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CN107446038A - 聚乙二醇修饰的重组人胰岛素及其制备方法 - Google Patents

聚乙二醇修饰的重组人胰岛素及其制备方法 Download PDF

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CN107446038A
CN107446038A CN201610381975.2A CN201610381975A CN107446038A CN 107446038 A CN107446038 A CN 107446038A CN 201610381975 A CN201610381975 A CN 201610381975A CN 107446038 A CN107446038 A CN 107446038A
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CN
China
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insulin
filler
polyethylene glycol
column packing
buffer
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Withdrawn
Application number
CN201610381975.2A
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English (en)
Inventor
成佳
邓泽平
李书耘
陈芳军
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Hunan Huateng Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Hunan Huateng Pharmaceutical Co Ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Huateng Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Hunan Huateng Pharmaceutical Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins

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  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇修饰的重组人胰岛素及其制备方法，其结构式如式(I)所示，m为单甲氧基monomethoxy的缩写，R是去除n个氨基的重组人胰岛素亚基，n是1‑200的整数。本发明的化合物成分均一、生物活性高、降血糖持续作用时间延长。

Description

聚乙二醇修饰的重组人胰岛素及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰重组人胰岛素的方法。
技术背景
胰岛素是人体内唯一降低血糖的激素，对于糖尿病的治疗特别是抑制并发症至关重要。但目前胰岛素的使用面临注射次数频繁，低血糖风险，患者体重增加等诸多问题。为减少频繁地注射胰岛素给糖尿病患者带来诸多的不便和痛苦，同时降低低血糖事件，特别是夜间低血糖事件，临床需要降糖有效时间更长且药物代谢更平稳的长效胰岛素类似物。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种聚乙二醇修饰重组人胰岛素的方法，解决了目标产物分离困难的问题。
本发明的技术方案为：将重组人胰岛素溶液加入装有填料的容器中，搅拌，使蛋白质分子均匀吸附在填料上，过滤得到该填料并加入到含活性聚乙二醇的溶液中，搅拌，使活性聚乙二醇与重组人胰岛素形成共价键，然后将填料装柱、用缓冲液梯度洗脱分离，并收集聚乙二醇修饰的重组人胰岛素组分。
上文所述的重组人胰岛素的浓度为10～25毫克/毫升，优选为10～15毫克/毫升；所述的填料为层析柱填料，为疏水柱填料、离子层析柱填料或亲和层析柱填料之一，优选为疏水柱填料；所述的活性聚乙二醇的分子量在5000～50000之间，优选为分子量在5000～30000之间；所述的缓冲液为pH为2.0～8.0的醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和枸橼酸缓冲液之一，优选为醋酸盐缓冲液；所述的重组人胰岛素为重组人胰岛素DesB30。
下面通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明的技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
具体实施例方式
实施例1
以100毫摩尔pH为6.0的醋酸钠溶液为缓冲液A；将氯化钠加入到A中使得氯化钠浓度为1摩尔/升，以此为缓冲液B；向A中加入活性聚乙二醇10000(mPEG-NHS)，用于配制活性聚乙二醇溶液。所添加的活性聚乙二醇的摩尔量是重组人胰岛素DesB30摩尔量的4倍。再用缓冲液A平衡柱填料HyperD F S 3次，过滤，加入30毫升浓度为5毫克/毫升的重组人胰岛素DesB30，搅拌3小时，过滤，干燥。
将干燥的柱填料加入50毫升活性聚乙二醇溶液中，搅拌，反应3小时，将填料装入层析柱中。再用缓冲液A淋洗，以除去未反应的活性聚乙二醇及其他杂质。最后，用0～100％的梯度添加缓冲液B，得到聚乙二醇修饰的重组人胰岛素DesB30。
实施例2
以200毫摩尔pH为7.0的磷酸盐溶液为缓冲液C；将氯化钠加入到A中使得氯化钠浓度为1摩尔/升，以此为缓冲液D；向A中加入活性聚乙二醇10000(mPEG-NHS)，用于配制活性聚乙二醇溶液。所添加的活性聚乙二醇的摩尔量是干扰素摩尔量的5倍。再用缓冲液C平衡柱填料HyperD F S 3次，过滤，加入50毫升浓度为5毫克/毫升的γ-干扰素，搅拌3小时，过滤，干燥。
将干燥的柱填料加入50毫升活性聚乙二醇溶液中，搅拌，反应3小时，将填料装入层析柱中。再用缓冲液C淋洗，以除去未反应的活性聚乙二醇及其他杂质。最后，用0～100％的梯度添加缓冲液D，得到聚乙二醇修饰的重组人胰岛素DesB30。

Claims (5)

1.一种聚乙二醇修饰重组人胰岛素的方法，将重组人胰岛素溶液加入装有填料的容器中，搅拌，使蛋白质分子均匀吸附在填料上，过滤得到该填料并加入到含活性聚乙二醇的溶液中，搅拌，使活性聚乙二醇与重组人胰岛素形成共价键，然后将填料装柱、用缓冲液梯度洗脱分离，并收集聚乙二醇修饰的重组人胰岛素组分。
2.根据权利要求1的方法，所述的重组人胰岛素的浓度为10～25毫克/毫升；所述的填料为层析柱填料，为疏水柱填料、离子层析柱填料或亲和层析柱填料之一。
3.根据权利要求1的方法，所述的活性聚乙二醇的分子量在5000～50000之间。
4.根据权利要求1的方法，所述的缓冲液为pH为2.0～8.0的醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和枸橼酸缓冲液之一。
5.根据权利要求1的方法，所述的重组人胰岛素为重组人胰岛素DesB30。
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Title
陈代杰等: "《生物产业》", 30 June 2014 *

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