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CN107446016A - 一种硬脂酸修饰的细胞穿膜肽及其制备与应用 - Google Patents

一种硬脂酸修饰的细胞穿膜肽及其制备与应用 Download PDF

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CN107446016A
CN107446016A CN201610369973.1A CN201610369973A CN107446016A CN 107446016 A CN107446016 A CN 107446016A CN 201610369973 A CN201610369973 A CN 201610369973A CN 107446016 A CN107446016 A CN 107446016A
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CN
China
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cell
peptide
liposome
preparation
penetrating peptide
Prior art date
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Pending
Application number
CN201610369973.1A
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English (en)
Inventor
徐宇虹
李秩举
彭金良
魏晓慧
陈晓龙
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Shanghai Jiao Tong University
Original Assignee
Shanghai Jiao Tong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本发明属于生物药物研发领域，具体涉及一种硬脂酸修饰的细胞穿膜肽及其制备与应用。本发明通过广泛而深入的研究发现，一种全新的硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，将所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽与多肽融合形成的融合肽，能够有效帮助多肽进入细胞内。将所述融合肽采用表面活性剂法进一步制备成脂质体制剂后，粒径均一、包封率好，稳定性高，能够进一步提高融合肽进入细胞的能力，克服了许多包括功能肽在内的多肽不能进入细胞的缺陷。

Description

一种硬脂酸修饰的细胞穿膜肽及其制备与应用
技术领域
本发明属于生物药物研发领域，具体涉及一种硬脂酸修饰的细胞穿膜肽及其制备与应用。
背景技术
大部分的多肽药物的治疗靶点都在细胞内，比如细胞质，细胞核或者其他特殊的细胞器如线粒体等，因此，把具有生物活性的多肽输送到细胞内是多肽类药物发挥药效的关键所在。在多肽药物的输送过程中，存在很多的局限性。首先多肽本身的大分子量使得多肽对于受体生物来说是外来物，除了一些小分子多肽通过主动转运进入细胞外，亲脂性的生物膜也阻碍着多肽分子自发进入细胞。虽然有些多肽可以通过受体介导的细胞内吞作用进入细胞，但是进入细胞的多肽最终被溶酶体吞噬，多肽的生物活性被溶酶体内的酶破坏，这样就导致仅有很少一部分的多肽可以进入细胞质发挥作用，所以有很多的多肽虽然在体外有很好的作用，却由于生物利用度问题无法应用于体内。另外多肽药物在体内也不稳定，各种各样的体内因素均会导致多肽的失活：温度，PH，高盐浓度，或者表面活性影响其活性，非共价离子化合物、低分子或者高分子化合物也影响多肽的结构等等。由于多肽的半衰期短，不断的注射给药使病人的顺应性差，多肽本身的物化性质和低的渗透性也限制了其通过非侵袭性的鼻腔、皮肤、肺和口服的给药途径[3]的应用。多肽药物的细胞内输送过程中存在着一系列的难点，因此在多肽药物的研发过程中，寻找合适的输送载体来提高多肽的生物利用度至关重要。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种硬脂酸修饰的细胞穿膜肽及其制备与应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，包括硬脂酸和细胞穿膜肽，所述硬脂酸修饰于细胞穿膜肽上。
优选地，所述硬脂酸与细胞穿膜肽之间通过酰胺键连接。
优选地，所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽为CPP-SA，所述CPP的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，硬脂酸SA修饰于所述CPP的C端。
进一步优选地，硬脂酸SA的羧基与所述CPP的C端的赖氨酸的侧链氨基连接。
进一步优选地，硬脂酸修饰的细胞穿膜肽CPP-SA的结构式如式(1)所示，具体为：
优选地，所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽为CPP-MMP-SA，所述CPP-MMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，硬脂酸SA修饰于所述CPP-MMP的C端。
进一步优选地，硬脂酸SA的羧基与所述CPP-MMP的C端的赖氨酸的侧链氨基连接。
进一步优选地，硬脂酸修饰的细胞穿膜肽CPP-MMP-SA的结构式如式(2)所示，具体为：
优选地，所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽为GGGSK-SA，硬脂酸SA修饰于所述GGGSK的C端。
进一步优选地，硬脂酸SA的羧基与所述GGGSK的C端的赖氨酸的侧链氨基连接。
进一步优选地，硬脂酸修饰的细胞穿膜肽GGGSK-SA的结构式如式(3)所示，具体为：
本发明的第二方面，提供了前述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽在输送多肽进入细胞中的用途。
本发明的第三方面，提供了前述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽在制备融合肽中的用途。
本发明的第四方面，提供一种融合肽，包括多肽和前述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，所述多肽的C端与所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽的N端连接。
优选地，所述多肽的C端与硬脂酸修饰的细胞穿膜肽的N端通过酰胺键连接。
本发明对于多肽没有特别的限制。优选地，所述多肽含有1～50个氨基酸。
本发明的第五方面，提供一种脂质体制剂，含有前述融合肽和脂质体载体。
优选地，融合肽与脂质体之间的摩尔比例范围是1:(1～10)。
本发明对于脂质体的组成成分没有特别的限制，只要能够实现对融合肽的有效包封和运载即可。优选地，所述脂质体的组成成分选自蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂、胆固醇、二油氧基丙基三甲基氯化铵(DOTAP)、二油酰氯丙基氯化三甲铵(DOTMA)、双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)、二甲基胺乙基胺基丙酰基-胆固醇(DC-Chol)、精胺-5-羧基氨基乙酸二十八烷基酰胺(DOGS)、二油酰琥珀酰甘油胆碱酯(DOSC)、二油酰氯精胺羧基酰胺乙基二甲基丙基三氟乙酸铵(DOSPA)、MVL5中的任一种或它们的两种或两种以上的组合。
优选地，所述脂质体的组成成分选自大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂、胆固醇。
本发明的第六方面，提供了一种制备前述脂质体制剂的方法，为表面活性剂透析法。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(4)制备脂质体混悬液：按配比取各脂质体成分，混匀，得脂质膜，加入水合液，水合，得脂质体混悬液；
(5)制备多肽表面活性剂溶液：按配比取融合肽以及表面活性剂，混匀，得多肽表面活性剂溶液；
(6)制备脂质体制剂：将步骤(2)所得多肽表面活性剂溶液加入到步骤(1)所得脂质体混悬液中，混匀，孵育，透析去除表面活性剂及游离融合肽，得脂质体制剂。
优选地，所述融合肽与脂质体总成分之间的摩尔比例范围是1:(1～10)。
优选地，所述融合肽与表面活性剂之间的摩尔比例范围是1：(5～50)。
优选地，步骤(1)中，所述水合液选自质量体积浓度为5％的葡萄糖水溶液。
优选地，步骤(2)中，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂。
优选地，步骤(2)中，所述表面活性剂选自n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-癸基-β-D-麦芽糖苷。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过广泛而深入的研究发现，一种全新的硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，将所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽与多肽融合形成的融合肽，能够有效帮助多肽进入细胞内。将所述融合肽采用表面活性剂法进一步制备成脂质体制剂后，粒径均一、包封率好，稳定性高，能够进一步提高融合肽进入细胞的能力，克服了许多包括功能肽在内的多肽不能进入细胞的缺陷。
附图说明
图1：实施例2中罗丹明B标记的1号样品脂质体和融合肽原料给药2h时的胞内运输情况，制剂组2h(左)；原料组2h(右)。
图2：实施例3罗丹明B标记的1号样品脂质体和原料给药2h时的胞内运输情况，制剂组2h(左)；原料组2h(右)。
图3：实施例4罗丹明B标记的1号样品和原料给药2h时的胞内运输情况，制剂组2h(左)；原料组2h(右)。
图4：实施例7罗丹明B标记的1号样品和原料给药2h时的胞内运输情况，制剂组2h(左)；原料组2h(右)。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
本发明中，缩写符号表示如下：
缩写名称 中文全称
PDI 粒径分布系数
Chol 胆固醇
HSPC 氢化大豆卵磷脂
OG n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷
EPC 大豆卵磷脂
HPLC 高效液相色谱仪
实施例1细胞穿膜肽CPP-SA的制备与获得
1.1采用化学合成的方法制备与获得多肽CPP，所述CPP的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，具体为：Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys(GRKKRRQRRRK)。然后将硬脂酸修饰于所述CPP的C端Lys上，具体地，可将所述CPP的C端Lys上的羧基酰胺化，再将硬脂酸的羧基与所述CPP的C端Lys的侧链氨基进行缩合反应，制备获得CPP的C端修饰有硬脂酸的细胞穿膜肽，命名为CPP-SA。经验证和表征，CPP-SA结构式正确，如式(1)所示，具体为：
1.2采用化学合成的方法制备与获得多肽CPP-MMP，所述CPP-MMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-Gly-Gly-Gly-Gl y-Ser-Lys(GRKKRRQRRRPLGMWSRGGGGSK)。然后将硬脂酸修饰于所述CPP-MMP的C端Lys上，具体地，可将所述CPP-MMP的C端Lys上的羧基酰胺化，再将硬脂酸的羧基与所述CPP-MMP的C端Lys的侧链氨基进行缩合反应，制备获得CPP-MMP的C端修饰有硬脂酸的细胞穿膜肽，命名为CPP-MMP-SA。经验证和表征，CPP-MMP-SA结构式正确，如式(2)所示，具体为：
1.3采用化学合成的方法制备与获得多肽GGGSK，然后将硬脂酸修饰于所述GGGSK的C端Lys上，具体地，可将所述GGGSK的C端Lys上的羧基酰胺化，再将硬脂酸的羧基与所述GGGSK的C端Lys的侧链氨基进行缩合反应，制备获得GGGSK的C端修饰有硬脂酸的细胞穿膜肽，命名为GGGSK-SA。经验证和表征，GGGSK-SA结构式正确，如式(3)所示，具体为：
实施例2融合肽Gaegurins5-CPP-SA及其脂质体制剂
(一)、采用化学合成的方法将Gaegurins5的C端与CPP-SA的N端相连，制备与获得融合肽Gaegurins5-CPP-SA。Gaegurins5的氨基序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：Phe-Leu-Gly-Ala-Leu-Phe-Lys-Val-Ala-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Ser-Val-Lys-Cys-Ala-Ile-Thr-Lys-Lys-Cys。
(二)表面活性剂透析法制备脂质体制剂：
a)制备脂质体混悬液：按配比取各脂质体成分HSPC、Chol，混匀，N2吹干得脂质膜，加入5％葡萄糖，以功率80％在40℃条件下超声水合30min，用Extruder过80nm膜21次，得脂质体混悬液；
b)制备融合肽表面活性剂溶液：按配比取融合肽Gaegurins5-CPP-SA以及表面活性剂OG，在5％葡萄糖水溶液中混合均匀，得融合肽表面活性剂溶液；
c)将c)所得融合肽表面活性剂溶液在40℃下注入b)所得脂质体混悬液中，保温孵育30min，MW10000透析袋4℃透析除去表面活性剂OG和游离融合肽，得到脂质体制剂。
(三)粒径测定
仪器：动态光散射激光粒度仪和zeta电位分析仪(zetasizer3000)；
条件：设定样品折射率为二氧化硅的折射率(1.59)，分散相为水(折射率1.36，粘度0.8cp)，检测温度25℃，样品检测前于检测腔内温度平衡60秒。激光波长为633nm，折射角为90°；
方法：每个样品取60μl，5％无水葡萄糖溶液稀释13倍，转移至粒径池，每个样品平行测定三次。
(四)包封率测定
2.4.1具体测定方法如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB C18大孔柱，5um，4.6×250mm
流动相：A相：0.1％TFA+2％ACN
B相：0.1％TFA+90％ACN
流速：1mL/min
柱温：38℃
检测波长：220nm
进样体积：20μL
洗脱梯度方式如表2-1：
表2-1 HPLC分析多肽洗脱梯度
2.4.2标准曲线制备：
样品溶剂的制备：将5％葡萄糖与色谱甲醇按1:5混合，即得。
融合肽系列梯度溶液的制备：称取一定量的融合肽，加样品溶剂溶解并制成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、1.5和2mg/mL的溶液。
分别取融合肽系列对照品溶液进样分析，以峰面积对浓度作图，制作标准曲线。
2.4.3.脂质体制剂包封率测定
分别取适量(二)项下所制备的脂质体制剂，以5倍色谱甲醇破乳，按(四)项下所述高效液相的方法进样分析。
(五)冻干前后制剂稳定性结果
对制剂冷冻干燥，复溶，MW10000透析袋透析去除游离，马尔文激光粒度仪表征制剂，5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。
(六)脂质体制剂的短期放置稳定性考察
将制备的脂质体制剂在4℃放置一周，MW10000透析袋，5％葡萄糖溶液透析，去除游离的融合肽，使用马尔文激光粒度仪测定粒径，粒径分布系数和电位，取适量制剂以5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。评估其短期放置稳定稳定性。
(七)聚焦显微镜检测荧光标记融合肽的细胞内输送
具体实验方法和步骤：
(1)将HCT116细胞培养至对数期，用胰蛋白酶消化后用RPMI1640完全培养基(含10％FBS，1％双抗)将细胞稀释成3×105的细胞密度；
取1块细胞培养用六孔板，每个孔里放置一片细胞爬片，每个板上接种密度3×105的细胞200μl，3～4h后，待细胞贴片后，补加新鲜的RPMI1640完全培养基800μl，继续培养细胞过夜；
(2)待更换新鲜的培养液之后，六孔细胞培养板分别给予荧光标记Gaegurins5-CPP-SA的脂质体制剂和荧光标记的Gaegurins5-CPP-SA溶液20μl，并按照时间点2，8，24h给药：①为融合多肽脂质体组；②为融合多肽原料组；
(3)在各给药时间完成后，首先吸走培养液，PBS将细胞爬片冲洗三次，然后滴加4％多聚甲醛溶液固定细胞，15～20min后，用PBS冲洗三次，然后滴加DAPI染色液染细胞核，20min后，PBS冲洗细胞爬片三次，待片子自然风干后，滴加封片液，等封片液凝固后，在共聚焦荧光显微镜下观察实验结果。
(八)结果分析
2.8.1按表面活性剂透析法制备的脂质体制剂表征如下：
表2-2
表面活性剂透析法制备的脂质体制剂，纳米粒子呈规则的圆球形，粒径分布较均一，分散性较好，包封效果好。
2.8.2冻干稳定性：把上述制剂冻干机冷冻干燥24h，复溶，透析，去除游离，制剂表征如下：
表2-3
脂质体制剂冻干复溶之后，制剂粒径，粒径分布系数，电位，包封率的指标变化均在可接受范围内，即冷冻干燥操作对脂质体各检测指标无明显影响。
2.8.3放置稳定性：把上述制剂4℃短期放置一个星期，透析去除游离，制剂表征如下：
表2-4
脂质体制剂4℃短期放置之后，各制剂的粒径，粒径分布系数，电位几乎无变化，包封率稍有下降，但均在可接受范围内，即脂质体在4℃短期放置是稳定的。
2.8.4融合肽的细胞内输送：
本实施例1号样品的融合肽细胞内输送结果如图1所示，罗丹明B标记的融合肽制备成脂质体制剂后，2h即可进入细胞，可明显的观察到融合肽聚集于细胞，而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比较弱，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成2号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，可明显的观察到融合肽聚集于细胞，而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比较弱，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成3号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，可明显的观察到融合肽聚集于细胞，而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比较弱，直到24h的时候也无较大的变化。
实施例3融合肽HNPs1-CPP-SA及其脂质体制剂
(一)、采用化学合成的方法将人中性粒细胞肽-1(HNPs1)的C端与CPP-SA的N端相连，制备与获得融合肽HNPs1-CPP-SA。HNPs1的氨基序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：Ala-Cys-Tyr-Cys-Arg-Ile-Pro-Ala-Cys-Ile-Ala-Gly-Glu-Arg-Arg-Tyr-Gly-Thr-Cys-Ile-Tyr-Gln-Gl y-Arg-Leu-Trp-Ala-Phe-Cys-Cys。
(二)表面活性剂透析法制备脂质体制剂：
a)制备脂质体混悬液：按配比取各脂质体成分EPC、Chol，混匀，N2吹干得脂质膜，加入5％葡萄糖，以功率80％在40℃条件下超声水合30min，用Extruder过80nm膜21次，得脂质体混悬液；
b)制备融合肽表面活性剂溶液：按配比取融合肽HNPs1-CPP-SA以及表面活性剂n-壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷，在5％葡萄糖水溶液中混合均匀，得融合肽表面活性剂溶液；
c)将c)所得融合肽表面活性剂溶液在40℃下注入b)所得脂质体混悬液中，保温孵育30min，MW10000透析袋4℃透析除去表面活性剂和游离融合肽，得到脂质体制剂。
(三)粒径测定
仪器：动态光散射激光粒度仪和zeta电位分析仪(zetasizer3000)；
条件：设定样品折射率为二氧化硅的折射率(1.59)，分散相为水(折射率1.36，粘度0.8cp)，检测温度25℃，样品检测前于检测腔内温度平衡60秒。激光波长为633nm，折射角为90°；
方法：每个样品取60μl，5％无水葡萄糖溶液稀释13倍，转移至粒径池，每个样品平行测定三次。
(四)包封率测定
3.4.1具体测定方法如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB C18大孔柱，5um，4.6×250mm
流动相：A相：0.1％TFA+2％ACN
B相：0.1％TFA+90％ACN
流速：1mL/min
柱温：38℃
检测波长：220nm
进样体积：20μL
洗脱梯度方式如表3-1：
表3-1 HPLC分析多肽洗脱梯度
3.4.2标准曲线制备：
样品溶剂的制备：将5％葡萄糖与色谱甲醇按1:5混合，即得。
融合肽系列梯度溶液的制备：称取一定量的融合肽，加样品溶剂溶解并制成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、1.5和2mg/mL的溶液。
分别取融合肽系列对照品溶液进样分析，以峰面积对浓度作图，制作标准曲线。
2.4.3.脂质体制剂包封率测定
分别取适量(二)项下所制备的脂质体制剂，以5倍色谱甲醇破乳，按(四)项下所述高效液相的方法进样分析。
(五)冻干前后制剂稳定性结果
对制剂冷冻干燥，复溶，MW10000透析袋透析去除游离，马尔文激光粒度仪表征制剂，5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。
(六)脂质体制剂的短期放置稳定性考察
将制备的脂质体制剂在4℃放置一周，MW10000透析袋，5％葡萄糖溶液透析，去除游离的融合肽，使用马尔文激光粒度仪测定粒径，粒径分布系数和电位，取适量制剂以5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。评估其短期放置稳定稳定性。
(七)聚焦显微镜检测荧光标记融合肽的细胞内输送
具体实验方法和步骤：
(1)将KBv200细胞培养至对数期，用胰蛋白酶消化后用RPMI1640完全培养基(含10％FBS，1％双抗)将细胞稀释成3×105的细胞密度；取1块细胞培养用六孔板，每个孔里放置一片细胞爬片，每个板上接种密度3×105的细胞200μl，3～4h后，待细胞贴片后，补加新鲜的RPMI1640完全培养基800μl，继续培养细胞过夜；
(2)待更换新鲜的培养液之后，六孔细胞培养板分别给予荧光标记HNPs1-CPP-SA的脂质体制剂和荧光标记的HNPs1-CPP-SA溶液20μl，并按照时间点2，8，24h给药：①为融合多肽脂质体组；②为融合多肽原料药组；
(3)在各给药时间完成后，首先吸走培养液，PBS将细胞爬片冲洗三次，然后滴加4％多聚甲醛溶液固定细胞，15～20min后，用PBS冲洗三次，然后滴加DAPI染色液染细胞核，20min后，PBS冲洗细胞爬片三次，待片子自然风干后，滴加封片液，等封片液凝固后，在共聚焦荧光显微镜下观察实验结果。
(八)结果分析
3.8.1按表面活性剂透析法制备的脂质体制剂表征如下：
表3-2
表面活性剂透析法制备的脂质体制剂，纳米粒子呈规则的圆球形，粒径分布较均一，分散性较好，包封效果好。
3.8.2冻干稳定性：把上述制剂冻干机冷冻干燥24h，复溶，透析，去除游离，制剂表征如下：
表3-3
脂质体制剂冻干复溶之后，制剂粒径，粒径分布系数，电位，包封率的指标变化均在可接受范围内，即冷冻干燥操作对脂质体各检测指标无明显影响。
3.8.3放置稳定性：把上述制剂4℃短期放置一个星期，透析去除游离，制剂表征如下：
表3-4
脂质体制剂4℃短期放置之后，各制剂的粒径，粒径分布系数，电位几乎无变化，包封率稍有下降，但均在可接受范围内，即脂质体在4℃短期放置是稳定的。
3.8.4融合肽的细胞内输送：
本实施例1号样品的融合肽细胞内输送结果如图2所示，罗丹明B标记的融合肽制备成脂质体制剂后，2h即可进入细胞，24h时可明显的观察到融合肽聚集于细胞，而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比非常不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成2号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，24h时可明显的观察到融合肽聚集于细胞。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比比较不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成3号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比比较不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
实施例4融合肽ANUP-CPP-MMP-SA及其脂质体制剂
(一)、采用化学合成的方法将抗肿瘤尿蛋白(ANUP)的C端与CPP-MMP-SA的N端相连，制备与获得融合肽ANUP-CPP-MMP-SA。ANUP的氨基序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
Glu-Leu-Lys-Cys-Tyr-Thr-Cys-Lys-Glu-Pro-Met-Thr-Ser-Ala-Ser-Cys-Arg-Thr-Ile-Thr。
(二)表面活性剂透析法制备脂质体制剂：
a)制备脂质体混悬液：按配比取各脂质体成分HSPC、Chol，混匀，N2吹干得脂质膜，加入5％葡萄糖，以功率80％在40℃条件下超声水合30min，用Extruder过80nm膜21次，得脂质体混悬液；
b)制备融合肽表面活性剂溶液：按配比取融合肽ANUP-CPP-MMP-SA以及表面活性剂n-壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷，在5％葡萄糖水溶液中混合均匀，得融合肽表面活性剂溶液；
c)将c)所得融合肽表面活性剂溶液在40℃下注入b)所得脂质体混悬液中，保温孵育30min，MW10000透析袋4℃透析除去表面活性剂n-壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷和游离融合肽，得到脂质体制剂。
(三)粒径测定
仪器：动态光散射激光粒度仪和zeta电位分析仪(zetasizer3000)；
条件：设定样品折射率为二氧化硅的折射率(1.59)，分散相为水(折射率1.36，粘度0.8cp)，检测温度25℃，样品检测前于检测腔内温度平衡60秒。激光波长为633nm，折射角为90°；
方法：每个样品取60μl，5％无水葡萄糖溶液稀释13倍，转移至粒径池，每个样品平行测定三次。
(四)包封率测定
4.4.1具体测定方法如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB C18大孔柱，5um，4.6×250mm
流动相：A相：0.1％TFA+2％ACN
B相：0.1％TFA+90％ACN
流速：1mL/min
柱温：38℃
检测波长：220nm
进样体积：20μL
洗脱梯度方式如表6-1：
表4-1 HPLC分析多肽洗脱梯度
4.4.2标准曲线制备：
样品溶剂的制备：将5％葡萄糖与色谱甲醇按1:5混合，即得。
融合肽系列梯度溶液的制备：称取一定量的融合肽，加样品溶剂溶解并制成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、1.5和2mg/mL的溶液。
分别取融合肽系列对照品溶液进样分析，以峰面积对浓度作图，制作标准曲线。
4.4.3.脂质体制剂包封率测定
分别取适量(二)项下所制备的脂质体制剂，以5倍色谱甲醇破乳，按(四)项下所述高效液相的方法进样分析。
(五)冻干前后制剂稳定性结果
对制剂冷冻干燥，复溶，MW10000透析袋透析去除游离，马尔文激光粒度仪表征制剂，5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。
(六)脂质体制剂的短期放置稳定性考察
将制备的脂质体制剂在4℃放置一周，MW10000透析袋，5％葡萄糖溶液透析，去除游离的融合肽，使用马尔文激光粒度仪测定粒径，粒径分布系数和电位，取适量制剂以5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。评估其短期放置稳定稳定性。
(七)聚焦显微镜检测荧光标记融合肽的细胞内输送
具体实验方法和步骤：
(1)将MHCC97L细胞培养至对数期，用胰蛋白酶消化后用RPMI1640完全培养基(含10％FBS，1％双抗)将细胞稀释成3×105的细胞密度；
取1块细胞培养用六孔板，每个孔里放置一片细胞爬片，每个板上接种密度3×105的细胞200μl，3～4h后，待细胞贴片后，补加新鲜的RPMI1640完全培养基800μl，继续培养细胞过夜；
(2)待更换新鲜的培养液之后，六孔细胞培养板分别给予荧光标记ANUP-CPP-MMP-SA的脂质体制剂和荧光标记的ANUP-CPP-MMP-SA溶液20μl，并按照时间点2，8，24h给药：①为融合多肽脂质体组；②为融合多肽原料组；
(3)在各给药时间完成后，首先吸走培养液，PBS将细胞爬片冲洗三次，然后滴加4％多聚甲醛溶液固定细胞，15～20min后，用PBS冲洗三次，然后滴加DAPI染色液染细胞核，20min后，PBS冲洗细胞爬片三次，待片子自然风干后，滴加封片液，等封片液凝固后，在共聚焦荧光显微镜下观察实验结果。
(八)结果分析
4.8.1按表面活性剂透析法制备的脂质体制剂表征如下：
表4-2
表面活性剂透析法制备的脂质体制剂，纳米粒子呈规则的圆球形，粒径分布较均一，分散性较好，包封效果好。
4.8.2冻干稳定性：把上述制剂冻干机冷冻干燥24h，复溶，透析，去除游离，制剂表征如下：
表4-3
脂质体制剂冻干复溶之后，制剂粒径，粒径分布系数，电位，包封率的指标变化均在可接受范围内，即冷冻干燥操作对脂质体各检测指标无明显影响。
4.8.3放置稳定性：把上述制剂4℃短期放置一个星期，透析去除游离，制剂表征如下：
表4-4
脂质体制剂4℃短期放置之后，各制剂的粒径，粒径分布系数，电位几乎无变化，包封率稍有下降，但均在可接受范围内，即脂质体在4℃短期放置是稳定的。
4.8.4融合肽的细胞内输送：
本实施例1号样品的融合肽细胞内输送结果如图3，发现罗丹明B标记的融合肽制备成脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成2号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成3号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
实施例5融合肽b-MSH-CPP-MMP-SA及其脂质体制剂
(一)、采用化学合成的方法将促黑色素-b(b-MSH)的C端与CPP-MMP-SA的N端相连，制备与获得融合肽b-MSH-CPP-MMP-SA。b-MSH的氨基序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：Ala-Glu-Lys-Lys-Asp-Glu-Gly-Pro-Tyr-Arg-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Ser-Pro-Pro-Lys-Asp。
(二)表面活性剂透析法制备脂质体制剂：
a)制备脂质体混悬液：按配比取各脂质体成分HSPC、Chol，混匀，N2吹干得脂质膜，加入5％葡萄糖，以功率80％在40℃条件下超声水合30min，用Extruder过80nm膜21次，得脂质体混悬液；
b)制备融合肽表面活性剂溶液：按配比取融合肽b-MSH-CPP-MMP-SA以及表面活性剂OG，在5％葡萄糖水溶液中混合均匀，得融合肽表面活性剂溶液；
c)将c)所得融合肽表面活性剂溶液在40℃下注入b)所得脂质体混悬液中，保温孵育30min，MW10000透析袋4℃透析除去表面活性剂OG和游离融合肽，得到脂质体制剂。
(三)粒径测定
仪器：动态光散射激光粒度仪和zeta电位分析仪(zetasizer3000)；
条件：设定样品折射率为二氧化硅的折射率(1.59)，分散相为水(折射率1.36，粘度0.8cp)，检测温度25℃，样品检测前于检测腔内温度平衡60秒。激光波长为633nm，折射角为90°；
方法：每个样品取60μl，5％无水葡萄糖溶液稀释13倍，转移至粒径池，每个样品平行测定三次。
(四)包封率测定
5.4.1具体测定方法如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB C18大孔柱，5um，4.6×250mm
流动相：A相：0.1％TFA+2％ACN
B相：0.1％TFA+90％ACN
流速：1mL/min
柱温：38℃
检测波长：220nm
进样体积：20μL
洗脱梯度方式如表5-1：
表5-1 HPLC分析多肽洗脱梯度
5.4.2标准曲线制备：
样品溶剂的制备：将5％葡萄糖与色谱甲醇按1:5混合，即得。
融合肽系列梯度溶液的制备：称取一定量的融合肽，加样品溶剂溶解并制成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、1.5和2mg/mL的溶液。
分别取融合肽系列对照品溶液进样分析，以峰面积对浓度作图，制作标准曲线。
5.4.3.脂质体制剂包封率测定
分别取适量(二)项下所制备的脂质体制剂，以5倍色谱甲醇破乳，按(四)项下所述高效液相的方法进样分析。
(五)冻干前后制剂稳定性结果
对制剂冷冻干燥，复溶，MW10000透析袋透析去除游离，马尔文激光粒度仪表征制剂，5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。
(六)脂质体制剂的短期放置稳定性考察
将制备的脂质体制剂在4℃放置一周，MW10000透析袋，5％葡萄糖溶液透析，去除游离的融合肽，使用马尔文激光粒度仪测定粒径，粒径分布系数和电位，取适量制剂以5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。评估其短期放置稳定稳定性。
(七)聚焦显微镜检测荧光标记融合肽的细胞内输送
具体实验方法和步骤：
(1)将黑色素细胞培养至对数期，用胰蛋白酶消化后用RPMI1640完全培养基(含10％FBS，1％双抗)将细胞稀释成3×105的细胞密度；
取1块细胞培养用六孔板，每个孔里放置一片细胞爬片，每个板上接种密度3×105的细胞200μl，3～4h后，待细胞贴片后，补加新鲜的RPMI1640完全培养基800μl，继续培养细胞过夜；
(2)待更换新鲜的培养液之后，六孔细胞培养板分别给予荧光标记b-MSH-CPP-MMP-SA的脂质体制剂和荧光标记的b-MSH-CPP-MMP-SA溶液20μl，并按照时间点2，8，24h给药：①为融合多肽原料组；②为融合多肽原料组；
(3)在各给药时间完成后，首先吸走培养液，PBS将细胞爬片冲洗三次，然后滴加4％多聚甲醛溶液固定细胞，15～20min后，用PBS冲洗三次，然后滴加DAPI染色液染细胞核，20min后，PBS冲洗细胞爬片三次，待片子自然风干后，滴加封片液，等封片液凝固后，在共聚焦荧光显微镜下观察实验结果。
(八)结果分析
5.8.1按表面活性剂透析法制备的脂质体制剂表征如下：
表5-2
表面活性剂透析法制备的脂质体制剂，纳米粒子呈规则的圆球形，粒径分布较均一，分散性较好，包封效果好。
5.8.2冻干稳定性：把上述制剂冻干机冷冻干燥24h，复溶，透析，去除游离，制剂表征如下：
表5-3
脂质体制剂冻干复溶之后，制剂粒径，粒径分布系数，电位，包封率的指标变化均在可接受范围内，即冷冻干燥操作对脂质体各检测指标无明显影响。
5.8.3放置稳定性：把上述制剂4℃短期放置一个星期，透析去除游离，制剂表征如下：
表5-4
脂质体制剂4℃短期放置之后，各制剂的粒径，粒径分布系数，电位几乎无变化，包封率稍有下降，但均在可接受范围内，即脂质体在4℃短期放置是稳定的。
5.8.4融合肽的细胞内输送：
本实施例1号样品的融合肽细胞内输送结果显示，罗丹明B标记的融合肽制备成脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成2号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成3号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
实施例6融合肽NPY-CPP-SA及其脂质体制剂
(一)、采用化学合成的方法将神经肽NPY的C端与CPP-SA的N端相连，制备与获得融合肽NPY-CPP-SA。NPY的氨基序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：
Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr。
(二)表面活性剂透析法制备脂质体制剂：
a)制备脂质体混悬液：按配比取各脂质体成分HSPC、Chol，混匀，N2吹干得脂质膜，加入5％葡萄糖，以功率80％在40℃条件下超声水合30min，用Extruder过80nm膜21次，得脂质体混悬液；
b)制备融合肽表面活性剂溶液：按配比取融合肽NPY-CPP-SA以及表面活性剂n-癸基-β-D-麦芽糖苷，在5％葡萄糖水溶液中混合均匀，得融合肽表面活性剂溶液；
c)将c)所得融合肽表面活性剂溶液在40℃下注入b)所得脂质体混悬液中，保温孵育30min，MW10000透析袋4℃透析除去表面活性剂和游离融合肽，得到脂质体制剂。
(三)粒径测定
仪器：动态光散射激光粒度仪和zeta电位分析仪(zetasizer3000)；
条件：设定样品折射率为二氧化硅的折射率(1.59)，分散相为水(折射率1.36，粘度0.8cp)，检测温度25℃，样品检测前于检测腔内温度平衡60秒。激光波长为633nm，折射角为90°；
方法：每个样品取60μl，5％无水葡萄糖溶液稀释13倍，转移至粒径池，每个样品平行测定三次。
(四)包封率测定
6.4.1具体测定方法如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB C18大孔柱，5um，4.6×250mm
流动相：A相：0.1％TFA+2％ACN
B相：0.1％TFA+90％ACN
流速：1mL/min
柱温：38℃
检测波长：220nm
进样体积：20μL
洗脱梯度方式如表4-1：
表6-1 HPLC分析多肽洗脱梯度
6.4.2标准曲线制备：
样品溶剂的制备：将5％葡萄糖与色谱甲醇按1:5混合，即得。
融合肽系列梯度溶液的制备：称取一定量的融合肽，加样品溶剂溶解并制成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、1.5和2mg/mL的溶液。
分别取融合肽系列对照品溶液进样分析，以峰面积对浓度作图，制作标准曲线。
6.4.3.脂质体制剂包封率测定
分别取适量(二)项下所制备的脂质体制剂，以5倍色谱甲醇破乳，按(四)项下所述高效液相的方法进样分析。
(五)冻干前后制剂稳定性结果
对制剂冷冻干燥，复溶，MW10000透析袋透析去除游离，马尔文激光粒度仪表征制剂，5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。
(六)脂质体制剂的短期放置稳定性考察
将制备的脂质体制剂在4℃放置一周，MW10000透析袋，5％葡萄糖溶液透析，去除游离的融合肽，使用马尔文激光粒度仪测定粒径，粒径分布系数和电位，取适量制剂以5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。评估其短期放置稳定稳定性。
(七)聚焦显微镜检测荧光标记融合肽的细胞内输送
具体实验方法和步骤：
(1)将神经细胞培养至对数期，用胰蛋白酶消化后用RPMI1640完全培养基(含10％FBS，1％双抗)将细胞稀释成3×105的细胞密度；
取1块细胞培养用六孔板，每个孔里放置一片细胞爬片，每个板上接种密度3×105的细胞200μl，3～4h后，待细胞贴片后，补加新鲜的RPMI1640完全培养基800μl，继续培养细胞过夜；
(2)待更换新鲜的培养液之后，六孔细胞培养板分别给予荧光标记NPYCPP-SA的脂质体制剂和荧光标记的NPY-CPP-SA溶液20μl，并按照时间点2，8，24h给药：①为融合多肽脂质体组；②为融合多肽原料组；
(3)在各给药时间完成后，首先吸走培养液，PBS将细胞爬片冲洗三次，然后滴加4％多聚甲醛溶液固定细胞，15～20min后，用PBS冲洗三次，然后滴加DAPI染色液染细胞核，20min后，PBS冲洗细胞爬片三次，待片子自然风干后，滴加封片液，等封片液凝固后，在共聚焦荧光显微镜下观察实验结果。
(八)结果分析
6.8.1按表面活性剂透析法制备的脂质体制剂表征如下：
表6-2
表面活性剂透析法制备的脂质体制剂，纳米粒子呈规则的圆球形，粒径分布较均一，分散性较好，包封效果好。
6.8.2冻干稳定性：把上述制剂冻干机冷冻干燥24h，复溶，透析，去除游离，制剂表征如下：
表6-3
脂质体制剂冻干复溶之后，制剂粒径，粒径分布系数，电位，包封率的指标变化均在可接受范围内，即冷冻干燥操作对脂质体各检测指标无明显影响。
6.8.3放置稳定性：把上述制剂4℃短期放置一个星期，透析去除游离，制剂表征如下：
表6-4
脂质体制剂4℃短期放置之后，各制剂的粒径，粒径分布系数，电位几乎无变化，包封率稍有下降，但均在可接受范围内，即脂质体在4℃短期放置是稳定的。
6.8.4融合肽的细胞内输送：
本实施例1号样品的融合肽细胞内输送结果显示，罗丹明B标记的融合肽制备成脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成2号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成3号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
实施例7融合肽Melittin-GGGS-SA及其脂质体制剂
(一)、采用化学合成的方法将蜂毒素Melittin的C端与GGGS-SA的N端相连，制备与获得融合肽Melittin-GGGS-SA。Melittin的氨基序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln。
(二)表面活性剂透析法制备脂质体制剂：
a)制备脂质体混悬液：按配比取各脂质体成分HSPC、Chol，混匀，N2吹干得脂质膜，加入5％葡萄糖，以功率80％在40℃条件下超声水合30min，用Extruder过80nm膜21次，得脂质体混悬液；
b)制备融合肽表面活性剂溶液：按配比取融合肽Melittin-GGGS-SA以及表面活性剂n-正辛基-β-D-吡喃糖苷，在5％葡萄糖水溶液中混合均匀，得融合肽表面活性剂溶液；
c)将c)所得融合肽表面活性剂溶液在40℃下注入b)所得脂质体混悬液中，保温孵育30min，MW10000透析袋4℃透析除去表面活性剂和游离融合肽，得到脂质体制剂。
(三)粒径测定
仪器：动态光散射激光粒度仪和zeta电位分析仪(zetasizer3000)；
条件：设定样品折射率为二氧化硅的折射率(1.59)，分散相为水(折射率1.36，粘度0.8cp)，检测温度25℃，样品检测前于检测腔内温度平衡60秒。激光波长为633nm，折射角为90°；
方法：每个样品取60μl，5％无水葡萄糖溶液稀释13倍，转移至粒径池，每个样品平行测定三次。
(四)包封率测定
7.4.1具体测定方法如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB C18大孔柱，5um，4.6×250mm
流动相：A相：0.1％TFA+2％ACN
B相：0.1％TFA+90％ACN
流速：1mL/min
柱温：38℃
检测波长：220nm
进样体积：20μL
洗脱梯度方式如表4-1：
表7-1 HPLC分析多肽洗脱梯度
7.4.2标准曲线制备：
样品溶剂的制备：将5％葡萄糖与色谱甲醇按1:5混合，即得。
融合肽系列梯度溶液的制备：称取一定量的融合肽，加样品溶剂溶解并制成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、1.5和2mg/mL的溶液。
分别取融合肽系列对照品溶液进样分析，以峰面积对浓度作图，制作标准曲线。
7.4.3.脂质体制剂包封率测定
分别取适量(二)项下所制备的脂质体制剂，以5倍色谱甲醇破乳，按(四)项下所述高效液相的方法进样分析。
(五)冻干前后制剂稳定性结果
对制剂冷冻干燥，复溶，MW10000透析袋透析去除游离，马尔文激光粒度仪表征制剂，5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。
(六)脂质体制剂的短期放置稳定性考察
将制备的脂质体制剂在4℃放置一周，MW10000透析袋，5％葡萄糖溶液透析，去除游离的融合肽，使用马尔文激光粒度仪测定粒径，粒径分布系数和电位，取适量制剂以5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。评估其短期放置稳定稳定性。
(七)聚焦显微镜检测荧光标记融合肽的细胞内输送
具体实验方法和步骤：
(1)将BEL-7402培养至对数期，用胰蛋白酶消化后用RPMI1640完全培养基(含10％FBS，1％双抗)将细胞稀释成3×105的细胞密度；
取1块细胞培养用六孔板，每个孔里放置一片细胞爬片，每个板上接种密度3×105的细胞200μl，3～4h后，待细胞贴片后，补加新鲜的RPMI1640完全培养基800μl，继续培养细胞过夜；
(2)待更换新鲜的培养液之后，六孔细胞培养板分别给予荧光标记Melittin-GGGS-SA的脂质体制剂和荧光标记的Melittin-GGGS-SA溶液20μl，并按照时间点2，8，24h给药：①为融合多肽脂质体组；②为融合多肽原料组；
(3)在各给药时间完成后，首先吸走培养液，PBS将细胞爬片冲洗三次，然后滴加4％多聚甲醛溶液固定细胞，15～20min后，用PBS冲洗三次，然后滴加DAPI染色液染细胞核，20min后，PBS冲洗细胞爬片三次，待片子自然风干后，滴加封片液，等封片液凝固后，在共聚焦荧光显微镜下观察实验结果。
(八)结果分析
7.8.1按表面活性剂透析法制备的脂质体制剂表征如下：
表7-2
表面活性剂透析法制备的脂质体制剂，纳米粒子呈规则的圆球形，粒径分布较均一，分散性较好，包封效果好。
7.8.2冻干稳定性：把上述制剂冻干机冷冻干燥24h，复溶，透析，去除游离，制剂表征如下：
表7-3
脂质体制剂冻干复溶之后，制剂粒径，粒径分布系数，电位，包封率的指标变化均在可接受范围内，即冷冻干燥操作对脂质体各检测指标无明显影响。
7.8.3放置稳定性：把上述制剂4℃短期放置一个星期，透析去除游离，制剂表征如下：
表7-4
脂质体制剂4℃短期放置之后，各制剂的粒径，粒径分布系数，电位几乎无变化，包封率稍有下降，但均在可接受范围内，即脂质体在4℃短期放置是稳定的。
7.8.4融合肽的细胞内输送：
本实施例1号样品的融合肽细胞内输送结果如图4所示，罗丹明B标记的融合肽制备成脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成2号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成3号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
实施例8融合肽Magainin2-GGGS-SA及其脂质体制剂
(一)、采用化学合成的方法将抗肿瘤肽Magainin2的C端与GGGS-SA的N端相连，制备与获得融合肽Magainin2-GGGS-SA。Magainins的氨基序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Asn-S er。
(二)表面活性剂透析法制备脂质体制剂：
a)制备脂质体混悬液：按配比取各脂质体成分HSPC、Chol，混匀，N2吹干得脂质膜，加入5％葡萄糖，以功率80％在40℃条件下超声水合30min，用Extruder过80nm膜21次，得脂质体混悬液；
b)制备融合肽表面活性剂溶液：按配比取融合肽Magainin2-GGGS-SA以及表面活性剂n-壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷，在5％葡萄糖水溶液中混合均匀，得融合肽表面活性剂溶液；
c)将c)所得融合肽表面活性剂溶液在40℃下注入b)所得脂质体混悬液中，保温孵育30min，MW10000透析袋4℃透析除去表面活性剂和游离融合肽，得到脂质体制剂。
(三)粒径测定
仪器：动态光散射激光粒度仪和zeta电位分析仪(zetasizer3000)；
条件：设定样品折射率为二氧化硅的折射率(1.59)，分散相为水(折射率1.36，粘度0.8cp)，检测温度25℃，样品检测前于检测腔内温度平衡60秒。激光波长为633nm，折射角为90°；
方法：每个样品取60μl，5％无水葡萄糖溶液稀释13倍，转移至粒径池，每个样品平行测定三次。
(四)包封率测定
8.4.1具体测定方法如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB C18大孔柱，5um，4.6×250mm
流动相：A相：0.1％TFA+2％ACN
B相：0.1％TFA+90％ACN
流速：1mL/min
柱温：38℃
检测波长：220nm
进样体积：20μL
洗脱梯度方式如表4-1：
表7-1 HPLC分析多肽洗脱梯度
8.4.2标准曲线制备：
样品溶剂的制备：将5％葡萄糖与色谱甲醇按1:5混合，即得。
融合肽系列梯度溶液的制备：称取一定量的融合肽，加样品溶剂溶解并制成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、1.5和2mg/mL的溶液。
分别取融合肽系列对照品溶液进样分析，以峰面积对浓度作图，制作标准曲线。
8.4.3.脂质体制剂包封率测定
分别取适量(二)项下所制备的脂质体制剂，以5倍色谱甲醇破乳，按(四)项下所述高效液相的方法进样分析。
(五)冻干前后制剂稳定性结果
对制剂冷冻干燥，复溶，MW10000透析袋透析去除游离，马尔文激光粒度仪表征制剂，5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。
(六)脂质体制剂的短期放置稳定性考察
将制备的脂质体制剂在4℃放置一周，MW10000透析袋，5％葡萄糖溶液透析，去除游离的融合肽，使用马尔文激光粒度仪测定粒径，粒径分布系数和电位，取适量制剂以5倍甲醇破乳，高效液相测定包封率。评估其短期放置稳定稳定性。
(七)聚焦显微镜检测荧光标记融合肽的细胞内输送
具体实验方法和步骤：
(1)将宫颈癌HeLa细胞培养至对数期，用胰蛋白酶消化后用RPMI1640完全培养基(含10％FBS，1％双抗)将细胞稀释成3×105的细胞密度；
取1块细胞培养用六孔板，每个孔里放置一片细胞爬片，每个板上接种密度3×105的细胞200μl，3～4h后，待细胞贴片后，补加新鲜的RPMI1640完全培养基800μl，继续培养细胞过夜；
(2)待更换新鲜的培养液之后，六孔细胞培养板分别给予荧光标记Magainin2-GGGS-SA的脂质体制剂和荧光标记的Magainin2-GGGS-SA溶液20μl，并按照时间点2，8，24h给药：①为融合多肽脂质体组；②为融合多肽原料组；
(3)在各给药时间完成后，首先吸走培养液，PBS将细胞爬片冲洗三次，然后滴加4％多聚甲醛溶液固定细胞，15～20min后，用PBS冲洗三次，然后滴加DAPI染色液染细胞核，20min后，PBS冲洗细胞爬片三次，待片子自然风干后，滴加封片液，等封片液凝固后，在共聚焦荧光显微镜下观察实验结果。
(八)结果分析
8.8.1按表面活性剂透析法制备的脂质体制剂表征如下：
表8-2
表面活性剂透析法制备的脂质体制剂，纳米粒子呈规则的圆球形，粒径分布较均一，分散性较好，包封效果好。
8.8.2冻干稳定性：把上述制剂冻干机冷冻干燥24h，复溶，透析，去除游离，制剂表征如下：
表8-3
脂质体制剂冻干复溶之后，制剂粒径，粒径分布系数，电位，包封率的指标变化均在可接受范围内，即冷冻干燥操作对脂质体各检测指标无明显影响。
8.8.3放置稳定性：把上述制剂4℃短期放置一个星期，透析去除游离，制剂表征如下：
表8-4
脂质体制剂4℃短期放置之后，各制剂的粒径，粒径分布系数，电位几乎无变化，包封率稍有下降，但均在可接受范围内，即脂质体在4℃短期放置是稳定的。
8.8.4融合肽的细胞内输送：
本实施例1号样品的融合肽细胞内输送结果显示，罗丹明B标记的融合肽制备成脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成2号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
罗丹明B标记的融合肽制备成3号脂质体制剂后，2h即可进入细胞，在核周围分散，24h时可明显的观察到融合肽聚集于核周围，并部分进入核内。而原料组融合肽虽然也可隐约观察到荧光，但是跟融合肽脂质体制剂同一时间点相比不明显，直到24h的时候也无较大的变化。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (26)

1.一种硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，包括硬脂酸和细胞穿膜肽，所述硬脂酸修饰于细胞穿膜肽上。
2.根据权利要求1所述的硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，其特征在于，所述硬脂酸与细胞穿膜肽之间通过酰胺键连接。
3.根据权利要求1所述的硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，其特征在于，所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽为CPP-SA，所述CPP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，硬脂酸SA修饰于所述CPP的C端。
4.根据权利要求3所述的硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，其特征在于，硬脂酸SA的羧基与所述CPP的C端的赖氨酸的侧链氨基连接。
5.根据权利要求3所述的硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，其特征在于，硬脂酸修饰的细胞穿膜肽CPP-SA的结构式如式(1)所示。
6.根据权利要求1所述的硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，其特征在于，所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽为CPP-MMP-SA，所述CPP-MMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，硬脂酸SA修饰于所述CPP-MMP的C端。
7.根据权利要求6述的硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，其特征在于，硬脂酸SA的羧基与所述CPP-MMP的C端的赖氨酸的侧链氨基连接。
8.根据权利要求6述的硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，其特征在于，硬脂酸修饰的细胞穿膜肽CPP-MMP-SA的结构式如式(2)所示。
9.根据权利要求1所述的硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，其特征在于，所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽为GGGSK-SA，硬脂酸SA修饰于所述GGGSK的C端。
10.根据权利要求9所述的硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，其特征在于，硬脂酸SA的羧基与所述GGGSK的C端的赖氨酸的侧链氨基连接。
11.根据权利要求9所述的硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，其特征在于，硬脂酸修饰的细胞穿膜肽GGGSK-SA的结构式如式(3)所示。
12.如权利要求1～11任一权利要求所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽在输送多肽进入细胞中的用途。
13.如权利要求1～11任一权利要求所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽在制备融合肽中的用途。
14.一种融合肽，包括多肽和如权利要求1～11任一权利要求所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽，所述多肽的C端与所述硬脂酸修饰的细胞穿膜肽的N端连接。
15.根据权利要求14所述的融合肽，其特征在于，所述多肽含有1～50个氨基酸。
16.一种脂质体制剂，含有如权利要求14或15所述的融合肽和脂质体载体。
17.如权利要求16所述的脂质体制剂，其特征在于，融合肽与脂质体之间的摩尔比例范围是1:(1～10)。
18.如权利要求16所述的脂质体制剂，其特征在于，所述脂质体的组成成分选自蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂、胆固醇、二油氧基丙基三甲基氯化铵(DOTAP)、二油酰氯丙基氯化三甲铵(DOTMA)、双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)、二甲基胺乙基胺基丙酰基-胆固醇(DC-Chol)、精胺-5-羧基氨基乙酸二十八烷基酰胺(DOGS)、二油酰琥珀酰甘油胆碱酯(DOSC)、二油酰氯精胺羧基酰胺乙基二甲基丙基三氟乙酸铵(DOSPA)、MVL5中的任一种或它们的两种或两种以上的组合。
19.如权利要求16所述的脂质体制剂，其特征在于，所述脂质体的组成成分选自大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂、胆固醇。
20.如权利要求16～19任一权利要求所述脂质体制剂的制备方法，为表面活性剂透析法。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备脂质体混悬液：按配比取各脂质体成分，混匀，得脂质膜，加入水合液，水合，得脂质体混悬液；
(2)制备多肽表面活性剂溶液：按配比取融合肽以及表面活性剂，混匀，得多肽表面活性剂溶液；
(3)制备脂质体制剂：将步骤(2)所得多肽表面活性剂溶液加入到步骤(1)所得脂质体混悬液中，混匀，孵育，透析去除表面活性剂及游离融合肽，得脂质体制剂。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述融合肽与脂质体总成分之间的摩尔比例范围是1:(1～10)。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述融合肽与表面活性剂之间的摩尔比例范围是1：(5～50)。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水合液选自质量体积浓度为5％的葡萄糖水溶液。
25.如权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂。
26.如权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述表面活性剂选自n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-癸基-β-D-麦芽糖苷。
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