CN105377297A - 用于蛋白质药物失活的抗体锁扣 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够在目标细胞或组织中被选择性激活以治疗其中的状况的铰链抗体。该铰链抗体包括功能性抗体、两个抑制性结构域以及四个可裂解的接头。所述功能性抗体在激活状态下能够治疗所述状况，其具有两条轻链和两条重链。每个抑制性结构域含有免疫球蛋白的铰链区，且由两个肽臂组成。每个可裂解的接头含有可被在目标细胞或组织中特异性或高度表达的酶裂解的肽底物，且连接所述抑制性结构域的所述肽臂中的一个至所述功能性抗体的所述轻链和所述重链中的一个的N末端。本发明还公开了制备和使用该铰链抗体的方法。

Description

用于蛋白质药物失活的抗体锁扣

技术领域

本发明内容通常涉及一种用作治疗多种医学状况的治疗剂的抗体靶向(antibody-based)分子。更具体地，本发明内容涉及铰链抗体，所述铰链抗体在目标细胞或组织中被选择性激活，以治疗其中的医学状况。

背景技术

抗体靶向治疗剂，包括单克隆抗体，是作为有效治疗多种疾病的主要类别的药物中的一种出现的。在2012年，全球销量前10的药物中，5种是治疗性抗体，包括HUMIRA^TM，REMICADE^TM，RITUXAN^TM，HERCEPTIN^TM和AVASTIN^TM。该5种药物在全球的总收入达到约450亿美元，接近该年全球抗体靶向治疗剂市场的60％。当现有的产品扩宽它们的批准使用范围，且新的准入者进入市场时，全球市场有望于持续增长。

尽管该领域持续发展，要给市场带来更有效更负担得起的抗体靶向候选物仍然有许多挑战。目前抗体靶向治疗剂相关的一大问题是：作用位点的弱选择性。单克隆抗体和可溶性蛋白能够特异性结合且中和它们意向的目标分子(例如，抗原和细胞表面受体)。但是，大部分目标分子对疾病位点是非特异的，它们可能存在于除了疾病位点之外的细胞或组织。因此，这些治疗剂可能在那些非病的正常细胞或组织发生作用。这些脱靶作用可能导致不想要的副作用。因此，期望发展高精准性的抗体靶向治疗剂。

避免脱靶作用和提高选择性的一个可能的方案是提供可在目标位点激活的前抗体(pro-antibody)。例如，专利号为No.8,399,219的美国专利以及公开号为No.2010/0189651的美国专利申请公开了一种蛋白酶激活的抗体，该抗体通过肽饰(peptidemask)或修饰部分(maskingmoiety)进行了修饰。在这些申请文件中，采用了噬菌体展示技术筛选能够抑制/减弱功能性抗体与其结合靶标的结合的肽或部分。但是，采用这些方法获得的修饰部分不能广泛用于所有抗体，因为它们是基于其对特异性靶标的抑制能力而确定的。因此，针对这些方法有必要发展一种能用于每种抗体靶向治疗剂的修饰部分，这是非常耗时、昂贵和复杂的。此外，修饰部分的引入给受试者带来了诱导不必要的免疫应答的风险。

公开号为No.2010/0189727的美国专利申请公开了一种类似方法，该方法提供了一种非共价结合到抗体的抗原结合位点的修饰配体，以使所述抗体失活。特别地，该修饰配体含有2个拷贝的与抗体特异性结合的抗原表位和连接至所述表位的每个拷贝的可裂解多肽可裂解接头。类似于上述噬菌体展示技术，该修饰配体也需要根据每种抗体进行特别设计，因此，这种失活抗体的发展也是非常耗时和非常高成本的。进一步地，由于这种修饰配体对治疗性抗体具有高亲和力，在可裂解多肽可裂解接头裂解后，某些修饰配体可能会结合到抗体上。这些残留的修饰配体可能阻碍抗体的治疗性作用。

鉴于上述内容，本领域存在提供下一代治疗剂的需要，该治疗剂被精心设计和处理，以具有，例如，改善的作用位点选择性以及增强的效力等特性。进一步地，这些设计和处理方案将应用于多种抗体靶向治疗剂，且不会引起不需要的免疫应答。

发明内容

接下来对本发明内容进行简单的概述，为读者提供基本的理解。该概述并非是本发明内容广泛的综述，也没有定义本发明的关键/决定性要素，或描绘本发明的保护范围。该概述唯一的目的在于以简单的形式呈现本文中公开的一些概念，作为之后更加详细的描述的前奏。

一方面，本发明意在一种铰链抗体。该抗体靶向的治疗剂能够在目标细胞或组织中被选择性激活，以治疗目标细胞或组织中的状况。

根据本发明的各种实施例，铰链抗体含有功能性抗体，两个抑制性结构域以及四个可裂解的接头。所述功能性抗体在激活状态下能够治疗状况，其具有两条轻链和两条重链。两个抑制性结构域中每一个均由通过二硫键相互连接的两个肽臂组成。每个抑制性结构域由两个通过二硫键相互连接的肽臂组成。四个可裂解的接头中的每一个含有被在目标细胞或组织中特异性或高度表达的酶裂解的肽底物。每个可裂解的接头连接所述两个抑制性结构域的两个肽臂中的一个至功能性抗体的两条轻链和两条重链中的一个的N末端。

根据本发明的某些实施例，两个抑制性结构域中的每一个均是免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白D(IgD)或免疫球蛋白G(IgG)的铰链区或铰链区的片段。例如，抑制性结构域可能包括以下序列中的任一种序列：IgG的SEQIDNos.10，11，12，13；IgA的SEQIDNos.14，15；以及IgD的SEQIDNos.54，55。

在可选的实施例中，功能性抗体是anti-TNF-α抗体，anti-RANKL抗体，anti-CTLA-4抗体，anti-HER2抗体，anti-EGFR抗体，anti-VEGF抗体，anti-VEGFR2抗体，anti-IL6R抗体，anti-IL12/23抗体，anti-CD3抗体，anti-CD11a抗体，anti-CD20抗体，anti-CD25抗体，anti-CD30抗体，anti-CD33抗体或anti-CD52抗体。例如，功能性抗体的轻链的氨基酸序列是SEQIDNos.1，2，3，4，5，6，7，8和9中任一种氨基酸序列；而功能性抗体的重链的氨基酸序列是SEQIDNos.58，59，60，61，62，63，64，65和66中的任一种氨基酸序列。

在某些实施例中，所述肽底物被以下任一种酶裂解：基质金属蛋白酶(MMP)，组织蛋白酶(CTS)，半胱天冬酶(CASP)或整合素样金属蛋白酶(ADAM)。例如，根据一些实施例，酶是MMP-2或MMP-9，每个可裂解的接头包含氨基酸序列SEQIDNo.6。

根据本发明的某些实施例，功能性抗体是anti-TNF-α抗体，其具有含有氨基酸序列SEQIDNo.1的轻链和含有氨基酸序列SEQIDNo.58的重链，每个可裂解的接头包括氨基酸序列SEQIDNo.16；每个抑制性结构域含有氨基酸序列SEQIDNo.10。

在另一方面，本发明意在产生本发明上述方面/实施例中的铰链抗体的表达系统。

根据本发明的多个实施例，用于产生铰链抗体的表达系统包括第一核酸序列和第二核酸序列。第一核酸序列，从5’到3’端包括第一抑制性结构域编码区，第一可裂解的接头编码区以及轻链编码区。所述第一抑制性结构域编码区编码上述任一铰链抗体的抑制性结构域的第一肽臂。第一可裂解的接头编码区编码上述铰链抗体的可裂解的接头，所述可裂解的接头是可被在目标细胞或组织中特异性或高度表达的酶裂解的肽底物。轻链-编码区编码上述铰链抗体的功能性抗体的轻链，其中所述功能性抗体在激活状态下能够治疗状况。第二核酸序列，从5’到3’端包括第二抑制性结构域编码区，第二可裂解的接头编码区以及重链-编码区。所述第二抑制性结构域编码区编码铰链抗体的抑制性结构域的第二肽臂。第二可裂解的接头编码区编码铰链抗体的可裂解的接头。重链编码区编码铰链抗体的功能性抗体的重链。

在本发明的某些可选实施例中，第一和第二核酸序列可以在单一表达载体中构建。例如，表达系统可能进一步包括连接核酸序列，所述连接核酸序列连接所述第一核酸序列和第二核酸序列。连接核酸序列的非限制性实施例包括编码Furin-2A多肽的序列或编码内部核糖体进入位点(IRES)序列的序列。

在第一和第二核酸序列是在单一表达载体中构建的情况下，表达系统可能进一步可选地包括可操作地连接到第一核酸性序列和第二核酸序列的调控序列，以调控第一核酸序列、第二核酸序列以及可选的连接核酸序列在宿主细胞中的翻译。任选地，表达系统可能包括至少两段分别可操作地连接到第一和第二核酸性序列的调控序列，以分别调控第一和第二核酸序列的表达。

在一些其他实施例中，第一和第二核酸序列可能在两个单独的表达载体中构建。例如，第一核酸序列与可操控地连接的第一调控序列一起在第一表达载体中构建，而第二核酸序列与可操控地连接的第二调控序列一起在第二表达载体中构建。第一和第二表达载体随后被转移到相同的宿主细胞或不同的宿主细胞中，并在相同的宿主细胞或不同的宿主细胞中表达。

根据本发明的某些实施例，抑制性结构域是免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白D(IgD)或免疫球蛋白G(IgG)的铰链区或铰链区的片段。

根据本发明的多个实施例，表达载体编码上述铰链抗体中的任一种。例如，当表达系统是通过单一构建体进行时，该构建体的核酸序列可以是SEQIDNos.17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49和50中的任一种。在表达载体是以两个载体(或两个质粒)系统进行的情况下，第一核酸序列是SEQIDNos.67，69，71，73，75和77中的任一种；而第二核酸序列是SEQIDNos.68，70，72，74，76和78中的任一种。

在另一方面，本发明意在一种适用于制备本发明上述方面/实施例的铰链抗体的重组载体。

根据本发明的某些实施例，重组载体包括根据本发明上述方面/实施例的人工合成核酸和一段或多段可操控地连接所述人工合成核酸分子的调控序列，从而使得所述载体在合适的条件和在合适的宿主细胞中能够表达本发明上述方面/实施例的铰链抗体。

在再一方面，本发明意在一种治疗受试者，尤其是患有癌症或自身免疫疾病的受试者的方法。

根据本发明的一些实施例，该方法包括给受试者施用有效治疗剂量的本发明上述方面/实施例的铰链抗体。例如，所述铰链抗体可以口服，皮下注射，静脉内注射，鞘内注射或肌内注射给药给受试者。

参考以下具体描述和附图，将会更好地理解本发明的许多所附特性和优势。

附图说明

通过以下根据附图所理解到的详细描述将会更好地理解本说明书，其中：

图1是描述本发明某些实施例的铰链抗体的结构的示意图；

图2是描述本发明实施例的铰链抗体的设计方案的示意图；

图3是描述编码本发明某些实施例的铰链抗体的核酸分子的示意图；

图4是描述本发明一个实施例的铰链抗体的总体结构的示意图；

图5是本发明的一个作用实施例的SDSPAGE凝胶图谱；

图6是本发明的一个作用实施例的两个SDSPAGE凝胶图谱；

图7是描述本发明的一个作用实施例的各种抗体的结合能力的柱状图；

图8是描述本发明的一个作用实施例的TNF-α信号的柱状图；

图9是描述本发明的另一个作用实施例的各种抗体的结合能力的柱状图；

图10是描述本发明的另一个作用实施例的各种抗体的结合能力的柱状图；

图11提供了描述本发明的一个实施例中铰链-αEGFR抗体在小鼠肿瘤位点体内定位和激活的照片；

图12是指示铰链-TNFα抗体对胶原蛋白诱导的关节炎的消炎效果的线状图表。

依据常规实践，各种描述的特征/要素并不是为了标示范围，而是为了最好地标示本发明相关的特定特征/要素。而且，各个附图中的附图标记和名称也用于指示类似的要素/部分。

具体实施方式

以下提供的与附图相关的详细描述意在作为本发明实施例的描述，并不意在表示本发明实施例仅仅只能通过一种形式进行或利用。该描述阐述了实施例的作用，进行和操作实施例的步骤顺序。但是，不同的实施例可能伴随着相同或等同的作用和顺序。

为了方便起见，本说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语在此被统一。除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的常规理解相同的含义。

除非另有说明，本发明所采用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员常规理解和使用含义。除非上下文需要，应该理解单数术语包括同一术语的复数形式，复数形式也包括单数形式。特别是，在本说明书和权利要求书中，单数形式的“一”“一个”包括复数形式，除非上下文有明确指出。而且，在本说明书和权利要求书中，术语“至少一个”和“一个或多个”具有相同的含义，包括一个、两个或多个。

尽管阐述本发明保护范围的数值范围和参数是近似值，在特定实施例中阐述的数值已尽可能精确地报道。但是，任何数值固有地必定具有一定的误差，这些误差来源于各自测试计量中存在的标准偏差。而且，本发明所用的术语“约”通常意味着在给定数值或范围内10％，5％，1％或0.5％。可选地，从本领域普通技术人员的角度考虑，术语“约”意味着可接受的平均数标准偏差

术语“抗体靶向的治疗剂”意在表示抑制内源性人体蛋白的药理作用或病原体的治疗剂。当以治疗有效量呈现时，所述的“治疗剂”在受试者身上产生期望的治疗效果。出于本发明的目的，抗体靶向的治疗剂包括高度特异性结合并中和其意向目标分子的抗体和融合蛋白。

本文中所使用的术语“抗体”包括全长抗体和任意的抗原结合片段或其单链。每个抗体的基本功能单元是免疫球蛋白单体，该单体是由通过二硫键相互连接的两条重链和两条轻链构成的Y型分子。“功能性抗体”包括全长抗体或该抗体的一个或多个维持其特异结合能力的片段；该功能片段的实施例包括Fab(抗原结合片段)，Fv(可变片段)，F(ab′)₂，Fab′，scFv(可变的单链片段)等等。抗体可以是单克隆或多克隆抗体，可以是人类或非人类来源抗体，或嵌合蛋白。

在本文中，“可裂解的接头”是可以被酶裂解的肽底物。至关重要地，该可裂解的接头一旦被酶裂解，本发明的铰链抗体被激活。优选地，选择可裂解的接头，以使得激活发生在期望的作用位点，可以是位于目标细胞(例如，癌细胞)或组织内的位点，或接近目标细胞或组织的位点。例如，可裂解的接头是对在作用位点特性性或高度表达的酶特异的肽底物，以使得可裂解的接头在目标位点的裂解速率高于在目标位点之外的位点的速率。

术语“配体”是指任何特异性结合或反应性关联或络合受体、底物、抗原决定簇的分子，或目标细胞或组织上其它结合位点。配体的实施例包括抗体和其片段(例如，单克隆抗体或其片段)，酶类(例如，纤维蛋白溶解酶)，生物应答调节剂(例如，白细胞介素，干扰素，红细胞生成素或集落刺激因子)，肽激素以及其抗原结合片段。

在本文中，术语“核酸”是指单链或双链RNA，mRNA和DNA，包括cDNA和基因组DNA。除非另有说明，特定的核酸序列也暗示着包括保守修饰变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。另外，单链多核酸序列的左手端是5′端；双链多核酸序列的左手方向称为5′方向，除非另有规定。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，表示氨基酸残基的聚合物。这些术语还包括术语“抗体”。术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。根据标准用法和惯例，在本文所用的多肽注释中，左手方向是氨基(N)-末端方向，右手方向是羧基(C)-末端方向。

在整个本发明中，术语“合成”核酸或氨基酸是指并非在自然界中发现的核酸或氨基酸序列。由方法设计的合成序列可以以任何形式(例如，纸质或计算机可读)包括在本发明中，且是物理性创建的核酸或多肽。本发明的物理性创建的核酸和多肽是本发明的一部分，不管是直接来源于所设计的序列，还是该序列的拷贝(例如，通过PCR、质粒复制、化学合成等产生的拷贝)。术语“合成核酸”可以包括，例如，完全源自或设计自人工氨基酸序列的核酸序列，或与天然存在的序列相比具有单个或多个核苷酸改变的核酸序列，通过随机或定向诱变产生的核酸序列，通过化学合成产生的核酸序列，通过DNA改组方法产生的核酸序列，通过DNA重组方法产生的核酸序列，或通过本领域技术人员任何已知的方法产生的核酸序列。在不改变由核酸序列编码的氨基酸序列的情况下，可以进行这样的改变，或者这样的改变可以调节氨基酸序列，使得编码的蛋白质的功能不发生改变或被增强。

在本文中，术语“载体”是指用于传递遗传物质至宿主细胞的物质的组合物(例如，噬菌体，质粒，病毒载体以及人工染色体，例如，细菌或酵母人工染色体)。载体可以由DNA或RNA构成。载体可以通过本领域公知的各种技术被引入到宿主细胞。载体的调控序列是可操控地连接到载体上的目标基因产物的表达必需的核酸序列。本文所用的术语“可操作地连接”是指调控核酸和感兴趣的核酸连接，使得感兴趣的核酸的表达可以通过调控核酸控制，即调控核酸序列应功能性地连接到待表达的核酸序列。因此，调控核酸序列和待表达的核酸序列可以物理性地彼此连接，例如，通过在待表达的核酸序列的5’端插入调控核酸序列。可选地，调控核酸序列和待表达核酸序列可能仅仅物理性接近，以使得调控核酸序列能够控制至少一个目标核酸序列的表达。优选地，调控核酸序列和待表达核酸序列被隔离不超过500bp，300bp，100bp，80bp，60bp，40bp，20bp，10bp或5bp。

本文中所用的术语“治疗”是指将本发明的铰链抗体应用于或给药给受试者，所述受试者具有医学状况、状况症状、继发于状况的疾病或紊乱、或状况倾向性，其目的是部分或完全减轻、改善、缓解特定疾病、紊乱和/或状况，延迟特定疾病、紊乱和/或状况的发作，抑制特定疾病、紊乱和/或状况的发展，降低特定疾病，紊乱和/或状况的严重程度，和/或减少特定疾病，紊乱和/或状况的一种或多种症状或特性的发生率。通常，“治疗”不仅包括症状的改善或疾病标志的降低，还包括停止或减慢在不进行治疗时可以预期的症状进展或恶化。有益的或期望的临床结果包括，但不限于，减轻一种或多种症状，减小疾病的程度，稳定(即不恶化)疾病状态，延迟或减慢疾病发展，改善或延缓疾病状态，以及缓解(无论是部分还是全部)疾病状态，无论是可检测的还是不可检测的。

本文所用的术语“有效量”是指足以产生所希望的治疗反应的组分的量。治疗有效量也指化合物或组合物的任何毒性或有害作用被有益治疗效果盖过。具体的有效量或足量将随着，例如，被治疗的具体病症，患者的身体状况(例如，患者的体重，年龄或性别)，所治疗的哺乳动物或动物的类型，治疗的持续时间，并行治疗的性质(如果有的话)，以及所采用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构这些因素而变化。有效量可以以，例如，克，毫克或微克或毫克每千克体重(mg/kg)表示。

术语“受试者”是指包括人类在内的被本发明的铰链抗体和/或方法治疗的哺乳动物。术语“受试者”意在指雄性和雌性性别，除非某一性别被特别指明。

本发明是针对能够在目标细胞或组织中选择性激活的铰链抗体。用于制备本发明铰链抗体的方法和物质组合物(例如，核酸序列和载体)、包括铰链抗体的药物组合物以及使用该铰链抗体的治疗方法均落入本发明的保护范围。

图1是描述本发明某些实施例中铰链抗体100的一般结构的示意图，图2是描述铰链抗体100的设计方案和作用机制的示意图。如图1所示，铰链抗体100包括功能性抗体110，两个抑制性结构域120，以及四个连接抑制性结构域120到功能性抗体110的可裂解的接头130。参考图2，处于原始未被裂解形式时，针对目标配体(L)的铰链抗体100的结合能力基本被抑制(未激活)。一旦铰链抗体100被给药给受试者，到达目标位点，在目标位点特异性或高度表达的酶(E)将会在可裂解的接头130处裂解铰链抗体100。铰链抗体100的酶裂解从铰链抗体100中去除抑制性结构域120，导致功能性抗体110具有与配体(L)的结合亲和力。因此，功能性抗体110的治疗作用可以在疾病位点恢复。

回过头看图1，功能性抗体110是全长抗体，或包括一个或多个在激活状态下治疗状况的抗体的功能性片段。在结构上，功能性抗体110包括通过二硫键连接的两条轻链112和两条重链114。特别地，两条重链114通过在铰链区的一个或多个二硫键116连接。

优选地，功能性抗体110是用于治疗受试者体内一种或多种状况的治疗性抗体。功能性抗体110可以是全长治疗性抗体或其功能片段。功能性抗体110的非限制性实施例包括：抗肿瘤坏死因子α(anti-TNF-α)的抗体(例如，英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumabpegol)和戈利木单抗(golimumab))，抗NFκb配体受体激活剂(anti-RANKL)的抗体(例如，狄诺塞麦单抗(denosumab))，抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4((anti-CTLA-4)的抗体(例如，tremelimumab和易普利姆玛单抗(ipilimumab))，抗人表皮生长因子受体(anti-HER2)的抗体(例如，帕妥珠单抗(pertuzumab)，曲妥单抗(trastuzumab)和曲妥珠单抗(trastuzumabemtansine))，抗表皮生长因子受体(anti-EGFR)的抗体(例如，帕尼单抗(panitumumab)，西妥昔单抗(cetuximab)，扎妥木单抗(zalutumumab)和necitumumab)，抗血管内皮细胞生长因子(anti-VEGF)的抗体(例如，贝伐单抗(bevacizumab)和雷珠单抗(ranibizumab))，抗血管内皮细胞生长因子受体2(anti-VEGFR2)的抗体(例如，雷莫芦单抗(ramucirumab))，抗白介素6受体(anti-IL6R)的抗体(例如，Regeneron和托珠单抗(tocilizumab))，抗白介素12/23(anti-IL12/23)的抗体(例如，ustekinumab和briakinumab)，抗分化抗原簇3(anti-CD3)的抗体(例如，otelixizumab，teplizumab和莫罗单抗CD3(muromonab-CD3))，抗CD11a的抗体(例如，依法利珠单抗(efalizumab))，抗CD20的抗体(例如，obinutuzumab，ofatumumab，托西莫单抗-I131(tositumomab-i131)，替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)和利妥昔单抗(rituximab))，抗CD25(也称为anti-IL2R)的抗体(例如，巴利昔(basiliximab)和达利珠单抗(daclizumab))，抗CD30的抗体(例如，brentuximabvedotin)，抗CD33的抗体(例如，吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)))和抗CD52的抗体(例如，阿仑单抗(alemtuzumab))。应当注意的是，这并非适用于在本文描述的功能性抗体110的治疗性抗体的详尽无遗的清单，而且，其他具有上述结构的抗体也同样可应用于本发明。

可被一种或多种上述治疗性抗体治疗的疾病或医学状况包括，但不限于，晚期黑素瘤(例如，通过易普利姆玛治疗)，骨质流失(例如，通过狄诺塞麦治疗)，乳腺癌(例如，通过曲妥珠单抗、曲妥单抗，帕妥珠单抗或雷莫芦单抗治疗)，慢性淋巴细胞性白血病(例如，通过obinutuzumab或ofatumumab治疗)，结肠直肠癌(例如通过帕尼单抗，西妥昔单抗或贝伐单抗治疗)，克罗恩病(例如，通过英利昔单抗或赛妥珠单抗治疗)，胃或胃食管交界处腺癌(例如，通过雷莫芦单抗治疗)，头颈部肿瘤(例如，通过扎妥木单抗治疗)，肝癌(例如，通过雷莫芦单抗治疗)，霍奇金淋巴瘤(例如，通过brentuximabvedotin治疗)，黄斑变性(例如，通过兰尼单抗治疗)，转移性黑色素瘤(例如，通过tremelimumab治疗)，粒细胞性白血病(例如，通过吉姆单抗奥佐米星或阿仑单抗治疗)，非霍奇金淋巴瘤(例如，通过托西莫单抗-I131、替伊莫单抗或利妥昔单抗治疗)，非小细胞肺癌(例如，通过necitumumab治疗)，银屑病(例如，通过依法利珠单抗治疗)，牛皮癣(例如，通过ustekinumab或briakinumab治疗)，逆转或预防肾脏移植排斥反应(例如，通过莫罗单抗CD3、巴利昔单抗或达利珠单抗治疗)，类风湿关节炎(例如，通过托珠单抗、戈利木单抗或阿达木单抗治疗)和1型糖尿病(例如，通过otelixizumab或teplizumab治疗)。

在某些实施例中，功能性抗体110是具有氨基酸序列SEQIDNo.1(例如，英夫利昔轻链)和氨基酸序列SEQIDNo.58(例如，英夫利昔重链)的anti-TNF-α抗体，具有氨基酸序列SEQIDNo.2(例如，帕尼单抗轻链)和氨基酸序列SEQIDNo.59(例如，帕尼单抗重链)的anti-EGFR抗体，具有氨基酸序列SEQIDNo.3(例如，曲妥单抗轻链)和氨基酸序列SEQIDNo.60(例如，曲妥单抗重链)的anti-HER2抗体，具有氨基酸序列SEQIDNo.4(例如，阿达木单抗轻链)和氨基酸序列SEQIDNo.61(例如，阿达木单抗重链)的anti-TNF-α抗体，具有氨基酸序列SEQIDNo.5(例如，迪诺塞麦单抗轻链)和氨基酸序列SEQIDNo.62(例如，迪诺塞麦单抗重链)的anti-RANKL抗体，具有氨基酸序列SEQIDNo.6(例如，易普利姆玛单抗轻链)和氨基酸序列SEQIDNo.63(例如，易普利姆玛单抗重链)的anti-CTLA-4抗体，具有氨基酸序列SEQIDNo.7(例如，tremelimumab(亦称ticilimumab)轻链)和氨基酸序列SEQIDNo.tremelimumab(例如，tremelimumab重链)的anti-CTLA-4抗体，具有SEQIDNo.8(例如，依法利珠轻链)和氨基酸序列SEQIDNo.65(例如，依法利珠重链)的anti-CD11a抗体，或具有SEQIDNo.9(例如，ustekinumab轻链)和氨基酸序列SEQIDNo.66(例如，ustekinumab重链)的anti-IL12/23抗体。

如图1所示，每个抑制性结构域120由两个肽臂122组成。在该描述性实施例中，两个肽臂122通过二硫键124相互连接，但是，本发明并不限于此。根据本发明的某些实施例，抑制性结构域120是免疫球蛋白的铰链区的一部分，或包括免疫球蛋白的铰链区的一部分，例如，免疫球蛋白A(IgA)，免疫球蛋白D(IgD)或免疫球蛋白G(IgG)。根据本发明的多个实施例，IgA是IgA1(SEQIDNo.14)或IgA2(SEQIDNo.15)；IgG是IgG1(SEQIDNo.10)，IgG2(SEQIDNo.11)，IgG3(SEQIDNo.12)或IgG4(SEQIDNo.13)；而IgD是IgD1(SEQIDNo.54)或IgD2(SEQIDNo.55)。

抑制性结构域120的铰链结构连接在功能性抗体110上时，在空间上掩盖了功能性抗体110的配体结合位点。因此，在未裂解状态，铰链抗体100显示轻微的(如果有的话)与意向配体的相互作用。根据本文提供的作用实施例，在未裂解状态，功能性抗体110与其配体的结合亲和力被减弱至少约70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，甚至100％。

根据本发明的多个实施例，当功能性抗体110被连接到抑制性结构域120时，在意向配体存在的情况下，功能性抗体110与其配体不会结合，或几乎不会结合，或与功能性抗体110没有被连接到抑制性结构域120时相比，功能性抗体110与其配体的结合不超过0.001％，0.02％，0.1％，1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％或30％。

抑制性结构域120的其他优势取决于其通用适用性。应该被理解的是，抑制性结构域120的设计并不是基于其与功能性抗体110和/或功能性抗体110的意向配体的特定相互作用，因此，其抑制活性并不依赖于功能性抗体110。而且，大部分治疗性抗体具有共同和类似的骨架，便于抑制性结构域120结合到其上。

除了所期望的抑制活性和通用适用性，本发明的抑制性结构域120还具有源自免疫球蛋白的铰链区的优势。因此，不像现有技术中的外源修饰配体，本发明的抑制性结构域不会引起受试者体内不想要的免疫应答。

抑制性结构域120通过可裂解的接头130连接到功能性抗体。具体地，四个可裂解的接头130中的每一个连接两个抑制性结构域120的两个肽臂122中的一个至功能性抗体110的两条轻链112和两条重链114中的一个的N末端。可裂解的接头130包括可被在目标细胞或组织(例如，受试者的病变位点)中特异性或高度表达的酶裂解的肽底物，从而使得铰链抗体100在目标细胞或组织中激活。

如上述，抑制性结构域120与功能性抗体110的连接导致功能性抗体110与其意向配体的结合被抑制。但是，一旦酶消化了可裂解的接头130，抑制性结构域120会从铰链抗体100脱落，从而恢复功能性抗体110的结合活性。

在某些实施例中，肽底物可被以下任一种酶裂解：基质金属蛋白酶(例如，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MMP-13和MMP-14)，组织蛋白酶(例如，CTSA，CTSB，CTSD，CTSE和CTSK)，半胱天冬酶(例如，CASP-1，CASP-2，CASP-3，CASP-4，CASP-5，CASP-6，CASP-7，CASP-7，CASP-9，CASP-10，CASP-11，CASP-12，CASP-13和CASP-14)，或整合素样金属蛋白酶(例如，ADAM-10，ADAM-12，ADAM-17，ADAM-TS和ADAM-TS5)。

基质金属蛋白酶(MMPs)是降解基质蛋白的锌依赖性内肽酶的一个家族。MMPs包括胶原酶，明胶酶，基质溶解因子(matrilysins)，釉质溶解蛋白(enamelysins)，金属弹性蛋白酶(metalloelastases)，基质溶解素和其它结构的蛋白和受体溶解酶。在正常生理过程(例如，胚胎发育和繁殖)和疾病过程(如关节炎和扩散)中，MMPs参与细胞外基质的降解。

例如，MMP-2(也称为明胶酶A或72kDaIV型胶原酶)和MMP-9(也称为明胶酶B或92kDaIV型胶原酶)均在炎症反应中起作用。因此，与受试者的其他细胞/组织相比，这些蛋白在炎症部位高度表达。此外，上升表达的MMP-2或MMP-9也与肿瘤进展(包括侵袭，转移，生长和血管生成)正相关。因此，用于这些蛋白的肽底物适合用作可裂解的接头130，以使得铰链抗体100在炎症位点或癌症位点激活。进一步地，由于MMP-2/MMP-9在细胞/组织中的表达比在病变位点的表达相对低，与病变位点相比，本发明的铰链抗体100在这些组织/细胞中很少发生激活。因此，由于改善的作用位点选择性，本发明的铰链抗体100可操控地治疗疾病。

在一些实施例中，每个可裂解的接头130包括氨基酸序列Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg(GPLGVR；SEQIDNo.16)，其是MMP-2或MMP-9的肽底物。MMP-2/MMP-9的肽底物的非限制性实施例包括：Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg(PLGMWSR；SEQIDNo.51)，Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-(d)-Arg(PLGLWA-(d)-R；SEQIDNo.52)以及Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-(d)-Arg(PQGIAGQ-(d)-R；SEQIDNo.53)。

“激活”意味着：当处于未裂解或非激活状态，铰链抗体100显示出与目标配体的第一结合亲和力；当处于裂解或激活状态，铰链抗体100显示出与目标配体的第二结合亲和力，其中，第二结合亲和力远远大于第一结合亲和力。例如，激活的功能性抗体110与其意向配体的结合亲和力比未裂解的铰链抗体100与同一配体的结合亲和力至少大2，3，4，5，10，15，20，25，30，35，35，40，45，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，600，700，800，900，甚至1000倍。

由于可裂解的接头130的设计是基于其对在目标位点高度表达的酶的特异性，因此，铰链抗体100的激活绝大部分发生在目标位点。作用位点的高选择性以及未裂解状态下良好的抑制活性基本上可以避免功能性抗体110脱离目标位点。

本发明的进一步的优势在于可分离的抑制性结构域120不会干扰激活的功能性抗体110与功能性抗体110的意向配体的结合。因此，一旦铰链抗体100通过可裂解的接头130的裂解被激活，功能性抗体110的结合亲和力就会被充分恢复。例如，在铰链抗体100接触在特定时间内在目标位点高度表达的酶之后，与没有结合到抑制性结构域120上的功能抗体110相比，被激活的功能性抗体110与其意向配体上的结合至少为70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。

在本发明的某些实施例中，功能性抗体110是抗TNF-α抗体，且包含SEQIDNo.1氨基酸序列，每个可裂解的接头130包含SEQIDNo.14氨基酸序列；每个抑制结构域120包含SEQIDNo.8氨基酸序列。

本发明实施例的铰链抗体能够被合成产生或能够被重组表达和纯化。

例如，铰链抗体可以采用一般方法合成，如α-氨基酸基团的t-BOC或FMOC保护。这两种方法都涉及逐步合成，从肽的C末端开始每一步添加一个氨基酸。也可采用众所周知的固态多肽合成方法合成本发明的铰链抗体。

针对铰链抗体的重组制备，提供了编码本发明铰链抗体的载体构建体或核酸分子。现有技术中已知多种能够在原核或真核细胞中表达的载体。为了与表达载体所用的宿主细胞相适应，表达载体通常被选择。在某些实施例中，载体编码功能性抗体的轻链和重链、抑制性结构域和可裂解的接头。

图3是本发明的某些实施例的一个示例性核酸分子200的示意图。在合适的条件下，核酸分子200能够被翻译，表达的多核苷酸随后被修饰和/或装配到本发明的铰链抗体(例如，上述的铰链抗体100)中。根据，图3是描述编码本发明的某些实施例的铰链抗体(例如，上述铰链抗体100)的核酸分子示意图。

在某些实施例中，合成的核酸分子200包括第一核酸序列210，第二核酸序列220和连接核酸序列230。第一核酸序列210从5′到3′端包括，第一抑制性结构域的编码区212，第一可裂解的接头的编码区214，轻链编码区216。第一抑制性结构域的编码区212编码本发明铰链抗体的抑制性结构域(如图1中的抑制性结构域120)的第一肽臂(如图1所述的肽臂122)。在某些实施例中，抑制性结构域可以是IgA，IgD或IgG的铰链区或铰链区的片段。第一可裂解的接头的编码区214编码可裂解的多肽底物(如图1可裂解的接头130)，该底物可被目标细胞或组织中特异性或高度表达的酶裂解。轻链编码区216编码在激活状态下能够治疗状况的功能性抗体的轻链(如图1的轻链102)。第二核酸序列220从5′到3′端包括，第二抑制性结构域编码区222，第二可裂解的接头编码区224，重链编码区226。第二抑制性结构域的编码区222编码抑制结构域(如图1的抑制结构域120)的第二肽臂(如图1中的另一个肽臂122)。第二可裂解的接头编码区224编码相同的多肽底物(如图1所述的可裂解的接头130)。重链编码区226编码功能性抗体的重链(如重链104)。

连接核酸序列230用于连接第一核酸序列210和第二核酸序列220，以形成单一核酸分子200。

在可选实施例中，第一核酸序列210和第二核酸序列220在一个单一的开放阅读框中结合，翻译的产物经分泌后，被修饰形成装配好的铰链抗体。例如，如图3所示，在第一核酸序列210和第二核酸序列220之间提供Furin-2A编码序列230。或者，IRES序列(图中未显示)也可用于连接第一核酸序列210和第二核酸序列220，以使得这两个核酸序列分别被翻译成两个多肽。

根据本发明的多种实施例，合成的核酸分子200包含编码任何上述铰链抗体或其等同物的核苷酸序列。例如，合成的核酸分子可能含有SEQIDNos.17-50中的任一种核苷酸序列。根据本发明的其他实施例，分别在两个载体中构建第一和第二核酸序列，其中，第一核酸序列是SEQIDNos.67，69，71，73，75和77中的任一种，第二核酸序列是SEQIDNos.68，70，72，74，76和78中的任一种。

同时，SEQIDNo.56是编码IgD1铰链区的核酸分子的一个示例性序列，其中IgD1铰链区的序列为SEQIDNo.54；而SEQIDNo.57是编码IgD2铰链区的核酸分子的一个示例性序列，其中IgD2铰链区的序列为SEQIDNo.55。

通过将合成的核酸分子200与一个或多个调控序列连接起来，构建表达上述合成的核酸分子200的载体，以使得合成的核酸分子200在调控序列的调控下进行转录和/或翻译。调控序列的非限制性例子包括启动子、增强子、终止子、操纵子、阻遏蛋白和诱导物。

表达载体构建体通常也提供可能需要或期望的转录和翻译起始区，其可能是诱导型或组成型，在转录起始区、转录和翻译终止区的转录调控下，可操纵地连接编码区。这些调控区可能来源于获得核酸的本身物种中，或可能来自于外源。为了便于，例如，包含感兴趣的构建体的宿主细胞的生长，表达载体构建体还可以包括可在宿主细胞中操纵的选择标记。这样的选择标记能够为转化的宿主细胞的选择提供表型性状，例如，真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素耐药性。

应该被理解的是，当第一核酸序列210和第二核酸序列220是在单一的阅读框中构建时，表达载体可以包含一个可操作地连接到第一核酸序列和第二核酸序列上的调控序列。另一方面，当第一核酸序列210和第二核酸序列220被设置在不同的阅读框时，表达载体可能具有至少两个分别连接到第一核酸序列和第二核酸序列上的调控序列。

在其他实施例中，第一核酸和第二核酸不是在单一载体中构建的；相反，它们处于两个独立的载体中，每个载体有自己的转录和翻译起始区，选择标记，和/或调控序列。

本发明的铰链抗体可以用于治疗可被铰链抗体的功能性抗体治疗的疾病或医疗状况。可通过抗体靶向的治疗治疗的疾病或医疗状况主要是癌症或自身免疫性疾病。

为了治疗患有这些疾病的受试者，本发明的铰链抗体或含有该铰链抗体的药物组合物以治疗有效剂量给药给受试者。因此，药物组合物和治疗方法也落入本发明的范围之内。

除铰链抗体之外，所述药物组合物进一步包括一种药物学上可接受的载体。本文中所用的“药物学上可接受的载体”一词是指药物学上可接受的材料、组合物或介质，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，它们参与从身体的一个器官或一部分携带或转运活性剂(如铰链抗体)到身体的另一个器官或另一部分。从可以与配方中的其他成分相兼容的意义上来讲，载体必须是“可接受的”，以及被选择为对活性剂的降解最小化，对患者的不利副作用最小化。药物组合物可能进一步包括一种或多种药物学上可接受的添加剂，包括结合剂、调味剂、缓冲剂、增稠剂、着色剂、抗氧化剂、稀释剂、稳定剂、缓冲剂、乳化剂、分散剂、悬浮剂、防腐剂等。

将与本发明的铰链抗体肽联合使用的药学上可接受的载体主要是根据施用药物组合物的方式来选择的。本发明的药物组合物可能皮下注射、静脉注射、鞘内注射或肌内注射。

可以在无菌水或无水溶剂、悬浮液和乳剂中配制施用的注射药物。无水溶剂的例子包括，但不限于，丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水溶液载体的描述性例证包括水、酒精/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲液。常见的不经肠道的介质包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油；而静脉内的介质通常包括液体和营养补充剂，电解质补充剂(例如，那些基于林格氏葡萄糖的补充剂)等等。

应当理解的是，因为本发明的铰链抗体在病变部位被裂解和激活，在身体的其他部位仍然未裂解和未激活，所以本发明的治疗方法在减少甚至消除由非靶标作用导致的系统性副作用风险方面是有利的。而且，本发明的治疗方法提高了现有治疗性抗体的功效。

提供以下实施例来阐明本发明的某些方面，帮助本领域的技术人员实现本发明。这些实施例不应该被认为以任何方式限制本发明的范围。不需要进一步详细阐述，我们相信本领域的技术人员基于本文的描述能够在最大程度上利用本发明。所有在本文中引用的出版物以整体引用的方式并入本文。

实施例1

材料和方法

1.1细胞系和细胞培养

表达SV40T抗原的人类胚胎肾细胞系(293T)、人类乳腺癌细胞系(SKBr3)、人类结肠癌细胞系(SW480)、Huh7均购买自美国典型培养物保藏中心。细胞培养在含10％胎牛血清(CCS；Sigma-Aldrich)、1％(10000μ/ml)青霉素、1％(10000μ/ml)链霉素(Invitrogen)的杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM；Sigma-Aldrich)中，在37℃、含5％二氧化碳的湿润空气中培养。Phoenix逆转录病毒包装细胞(Source)培养在含10％胎牛血清(FBS；Sigma-Aldrich)、1％(10000μ/ml)青霉素和1％(10000μ/ml)链霉素的DMEM/NutrientF-12Ham(DMEM/F12)培养基中，在37℃、含5％二氧化碳的湿润空气中培养。出于传代目的，293T细胞和Phoenix细胞用1x凡尔生(Versene)(EDTA)溶液处理3～5分钟，而SKBr3、SW480和Huh7细胞用胰蛋白酶处理3～5分钟。然后根据实验需要，分别以不同浓度培养细胞。

1.2生化试剂

-LT1转染试剂购买自Mirus生物有限责任公司(MirusBioLLC.)。Opti-MEM和EDTA购买自Invitrogen公司。牛血清白蛋白(BSA)和IV型MMP2(明胶酶A)购买自Sigma-Aldrich公司。HRP-羊抗人IgGFcγ抗体(HRP-Goat-αhumanIgGFcγ)和FITC-羊抗人IgGAMFcγ(FITC-Goat-αhumanIgGAMFcγ)购买自Jackson。

1.3质粒构建

为了构建编码anti-TNF-α抗体、英夫利昔单抗的核酸构建体，在单一质粒中采用编码Furin-2A肽的核酸序列连接轻链编码序列和重链编码序列上。然后，采用聚合酶链反应(PCR)在轻链的N末端引入NheI、HindIII和SfiI，在轻链的C末端引入XhoI，在重链的N末端引入BglII，在重链的C末端引入ClaI和AscI。接下来，引入IgG1铰链编码序列和MMP2底物编码序列到轻链和重链编码序列的上游，以产生编码IgG1铰链/MMP2/英夫利昔单抗的核酸构建体(SEQIDNo.43)。采用同样的方法构建编码其他抗体或铰链/MMP2/抗体的核酸构建体，例如，IgG1铰链/MMP2/易普利姆玛单抗(SEQIDNo.17)，IgG2铰链/MMP2/易普利姆玛单抗(SEQIDNo.18)，IgG3铰链/MMP2/易普利姆玛单抗(SEQIDNo.19)，IgG4铰链/MMP2/易普利姆玛单抗(SEQIDNo.20)，IgA1铰链/MMP2/易普利姆玛单抗(SEQIDNo.21)，IgA2铰链/MMP2/易普利姆玛单抗(SEQIDNo.22)，IgG1铰链/MMP2/tremelimumab(SEQIDNo.23)，IgG2铰链/MMP2/tremelimumab(SEQIDNo.24)，IgG3铰链/MMP2/tremelimumab(SEQIDNo.25)，IgG4铰链/MMP2/tremelimumab(SEQIDNo.26)，IgA1铰链/MMP2/tremelimumab(SEQIDNo.27)，IgA2铰链/MMP2/tremelimumab(SEQIDNo.28)，IgG1铰链/MMP2/阿达木单抗(SEQIDNo.29)，IgG2铰链/MMP2/阿达木单抗(SEQIDNo.30)，IgG3铰链/MMP2/阿达木单抗(SEQIDNo.31)，IgG4铰链/MMP2/阿达木单抗(SEQIDNo.32)，IgA1铰链/MMP2/阿达木单抗(SEQIDNo.33)，IgA2铰链/MMP2/阿达木单抗(SEQIDNo.34)，IgG1铰链/MMP2/帕尼单抗(SEQIDNo.35)，IgG1铰链/MMP2/迪诺塞麦单抗(SEQIDNo.36)，IgG2铰链/MMP2/迪诺塞麦单抗(SEQIDNo.37)，IgG3铰链/MMP2/迪诺塞麦单抗(SEQIDNo.38)，IgG4铰链/MMP2/迪诺塞麦单抗(SEQIDNo.39)，IgA1铰链/MMP2/迪诺塞麦单抗(SEQIDNo.40)，IgA2铰链/MMP2/迪诺塞麦单抗(SEQIDNo.41)，IgG1铰链/MMP2/依法利珠单抗(SEQIDNo.42)，IgG2铰链/MMP2/英夫利昔单抗(SEQIDNo.44)，IgG3铰链/MMP2/英夫利昔单抗(SEQIDNo.45)，IgG4铰链/MMP2/英夫利昔单抗(SEQIDNo.46)，IgA1铰链/MMP2/英夫利昔单抗(SEQIDNo.47)，IgA2铰链/MMP2/英夫利昔单抗(SEQIDNo.48)，IgG1铰链/MMP2/ustekinumab(SEQIDNo.49)，andIgG1铰链/MMP2/曲妥单抗(SEQIDNo.50)。

然后分别引入编码英夫利昔单抗和铰链/MMP2/英夫利昔单抗的构建体到pLKOAS3w.puro质粒中(此质粒包含延伸的病毒包装信号(Ψ+)、抗嘌呤霉素基因(Puror)和抗氨苄青霉素基因(Ampr))以产生表达载体(英夫利昔单抗-pLKO质粒和铰链/MMP2/英夫利昔单抗-pLKO质粒)。表达其他核酸构建体的质粒采用同样方法来制备。

1.4慢病毒转染

用乙二胺四乙酸处理Phoenix细胞，分散的细胞在6孔板中培养(1.5x10⁶细胞/孔)。在37℃培养箱培养24小时后，除去原始的细胞培养液，补充一半体积的含10％FBS培养液的DMEM。

将1.25μg铰链/MMP2/英夫利昔单抗-pLKO质粒(在125μL加有1.125μgpCMV-ΔR8.91μg质粒和0.125μgpMD.G质粒的Opti-MEM中)缓慢加入到含7.5ul试剂的125μLOpti-MEM反应溶液中。静置混合物30min，然后缓慢加入到6孔板中，在添加一半体积的新鲜培养基(DMEM/F12+10％FBS+1％BSA+1xp/s)前，在37℃培养箱中震荡培养16小时。在接下来的3天里，每24小时收集2ml上层清液，再补充2ml新鲜培养基。收集的上层清液以1250rpm，离心5分钟，然后将上层清液储存在4℃冰箱里。

至于病毒浓缩，冷冻的上层清液在室温下回温，过滤到蛋白离心过滤管中，然后在4℃下，以3500rpm离心，直到体积减少到1.5ml。分装浓缩液、储存在-80℃冰箱。

为了转染293T细胞，将293T细胞以4x10⁴个/孔传到6孔板中。第二天，当覆盖率在10～20％时，进行细胞转染。除去原始培养基，随后沿壁加入转染培养基(1ml生长培养基(DMEM+10％CCS+1％P/S)+150μl病毒悬液+8μg/ml聚凝胺)。震荡培养24h后，除去培养基，补入新的生长培养基，采用嘌呤霉素(3-5μg/ml)来筛选转染的293T细胞。每2天换一次新鲜的生长培养基，用嘌呤霉素筛选2周。然后将收集的细胞进行westernblotting，以检测细胞是否稳定表达了铰链/MMP2/英夫利昔单抗。采用同样方法制备表达英夫利昔单抗的293T细胞。

1.5抗体纯化

将转染的293T细胞传到培养皿(15cm)里，用添加有10％CCS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基培养，直到约80～90％的覆盖率。除去原始的生长培养基，用10mlPBS洗涤，以去除血清。然后用15ml无血清的DMEM培养基培养细胞两天，收集上层清液，在4℃，以3500rpm离心10分钟。收集上层清液，使用之前储存在-80℃。

为了纯化，将135ml冰冻的上层清液在37℃水浴中回温。然后采用蛋白质离心过滤管将上层清液浓缩30倍。采用蛋白A琼脂糖凝胶纯化系统纯化抗体，用0.1M甘氨酸洗脱缓冲液(pH3.0)洗脱结合的抗体。用1MTris-base(pH8.0)和6NHCL调整洗脱液的pH值到7.4。样品随后被收集到透析膜(T4再生纤维素管状膜，截留分子量(MWCO)：12000～14000，CelluSep)中，然后用1xPBS(pH7.4)透析两次，约1～2个小时。在10％SDS-PAGE分离后，用考马斯亮蓝染色10分钟，确认产物。

1.6MMP2底物裂解

铰链/MMP2/英夫利昔单抗(36μlPBS中有5μg)和MMP2(4μlDMEM中有0.8μg，最终浓度20μg/ml)在冰上反应0、1、5、10、30、60分钟。用抗TNF-α抗体(英夫利昔单抗)作为对照。然后将反应混合物添加到还原染料中，在100℃煮10分钟以终止MMP2的活性。通过10％SDS-PAGE和westernblotting确认MMP2底物的裂解。

为了分析westernblotting，以体积比6∶1(v/v)的比率添加还原染料到收集的细胞和上层清液中，在100℃煮10分钟。然后，采用10％SDS-PAGE分离蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜上，采用5％的脱脂牛奶4℃封闭过夜。然后采用HRP羊抗人IgGFcγ抗体(在5％的脱脂牛奶中，抗体浓度为0.4μg/ml)来识别抗体。

1.7酶联免疫吸附试验

通过基于抗原的ELISA或基于细胞的ELIA来测定铰链/MMP2/抗体的活性。

(A)包被孔板

为了测定铰链/MMP2/英夫利昔单抗或铰链/MMP2/阿达木单抗的活性，用包被缓冲液(100mMNa₂CO₃，pH＝8.0)稀释TNF-α(0.3μg/ml)，然后在37℃温育2小时，TNF-α被包被到ELISA上(Nunc-Maxisorp)。关于铰链/MMP2/狄诺塞麦单抗，在包被液(100mMNa₂CO₃，pH8.0)中，采用50μl/孔的RANKL(0.3μg/ml)37℃温育2小时，包被96孔板。为了测定铰链/MMP2/易普利姆玛单抗或铰链/MMP2/tremelimumab的活性，在包被液(100mMNa2CO3，pH8.0)中，采用50μl/孔的CTLA4(0.3μg/ml)，37℃温育2小时，包被96孔板。

为了封闭，96孔板的每孔中加入200μl5％的脱脂牛奶，在4℃冰箱中储存过夜。

采用基于细胞的ELISA测定铰链/MMP2/anti-EGFR抗体和铰链/MMP2/anti-HER2抗体的活性。简而言之，采用200μl生长培养基(DMEM+10％CCS+1％P/S)将EGFR阳性SW480细胞或HER2阳性SKBr3细胞以10⁵个/孔传到96板中，37℃培养过夜。

(B)MMP2处理

将20μl冰冻的MMP2酶(200μg/ml，在无血清的DMEM中)稀释10倍，在冰上与180μL转染的293T细胞上层清液反应0，1，10，30，60或90分钟，然后加入20μlCCS终止反应。

(C)抗体活性

第二天，除去封闭的96孔板中的原始培养液后，用0.05％PBST(200μl/孔)洗涤培养板一次，用PBS(200μl/孔/次)洗涤(或在基于细胞的ELIA情况下，用DMEM(200μl/孔)洗涤一次)，除去孔里的液体。然后加入MMP2处理的铰链/MMP2/抗体(50μl/孔)，重复两次(或在基于细胞的ELIA情况下，重复3次)，然后室温下反应2个小时。反应之后，从孔里吸出样品，用0.05％PBST(200μl/孔)洗涤三次，PBS(200μl/孔)洗涤一次(或在基于细胞的ELIA的情况下，用DMEM(200μl/孔)洗涤3次)，以除去游离的抗体。接下来，在96孔板的每孔中加入50μl/孔的1μg/ml的HRP-羊抗人IgGFcγ抗体(在用PBS配制的2％脱脂牛奶中)(或在基于细胞的ELIA的情况下，在DMEM+2％CCS中)，室温下反应一个小时。然后从孔里吸出HRP-羊抗人IgGFcγ抗体，用0.05％PBST(或在基于细胞的ELIA的情况下用DMEM)(200μl/孔))洗涤孔板3次，用PBS(200μl/孔)洗涤一次。

MMP2处理的铰链/MMP2/抗体的活性可通过氧化其底物2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)的氧化来测定。培养板每孔中加入150μl包含ABTS和30％H₂O₂的反应混合物(ABTS∶H₂O₂＝3000∶1)。ABTS的氧化伴随着405nm处吸光度的增加。通过吸光度的强度来估算酶活。采用同样的方法测得其他抗体的活性。

1.8通过铰链/MMP2/英夫利昔单抗中和TNF-α信号

用胰蛋白酶(0.05％)消化Huh7细胞，然后以7x10⁴个/孔将分散的细胞接种到24孔板中。在37℃培养箱中培养24小时后，除去原始的细胞培养液，补入含10％FBS的DMEM培养液。

将0.5μgNF-kB-Luc报告质粒加入到30μL含有1.5μL-LT转染试剂的无血清DMEM中。将混合物缓慢地加入到24孔板中，在37℃培养箱中震荡培养24小时。

转染24小时之后，采用下列物质之一处理细胞：(1)培养基(作为阴性对照)；(2)20ngTNF-α(作为阳性对照)；(3)20ngTNF-α和100mg/ml英夫利昔单抗；(4)20ngTNF-α，100mg/ml英夫利昔单抗和20mg/mlMMP2；(5)20ngTNF-α和100mg/mlIgGl铰链/MMP2/英夫利昔单抗；和(6)20ngTNF-α，100mg/mlIgG1铰链/MMP2/英夫利昔单抗和20mg/mlMMP2。处理24h后，往96孔中加入稳定的血清球蛋白和PBS，采用萤光素酶检测仪检测萤光素酶活性。

1.9动物实验

本发明作用实施例中的所有动物均饲养在动物室，温度控制在24～25℃，12∶12的光照-黑暗循环。可随时获取标准的实验室食物和自来水。实验程序获得了高雄医学大学审查委员会(中华民国台湾高雄市)的批准，并且按照国家动物福利法规执行实验。

实施例2

铰链/MMP2/英夫利昔单抗的纯化

通过计算机模拟生成铰链/MMP2/英夫利昔单抗的三维结构。参考图4，IgG1铰链区由两个通过二硫键相互连接的肽组成，英夫利昔单抗的轻链和重链互补决定区(CDR)被活跃的来源于IgG1铰链区的抑制性结构域所封闭。

按照上述实施例1.5中描述的方法进行纯化，纯化的产物通过SDS-PAGE(图5)确定。纯化的产物被确定为55kDa的IgG1铰链/MMP2/英夫利昔单抗重链(左)，其分子量大小类似于英夫利昔单抗(中)。泳道4中产物的纯度约为85％。

实施例3

通过MMP2处理除去铰链/MMP2/英夫利昔单抗的抑制性结构域

按照实施例1.6中的方法，用MMP2(20μg/ml)处理IgG1铰链/MMP2/英夫利昔单抗或英夫利昔单抗(抗TNF-α抗体)。如图6所示的westernblot分析结果表明，在MMP2处理前和处理后，英夫利昔单抗的分子量(约53.5kDa)是稳定不变的。另一方面，在MMP2处理之前，IgG1铰链/MMP2/英夫利昔单抗的分子量约为55kDa，然而MMP2处理之后，55kDa的产物的条带强度逐渐减弱，而53.5kDa的产物的条带强度随时间逐渐增加。结果表明，采用MMP2处理，能从功能性抗体区除去本发明铰链抗体的抑制性结构域。

实施例4

铰链/MMP2/抗TNF-α抗体的抗原结合活性的抑制和恢复

通过ELISA检测MMP2处理前和处理后(实施例1.6)纯化的铰链/MMP2/英夫利昔单抗的抗原结合活性，结果总结在图7中。在该分析中，抗TNF-α抗体与TNF-α上的结合能力被设为100％，铰链/MMP2/英夫利昔单抗的相对结合百分比据此计算。

ELISA结果表明，在用MMP2处理前，铰链/MMP2/英夫利昔单抗与TNF-α上的结合能力约为0.5％，证明抑制性结构域的连接基本抑制了99.5％的功能性抗TNF-α结构域的结合能力。该数据也表明一小时的MMP2处理能充分激活铰链/MMP2/英夫利昔单抗的结合能力，结合能力能恢复约到110％。相比英夫利昔单抗，两小时的MMP2处理，被激活的铰链/MMP2/英夫利昔单抗的结合能力能进一步提升到约120％。

实施例5

TNF-α信号被铰链/MMP2/英夫利昔单抗中和

实施例1.8是用于分析在MMP2处理后，IgG1铰链/MMP2/英夫利昔单抗是否仍能中和TNF-α信号。如图8所示，结果表明与阳性对照(第2组)相比，常规的英夫利昔单抗无论用MMP2处理(第4组)还是不用MMP2处理(第3组)，都能有效的封闭TNF-α信号。相反，没有用MMP2处理(第5组)的IgG1铰链/MMP2/英夫利昔单抗几乎不能中和TNF-α信号，然而用MMP2处理的IgG1铰链/MMP2/英夫利昔单抗(第6组)能有效的减少TNF-α信号。这些结果表明，本发明提出的抑制性结构域可以有效地阻止功能性抗体结构域与该功能性抗体的意向配体之间的结合。此外，本实验也证明，可通过MMP2处理来恢复本发明铰链抗体的功能性结构域的功能。

实施例6

多种铰链/MMP2/抗体的抗原结合活性的抑制和恢复

图9、图10和表1总结了多种铰链/MMP2/anti-HER2抗体在MMP2处理前和处理后的抗原结合能力。

表1

INN，国际非专属名称

参考图9和表1，MMP2处理前，未激活的IgG1铰链/MMP2/曲妥单抗的抗原结合活性约为27％，表明约73％的功能性anti-HER2结构域的结合能力被连接的抑制性结构域抑制了。MMP2处理约1.5h后，IgG1铰链/MMP2/曲妥单抗被充分激活，结合能力恢复到约97％。

在MMP2处理前，未激活的IgG1铰链/MMP2/帕尼单抗的抗原结合活性约为11％，表明功能性anti-EGFR结构域约89％的结合能力被连接的抑制性结构域抑制了。MMP2处理约2h后，IgG1铰链/MMP2/帕尼单抗的大部分活性被恢复，通过抗原结合能力约为90％证明。

总之，多种IgG1铰链/MMP2/抗体对该铰链抗体与其相应配体的结合显示出约73％～99.5％的抑制，在MMP2处理后，其结合力能恢复到约100％。

为了理解铰链区对铰链抗体的抑制效果的影响，按照上述方法，不同免疫球蛋白(如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)的铰链区被连接到功能性抗体上。当铰链抗体没有被激活时，所有铰链区基本能抑制铰链抗体与其意向配体的结合。尤其是，在MMP2处理前，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2铰链/MMP2/抗-TNF-α抗体的抗原结合能力分别为0.5％，6％，1％，31.5％，2.5％和23.5％(图10)。并且，在用MMP2激活以后，这些被激活的抗体的结合能力恢复到100％(图10)。

这些结果表明，本发明提出的抑制性结构域可抑制功能性抗体结构域73～99.5％的结合能力，通过MMP2处理，铰链抗体的结合亲和力能恢复到约90～100％，表明本发明铰链抗体的设计方案适用于任何临床可获得的抗体。

实施例7

在动物模型中，铰链-αEGFR抗体的定位和激活

帕尼单抗(抗-αEGFR抗体)被用于治疗EGFR表达的结直肠癌。在该实施例中，制备铰链/MMP2/帕尼单抗(以下简称铰链-αEGFR抗体)，并且使用患有结直肠癌的老鼠来检测铰链/MMP2/帕尼单抗的体内定位和激活。

按照实施例1中的方法制备抗-αEGFR抗体(帕尼单抗)和铰链-αEGFR抗体。然后将抗-αEGFR抗体和铰链-αEGFR抗体连接上市场上可买到的花青染料(IR820，购自Sigma543365)。

平均体重为20g的裸鼠被移植了人类结肠癌细胞HCT116(EGFR⁺/MMP⁺)。用5mg/kgIR820-抗-αEGFR抗体或IR820-铰链-αEGFR抗体与PBS或MMP抑制剂(购自Sigma的5mg/kg的1.10-邻二氮杂菲一水合物)静脉注射患有HCT116(EGFR⁺/MMP⁺)结肠肿瘤的老鼠。注射48h后，用IVIS光谱/CT成像系统(Caliper生命科学公司，PE)分别在710nm和820nm的激发和发射波长下对小鼠进行光学成像。成像过程中，老鼠处于37℃的气态麻醉环境中(5％异氟烷)。代表性的成像结果如图11所示。

光学成像非侵害性地提供了施用给有生命的受试者的荧光信号的三维分布的定量测定。理论上，一旦铰链-αEGFR抗体到达肿瘤位点，在MMP2蛋白酶的作用下，铰链-αEGFR抗体会被激活，被激活的功能性抗体随后会和EGFR阳性的肿瘤细胞结合。

如图11所示，类似anti-αEGFR抗体(左起第一张图)，被激活的铰链-αEGFR抗体(左起第三张图)被选择性地定位在肿瘤位点。进一步，从图像记录的颜色判断，被激活的铰链-αEGFR抗体在肿瘤位点的集聚水平与anti-αEGFR抗体在肿瘤位点的集聚水平相当。

另外，如图11所示，通过比较两组分别用anti-αEGFR抗体和铰链-αEGFR抗体处理的图像，我们注意到存在MMP抑制剂时，更少的铰链-αEGFR抗体被激活，以及更少的铰链-αEGFR抗体结合到EGFR阳性的肿瘤细胞上。这些数据表明MMP抑制剂铰链-αEGFR抗体的活性。这个结果也证明了本发明实施例的铰链/MMP2抗体的激活由裂解酶(例如，MMP2)的作用完成。

实施例8

动物模型中铰链-TNFα抗体的抗炎效果

Anti-TNFα抗体，例如，阿达木单抗，已经被用来治疗多种期望抑制免疫反应的状况。在此实施例中，研究了IgG1铰链/MMP2/阿达木单抗(下文中统称铰链-TNFα抗体)治疗胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)的功效。CIA是人类风湿性关节炎的长期自身免疫模型，被广泛用于分析风湿性关节炎的分子和细胞调控介质。

根据上述实施例1中的方法制备Anti-TNFα抗体(阿达木单抗)和铰链-TNFα抗体。

胶原蛋白诱导性关节炎的动物模型采用如下方法建立。在雄性DBA/1小鼠(8到10周大)的尾巴端部皮内注射100μg牛II型胶原蛋白(Chondrex，Inc.，雷德蒙德市，西雅图，美国)进行免疫，其中牛II型胶原蛋白用相同体积的弗氏完全佐剂(Chondrex，Inc.，雷德蒙德市，西雅图，美国)乳化。首次免疫之后重复以上步骤三周。每2-3天检测一次小鼠，在一个或多个四肢上表现出红斑和/或足肿胀的每只老鼠被用来做治疗研究。在关节炎开始，老鼠被腹腔注射PBS、anti-TNFα抗体或铰链-TNFα抗体(100μg/只)。四只爪子的炎症被分为0～4级：0＝无红肿和局部发红；1＝手指关节肿胀；2＝脚踝或腕关节轻微肿胀；3＝整只爪子严重发炎；4＝畸形或关节僵硬。每只爪子都被分级，统计4个得分，因此每只老鼠最大的可能炎症得分是16分。结果总结在图12中。

图12中的数据表明，用anti-TNFα抗体(阿达木单抗)和铰链-TNFα抗体处理的小鼠的炎症得分显著低于用PBS处理的小鼠的炎症得分。此外，用本发明的铰链-TNFα抗体处理的小鼠的炎症评分低于那些用商业化anti-TNFα抗体处理的小鼠的炎症得分。因此，这些数据证明，本发明的铰链-TNFα抗体可用于治疗风湿性关节炎。

应该注意的是，尽管上述实施例和作用实施例的铰链抗体来自于单克隆抗体，但是本发明并不局限于此。而且，本发明提供的设计法案适用于其他抗体靶向的治疗剂。例如，本发明提出的抑制性结构域可以采用上述类似方法被连接到双特异性抗体(如卡妥索单抗)的N端。其他适用于本发明的抗体靶向的治疗剂包括，但不限于，例如，双特异性抗体、三特异性Fab₃抗体、二价微抗体、三链抗体、四链抗体、scFv片段、Fab片段和Bis-scFv片段。

应当理解的是，上述实施例的描述仅仅是作为例子，本领域的普通技术人员能够进行多种调整。上述说明书、实施例和数据对本发明示例性实例的用途和结构提供了完整的描述。尽管本发明以上描述了多种实施例，但是这些实施例具有一定的特殊性或参考了一个或多个个别的实施例，在不脱离本发明的精神或保护范围的情况下，本发明的普通技术人员能够对本发明公开的实施例进行许多改变。

Claims (24)

1.一种铰链抗体，所述铰链抗体能够在目标细胞或组织中被选择性激活以治疗其中的状况，包括：

在激活状态下能够治疗所述状况的功能性抗体，所述功能性抗体包括两条轻链和两条重链；

两个抑制性结构域，其中每个抑制性结构域由两个通过二硫键相互连接的肽臂组成；以及，

四个可裂解的接头，其中每个可裂解的接头包括可被在所述目标细胞或组织中特异性或高度表达的酶裂解的肽底物，且连接所述抑制性结构域的所述两个肽臂中的一个至所述功能性抗体的所述两条轻链和所述两条重链中的一个的N末端。

2.如权利要求1所述的铰链抗体，其中所述功能性抗体选自由以下抗体构成的组：anti-TNF-α抗体，anti-RANKL抗体，anti-CTLA-4抗体，anti-HER2抗体，anti-EGFR抗体，anti-VEGF抗体，anti-VEGFR2)抗体，anti-IL6R抗体，anti-IL12/23抗体，anti-CD3抗体，anti-CD11a抗体，anti-CD20抗体，anti-CD25抗体，anti-CD30抗体，anti-CD33抗体和anti-CD52抗体。

3.如权利要求1所述的铰链抗体，其中所述功能性抗体的所述轻链具有SEQIDNos.1，2，3，4，5，6，7，8或9中的任一种氨基酸序列：所述功能性抗体的所述重链具有SEQIDNos.58，59，60，61，62，63，64，65和66中的任一种氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的铰链抗体，其中所述两个抑制性结构域中的每一个是免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白D(IgD)或免疫球蛋白G(IgG)的铰链区，或所述铰链区的片段。

5.如权利要求4所述的铰链抗体，其中所述IgA是IgA1或IgA2。

6.如权利要求4所述的铰链抗体，其中所述IgG是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。

7.如权利要求4所述的铰链抗体，其中所述抑制性结构域中的每一个含有SEQIDNos.10，11，12，13，14，15，54或55中的任一种氨基酸序列。

8.如权利要求1所述的铰链抗体，其中所述肽底物可被以下任一种酶裂解：基质金属蛋白酶(MMP)，组织蛋白酶(CTS)，半胱天冬酶(CASP)或整合素样金属蛋白酶(ADAM)。

9.如权利要求8所述的铰链抗体，其中所述酶是MMP-2或MMP-9，且每个可裂解的接头包括氨基酸序列SEQIDNo.16。

10.如权利要求1所述的铰链抗体，其中，

所述功能性抗体是anti-TNF-α抗体，其中，其所述轻链包括氨基酸序列SEQIDNo.1，且其所述重链包括氨基酸序列SEQIDNo.58；

所述可裂解的接头中的每一个包括氨基酸序列SEQIDNo.16；以及，

所述抑制性结构域中的每一个包括氨基酸序列SEQIDNo.10。

11.一种用于制备能够在目标细胞或组织中被选择性激活以治疗其中的状况的铰链抗体的表达系统，包括：

第一核酸序列，从5’到3’端包括：

编码所述铰链抗体的抑制性结构域的第一肽臂的第一抑制性结构域编码区，其中所述抑制性结构域包括免疫球蛋白的铰链区或所述铰链区的片段；

编码所述铰链抗体的可裂解的接头的第一可裂解的接头编码区，其中，所述可裂解的接头是可被在所述目标细胞或组织中特异性或高度表达的酶裂解的肽底物；以及，

编码所述铰链抗体的功能性抗体的轻链的轻链编码区，其中所述功能性抗体在激活状态下能够治疗所述状况；以及，

第二核酸序列，从5’到3’端包括：

编码所述铰链抗体的所述抑制性结构域的第二肽臂的第二抑制性结构域编码区；

编码所述铰链抗体的所述可裂解的接头的第二可裂解的接头编码区；以及，

编码所述铰链抗体的所述功能性抗体的重链的重链编码区。

12.如权利要求11所述的表达系统，进一步包括连接所述第一核酸序列和所述第二核酸序列的连接核酸序列，其中，所述连接核酸序列是Furin-2A编码序列或内部核糖体进入位点(IRES)序列。

13.如权利要求12所述的表达系统，进一步包括可操作地连接到所述第一核酸性序列和所述第二核酸序列的调控序列，以表达所述第一核酸性序列、所述第二核酸序列和所述连接核酸序列。

14.如权利要求11所述的表达系统，进一步包括：

可操控地连接到所述第一核酸序列以表达所述第一核酸序列的第一调控序列；以及，

可操控地连接到所述第二核酸序列以表达所述第二核酸序列的第二调控序列。

15.如权利要求14所述的表达系统，其中，

所述第一核酸序列和第一调控序列是在第一表达载体中构建的；以及，

所述第二核酸序列和第二调控序列是在第二表达载体中构建的。

16.如权利要求14所述的表达系统，其中所述第一核酸序列、所述第一调控序列、所述第二核酸序列以及所述第二调控序列是在单一的表达载体中构建的。

17.如权利要求11所述的表达系统，其中所述功能性抗体选自由以下抗体构成的组：anti-TNF-α抗体，anti-RANKL抗体，anti-CTLA-4抗体，anti-HER2抗体，anti-EGFR抗体，anti-VEGF抗体，anti-VEGFR2)抗体，anti-IL6R抗体，anti-IL12/23抗体，anti-CD3抗体，anti-CD11a抗体，anti-CD20抗体，anti-CD25抗体，anti-CD30抗体，anti-CD33抗体和anti-CD52抗体。

18.如权利要求11所述的表达系统，其中所述免疫球蛋白是免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白D(IgD)或免疫球蛋G(IgG)。

19.如权利要求18所述的合成核酸分子，其中，所述IgA是IgA1或IgA2。

20.如权利要求18所述的合成核酸分子，其中所述IgG是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。

21.如权利要求11所述的合成核酸分子，其中所述肽底物可被以下任一种酶裂解：基质金属蛋白酶(MMP)，组织蛋白酶(CTS)，半胱天冬酶(CASP)或整合素样金属蛋白酶(ADAM)。

22.如权利要求11所述的合成核酸分子，其中所述合成核酸分子具有SEQIDNos.17～50中的任一种核酸序列。

23.一种治疗受试者体内的癌症或自身免疫疾病的方法，包括给所述受试者施用有效治疗量的如权利要求1～10中的任一种所述铰链抗体。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述铰链抗体是皮下注射，口服，静脉注射、鞘内注射或肌内注射给药。