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CN107474115B - 一种多肽及其在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用 - Google Patents

一种多肽及其在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用 Download PDF

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CN107474115B
CN107474115B CN201610402144.9A CN201610402144A CN107474115B CN 107474115 B CN107474115 B CN 107474115B CN 201610402144 A CN201610402144 A CN 201610402144A CN 107474115 B CN107474115 B CN 107474115B
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Abstract

本发明提供了一种多肽及其在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。所述多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，或者，如将序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为侧链可相连的非天然氨基酸所示，所述的衍生物包括所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽、所述多肽与病毒形成的融合肽、甲基化的所述多肽、糖基化的所述多肽和聚乙二醇化的所述多肽。所述的多肽或多肽衍生物能够靶向增加PML核小体数量的数量，从而应用于治疗和/或预防肿瘤的药物的制备中。

Description

一种多肽及其在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种多肽及其在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。
背景技术
肿瘤抑制因子PML(Promyelocytic leukemia protein,PML)由于与急性早幼粒白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)的发病和疾病进展有关，一直都是科学界的研究热点。位于第15号染色体的PML基因和位于17号染色体的RARα基因相融合，从而编码产生融合蛋白PML-RARα，是APL发病的主要致癌因子。PML基因包含9个外显子，在整个基因组中跨度为53kb。PML基因由于断裂点不同，形成6个胞核和1个胞浆形式的PML异构体。其中PML-I是最长的异构体，包含882个氨基酸；PML VII是最短的异构体，由435个氨基酸组成。PML蛋白氨基酸序列的N端418个氨基酸是所有异构体共有的，包含多个保守结构域，如环指结构域(R)、两个富含半胱氨酸/组氨酸的B-Box结构域(B)和一个α螺旋的卷曲结构域(CC)，这样的结构域又叫RBCC结构域或者TRIM结构域。PML的RBCC结构域对其发挥生物学调节功能起关键作用。
PML蛋白主要富集于细胞核，呈点状结构分布于染色质中。这样的点状结构被命名为PML核小体。PML核小体在结构和功能上具有异质性，而且也是一种动态的结构，其RBCC结构域对于PML核小体的形成是关键的。根据细胞类型、应激状态以及营养状态不同，PML核小体的大小范围为0.1μm-1μm，每个细胞核内大概有5-30个PML核小体。此外，PML核小体被认为是聚集或招募相关蛋白(如P53、DAXX等)的地点。虽然许多存在于PML核小体上的蛋白是构成性的，但大部分蛋白在PML核小体内是动态变化的。PML通过与相关蛋白(如P53、DAXX等)发生相互作用，将其募集到核小体后，通过抑制或上调相关蛋白功能发挥调节作用。PML核小体还可以作为调节相关蛋白翻译后修饰的核心地点。例如，PML蛋白通过调节某些转录因子活性来调控相关基因的表达；PML蛋白和PML核小体还调节DNA损伤后修复和介导端粒的增长维持基因组的稳定性。因此，PML核小体能够调节各种细胞功能，如参与细胞凋亡和细胞衰老、抑制细胞增殖、维持基因组稳定性和抗病毒功能。
多项研究证实PML蛋白是一个多面性的蛋白，除APL外，PML蛋白在非造血肿瘤中也发挥肿瘤抑制的功能。PML抑制肿瘤的作用已经在多个类型癌症中得到验证，例如乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和膀胱癌等。研究表明，多种肿瘤细胞内的PML蛋白表达水平明显下降，PML核小体数量减少。过表达PML蛋白可以抑制肿瘤细胞的增殖，导致细胞周期阻滞，促进肿瘤细胞发生老化和凋亡。相反，敲除PML基因的细胞表现出较强的增殖活性和抵抗紫外线或者细胞因子诱导的凋亡。敲除PML基因的小鼠也被证实化学致癌物诱发的肿瘤发生率明显上调。以上研究都表明PML是一个肿瘤抑制因子，靶向增加PML核小体数量的数量是治疗肿瘤的一个潜在靶点。因此，研究和开发靶向增加PML核小体数量的物质，具有很好的抑制肿瘤发生和发展的成药前景。
近年来，用化学合成方式得到高活性、高选择性的合成多肽类药物已经成为新的研究热点。其中结构稳定的α螺旋肽由于其较高的成药性获得研究人员的青睐。然而，普通的α螺旋肽细胞通透性差且易被蛋白酶水解。因此，多肽类靶点药物目前还有很多不足。由上可知，亟待获得靶向增加PML核小体数量的、高活性、高选择性的合成多肽类药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前缺乏靶向增加PML核小体数量的、高活性、高选择性的合成多肽类药物的现状，提供一种多肽及其在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。
本发明的发明人经过深入的研究和反复的试验发现，获得了能够靶向PML核小体形成的多肽S160(其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示)，然而多肽S160的生物稳定性比较低。该生物稳定性低的缺陷与多肽S160在溶液中不能稳定形成活性所需的α螺旋构象直接相关。由此，发明人进行了针对性的研究和试验，发现如果将多肽S160中特定位置的氨基酸残基替换为侧链可以相连的非天然氨基酸，如S-戊烯丙氨酸(S5)，则改造后的多肽具有稳定的α螺旋的二级结构，使改造后的多肽具有极高的亲和力、抗酶解稳定性以及细胞穿膜性，从而具有极高的α螺旋稳定性、代谢稳定性，能够抑制多种肿瘤细胞增殖和转移，从而应用于制备治疗和/或预防肿瘤的药物中。基于发明人的研究工作，本发明提供下述的技术方案。
本发明提供的技术方案之一是：一种靶向增加PML核小体数量的多肽或所述多肽的衍生物，所述多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，或者，如将序列表SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为侧链可相连的非天然氨基酸所示，所述的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽、所述多肽与病毒形成的融合肽、甲基化的所述多肽、糖基化的所述多肽或聚乙二醇化的所述多肽。
本发明中，所述的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示的多肽称为多肽S160。
本发明中，所述的侧链可相连的非天然氨基酸为本领域常规的非天然氨基酸，较佳的为S-戊烯丙氨酸(S5)。所述的多肽中，所述替换的氨基酸的数目为两个且所述替换的氨基酸的位置分别为第i位和第i+3位，或者，为第i位和第i+4位，其中1≤i≤7，i为正整数。
其中，本发明所述的细胞穿膜肽为本领域常规的细胞穿膜肽，只要其能辅助将所述多肽送入细胞以发挥作用即可。一般，所述的细胞穿膜肽为由10～30个氨基酸组成的短肽分子。较佳地，所述细胞穿膜肽连接在所述多肽的N端或者C端，更佳地连接在所述多肽的N端。本发明所述的嵌合肽为本领域常规的嵌合肽，较佳地由本发明所述的多肽形成。
本发明所述的融合肽为本领域常规的融合肽，只要所述多肽的N端疏水的保守区为介导病毒融合过程的活性肽段，即含有融合肽区域即可。较佳地，所述融合肽在插入宿主细胞膜的过程中发生了构象的转变。
本发明所述的甲基化是本领域常规的甲基化，较佳地，为从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。本发明所述的糖基化是本领域常规的糖基化，较佳地，为在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键的过程。本发明所述的聚乙二醇化是本领域常规的聚乙二醇化，较佳地，指将聚乙二醇通过生物技术安装到具有活性的蛋白质分子之上，从而改变其活性的过程。
本发明中，更佳地，所述的多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12中任一项所示。
本发明中，上述SEQ ID No.1～SEQ ID No.12所示的氨基酸序列中可进行适当地氨基酸替换、缺失或添加，只要使改造后的氨基酸序列仍然能够增加PML核小体的数目并且保持改造前的活性即可。
本发明提供的技术方案之二是：一种靶向增加PML核小体数量的多肽或所述多肽的衍生物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。
本发明所述的肿瘤为本领域常规的肿瘤。较佳地为肝癌、肺癌、乳腺癌、肠癌或白血病。其中，所述肝癌为本领域常规的肝癌，较佳地为原发性肝癌或继发性肝癌。所述肺癌为本领域常规的肺癌，较佳地为小细胞肺癌或非小细胞肺癌。所述乳腺癌为本领域常规的乳腺癌，较佳地为非浸润性乳腺癌、早期浸润性乳腺癌、浸润性特殊类型乳腺癌或浸润性非特殊类型乳腺癌。所述肠癌为本领域常规的肠癌，较佳地为结肠癌或直肠癌。所述白血病为本领域常规的白血病，较佳地为淋巴细胞型白血病或非淋巴细胞型白血病。
本发明中，所述预防是本领域常规的预防，较佳地指在存在可能的肿瘤因素时，使用后防止或降低肿瘤的产生。所述治疗是本领域常规的治疗，较佳地指指减轻肿瘤的程度，或者治愈肿瘤使之正常化，或者减缓肿瘤的进程。
本发明提供的技术方案之三是：一种抗肿瘤的药物组合物，其含有上述靶向增加PML核小体数量的多肽或所述多肽的衍生物作为活性成分。
本发明中，所述的活性成分是指具有预防或治疗肿瘤功能的化合物。在所述药物组合物中，上述靶向增加PML核小体数量的多肽或所述多肽的衍生物可以单独作为活性成分或和其他具有抗肿瘤活性的化合物一起作为活性成分。
本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述靶向增加PML核小体数量的多肽或所述多肽的衍生物，和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的多肽或多肽衍生物能够靶向增加PML核小体的数量，从而应用于治疗和/或预防肿瘤的药物的制备中。所制备的药物在治疗和/或预防肿瘤疾病中，具有疗效显著，毒副作用少，使用安全的优点。
附图说明
图1为免疫荧光法验证多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11对PML核小体数量的影响。纵坐标为单个细胞内含PML核小体数量的平均值，单位为个。
图2为多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11抑制肝癌细胞HepG2生长结果图。横坐标为给药时间，单位为天。纵坐标为细胞数量，单位为万。对照为不给药组。
图3为多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11抑制肺癌细胞A549生长结果图。横坐标为给药时间，单位为天。纵坐标为细胞数量，单位为万。对照为不给药组。
图4为多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231生长结果图。横坐标为给药时间，单位为天。纵坐标为细胞数量，单位为万。对照为不给药组。
图5为多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11抑制肠癌细胞HCT-7生长结果图。横坐标为给药时间，单位为天。纵坐标为细胞数量，单位为万。对照为不给药组。
图6为多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11抑制白血病细胞K562生长结果图。横坐标为给药时间，单位为天。纵坐标为细胞数量，单位为万。对照为不给药组。
图7为多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11抑制肝癌细胞HepG2迁移结果图。纵坐标为细胞划痕后修复面积比，单位为百分数。对照为不给药组。
图8为多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11抑制肺癌细胞A549迁移结果图。纵坐标为细胞划痕后修复面积比，单位为百分数。对照为不给药组。
图9为多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移结果图。纵坐标为细胞划痕后修复面积比，单位为百分数。对照为不给药组。
图10为多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11抑制肠癌细胞HCT-8迁移结果图。纵坐标为细胞划痕后修复面积比，单位为百分数。对照为不给药组。
图11为多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11抑制白血病细胞K562克隆形成结果图。纵坐标为克隆形成数，单位为个。对照为不给药组。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述的PBS，指浓度为0.1M，pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，较佳地为15～30℃。
实验结果用均值±标准误表示，经参数或者非参数方差检验，经比较p<0.05认为有显著性差异，p<0.01认为有极其显著性差异。
实施例1多肽的合成
多肽S160的氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.1。多肽S160由北京赛百盛基因技术有限公司合成并纯化。
引入两个非天然氨基酸S-戊烯丙氨酸(S5)进行固相多肽链合成。固相多肽链合成完成后采用钌作为催化剂进行烯烃复分解反应(RCM)环化即得目标多肽。最后将目标多肽从树脂上切割下来进行纯化。上述固相多肽链合成及纯化的步骤由中肽生化有限公司公司完成。其中，两个S-戊烯丙氨酸插入在多肽A2氨基酸序列中的第i、i+4位，由此得到不同序列的改造后的多肽(氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.2～SEQ ID No.12)，其具体插入位点如下所示：
S160：Ala-Lys-Cys-Phe-Glu-Ala-His-Gln-Trp-Phe-Leu-Lys-His-Glu-Ala；
S160-S1：S5-Lys-Cys-Phe-S5-Ala-His-Gln-Trp-Phe-Leu-Lys-His-Glu-Ala；
S160-S2：Ala-S5-Cys-Phe-Glu-S5-His-Gln-Trp-Phe-Leu-Lys-His-Glu-Ala；
S160-S3：Ala-Lys-S5-Phe-Glu-Ala-S5-Gln-Trp-Phe-Leu-Lys-His-Glu-Ala；
S160-S4：Ala-Lys-Cys-S5-Glu-Ala-His-S5-Trp-Phe-Leu-Lys-His-Glu-Ala；
S160-S5：Ala-Lys-Cys-Phe-S5-Ala-His-Gln-S5-Phe-Leu-Lys-His-Glu-Ala；
S160-S6：Ala-Lys-Cys-Phe-Glu-S5-His-Gln-Trp-S5-Leu-Lys-His-Glu-Ala；
S160-S7：Ala-Lys-Cys-Phe-Glu-Ala-S5-Gln-Trp-Phe-S5-Lys-His-Glu-Ala；
S160-S8：Ala-Lys-Cys-Phe-Glu-Ala-His-S5-Trp-Phe-Leu-S5-His-Glu-Ala；
S160-S9：Ala-Lys-Cys-Phe-Glu-Ala-His-Gln-S5-Phe-Leu-Lys-S5-Glu-Ala；
S160-S10：Ala-Lys-Cys-Phe-Glu-Ala-His-Gln-S5-Phe-Leu-Lys-His-S5-Ala；
S160-S11：Ala-Lys-Cys-Phe-Glu-Ala-His-Gln-Trp-S5-Leu-Lys-His-Glu-S5。
实施例2圆二色谱法检测多肽的α螺旋率
用圆二色谱仪(购自日本Jasco公司)检测多肽的α螺旋率。将实施例1所制备的多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11溶解到水溶液中，将圆二色谱仪的上机浓度调整为1mg/mL，结果如表1所示。其中，α螺旋率指保持二级结构α螺旋的多肽的肽段数量占总多肽的肽段数量的百分比。
表1说明，多肽S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10、S160-S11的α螺旋率明显高于多肽S160，由于多肽的α螺旋率的维持是增加多肽稳定性的重要指标，因此，多肽S160-S1～S160-S11的α螺旋率的提高会增强其稳定性。
表1 圆二色谱法测定多肽α螺旋率
Figure BDA0001012273310000091
实施例3免疫荧光染色验证多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11靶向增加PML核小体的数量
具体操作步骤如下：
1.收集对数生长期的肝癌细胞HepG2(购自中国医学科学院基础医学研究所)，用DMEM培养基(购自美国Invitrogen公司)调整细胞浓度，制成15万个/mL的细胞悬液。
2.将1mL步骤1所制得的细胞悬液加入12孔板(12孔板中预先加入细胞培养玻璃圆片，细胞培养玻璃圆片购自(北京海德创业生物技术有限公司)进行培养，12小时后换成新的培养基，并且分别加入1μg/mL实施例1所制得的多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11，培养12小时。
3.吸去细胞培养基上清，用PBS清洗3次。4％(v/v)多聚甲醛固定10分钟。PBS洗涤2-3次，每次5分钟。用含0.5％(v/v)TritonX-100的PBS透化10分钟。再用PBS洗涤3次，每次5分钟。封闭液[含3％(v/v)BSA的PBS]封闭15分钟，室温放置。加入按体积比1∶1000稀释(PBS稀释)的PML一抗(购自Novus公司)，4℃湿盒过夜。次日PBS洗涤3次，每次5分钟。加入按体积比1∶100稀释的FITC荧光标记的二抗，室温湿盒1小时。PBS洗涤3次，每次5分钟。用含有封片剂的DAPI(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)染细胞核，室温4分钟。
4.采用Leica SP2共聚焦荧光显微镜观察，使用488nm波长激光激发FITC，使用紫外激发DAPI，观察细胞内PML核小体的数目和大小。结果如表2和图1所示。
表2说明，与多肽S160相比，多肽S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11能明显增加细胞内PML核小体的数量，由于PML核小体的形成是PML发挥其抑癌蛋白的关键过程，因此，多肽S160-S1～S160-S11增加PML核小体的形成会增强PML蛋白的抗肿瘤活性。
表2 细胞免疫荧光发法测定多肽对细胞PML核小体数量的影响
Figure BDA0001012273310000101
Figure BDA0001012273310000111
实施例4细胞计数实验验证多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11抑制肿瘤细胞的生长
具体操作步骤如下：
1.收集对数生长期的肝癌细胞HepG2(购自中国医学科学院基础医学研究所)、肺癌细胞A549(购自中国医学科学院基础医学研究所)、结肠癌细胞HCT-8(购自中国医学科学院基础医学研究所)、乳腺癌细胞MDA-MB-231(购自中国医学科学院基础医学研究所)和白血病细胞K562(购自中国医学科学院基础医学研究所)，调整细胞浓度，制成浓度为15万个/mL的细胞悬液。
2.将1mL步骤1所制得的细胞悬液加入12孔板进行培养(其中HepG2、A549、HCT-8和MDA-MB-231细胞所用培养基为DMEM培养基，K562细胞所用培养基为1640培养基，均购自Invitrogen公司；培养温度为37℃，培养基体积为1mL)，12小时后换成新的培养基，并且分别加入1μg/mL实施例1所制得的多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11。每隔一天进行传代一次，并进行计数。培养12天后绘制出生长曲线。实验结果见图2～6和表3～7。
图2～6和表3～7说明多肽S160-S1～S160-S11相比于S160更能够抑制肿瘤细胞的生长。
表3 多肽抑制肝癌细胞HepG2的生长
Figure BDA0001012273310000112
Figure BDA0001012273310000121
表4 多肽抑制肺癌细胞A549的生长
Figure BDA0001012273310000122
Figure BDA0001012273310000131
表5 多肽抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长
多肽名称 细胞数量(万)
对照 539.000±39.219
S160 547.333±22.048
S160-S1 294.000±38.527
S160-S2 327.333±41.176
S160-S3 194.000±25.515
S160-S4 312.000±28.746
S160-S5 255.333±20.515
S160-S6 267.000±27.465
S160-S7 300.333±44.333
S160-S8 333.667±59.150
S160-S9 207.000±4.583
S160-S10 282.333±42.990
S160-S11 265.667±34.372
表6多肽抑制肠癌细胞HCT-7的生长
Figure BDA0001012273310000132
Figure BDA0001012273310000141
表7 多肽抑制白血病细胞K562的生长
多肽名称 细胞数量(万)
对照 729.000±30.216
S160 714.000±43.301
S160-S1 275.667±24.592
S160-S2 309.000±46.479
S160-S3 267.333±26.766
S160-S4 330.333±56.628
S160-S5 197.000±12.741
S160-S6 230.333±36.608
S160-S7 297.000±45.044
S160-S8 297.000±45.044
S160-S9 229.333±27.891
S160-S10 197.000±12.741
S160-S11 236.555±60.628
实施例5细胞划痕实验验证多肽抑制肿瘤细胞划痕后的愈合具体操作步骤如下：
1.先用记号笔在6孔板背后，用直尺比着划横线，横穿过孔。
2.在每个孔中分别加入5×105个肿瘤细胞，在DMEM培养基中37℃孵育箱培养过夜后细胞贴壁。该肿瘤细胞为对数生长期的肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549、结肠癌细胞HCT-8和乳腺癌细胞MDA-MB-231。
3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线进行划痕，枪头要垂直。
4.用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入新的培养基，同时加入1μg/mL实施例1所制备的多肽S160、S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11。
5.然后放入37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养，24小时后取样拍照。实验结果见图7～10和表8～11。
图7～10和表8～11的结果说明，损伤修复面积比越大说明肿瘤细胞的迁移能力越强，细胞划痕后愈合能力越强。因此多肽S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11可以降低肿瘤细胞划痕后的愈合能力。
表8 多肽抑制肝癌细胞HepG2迁移
Figure BDA0001012273310000151
Figure BDA0001012273310000161
表9 多肽抑制肺癌细胞A549迁移
多肽名称 损伤修复面积比
对照 86.00±2.082
S160 45.67±6.064
S160-S1 21.67±2.404
S160-S2 23.67±4.096
S160-S3 22.33±1.856
S160-S4 28.33±0.67
S160-S5 21.33±4.702
S160-S6 22.67±4.256
S160-S7 18.00±0.5774
S160-S8 27.67±1.202
S160-S9 22.00±1.732
S160-S10 26.00±1.000
S160-S11 24.67±2.603
表10 多肽抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移
Figure BDA0001012273310000162
Figure BDA0001012273310000171
表11 多肽抑制结肠癌细胞HCT-8迁移
多肽名称 损伤修复面积比
对照 86.00±5.568
S160 49.00±3.512
S160-S1 28.33±2.404
S160-S2 33.67±1.856
S160-S3 22.33±1.856
S160-S4 28.33±0.6667
S160-S5 28.00±2.082
S160-S6 29.67±6.489
S160-S7 24.67±3.844
S160-S8 21.00±2.646
S160-S9 22.00±1.732
S160-S10 26.00±4.933
S160-S11 28.00±1.528
实施例6克隆形成实验验证多肽抑制白血病细胞的克隆形成
其操作步骤如下：
1.铺下层琼脂：5％(w/w)琼脂沸水浴至完全融化，冷却至50℃，加9倍体积37℃预温的1640培养液(购自Invitrogen公司)，混匀，加入24孔板，每孔0.8mL，室温凝固备用。
2.铺上层琼脂：9.4mL细胞悬液中加入0.6mL 50℃5％(w/w)琼脂，混匀，加入已铺好下层琼脂的24孔板，每孔0.8mL。室温凝固。每孔细胞数100个。其中，细胞悬液的制备方法为：将白血病细胞K562用1640培养液稀释，调整浓度为132个细胞/mL。
3.将步骤2所得的细胞用1640培养液在37℃孵育箱中孵育培养3周，计算克隆形成数量。
其结果如图11和表12所示。表12的结果说明，多肽S160-S1、S160-S2、S160-S3、S160-S4、S160-S5、S160-S6、S160-S7、S160-S8、S160-S9、S160-S10和S160-S11相对于多肽S160对白血病细胞克隆形成的抑制水平显著提高。
表12 多肽抑制白血病细胞克隆形成
Figure BDA0001012273310000181
Figure BDA0001012273310000191
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0001012273370000011
Figure IDA0001012273370000021
Figure IDA0001012273370000031
Figure IDA0001012273370000041

Claims (6)

1.一种靶向增加PML核小体数量的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；或者，如将序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为侧链可相连的非天然氨基酸，所述侧链可相连的非天然氨基酸为S-戊烯丙氨酸，所述的多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11和SEQ ID No.12中任一项所示。
2.如权利要求1所述的靶向增加PML核小体数量的多肽在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌、肺癌、乳腺癌、肠癌或白血病。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肝癌为原发性肝癌或继发性肝癌；所述肺癌为小细胞肺癌或非小细胞肺癌；所述乳腺癌为非浸润性乳腺癌、早期浸润性乳腺癌、浸润性特殊类型乳腺癌或浸润性非特殊类型乳腺癌；所述肠癌为结肠癌或直肠癌；所述白血病为淋巴细胞型白血病或非淋巴细胞型白血病。
4.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，其含有如权利要求1所述的靶向增加PML核小体数量的多肽。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，其还包括一种或多种药用载体。
6.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的靶向增加PML核小体数量的多肽作为活性成分。
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