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CN107446963B - 一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法 - Google Patents

一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法 Download PDF

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CN107446963B CN201610377220.5A CN201610377220A CN107446963B CN 107446963 B CN107446963 B CN 107446963B CN 201610377220 A CN201610377220 A CN 201610377220A CN 107446963 B CN107446963 B CN 107446963B
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Abstract

本发明涉及一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，收集高山被孢霉发酵清液，通过亲水性有机溶剂萃取浓缩，筛选获得可调控高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的促进剂，在发酵初期0～48h，将上述促进剂按照0.1‑0.5％比例添加至正常的培养基，制备成条件培养液，接种，28℃培养，发酵结束后，在一些实施例的发酵结果中，生物量43.2g/L、油脂含量61.3％、ARA含量60.7％，ARA产量16.1g/L，发酵周期由192h缩短至168h。该方法简单，有效，促进了高山被孢霉生长，提高了花生四烯酸油脂产率，对于工业化应用具有重要的意义。

Description

一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，更具体的说，涉及一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法。
背景技术
花生四烯酸(ARA)是一种长链多不饱和脂肪酸，具有十分重要的生理功能，是人体自身不能大量合成但又不可缺少的重要营养物质，ARA大量存在于人体视网膜及大脑皮层的神经组织中，是胎儿和婴儿大脑发育的基础，对其智力和认知能力具有促进作用。
通过优化发酵条件提高ARA产量是目前研究的重点，中国专利201310475443.1公开了一种通过诱变及培养基优化提高ARA产量的方法，ARA产量虽有较大提升，但诱变具有随机性，且诱变后的菌株具有遗传不稳定性，易导致回复突变，不易进行工业化应用。中国专利CN201410556081.3公开了一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵生产花生四烯酸油脂的方法，该方法主要通过调控高的溶氧浓度，提高ARA产量，但ARA产量提高的同时也增加了能耗，增加了生产成本。
目前，虽然利用微生物高山被孢霉发酵生产ARA油脂已经实现工业化生产，但其工业化生产过程中仍然存在生产周期长、生产效率低等问题。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供了一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，不增加生产成本的前提下，可显著促进高山被孢霉生长及ARA油脂产率的方法，操作简单，可用于指导工业化生产。
本发明为了解决上述问题，提供的技术方案为：提供了一种促进高山被孢霉生长及ARA油脂产率的方法，包括如下步骤：
S100.进行第一批次的高山被孢霉发酵培养，收集发酵72h之后的发酵清液；
S200.利用亲水性有机溶剂萃取浓缩所述发酵清液，获得促进剂；
S300.在第二批次的高山被孢霉发酵培养过程中，添加所述促进剂至发酵培养基。
在本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法中，步骤S200中，所述亲水性有机溶剂为正丁醇、二氯甲烷、丙醇中的一种，亲水性有机溶剂与发酵清液体积比为1:1～1:5，萃取时间1～3h，萃取2～3次，合并萃取液，将萃取液旋转蒸发，萃取液浓缩比为1/100～1/200，得所述促进剂。
在本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法中，所述促进剂用无菌有机滤膜过滤除菌后，4℃密封保存。
在本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法中，步骤S300中，添加所述促进剂的时间为所述第二批次的高山被孢霉发酵培养进行0～48h时，按照体积比0.1～0.5％添加。
在本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法中，所述第一批次的高山被孢霉发酵培养和所述第二批次的高山被孢霉发酵培养，均使用高山被孢霉种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
在本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法中，高山被孢霉种子液的制备过程包括：将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉活化制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液。将种子液按照5％～10％的接种量接入无菌发酵培养基，28℃下进行不同批次的高山被孢霉发酵培养。
在本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法中，步骤S300之后还包括：
S400.所述第二批次的高山被孢霉发酵培养结束后，收集湿菌体，干燥至恒重，破壁，利用亲油性有机溶剂萃取得到富含ARA的油脂。
实施本发明，具有如下有益效果：本发明利用高山被孢霉自身发酵清液制备可调控高山被孢霉生长和ARA油脂产率的促进剂，并重新添加至发酵培养基，制备条件培养液，该条件培养液可显著促进高山被孢霉生长及ARA油脂产率，且该油脂合成促进剂来源于高山被孢霉自身发酵清液，使其附加值大大增加，从而降低了生产成本。该方法操作简单易行，切实有效，为高山被孢霉菌体生长及ARA油脂产率的提高提供了一条全新的思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在无需付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法较佳实施例的流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
图1示出了本发明的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法较佳实施例的流程，如图1所示，包括如下步骤：
S100.进行第一批次的高山被孢霉发酵培养，收集发酵72h之后的发酵清液；
S200.利用亲水性有机溶剂萃取浓缩所述发酵清液，获得促进剂；
S300.在第二批次的高山被孢霉发酵培养过程中，添加所述促进剂至发酵培养基。
其中，第一批次的高山被孢霉发酵培养在第二批次的高山被孢霉发酵培养之前进行。
本发明实例提供促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，具体实现步骤包括：
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉活化制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照5％～10％的接种量接入发酵培养基28℃进行培养，在发酵初期0～48h，添加0.1％～0.5％的体积比添加调控高山被孢霉生长及ARA油脂产率的促进剂，可以一次添加，也可分多次添加，28℃培养；
种子培养基组成成分(g/L)：葡萄糖50.0，酵母粉10.0，硝酸钠3.0，磷酸二氢钾3.0，七水合硫酸镁0.5。
发酵培养基组成成分及浓度(g/L)：葡萄糖100.0，酵母粉5.0，玉米浆3.0，黄豆饼粉2.0，硝酸钠2.0，磷酸二氢钾2.0，七水合硫酸镁0.5。
促进剂制备：利用亲水性有机溶剂，如正丁醇、二氯甲烷、丙醇中的一种，萃取浓缩高山被孢霉的发酵清液，亲水性有机溶剂与发酵清液的萃取比例1:1～1:5，萃取时间1～3h，萃取次数为2～3次，所述的萃取浓缩，旋转蒸发浓缩后的萃取液，浓缩比为1/100～1/200；用0.22μm的无菌有机滤膜过滤除菌后4℃密封保存。
(3)发酵结束后，真空泵抽滤收集湿菌体，60℃烘箱干燥6～8h至恒重，破壁，利用亲油性有机溶剂(30～60沸程石油醚、正己烷等)萃取得到富含ARA的油脂，甲酯化后，气相检测，得到ARA含量。
步骤(3)可采用现有技术，在此不再赘述。
实施例1调控高山被孢霉生长及ARA油脂产率的促进剂制备
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化168h制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照10％的接种量(v/v)接入发酵培养基，28℃进行培养，发酵周期为192h；
(3)发酵结束后，利用抽滤瓶进行抽滤，获得的湿菌体置于60℃烘箱进行干燥，约需6～8h，至菌体恒重，并称重。
(4)对干燥的菌体进行破壁，称取0.5g破壁菌体，加入3mL的30～60沸程的石油醚进行萃取，离心，去上清，重复该操作两次，合并上清液，旋转蒸发，获得富含ARA的油脂，甲酯化后进行气相检测分析。
发酵结果：生物量38.1g/L，油脂含量56.5％，ARA含量59.4％，ARA产量12.8g/L。
(5)收集步骤(3)的发酵清液，减压蒸馏浓缩后，分别用不同的溶剂(乙酸乙酯、正丁醇、乙醚、石油醚、二氯甲烷、丙醇、二甲苯)萃取，将溶剂旋蒸后浓缩，分别添加至刚配置好发酵培养基，研究结果发现正丁醇、二氯甲烷、丙醇三种溶剂萃取获得的提取物，对于调控高山被孢霉生长及ARA油脂产率效果最佳。促进剂的制备方法如前。通过调整浓缩比、萃取时间、萃取、浓缩比(萃取液体积大，浓缩比越小)，得到的促进剂效果相当。仅以下面方法做示例性说明：分别取60mL发酵清液三份，分别加入30mL正丁醇、二氯甲烷、丙醇萃取2h，分别收集萃取液，相同操作重复3次，合并萃取液，按照常规操作，分别将溶剂进行旋转蒸发，旋转蒸发浓缩后的萃取液浓缩比为1/100，收集浓缩液，用0.22μm的无菌有机滤膜过滤除菌，4℃密封保存，备用。
实施例2调控高山被孢霉生长及ARA油脂产率的促进剂制备
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化168h制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量(v/v)接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照6％的接种量(v/v)接入装有4L发酵培养基的7L发酵罐，150rpm，通气量1.5vvm，28℃培养；
(3)从高山被孢霉发酵72h开始连续取样，取样时间点72h，96h，120h，144h，168h，至192h发酵结束，分别按照实施例1中步骤(5)的萃取方式，萃取液选用正丁醇，旋转蒸发浓缩后的萃取液，浓缩比为1/200，收集浓缩液，用0.22μm的无菌有机滤膜过滤除菌，4℃密封保存，备用。
实施例3添加促进剂对高山被孢霉生长及ARA油脂产率的调控(摇瓶水平)
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化168h制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量(v/v)接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照10％的接种量(v/v)接入发酵培养基，在发酵开始0h，24h，48h，分别添加0.1％体积比的实施例1中制备的促进剂，28℃培养，发酵周期为180h；每组实验为5个平行样。
(3)发酵结束后，利用抽滤瓶进行抽滤，获得湿菌体，并将其置于60℃烘箱进行干燥，约需6～8h，至菌体恒重，并称重。
(4)对干燥的菌体进行破壁，称取0.5g破壁菌体，加入3mL的30～60沸程的石油醚进行萃取，离心，去上清，重复该操作两次，合并上清液，旋转蒸发，获得富含ARA的油脂，甲酯化后进行气相检测分析。
发酵结果如表1所示，结果表明，正丁醇、二氯甲烷、丙醇提取物对于高山被孢霉菌体量和油脂量都有明显提高，对ARA合成的调控不显著，结果差异不显著，同时发现促进剂添加时间越早更有利于生物量的积累。
表1不同溶剂提取物添加ARA合成的影响
Figure BDA0001005804030000061
Figure BDA0001005804030000071
实施例4添加促进剂对高山被孢霉生长及ARA油脂产率的调控(摇瓶水平)
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化168h制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量(v/v)接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照10％的接种量(v/v)接入发酵培养基，在发酵开始分别添加0.2％体积比的实施例2中制备的不同发酵时期的油脂合成促进剂，28℃培养，发酵周期为180h；每组实验为5个平行样。
(3)发酵结束后，利用抽滤瓶进行抽滤，获得湿菌体，并将其置于60℃烘箱进行干燥，约需6～8h，至菌体恒重，并称重。
(4)对干燥的菌体进行破壁，称取0.5g破壁菌体，加入3mL的30～60沸程的石油醚进行萃取，离心，去上清，重复该操作两次，合并上清液，旋转蒸发，获得富含ARA的油脂，甲酯化后进行气相检测分析。
发酵结果如表2所示，结果表明，随着培养时间的延长，高山被孢霉发酵液中可调控高山被孢霉生长及ARA油脂产率的促进剂越多，对于高山被孢霉菌体量和油脂量积累都有明显促进作用，综合考虑生产成本和操作难易度，选择高山被孢霉发酵结束时的发酵液进行萃取，制备条件培养液。
表2不同发酵时期的促进剂添加对ARA合成的影响
Figure BDA0001005804030000072
Figure BDA0001005804030000081
实施例5添加促进剂对高山被孢霉生长及ARA油脂产率的调控(7L发酵罐)
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化168h制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量(v/v)接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照6％的接种量(v/v)接入装有4L发酵培养基的7L发酵罐，在发酵开始时即发酵0h，添加0.5％体积比的实施例1中制备的油脂合成促进剂(丙醇提取物)，150rpm，通气量1.5vvm，28℃培养，发酵周期为168h；
(3)发酵结束后，取部分样品利用抽滤瓶进行抽滤，获得湿菌体，并将其置于60℃烘箱进行干燥，约需6～8h，至菌体恒重，并称重。
(4)对干燥的菌体进行破壁，称取0.5g破壁菌体，加入3mL的30～60沸程的石油醚进行萃取，离心，去上清，重复该操作两次，合并上清液，旋转蒸发，获得富含ARA的油脂，甲酯化后进行气相检测分析。
连续发酵三批次，ARA产量较不添加丙醇提取物都有所提高，最优的发酵结果：生物量41.9g/L、油脂含量59.5％、ARA含量61.8％，ARA产量15.4g/L。
实施例6添加促进剂对高山被孢霉生长及ARA油脂产率的调控(100L发酵罐)
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化168h制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照10％的接种量(v/v)接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)种子液扩大培养
将步骤(1)制备的种子液按照10％的接种量(v/v)接入装有5L种子培养基的10L发酵罐中，搅拌转速150rpm，通气量1.0vvm，28℃培养48h，制备种子扩大培养液。
(3)将种子扩大培养液按照8％的接种量(v/v)接入装有60L发酵培养基的100L发酵罐，在发酵开始时即发酵0h，添加0.5％体积比的依据实施例1中制备的油脂合成促进剂(丙醇提取物)，100rpm，通气量0.8vvm，28℃培养，发酵周期为168h；
(3)发酵结束后，取部分样品利用抽滤瓶进行抽滤，获得湿菌体，并将其置于60℃烘箱进行干燥，约需6～8h，至菌体恒重，并称重。
(4)对干燥的菌体进行破壁，称取0.5g破壁菌体，加入3mL的30～60沸程的石油醚进行萃取，离心，去上清，重复该操作两次，合并上清液，旋转蒸发，获得富含ARA的油脂，甲酯化后进行气相检测分析。
连续发酵三批次，ARA产量较不添加丙醇提取物都有所提高，最优的发酵结果：生物量43.2g/L、油脂含量61.3％、ARA含量60.7％，ARA产量16.1g/L。
需要特殊说明的是，以上技术方案仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做出改动或修改，这些等价形式同样在本申请所附权利要求书所限定的范围之内。

Claims (6)

1.一种促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S100.进行第一批次的高山被孢霉发酵培养，收集发酵72h之后的发酵清液；
S200.利用亲水性有机溶剂萃取浓缩所述发酵清液，获得促进剂；所述亲水性有机溶剂为正丁醇、二氯甲烷、丙醇中的一种，亲水性有机溶剂与发酵清液体积比为1:1～1:5，萃取液浓缩比为1/100～1/200；
S300.在第二批次的高山被孢霉发酵培养过程中，添加所述促进剂至发酵培养基。
2.根据权利要求1所述的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，其特征在于，步骤S200中，萃取时间1～3h，萃取2～3次，合并萃取液，将萃取液旋转蒸发，得所述促进剂。
3.根据权利要求2所述的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，其特征在于，所述促进剂用无菌有机滤膜过滤除菌后，4℃密封保存。
4.根据权利要求1所述的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，其特征在于，步骤S300中，添加所述促进剂的时间为所述第二批次的高山被孢霉发酵培养进行0～48h时，按照体积比0.1～0.5％添加。
5.根据权利要求1所述的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，其特征在于，所述第一批次的高山被孢霉发酵培养和所述第二批次的高山被孢霉发酵培养，均使用高山被孢霉种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
6.根据权利要求1所述的促进高山被孢霉生长及花生四烯酸油脂产率的方法，其特征在于，步骤S300之后还包括：
S400.所述第二批次的高山被孢霉发酵培养结束后，收集湿菌体，干燥至恒重，破壁，利用亲油性有机溶剂萃取得到富含ARA的油脂。
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