry1F蛋白进行了基因编码框及密码子改造。改造后的Cry1F蛋白命名为mcry1F蛋白。mcry1F蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。编码mcry1F蛋白的基因(即改造后的Cry1F基因，以下简称为mcry1F基因)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

mcry1F基因与Cry1F基因的序列同源性只有66％，同源区域仅为51％，编码框长度由原来的1174个氨基酸变为600个氨基酸，而G+C含量也由原来的38.9％变为66.6％，改造前后密码子使用率详见表2。

表2

实施例2、mcry1F蛋白对鳞翅目昆虫的生测

一、mcry1F蛋白的体外表达及纯化

mcry1F蛋白的体外表达及纯化的步骤具体如下：

1、人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子。

2、将步骤1合成的双链DNA分子与原核表达载体pEASY-E1连接，得到重组质粒pEASY-mcry1F。

对重组质粒pEASY-mcry1F进行测序。测序结果表明，重组质粒pEASY-mcry1F中含有序列表中序列1所示的DNA分子，表达序列表中序列2所示的mcry1F蛋白。

3、将重组质粒pEASY-mcry1F导入大肠杆菌transetta，得到重组菌，将该重组菌命名为transetta-mcry1F。

4、取transetta－mcry1F的单克隆，接种至100mL LB液体培养基(含50μg/mL氨苄霉素)，37℃、200rpm振荡培养12h，得到培养菌液。

5、取培养菌液，按体积比为1:100接种至50mL LB液体培养基(含50μg/mL氨苄霉素)，37℃、200rpm振荡培养至OD_600nm值为0.6，然后加入IPTG并使其浓度为1mM，28℃、220rpm振荡培养4h，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体沉淀。

6、取菌体沉淀，加入100mL pH 8.0、100mM的Tris-HCl缓冲液，重悬后超声破碎(超声波功率600W，循环程序为：破碎4s，停6s，共20min)，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液甲。

7、取上清液甲，4℃、12000rpm离心10min，收集上清液乙。

8、采用GE公司生产的镍柱对上清液乙进行纯化(纯化的具体步骤参考镍柱的说明书)，然后采用赛默飞世尔公司生产的蛋白定量试剂盒对mcry1F蛋白进行定量。

按照上述方法，将步骤1中“人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子”替换为“人工合成序列表中序列3所示的双链DNA分子”，其它步骤均不变，得到cry1F蛋白。

二、mcry1F蛋白对鳞翅目害虫的生测

根据Jing Xue(2008)报道的生测方法对mcry1F蛋白和cry1F蛋白进行活性比较，分别测定两种蛋白(mcry1F蛋白和cry1F蛋白)对四种鳞翅目昆虫(亚洲玉米螟、东方黏虫、棉铃虫和桃蛀螟)的杀虫活性。

部分实验结果见表3。结果表明，mcry1F蛋白对四种鳞翅目昆虫的杀虫活性明显好于cry1F蛋白，cry1F基因对亚洲玉米螟、棉铃虫、黏虫和桃蛀螟的抗虫活性明显提高。

表3

实施例3、转mcry1F基因玉米的获得及抗虫性鉴定

一、重组载体的构建

构建重组质粒pCAMBIA3301+mcry1F并测序。根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA3301+mcry1F进行结构描述如下：将载体pCAMBIA3301的限制性内切酶HindIII和BstEII识别序列间的小片段替换为序列表中序列5自5’末端起第1至2392位所示的双链DNA分子。重组质粒pCAMBIA3301+mcry1F表达序列表中序列2所示的mcry1F蛋白。

重组质粒pCAMBIA3301+mcry1F中含有表达盒，该表达盒的核苷酸序列如序列表中序列5所示。序列表中序列5中，自5’末端起第1至583位为玉米Gly启动子的核苷酸序列，第589至2392位为mcry1F基因的核苷酸序列，第2399至2652位为nos终止子的核苷酸序列(用于终止转录)。

将重组质粒pCAMBIA3301+mcry1F中mcry1F基因的核苷酸序列替换为Cry1F基因的核苷酸序列，其它序列均不变，得到重组质粒pCAMBIA3301+Cry1F。重组质粒pCAMBIA3301+mcry1F表达序列表中序列4所示的cry1F蛋白。

二、重组农杆菌的获得

将重组质粒pCAMBIA3301+mcry1F导入根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA3301+mcry1F。

将重组质粒pCAMBIA3301导入根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA3301。

将重组质粒pCAMBIA3301+Cry1F导入根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA3301+Cry1F。

三、转mcry1F基因玉米的获得

1、幼胚的获得及培养

(a)在田间种植玉米品种X178，待自花授粉9-11d后，去除授粉果穗的苞叶，然后把果穗放入盛有消毒液(向700mL的50％(v/v)的漂白剂水溶液或次氯酸钠水溶液(有效氯为5.25％(v/v))中加入一滴Tween 20得到)的烧杯里浸泡20min，然后用无菌水洗涤3次。浸泡过程中，需不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果。

(b)完成步骤(a)后，取果穗，将剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖轻轻托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E固体平板，幼胚的密度大约是2cm×2cm(30个/皿)。

(c)完成步骤(b)后，取所述N6E固体平板，用封口膜封住，28℃暗培养2-3d。

2、农杆菌浸染液的获得

(a)将EHA105/pCAMBIA3301+mcry1F接种于含33mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kana)和50mg/L链霉素(streptomycin，str)的YEP固体培养基上，19℃培养3天，进行活化。

(b)将步骤(a)得到的EHA105/pCAMBIA3301+mcry1F接种于浸染培养基中，25℃、75rpm振荡培养，得到OD_550nm为0.3-0.4的农杆菌浸染液。

3、转mcry1F基因玉米的获得

光暗交替培养(即光照培养和暗培养交替)的条件为：25℃。光照培养时的光照强度为15000Lx。光暗交替培养的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养。

(a)取完成步骤1的幼胚，置于离心管中，先用浸染培养基洗涤2次(每次使用浸染培养基2mL)，然后加入农杆菌浸染液，轻轻颠倒离心管20次，再直立静置于暗箱5min(确保幼胚全部浸泡在农杆菌浸染液中)。

(b)完成步骤(a)后，将所述幼胚转移至共培养培养基(使幼胚的胚轴接触共培养培养基表面，同时去除共培养培养基表面多余的农杆菌)，然后20℃暗培养3d。

(c)完成步骤(b)后，将所述幼胚转移至恢复培养基，然后28℃暗培养7d。

(d)完成步骤(c)后，将所述幼胚转移至一次选择培养基，然后28℃光暗交替培养两周。

(e)完成步骤(d)后，将所述幼胚转移至二次选择培养基，然后28℃光暗交替培养两周，得到抗性愈伤。

(f)完成步骤(e)后，将抗性愈伤转移至再生培养基Ⅰ，然后28℃光暗交替培养三周。

(g)完成步骤(f)后，将抗性愈伤转移至再生培养基Ⅱ，然后28℃光暗交替培养三周，得到再生苗。待再生苗生长至3-4片叶时转移至温室，正常培养，得到转mcry1F基因玉米。将其中5个转mcry1F基因玉米依次命名为mcry1F-1至mcry1F-5。

按照上述方法，将EHA105/pCAMBIA3301+mcry1F替换为EHA105/pCAMBIA3301，其它步骤均不变，得到转空载体玉米。

按照上述方法，将EHA105/pCAMBIA3301+mcry1F替换为EHA105/pCAMBIA3301+Cry1F，其它步骤均不变，得到转Cry1F基因玉米。将其中5个转Cry1F基因玉米依次命名为Cry1F-1至Cry1F-5。

四、分子鉴定

分别提取mcry1F-1至mcry1F-5的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用引物1FF：5'-ACAACCACTACAACCGCCTCATC-3'和引物1FR：5'-TGTTGATGGTGGCGTAGGAGAAG-3'组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物甲。分别提取Cry1F-1至Cry1F-5的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用引物cry1FF：5'-TATCGTTTGGGCAGGGTTGGG-3'和引物cry1FR：5'-CGCCACCAGGATTGAAGACCC-3'组成的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙。

按照上述方法，将mcry1F-1的叶片的基因组DNA替换为水，其它步骤均相同，作为阴性对照。

按照上述方法，将mcry1F-1的叶片的基因组DNA替换为转空载体玉米的叶片的基因组DNA，其它步骤均相同，作为对照1。

按照上述方法，将mcry1F-1的叶片的基因组DNA替换为玉米品种X178的叶片的基因组DNA，其它步骤均相同，作为对照2。

按照上述方法，将mcry1F-1的叶片的基因组DNA替换为重组质粒pCAMBIA3301+mcry1F，其它步骤均相同，作为阳性对照1。

按照上述方法，将mcry1F-1的叶片的基因组DNA替换为重组质粒pCAMBIA3301+Cry1F，其它步骤均相同，作为阳性对照2。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明，以mcry1F-1至mcry1F-5的叶片的基因组DNA或重组质粒pCAMBIA3301+mcry1F为模板均能扩增得到大小为1134bp的条带，以Cry1F-1至Cry1F-5的叶片的基因组DNA或重组质粒pCAMBIA3301+Cry1F为模板均能扩增得到大小为510bp的条带，以水、转空载体玉米的叶片的基因组DNA或玉米品种X178的叶片的基因组DNA为模板，均不能扩增得到大小为1134bp的条带或大小为510bp的条带。

经分子鉴定，mcry1F-1至mcry1F-5均为转mcry1F基因玉米，Cry1F-1至Cry1F-5均为转Cry1F基因玉米。

五、检测转mcry1F基因玉米中Cry1F蛋白的含量

待测样品为mcry1F-1的叶片、mcry1F-2的叶片、mcry1F-3的叶片、mcry1F-4的叶片、mcry1F-5的叶片、Cry1F-1的叶片、Cry1F-2的叶片、Cry1F-3的叶片、Cry1F-4的叶片、Cry1F-5的叶片、转空载体玉米的叶片或玉米品种X178的叶片。

Bt Cry1F ELISA试剂盒为美国Agdia公司的产品。

实验重复三次取平均值。具体步骤如下：

(1)准备样品及正对照：液氮研磨待测样品，称量0.1g研磨好的样品加入1mL样品提取缓冲液(试剂盒自带)，同时用2mL样品提取缓冲液稀释试剂盒自带的正对照，充分混匀后低速离心30s，准备加样。

(2)用酶联缓冲液(试剂盒自带)按照100:1的比例稀释抗体(试剂盒自带)，将稀释的抗体加入到酶标板中，每孔加入100μl。分别将不同的样品各取10μL加入到相应的样品孔中，同时分别取0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、50μL、100μL正对照加入相应的样品孔中，用洗板缓冲液(试剂盒自带)将各样品孔补至200μL，室温潮湿环境下孵育1h或4℃过夜。

(3)洗板：用1×PBST(试剂盒自带)洗板7次，每次加洗板缓冲液300μL，加满一板后倒掉，洗完后将酶标板倒置，充分去除内部残留液体。

(4)显色：每孔加入100μL TMB显色缓冲液，室温潮湿环境下孵育20min。

通过Thermo MK3酶标仪在650nm波长下分析不同样品的吸光值，利用正对照的绘制标准曲线进行Cry1F蛋白定量，然后统计Cry1F蛋白占待测样品鲜重的比例，即获得Cry1F蛋白的含量。

部分样品在650nm波长下的吸光值见图1。结果表明，mcry1F-1至mcry1F-5的叶片和Cry1F-1至Cry1F-5的叶片中均可检测到Cry1F蛋白，转空载体玉米的叶片和玉米品种X178的叶片均不能检测到Cry1F蛋白。同时，与Cry1F-1至Cry1F-5相比，mcry1F-1至mcry1F-5的叶片中Cry1F蛋白的含量有不同程度提高。

六、转mcry1F基因玉米的抗虫性鉴定

待测玉米为mcry1F-1、mcry1F-2、mcry1F-3、mcry1F-4、mcry1F-5、Cry1F-1、Cry1F-2、Cry1F-3、Cry1F-4、Cry1F-5、转空载体玉米或玉米品种X178。

实验设定至少2次生物学重复，每种待测玉米重复设置2个平行实验，具体步骤如下：

1、采集待测玉米的叶片并放入培养皿。

2、完成步骤1后，向每个培养皿内接入3头初孵玉米螟幼虫，然后置于28℃、光周期16h：8h(L:D)、相对湿度70-80％的人工气候培养箱中培养。144h后，观察叶片的表型。

实验结果见图2。结果表明，与转cry1F基因玉米相比，转mcry1F基因玉米的叶片抗虫性明显提高。

<110> 中国农业大学

<120> 人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mcry1F

<160> 5

<170> PatentInversion3.5

<210> 1

<211> 1803

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atggagaaca acatccagaa ccagtgcgtc ccctacaact gcctcaacaa ccccgaggtc 60

gagatcctca acgaggagcg ctccaccggc cgcctccccc tcgacatctc cctctccctc 120

acccgcttcc tcctctccga gttcgtcccc ggcgtcggcg tcgccttcgg cctcttcgac 180

ctcatctggg gcttcatcac cccctccgac tggtccctct tcctcctcca gatcgagcag 240

ctcatcgagc agcgcatcga gaccctcgag cgcaaccgcg ccatcaccac cctccgcggc 300

ctcgccgact cctacgagat ttacatcgag gccctccgcg agtgggaggc caaccccaac 360

aacgcccagc tccgcgagga cgtccgcatc cgcttcgcca acaccgacga cgccctcatc 420

accgccatca acaacttcac cctcacctcc ttcgagatcc ccctcctctc cgtctacgtc 480

caggccgcca acctccacct ctccctcctc cgcgacgccg tctccttcgg ccagggctgg 540

ggcctcgaca tcgccaccgt caacaaccac tacaaccgcc tcatcaacct catccaccgc 600

tacaccaagc actgcctcga cacctacaac cagggcctcg agaacctccg cggcaccaac 660

acccgccagt gggcccgctt caaccagttc cgccgcgacc tcaccctcac cgtcctcgac 720

atcgtcgccc tcttccccaa ctacgacgtc cgcacctacc ccatccagac ctcctcccag 780

ctcacccgcg agatttacac ctcctccgtc atcgaggact cccccgtctc cgccaacatc 840

cccaacggct tcaaccgcgc cgagttcggc gtccgccccc cccacctcat ggacttcatg 900

aactccctct tcgtcaccgc cgagaccgtc cgctcccaga ccgtctgggg cggccacctc 960

gtctcctccc gcaacaccgc cggcaaccgc atcaacttcc cctcctacgg cgtcttcaac 1020

cccggcggcg ccatctggat cgccgacgag gacccccgcc ccttctaccg caccctctcc 1080

gaccccgtct tcgtccgcgg cggcttcggc aacccccact acgtcctcgg cctccgcggc 1140

gtcgccttcc agcagaccgg caccaaccac acccgcacct tccgcaactc cggcaccatc 1200

gactccctcg acgagatccc cccccaggac aactccggcg ccccctggaa cgactactcc 1260

cacgtcctca accacgtcac cttcgtccgc tggcccggcg agatttccgg ctccgactcc 1320

tggcgcgccc ccatgttctc ctggacccac cgctccgcca cccccaccaa caccatcgac 1380

cccgagcgca tcacccagat ccccctcgtc aaggcccaca ccctccagtc cggcaccacc 1440

gtcgtccgcg gccccggctt caccggcggc gacatcctcc gccgcacctc cggcggcccc 1500

ttcgcctaca ccatcgtcaa catcaacggc cagctccccc agcgctaccg cgcccgcatc 1560

cgctacgcct ccaccaccaa cctccgcatc tacgtcaccg tcgccggcga gcgcatcttc 1620

gccggccagt tcaacaagac tatggacacc ggcgaccccc tcaccttcca gtccttctcc 1680

tacgccacca tcaacaccgc cttcaccttc cccatgtccc agtcctcctt caccgtcggc 1740

gccgacacct tctcctccgg caacgaggtc tacatcgacc gcttcgagct gatccccgtc 1800

tga 1803

<210>2

<211>600

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn

1 5 10 15

Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu

20 25 30

Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe

35 40 45

Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly

50 55 60

Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln

65 70 75 80

Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr

85 90 95

Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu

100 105 110

Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val

115 120 125

Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn

130 135 140

Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val

145 150 155 160

Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe

165 170 175

Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn

180 185 190

Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr

195 200 205

Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp

210 215 220

Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp

225 230 235 240

Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln

245 250 255

Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu

260 265 270

Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu

275 280 285

Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe

290 295 300

Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu

305 310 315 320

Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr

325 330 335

Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro

340 345 350

Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly

355 360 365

Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln

370 375 380

Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile

385 390 395 400

Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp

405 410 415

Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro

420 425 430

Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp

435 440 445

Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile

450 455 460

Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr

465 470 475 480

Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr

485 490 495

Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu

500 505 510

Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu

515 520 525

Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe

530 535 540

Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser

545 550 555 560

Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser

565 570 575

Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile

580 585 590

Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val

595 600

<210> 3

<211> 3525

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atggagaata atattcaaaa tcaatgcgta ccttacaatt gtttaaataa tcctgaagta 60

gaaatattaa atgaagaaag aagtactggc agattaccgt tagatatatc cttatcgctt 120

acacgtttcc ttttgagtga atttgttcca ggtgtgggag ttgcgtttgg attatttgat 180

ttaatatggg gttttataac tccttctgat tggagcttat ttcttttaca gattgaacaa 240

ttgattgagc aaagaataga aacattggaa aggaaccggg caattactac attacgaggg 300

ttagcagata gctatgaaat ttatattgaa gcactaagag agtgggaagc aaatcctaat 360

aatgcacaat taagggaaga tgtgcgtatt cgatttgcta atacagacga cgctttaata 420

acagcaataa ataattttac acttacaagt tttgaaatcc ctcttttatc ggtctatgtt 480

caagcggcga atttacattt atcactatta agagacgctg tatcgtttgg gcagggttgg 540

ggactggata tagctactgt taataatcat tataatagat taataaatct tattcataga 600

tatacgaaac attgtttgga cacatacaat caaggattag aaaacttaag aggtactaat 660

actcgacaat gggcaagatt caatcagttt aggagagatt taacacttac tgtattagat 720

atcgttgctc tttttccgaa ctacgatgtt agaacatatc caattcaaac gtcatcccaa 780

ttaacaaggg aaatttatac aagttcagta attgaggatt ctccagtttc tgctaatata 840

cctaatggtt ttaatagggc ggaatttgga gttagaccgc cccatcttat ggactttatg 900

aattctttgt ttgtaactgc agagactgtt agaagtcaaa ctgtgtgggg aggacactta 960

gttagttcac gaaatacggc tggtaaccgt ataaatttcc ctagttacgg ggtcttcaat 1020

cctggtggcg ccatttggat tgcagatgag gatccacgtc ctttttatcg gacattatca 1080

gatcctgttt ttgtccgagg aggatttggg aatcctcatt atgtactggg gcttagggga 1140

gtagcatttc aacaaactgg tacgaaccac acccgaacat ttagaaatag tgggaccata 1200

gattctctag atgaaatccc acctcaggat aatagtgggg caccttggaa tgattatagt 1260

catgtattaa atcatgttac atttgtacga tggccaggtg agatttcagg aagtgattca 1320

tggagagctc caatgttttc ttggacgcac cgtagtgcaa cccctacaaa tacaattgat 1380

ccggagagga ttactcaaat accattggta aaagcacata cacttcagtc aggtactact 1440

gttgtaagag ggcccgggtt tacgggagga gatattcttc gacgaacaag tggaggacca 1500

tttgcttata ctattgttaa tataaatggg caattacccc aaaggtatcg tgcaagaata 1560

cgctatgcct ctactacaaa tctaagaatt tacgtaacgg ttgcaggtga acggattttt 1620

gctggtcaat ttaacaaaac aatggatacc ggtgacccat taacattcca atcttttagt 1680

tacgcaacta ttaatacagc ttttacattc ccaatgagcc agagtagttt cacagtaggt 1740

gctgatactt ttagttcagg gaatgaagtt tatatagaca gatttgaatt gattccagtt 1800

actgcaacat ttgaagcaga atatgattta gaaagagcac aaaaggcggt gaatgcgctg 1860

tttacttcta taaaccaaat agggataaaa acagatgtga cggattatca tattgatcaa 1920

gtatccaatt tagtggattg tttatcagat gaattttgtc tggatgaaaa gcgagaattg 1980

tccgagaaag tcaaacatgc gaagcgactc agtgatgagc ggaatttact tcaagatcca 2040

aacttcaaag gcatcaatag gcaactagac cgtggttgga gaggaagtac ggatattacc 2100

atccaaagag gagatgacgt attcaaagaa aattatgtca cactaccagg tacctttgat 2160

gagtgctatc caacgtattt atatcaaaaa atagatgagt cgaaattaaa accctatact 2220

cgttatcaat taagagggta tatcgaggat agtcaagact tagaaatcta tttgatccgc 2280

tataatgcaa aacacgaaac agtaaatgtg ctaggtacgg gttctttatg gccgctttca 2340

gtccaaagtc caatcagaaa gtgtggagaa ccgaatcgat gcgcgccaca ccttgaatgg 2400

aatcctgatc tagattgttc ctgcagagac ggggaaaaat gtgcacatca ttcgcatcat 2460

ttctccttgg acattgatgt tggatgtaca gacttaaatg aggacttaga tgtatgggtg 2520

atattcaaga ttaagacgca agatggccat gcaagactag gaaatctaga gtttctcgaa 2580

gagaaaccat tagtcgggga agcactagct cgtgtgaaaa gagcagagaa aaaatggaga 2640

gataaacgtg aaaaattgga attggaaaca aatattgttt ataaagaggc aaaagaatct 2700

gtagatgctt tatttgtaaa ctctcaatat gatcaattac aagcggatac gaatattgcc 2760

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tcatgctgga acgtgaaagg gcatgtagat gtagaagaac aaaacaacca ccgttcggtc 3000

cttgttgttc cggaatggga agcagaagtg tcacaagaag ttcgtgtctg tccgggtcgt 3060

ggctatatcc ttcgtgtcac agcgtacaag gagggatatg gagaaggttg cgtaaccatt 3120

catgagatcg agaacaatac agacgaactg aagtttagca actgcgtaga agaggaagtc 3180

tatccaaaca acacggtaac gtgtaatgat tatactgcaa atcaagaaga atacgggggt 3240

gcgtacactt cccgtaatcg tggatatgac gaaacttatg gaagcaattc ttctgtacca 3300

gctgattatg cgtcagtcta tgaagaaaaa tcgtatacag atggacgaag agacaatcct 3360

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gaattagagt acttcccaga aaccgataag gtatggattg agatcggaga aacggaagga 3480

acattcatcg tggacagcgt ggaattactc cttatggagg aatag 3525

<210> 4

<211> 1174

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 4

Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn

1 5 10 15

Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu

20 25 30

Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe

35 40 45

Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly

50 55 60

Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln

65 70 75 80

Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr

85 90 95

Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu

100 105 110

Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val

115 120 125

Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn

130 135 140

Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val

145 150 155 160

Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe

165 170 175

Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn

180 185 190

Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr

195 200 205

Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp

210 215 220

Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp

225 230 235 240

Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln

245 250 255

Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu

260 265 270

Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu

275 280 285

Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe

290 295 300

Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu

305 310 315 320

Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr

325 330 335

Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro

340 345 350

Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly

355 360 365

Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln

370 375 380

Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile

385 390 395 400

Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp

405 410 415

Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro

420 425 430

Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp

435 440 445

Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile

450 455 460

Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr

465 470 475 480

Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr

485 490 495

Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu

500 505 510

Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu

515 520 525

Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe

530 535 540

Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser

545 550 555 560

Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser

565 570 575

Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile

580 585 590

Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr

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Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val

755 760 765

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Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu

850 855 860

Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg

865 870 875 880

Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Leu Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu

885 890 895

Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Gln

900 905 910

Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg

915 920 925

Val His Arg Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro

930 935 940

Gly Val Asn Val Asp Ile Phe Glu Glu Leu Lys Gly Arg Ile Phe Thr

945 950 955 960

Ala Phe Phe Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe

965 970 975

Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu

980 985 990

Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala

995 1000 1005

Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile

1010 1015 1020

Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val

1025 1030 1035

Thr Ile His Glu Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser

1040 1045 1050

Asn Cys Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys

1055 1060 1065

Asn Asp Tyr Thr Ala Asn Gln Glu Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Thr

1070 1075 1080

Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Glu Thr Tyr Gly Ser Asn Ser Ser

1085 1090 1095

Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Thr

1100 1105 1110

Asp Gly Arg Arg Asp Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr Gly

1115 1120 1125

Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu

1130 1135 1140

Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr

1145 1150 1155

Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu

1160 1165 1170

Glu

<210> 5

<211> 2652

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 5

agattacaag gtagtgaatt gtgacatgta ttcgttccta tccgatccgt cgtttttgag 60

cactaggtgc ggtcactgtg acgcgtggac ttggcttcgc ccactgccat cgtggaccca 120

cgtcatcagc aagtgtccat atccaccacc cgacccgacg accgcttgcc gtccgatccg 180

tgtgctcccg agggcaagga tggcatttcg ccacgcgaga tatttttcgg tggcctgcac 240

aggccggcag tgcagcggcc aaaacgaggt caggtcagtc acgctgggcc ccgcctcacg 300

ctcccgtcct gctccgggtc ccaacaaagc cgtccccggg aggtgctcgt gtgctcgtag 360

cgcggtggcg accccgatgc cccgcatatt ccactgggcg tccgcgccgt cggatgggat 420

caggacggcc gcggcggccc cgcgctcggc tataaagacg ctgcggggga cgcattccct 480

ctccgtgctt tcttagaggt gggttggctt ctcctccccc tccggttcgg gttcgggttc 540

gtgaggttct ccggggttcg ggttcgtggg tgagcggatc gagactagta tggagaacaa 600

catccagaac cagtgcgtcc cctacaactg cctcaacaac cccgaggtcg agatcctcaa 660

cgaggagcgc tccaccggcc gcctccccct cgacatctcc ctctccctca cccgcttcct 720

cctctccgag ttcgtccccg gcgtcggcgt cgccttcggc ctcttcgacc tcatctgggg 780

cttcatcacc ccctccgact ggtccctctt cctcctccag atcgagcagc tcatcgagca 840

gcgcatcgag accctcgagc gcaaccgcgc catcaccacc ctccgcggcc tcgccgactc 900

ctacgagatt tacatcgagg ccctccgcga gtgggaggcc aaccccaaca acgcccagct 960

ccgcgaggac gtccgcatcc gcttcgccaa caccgacgac gccctcatca ccgccatcaa 1020

caacttcacc ctcacctcct tcgagatccc cctcctctcc gtctacgtcc aggccgccaa 1080

cctccacctc tccctcctcc gcgacgccgt ctccttcggc cagggctggg gcctcgacat 1140

cgccaccgtc aacaaccact acaaccgcct catcaacctc atccaccgct acaccaagca 1200

ctgcctcgac acctacaacc agggcctcga gaacctccgc ggcaccaaca cccgccagtg 1260

ggcccgcttc aaccagttcc gccgcgacct caccctcacc gtcctcgaca tcgtcgccct 1320

cttccccaac tacgacgtcc gcacctaccc catccagacc tcctcccagc tcacccgcga 1380

gatttacacc tcctccgtca tcgaggactc ccccgtctcc gccaacatcc ccaacggctt 1440

caaccgcgcc gagttcggcg tccgcccccc ccacctcatg gacttcatga actccctctt 1500

cgtcaccgcc gagaccgtcc gctcccagac cgtctggggc ggccacctcg tctcctcccg 1560

caacaccgcc ggcaaccgca tcaacttccc ctcctacggc gtcttcaacc ccggcggcgc 1620

catctggatc gccgacgagg acccccgccc cttctaccgc accctctccg accccgtctt 1680

cgtccgcggc ggcttcggca acccccacta cgtcctcggc ctccgcggcg tcgccttcca 1740

gcagaccggc accaaccaca cccgcacctt ccgcaactcc ggcaccatcg actccctcga 1800

cgagatcccc ccccaggaca actccggcgc cccctggaac gactactccc acgtcctcaa 1860

ccacgtcacc ttcgtccgct ggcccggcga gatttccggc tccgactcct ggcgcgcccc 1920

catgttctcc tggacccacc gctccgccac ccccaccaac accatcgacc ccgagcgcat 1980

cacccagatc cccctcgtca aggcccacac cctccagtcc ggcaccaccg tcgtccgcgg 2040

ccccggcttc accggcggcg acatcctccg ccgcacctcc ggcggcccct tcgcctacac 2100

catcgtcaac atcaacggcc agctccccca gcgctaccgc gcccgcatcc gctacgcctc 2160

caccaccaac ctccgcatct acgtcaccgt cgccggcgag cgcatcttcg ccggccagtt 2220

caacaagact atggacaccg gcgaccccct caccttccag tccttctcct acgccaccat 2280

caacaccgcc ttcaccttcc ccatgtccca gtcctccttc accgtcggcg ccgacacctt 2340

ctcctccggc aacgaggtct acatcgaccg cttcgagctg atccccgtct gaggtcaccc 2400

gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga 2460

ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga 2520

cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga 2580

tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt 2640

tactagatcg gg 2652

Claims (6)

1.编码mCry1F蛋白的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2.含有权利要求1所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

3.权利要求1所述核酸分子或权利要求2所述表达盒、重组载体或重组微生物的应用，为e1）或e2）或e3）：e1）提高植物抗虫性；e2）制备具有抗虫效果的产品；e3）培育抗虫性提高的转基因植物；所述植物为玉米；所述抗虫性为抗亚洲玉米螟。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。

5.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗虫性增强；所述植物为玉米；所述抗虫性为抗亚洲玉米螟。

6.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1所述核酸分子编码的mCry1F蛋白的含量，从而增加抗虫性；所述植物为玉米；所述抗虫性为抗亚洲玉米螟。

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