CN107312796A

CN107312796A - 蛋白质的生产方法

Info

Publication number: CN107312796A
Application number: CN201710220003.XA
Authority: CN
Inventors: 川上浩; 川上浩一; 黑川惠; 山口惠奈; 小川梨沙; 塚原正义; 林洋子
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd; Inter University Research Institute Corp Research Organization of Information and Systems
Current assignee: Inter University Research Institute Corp Research Organization of Information and Systems; Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2010-12-15
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2017-11-03
Also published as: AU2011342161B2; WO2012081628A1; SG191124A1; JPWO2012081628A1; TWI617664B; CA2820151C; EP2653540B9; US9102971B2; AU2011342161C1; BR112013014949B1; DK2653540T3; EP2653540A1; PT2653540T; KR20140012035A; CA2820151A1; TR201802431T4; ES2661981T3; KR102058658B1; RU2598255C2; CN103261414A

Abstract

本发明涉及一种蛋白质的生产方法，所述方法包括将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入至少一种悬浮性CHO细胞中、将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该CHO细胞的染色体中、对生产该目标蛋白质的悬浮性CHO细胞进行悬浮培养而生产该目标蛋白质；得到所述悬浮性CHO细胞的方法；所述悬浮性CHO细胞以及一种表达载体。

Description

蛋白质的生产方法

本申请是申请日为2011年12月14日、国际申请号为PCT/JP2011/078935、中国国家阶段申请号为201180060832.7、发明名称为“蛋白质的生产方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入至少一种悬浮性哺乳动物细胞中、将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中的方法、对生产该蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该蛋白质的方法、表达该蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞以及包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。

背景技术

利用基因重组技术的外源蛋白质的生产在药品和食品行业等各种产业中得到利用。多数情况下，重组蛋白质的生产通过如下方法进行：将含有编码目标蛋白质的碱基序列的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞等宿主中，选择出该表达载体重组到染色体中而得到的转化株，再将该转化株在适当的培养条件下培养而使其表达目标蛋白质。

但是，为了开发出能够高效地生产外源蛋白质的宿主，需要根据每种目标蛋白质选择出生产率良好的宿主细胞，因而期望对各个宿主中的外源蛋白质生产技术进行进一步的技术革新。

大肠杆菌等细菌和酵母的系统与动物细胞不同，大多难以进行糖链修饰等翻译后修饰，在生产具有活性的蛋白质的方面成为问题。

昆虫细胞的系统具有如下优点：所生产的蛋白质接受磷酸化、糖链附加等翻译后修饰，能够在保持原有的生理活性的状态下进行表达。但是，分泌蛋白质的糖链结构与来源于哺乳类的细胞的糖链结构不同，因此，用于药品用途时抗原性等成为问题。

另外，昆虫细胞的系统在外源基因的导入中使用重组病毒，因此，从安全性的观点出发，存在需要使其灭活或将其包埋的问题。

对于动物细胞的系统而言，能够以更等同于生物体中制造的蛋白质的方式对以人类为代表的高等动物来源的蛋白质进行磷酸化、糖链附加、折叠等翻译后修饰。这种准确的翻译后修饰是在重组蛋白质中重现蛋白质本来具有的生理活性所必需的，对于需要这种生理活性的药品等，经常使用以哺乳动物细胞为宿主的蛋白质生产系统。

但是，以动物细胞为宿主的蛋白质表达系统的生产率一般较低，导入基因的稳定性也大多存在问题。提高以哺乳动物培养细胞为宿主的蛋白质的生产率不仅在治疗用药品或诊断药品等的制造中非常重要，对于它们的开发研究也有很大贡献。因此，当务之急是开发以哺乳动物培养细胞、特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)为宿主且能够容易地获得高生产株的基因表达系统。

转座子是能够从染色体的一个基因座移动到另一个基因座的转座性遗传因子。转座子是分子生物学或遗传学的研究中强有力的工具，基于突变导入、基因捕获、转基因个体的制作等目的用于昆虫或线虫(例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)或秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))和植物中，但这种技术的开发在包括哺乳动物细胞在内的脊椎动物中很缓慢。

但是，近年来，在脊椎动物中也报道了具有活性的转座子，并且确认了其中若干转座子在小鼠或人类等的哺乳动物细胞中也具有活性。作为代表性的转座子，可以列举：由青鳉克隆得到的转座子Tol1(专利文献1)、Tol2(非专利文献1)、由存在于鲑科鱼类基因组中的非自主性转座子重构而成的睡美人(Sleeping Beauty)(非专利文献2)、青蛙来源的人工转座子青蛙王子(Frog prince)(非专利文献3)、昆虫来源的转座子piggyBac(非专利文献4)。

这些DNA转座子作为用于给哺乳动物细胞的基因组带来新的表现型的基因导入工具已经用于突变导入、基因捕获、转基因个体的制作、表达抗药性蛋白质等(非专利文献5～12)。

对于昆虫而言，研究了使用鳞翅目昆虫来源的转座子piggyBac将外源基因导入家蚕染色体并使其表达该外源基因所编码的蛋白质的方法，并公开了使用该技术的蛋白质生产方法(专利文献2)。

但是，由于所表达的目标蛋白质的表达量不充分且在家蚕全身都有生产，因此，为了从存在大量杂质蛋白质的体液中以高纯度的形式回收表达的外源蛋白质，需要高度的纯化技术，因此在经济方面存在问题。

另外，已知使用来源于青鳉的Tol2转座子在哺乳动物细胞中表达与G418抗性相关的蛋白质的例子(非专利文献12、非专利文献13)。

在利用来源于哺乳动物的培养细胞生产医疗用蛋白质药品的情况下，为了防止未知病毒或者病原性多肽的不可预期的混入，重要的是在其生产步骤中不含来源于动物的成分。CHO细胞作为生产蛋白质药品的动物细胞最频繁地使用，通过近年的研究，也确立了能够在不使用血清或来源于动物的成分的安全的培养基中培养的悬浮性CHO细胞株。但是，在无血清/无蛋白质条件下进行基因导入而得到的细胞株止于在使用血清的条件下进行基因导入而得到的细胞株的一半的生产率(非专利文献14)，表明在无血清/无蛋白质条件下的基因导入在技术上困难。

通常而言，用于筛选表达目标蛋白质的细胞的选择标记配置在同一基因表达载体上。这基于如下假说：在基因组中存在的基因具有容易表达的位点和不易表达的位点(被称为位置效果，非专利文献15)，如果表达选择标记，则也表达目标蛋白质。

另一方面，还已知：如抗体等那样，目标蛋白质由多个多肽构成的情况下，使它们分别用不同的载体表达。在抗体的情况下，抗体的重链的表达与轻链的表达相比越高，则表示生产率越高(非专利文献16)。预测在同一载体上重链与轻链的表达一定，为了得到高生产率，通过故意地使重链和轻链用不同的载体表达，结果能够得到以最佳的比表达的细胞株。但是，在用多个不同的载体表达蛋白质的情况下，也需要多个选择标记基因。

作为克服其的方法，报道了如下例子：将本来由一条多肽链构成的dhfr基因分割成两条多肽链，在重链表达载体上配置一条多肽链，在轻链表达载体上配置另一条多肽链(非专利文献17)。

但是，在非专利文献17中记载的细胞是添加在培养基中的蛋白质成分依赖性的CHO细胞，如上所述，与无血清/无蛋白质条件下的基因导入的情况不同，存在基因导入效率高的可能性。仍然预测在不存在病毒感染等危险性的安全性高的无血清/无蛋白质条件下进行基因导入时，难以筛选出生产率高的细胞。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2008/072540号

专利文献2：日本特表2001-532188号公报

非专利文献

非专利文献1：Nature 383,30(1996)

非专利文献2：Cell 91,501-510(1997)

非专利文献3：Nucleic Acids Res,31,6873-6881(2003)

非专利文献4：Insect Mol.Biol.5,141-151(1996)

非专利文献5：Genetics.166,895-899(2004)

非专利文献6：PLoS Genet,2,e169(2006)

非专利文献7：Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,10769-10773(1998)

非专利文献8：Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6759-6764(2001)

非专利文献9：Nature 436,221-226(2005)

非专利文献10：Nucleic Acids Res,31,6873-6881(2003)

非专利文献11：Nucleic Acids Res.35,e87(2007)

非专利文献12：Proc Natl Acad Sci USA,103,15008-15013(2006)

非专利文献13：Plos Genetics,2,1715-1724(2006)

非专利文献14：Biotech.Bioeng.96,1118-1126(2007)

非专利文献15：Nature Biotech.22,1393-1398(2004)

非专利文献16：Biotech.Bioeng.96,337-348(2007)

非专利文献17：Biotech.Bioeng.84,439-444(2003)

发明内容

发明所要解决的问题

为了生产、分析目标蛋白质，必须使用来源于哺乳动物的培养细胞来选择稳定地高表达目标蛋白质的细胞株，但生产目标蛋白质的细胞的制作和培养需要大量的劳动和时间。

另外，迄今为止已知使用转座子序列在哺乳动物细胞中进行蛋白质表达的技术，但关于通过使用转座子序列制作能够作为蛋白质的生产系统利用的高表达目标蛋白质的细胞的技术以及使用转座子序列的高生产目标蛋白质的哺乳动物细胞的制作方法和使用该细胞的蛋白质的生产方法还没有任何了解。

一直以来期望高效且在短时间内制作如上所述使用哺乳动物培养细胞对目标蛋白质进行高表达的蛋白质生产系统从而高生产目标蛋白质的技术。此外，还期望在贯穿从基因导入到生产株建立的过程中完全不使用动物来源的成分的生产细胞的建立。

因此，本发明的目的在于提供能够高效制作的、高表达目标蛋白质的细胞以及使用该细胞生产目标蛋白质的方法。

用于解决问题的方法

本发明人为了解决上述问题而反复进行了深入的研究，结果发现，通过将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端具有一对转座子序列的表达载体导入至少一种悬浮性哺乳动物细胞中、使插入在一对(两个)转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中，能够高效地制作该目标蛋白质。而且还发现，通过使用该细胞，能够高效地生产目标蛋白质，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

1.一种生产目标蛋白质的方法，其中，将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中，得到生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，并且对该哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该目标蛋白质。

2.一种生产目标蛋白质的方法，其特征在于，包括以下的步骤(A)～(C)：

(A)将以下的表达载体(a)和(b)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，

(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体，

(b)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；

(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体(b)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞；以及

(C)对步骤(B)中得到的表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产目标蛋白质。

3.一种得到生产目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞的方法，其中，将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中，得到生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。

4.如上述项1～3中任一项所述的方法，其中，包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体的至少一种为包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。

5.如上述项1～4中任一项所述的方法，其中，除了将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入哺乳动物细胞中之外，还将在包含选择标记基因的基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入哺乳动物细胞中。

6.如上述项1～5中任一项所述的方法，其中，编码目标蛋白质的DNA为编码抗体的DNA。

7.如上述项6所述的方法，其中，编码抗体的DNA为编码抗体的H链的DNA和编码抗体的L链的DNA中的至少一种。

8.如上述项4～7中任一项所述的方法，其中，将选自下述(a)～(d)的表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中，

(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；

(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；

(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；

(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。

9.如上述项1～8中任一项所述的方法，其中，悬浮性哺乳动物细胞为能够在无血清培养条件下存活和增殖的细胞。

10.如上述项1～9中任一项所述的方法，其中，悬浮性哺乳动物细胞为选自将CHO细胞在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性CHO细胞、PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性小鼠骨髓瘤细胞NS0中的任意一种细胞。

11.如上述项10所述的方法，其中，CHO细胞为选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S中的任意一种细胞。

12.如上述项4～11中任一项所述的方法，其中，选择标记基因为抗放线菌酮基因。

13.如上述项12所述的方法，其中，抗放线菌酮基因为核糖体蛋白质。

14.如上述项1～13中任一项所述的方法，其中，一对转座子序列为在哺乳动物细胞中发挥作用的一对来源于DNA型转座子的碱基序列。

15.如上述项14所述的方法，其中，一对来源于DNA型转座子的碱基序列为一对来源于Tol1转座子的碱基序列或者来源于Tol2转座子的碱基序列。

16.如上述项15所述的方法，其中，一对来源于Tol2转座子的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。

17.如上述项15所述的方法，其中，一对来源于Tol1转座子的碱基序列为由序列号14表示的碱基序列和由序列号15表示的碱基序列。

18.一种悬浮性哺乳动物细胞，其通过将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体(a)和含有编码识别该转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶(转移酶)的DNA的表达载体(b)同时导入而将插入在该一对转座子序列之间的该基因片段重组到染色体中并且生产该目标蛋白质。

19.如上述项18所述的哺乳动物细胞，其中，包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体(a)为包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。

20.如上述项18或19所述的哺乳动物细胞，其为将表达载体(a)和(b)、以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体(c)导入哺乳动物细胞而得到的细胞。

21.如上述项18～20中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，编码目标蛋白质的DNA为编码抗体的DNA。

22.如上述项21所述的哺乳动物细胞，其中，编码抗体的DNA为编码抗体的H链的DNA和编码抗体的L链的DNA中的至少一种。

23.如上述项18～22中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，导入有选自下述(a)～(d)的表达载体，

24.如上述项18～23中任一项所述的哺乳动物细胞，其为能够在无血清培养条件下存活和增殖的悬浮性哺乳动物细胞。

25.如上述项18～24中任一项所述的哺乳动物细胞，其为选自将CHO细胞在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性CHO细胞、PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性小鼠骨髓瘤细胞NS0中的任意一种悬浮性哺乳动物细胞。

26.如上述项25所述的哺乳动物细胞，其中，CHO细胞为选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S中的任意一种细胞。

27.如上述项19～26中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，选择标记基因为抗放线菌酮基因。

28.如上述项27所述的哺乳动物细胞，其中，抗放线菌酮基因为编码人核糖体蛋白质的突变体的基因。

29.如上述项19～28中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，一对转座子序列为在哺乳动物细胞中发挥作用的一对来源于DNA型转座子的碱基序列。

30.如上述项29所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于DNA型转座子的碱基序列为一对来源于Tol1转座子的碱基序列或者来源于Tol2转座子的碱基序列。

31.如上述项30所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于Tol2转座子的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。

32.如上述项30所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于Tol1转座子的碱基序列为由序列号14表示的碱基序列和由序列号15表示的碱基序列。

33.一种表达载体，其包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段，并且在该基因片段的两端含有一对转座子序列。

34.如上述项33所述的表达载体，其中，一对转座子序列为一对来源于Tol1转座子的碱基序列或者来源于Tol2转座子的碱基序列。

35.如上述项34所述的表达载体，其中，一对来源于Tol2转座子的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。

36.如上述项34所述的表达载体，其中，一对来源于Tol1转座子的序列为由序列号14表示的碱基序列和由序列号15表示的碱基序列。

发明效果

根据本发明的蛋白质的生产方法，能够使用悬浮性哺乳动物细胞高效地生产目标蛋白质。另外，本发明的细胞能够作为用于高效地生产基因重组蛋白质或基因重组多肽的生产细胞使用。

附图说明

图1表示抗人流感M2抗体表达转座子载体的示意图。Tol2-L表示左端Tol2转座子(序列号2)，Tol2-R表示右端Tol2转座子(序列号3)，CMV表示CMV启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，Hc表示人抗体H链cDNA，Lc表示人抗体L链cDNA，CHX-r表示抗放线菌酮基因。

图2表示抗人流感M2抗体表达载体的示意图。CMV表示CMV启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，Hc表示人抗体H链cDNA，Lc表示人抗体L链cDNA，CHX-r表示抗放线菌酮基因。

图3表示Tol2转座酶表达载体的示意图。CAGGS表示CAGGS启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，TPase cDNA表示Tol2转座酶cDNA。

图4表示对使用抗人流感M2抗体表达Tol2转座子载体时的、悬浮性CHO-K1细胞和粘附性CHO-K1细胞中的抗人流感M2抗体的表达量进行研究而得到的结果。图4A表示悬浮性CHO-K1细胞的结果，图4B表示粘附性CHO-K1细胞的结果。在任意一个图中，纵轴均表示抗体产生量(μg/mL)，横轴均表示各细胞的基因导入克隆编号。

图5表示抗人流感M2抗体表达Tol1转座子载体的示意图。Tol1-L表示左端Tol1转座子(序列号14)，Tol1-R表示右端Tol1转座子(序列号15)，CMV表示CMV启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，Hc表示人抗体H链cDNA，Lc表示人抗体L链cDNA，CHX-r表示抗放线菌酮基因。

图6表示Tol1转座酶表达载体的示意图。CAGGS表示CAGGS启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，TPase cDNA表示Tol1转座酶cDNA。

图7表示对使用抗人流感M2抗体表达Tol1转座子载体时的、悬浮性CHO-K1细胞中的抗人流感M2抗体的表达量进行研究而得到的结果。纵轴表示抗体产生量(μg/mL)，横轴表示各细胞的基因导入克隆编号。

图8表示抗人CD98抗体重链表达转座子载体的示意图。Tol2-L表示左端Tol2转座子(序列号2)，Tol2-R表示右端Tol2转座子(序列号3)，Pmo表示莫洛尼小鼠白血病病毒启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，Hc表示抗人CD98抗体重链cDNA(序列号18)。

图9表示抗人CD98抗体轻链表达转座子载体的示意图。Tol2-L表示左端Tol2转座子(序列号2)，Tol2-R表示右端Tol2转座子(序列号3)，CMV表示CMV启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，Lc表示抗人CD98抗体轻链cDNA(序列号21)。

图10表示抗放线菌酮基因表达转座子载体的示意图。Tol2-L表示左端Tol2转座子(序列号2)，Tol2-R表示右端Tol2转座子(序列号3)，CMV表示CMV启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，CHX-r表示抗放线菌酮基因(序列号7)。

图11表示将TNFα-CHX串联载体、或者TNFαH-CHX载体以及TNFαL载体向CHO-K1细胞进行基因导入时的、抗人TNFα抗体产生量。纵轴表示培养基中产生的抗体浓度(mg/mL)，对照区用对照表示，实验区用Exp.表示。

图12表示将CD20-CHX串联载体、或者CD20H-CHX载体以及CD20L载体向CHO-K1细胞进行基因导入时的、抗人CD20抗体产生量。纵轴表示培养基中产生的抗体浓度(mg/mL)，对照区用对照表示，实验区用Exp.表示。

图13表示抗体表达载体A的结构。图13中，Tol2-L表示由Tol2-L序列(序列号2)构成的DNA片段，Tol2-R表示由Tol2-R序列(序列号3)构成的DNA片段，CMV表示CMV启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，Hc表示抗人CD98抗体的重链基因，Lc表示抗人CD98抗体轻链基因，SO表示SV40启动子，SV表示SV40多聚腺苷酸化位点，Neo-r表示抗新霉素基因。

具体实施方式

本发明涉及将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入哺乳动物细胞中、将插入在一对(两个)转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到悬浮性哺乳动物细胞的染色体中的方法、对生产该蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该蛋白质的方法以及表达该蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。

作为本发明的生产目标蛋白质的方法(以下也称为本发明的方法)，可以列举包括以下的步骤(A)～(C)的生产目标蛋白质的方法。

步骤(A)将以下的表达载体(a)和(b)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，

步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体(b)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到上述哺乳动物细胞的染色体中而得到表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞；以及

步骤(C)对步骤(B)中得到的表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产目标蛋白质。

另外，本发明涉及一种悬浮性哺乳动物细胞，其中，导入有包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体，将插入在一对转座子序列之间的该基因片段重组到染色体中，并且生产该目标蛋白质。

本发明中，目标蛋白质是指由一个以上多肽构成的蛋白质，根据本发明的方法，能够进行表达至少一种目标蛋白质和/或表达至少一个多肽中的任意一种。

包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体是指一种或两种以上的该表达载体。具体而言，为了表达由多个多肽构成的目标蛋白质，使用包含含有编码各多肽的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的多个表达载体。

更具体而言，例如，在上述由多个多肽构成的目标蛋白质为抗体的情况下，可以通过一种表达载体表达抗体的H链和L链，也可以使用表达H链的载体和表达L链的载体这两种表达载体进行表达。

根据本发明的方法，能够使用导入包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体、将插入在一对转座子序列之间的该基因片段重组到染色体中并且生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞来制造目标蛋白质。

作为基因插入的指标的选择标记基因可以重组到与含有编码目标蛋白质的DNA的表达载体相同的载体上，也可以重组到其他载体上。

即，可以将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体中的至少一种设定为包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。

另外，除了可以将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入哺乳动物细胞中之外，还可以将包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入哺乳动物细胞中。

具体而言，作为本发明的生产目标蛋白质的方法，可以列举包括以下的步骤(A)～(C)的生产目标蛋白质的方法。

(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的蛋白质表达载体，

步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性动物细胞中的表达载体(b)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的上述基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞；以及

另外，作为本发明的生产目标蛋白质的方法，可以列举包括以下的步骤(A)～(C)的生产目标蛋白质的方法。

步骤(A)将以下的表达载体(a)、(b)和(c)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，

(b)在选择标记基因的两端含有一对转座子序列的表达载体，

(c)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；

步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性动物细胞中的表达载体(c)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的上述基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞；

本发明涉及一种悬浮性哺乳动物细胞，其中，导入有包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体和在选择标记基因的两端含有一对转座子序列的表达载体，将插入在一对转座子序列之间的该基因片段和选择标记基因重组到染色体中，并且生产该目标蛋白质。

另外，本发明涉及一种悬浮性哺乳动物细胞，其中，导入有包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因的两端含有一对转座子序列的蛋白质表达载体，将插入在一对转座子序列之间的该基因片段重组到染色体中，并且生产该目标蛋白质。

另外，作为本发明的生产目标蛋白质的哺乳动物细胞，可以列举通过将包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的蛋白质表达载体(a)和含有编码识别该转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶(转移酶)的DNA的载体(b)同时导入而将插入在该一对转座子序列之间的该基因片段重组到染色体中并且生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。

本发明中，包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的、导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体只要能够利用该哺乳动物细胞表达和制造目标蛋白质，则数目没有限制，可以优选列举1～20种表达载体，可以更优选列举2～10种表达载体，优选例如3～8种表达载体、4～7种表达载体、1～6种表达载体、1～5种表达载体、1～4种表达载体、1～3种表达载体。

另外，作为本发明的方式，可以列举：通过将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种蛋白质表达载体(a)和含有编码识别该转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体(b)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中而将插入在该一对转座子序列之间的该基因片段向该哺乳动物细胞的染色体中的重组增加的方法；将编码目标蛋白质的DNA以高频率重组到该哺乳动物细胞的染色体中的方法；以及通过该方法得到的生产目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。

本说明书中，“转座子”为转座性遗传因子，是指在保持一定结构的状态下在染色体上转座(transposition)或者从染色体转座到其他染色体上的基因单元。

转座子包含在基因单元的两端具有反向或同向的重复的转座子序列[也称为反向重复序列(IR序列)或末端反向重复序列(TIR序列)]和编码识别该转座子序列并使存在于转座子序列之间的基因发生转移的转座酶的碱基序列。

由转座子翻译而成的转座酶识别转座子两端的转座子序列，将插入在一对转座子序列之间的DNA片段切出并插入到转移目的地，由此能够进行DNA的转移。

本说明书中，“转座子序列”是指被转座酶识别的转座子的碱基序列，与IR序列或TIR序列具有相同的含义。包含该碱基序列的DNA只要能够在转座酶的作用下发生转移(插入到基因组中的其他位置)则也可以含有不完全的重复部分，存在对转座酶具有特异性的转座子序列。

本发明中使用的转座子序列优选为来源于DNA型转座子的碱基序列，更优选为被转座酶识别的、能够在哺乳动物细胞内转座的天然或人工的一对来源于DNA型转座子的碱基序列。

作为来源于DNA型转座子的碱基序列，可以列举例如：来源于青鳉来源的Tol1和Tol2转座子、由存在于鲑科魚类基因组中的非自主性转座子重构而成的睡美人(SleepingBeauty)、青蛙来源的人工转座子青蛙王子(Frog prince)和昆虫来源的转座子piggyBac的碱基序列。

这些中，优选来源于由序列表的序列号6表示的碱基序列构成的青鳉来源的Tol2转座子和由序列表的序列号13表示的碱基序列构成的青鳉来源的Tol1转座子的碱基序列。

作为一对来源于Tol2转座子的碱基序列，可以列举：由序列表的序列号6表示的Tol2转座子的碱基序列的第1位至第2229位的碱基序列和第4148位至第4682位的碱基序列。

作为一对来源于Tol2转座子的碱基序列，可以更优选列举：由序列表的序列号1表示的Tol2转座子的碱基序列中第1位至第200位的碱基序列(序列号2)(以下，记作Tol2-L序列)和第2285位至第2788位的碱基序列(序列号3)(以下，记作Tol2-R序列)。

作为一对来源于Tol1转座子的碱基序列，可以列举：由序列表的序列号13表示的Tol1转座子的碱基序列中第1位至第157位的碱基序列和第1748位至第1855位的碱基序列。

作为一对来源于Tol1转座子的碱基序列，可以更优选列举：由序列表的序列号13表示的Tol1转座子的碱基序列中第1位至第200位的碱基序列(序列号14)(以下，记作“Tol1-L序列”)和第1351位至第1855位的碱基序列(序列号15)(以下，记作Tol1-R序列)。

本发明中使用的转座子序列也包括通过使用上述的转座子来源的转座子序列的部分序列、调节碱基序列的长度以及利用碱基序列的添加、缺失或取代进行改变而对转移反应进行调控后的转座子序列。

作为本发明的生产目标蛋白质的方法，也包括使用至少两种转座子序列和至少两种转座酶来制造至少一种目标蛋白质。

具体而言，可以列举例如包括如下步骤的蛋白质的制造方法：将插入在两个Tol1转座子序列中的第一个含有编码目标蛋白质的DNA的载体、插入在两个Tol2转座子序列中的第二个含有编码目标蛋白质的DNA的载体、Tol1转座酶表达载体和Tol2转座子表达载体同时或者依次导入悬浮性哺乳动物细胞中，使各个编码目标蛋白质的DNA重组到该哺乳动物细胞的染色体中，获得生产两种目标蛋白质的哺乳动物细胞。

另外，第一个目标蛋白质与第二个目标蛋白质可以相同，也可以通过使导入细胞中的基因的拷贝数增加来提高目标蛋白质的生产率。

转座子的转移反应的调控可以通过促进或抑制利用转座酶的转座子序列的识别来促进或抑制转移反应。另外，转座子的转移反应可以通过缩短一对(两个)转座子序列之间含有的碱基序列的长度而使该转移反应增强，可以通过延长一对(两个)转座子序列之间含有的碱基序列的长度而使转移反应减弱。因此，在表达、制造由多个蛋白质构成的目标蛋白质的情况下，可以制作将编码各蛋白质的DNA重组到各自的表达载体中、使该DNA重组到宿主细胞的染色体内并且生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，并使用该细胞来制造目标蛋白质。

本说明书中，“转座酶”是指识别具有转座子序列的碱基序列并使存在于该碱基序列之间的基因片段在染色体上转座或者从染色体转座到其他染色体上的酶。

作为转座酶，可以列举例如来源于青鳉来源的Tol1和Tol2、由存在于鲑科魚类基因组中的非自主性转座子重构而成的睡美人(Sleeping Beauty，SB)、睡美人11(SleepingBeauty11，SB11)、青蛙来源的人工转座子青蛙王子(Frog Prince，FP)或昆虫来源的转座子piggyBac(PB)的酶。

转座酶可以使用天然型酶，只要保持与转座酶同样的转座活性，也可以对其一部分氨基酸进行取代、缺失、插入和/或添加。通过调控转座酶的酶活性，能够调控存在于转座子序列之间的基因片段的转移反应。

分析是否保持与转座酶同样的转移活性时，可以利用日本特开2003-235575号公报所公开的双组分分析系统进行测定。

具体而言，可以分别使用含有Tol2转座酶发生缺陷的Tol2转座子(Tol2来源的非自主性转座子)的质粒和含有Tol2转座酶的质粒，对非自主性Tol2元件是否能够在转座酶的作用下转移、插入到哺乳动物细胞的染色体内进行分析。

本说明书中，“非自主性转座子”是指存在于转座子内的转座酶发生缺陷、不能自主性地转移的转座子。对于非自主性转座子而言，可以通过使细胞内同时存在转座酶的蛋白质、编码转座酶的蛋白质的mRNA或编码转座酶的蛋白质的DNA而将插入在非自主性转座子的转座子序列之间的DNA转移到宿主细胞的染色体内。

转座酶基因是指编码转座酶的基因。为了提高哺乳动物细胞中的表达效率，可以在该基因的翻译起始密码子ATG的上游连接有kozak的共有序列(Kozak,M.Nucleic AcidsRes.,12,857-872,1984)或者将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间调节至适当距离(例如6～18个碱基)而得到的序列。

本发明的方法中，为了将至少一种表达载体中的编码目标蛋白质的DNA重组到宿主细胞的染色体中，将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入宿主细胞中，使转座酶对导入到该细胞内的表达载体中含有的转座子序列发挥作用。

为了使转座酶对导入到宿主细胞内的表达载体中含有的转座子序列发挥作用，可以将转座酶注入该细胞内，也可以将包含编码转座酶的DNA的表达载体与包含至少一种编码目标蛋白质的DNA或者包含编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的表达载体一起导入宿主细胞中。另外，也可以将编码转座酶基因的RNA导入宿主细胞内，使转座酶在该细胞内进行表达。

作为表达载体，没有特别限定，可以根据重组有转座酶基因的载体所要导入的宿主细胞、用途等从本领域技术人员已知的表达载体中适当选择来使用。

本发明中，在生产由两种以上的多肽构成的目标蛋白质、或者两种以上的目标蛋白质的情况下，将编码各蛋白质的DNA重组到同一表达载体中，或者重组到各自不同的表达载体中，并将该表达载体导入宿主细胞中，由此，能够制作该DNA重组到该细胞的染色体中的蛋白质生产细胞。

转座酶可以重组到表达载体中与目标蛋白质一起表达，也可以重组到表达载体之外的载体中进行表达。转座酶可以暂时性地起作用，也可以持续性地起作用，为了制作稳定的产生细胞，优选使转座酶暂时性地起作用。

作为使转座酶暂时性地起作用的方法，可以列举例如将编码转座酶的DNA重组到含有编码目标蛋白质的DNA的表达载体之外的表达载体中并将两表达质粒同时导入宿主细胞中的方法。

本说明书中，“表达载体”是指为了转化哺乳动物细胞并表达目标蛋白质而使用的表达载体。本发明中使用的表达载体具有在表达盒的两侧至少存在一对转座子序列的结构。

本说明书中，“表达盒”是指具有用于表达目标蛋白质所需要的基因表达调控区域和编码目标蛋白质的序列的核酸序列。作为该基因表达调控区域，可以列举例如增强子、启动子和终止子等。表达盒中可以含有选择标记基因。

作为启动子，只要能够在哺乳动物细胞中发挥功能则可以使用任意一种启动子。可以列举例如：巨细胞病毒(CMV)的IE(immediate early，即刻早期)基因的启动子、SV40的初期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子、莫洛尼小鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)的启动子和增强子等。另外，可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。

“选择标记基因”是指能够用于区别导入有质粒载体的细胞和缺少该载体的细胞的任意的标记基因。

作为选择标记基因，可以列举例如：抗药性基因[抗新霉素基因、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、抗嘌呤霉素基因、抗杀稻瘟菌素基因、抗博莱霉素基因、抗潮霉素基因、抗放线菌酮基因(日本特开2002-262879号公报)]以及荧光或生物发光标记基因(绿色荧光蛋白GFP等)等。

本发明中，优选的选择标记为抗药性基因，特别优选的选择标记为抗放线菌酮基因。另外，通过对选择标记基因进行基因改变而制作氨基酸改变体或者调节选择标记基因的转录或翻译(例如，启动子的改变以及氨基酸密码子的改变等)，也可以改变选择标记蛋白质的抗药性能和发光能力。另外，通过调节药剂浓度，也可以选择抗药性强度不同的选择标记基因导入细胞。

为了调节选择标记蛋白质的抗药性能和发光能力，优选使用弱化的选择标记基因。弱化的选择标记基因是指以使选择标记基因所编码的蛋白质在细胞内的活性降低的方式进行改变后的选择标记基因。

作为以使细胞内的活性降低的方式进行改变后的选择标记基因，可以列举例如：(A)通过改变选择标记基因所编码的蛋白质的氨基酸序列而使该蛋白质在细胞内的活性降低的选择标记基因，以及(B)通过改变对选择标记基因的表达进行调控的碱基序列或改变选择标记基因的ORF(Open Reading Frame，开放读码框)内的碱基序列而使该蛋白质在细胞内的表达量降低的选择标记基因。

作为通过改变选择标记基因所编码的蛋白质的氨基酸序列而使该蛋白质在细胞内的活性降低的选择标记基因，可以列举例如：Sauter et al.[Biotech.Bioeng.89,530-538(2005)]或Chen et al.[Journal of Immunological Methods 295,49-56(2004)]中记载的抗新霉素基因。

作为通过改变对选择标记基因的表达进行调控的碱基序列而使该蛋白质在细胞内的表达量降低的方法，可以列举例如：对调控选择标记基因的表达的启动子序列、终止子序列、增强子序列、kozak的共有序列或夏因-达尔加诺序列的序列进行改变的方法。更具体而言，可以列举例如：将调控选择标记基因的表达的启动子序列取代成更弱的启动子序列的方法。

作为通过改变选择标记基因的ORF内的碱基序列而使该蛋白质在细胞内的表达量降低的方法，可以列举例如将该ORF内的密码子取代成在该细胞内的使用频率更低的同义密码子的方法。

作为本发明的弱化的选择标记基因，可以列举例如：将上述的该基因的ORF内的密码子取代成在该细胞内的使用频率更低的同义密码子的选择标记基因。

在各种生物种类的细胞内，各同义密码子中使用频率更低的同义密码子可以基于公知的文献或数据库等进行选择。

这种取代成使用频率低的同义密码子的取代，具体而言，例如，在CHO细胞的情况下，是指将亮氨酸的密码子取代成TTA、将精氨酸的密码子取代成CGA或CGT、将丙氨酸的密码子取代成GCG、将缬氨酸的密码子取代成GTA、将丝氨酸的密码子取代成TCG、将异亮氨酸的密码子取代成ATA、将苏氨酸的密码子取代成ACG、将脯氨酸的密码子取代成CCG、将谷氨酸的密码子取代成GAA、将酪氨酸的密码子取代成TAT、将赖氨酸的密码子取代成AAA、将苯丙氨酸的密码子取代成TTT、将组氨酸的密码子取代成CAT、将谷氨酰胺的密码子取代成CAA、将天冬酰胺的密码子取代成AAT、将天冬氨酸的密码子取代成GAT、将半胱氨酸的密码子取代成TGT或者将甘氨酸的密码子取代成GGT。

弱化的选择标记基因中，只要能够高效地获得生产蛋白质的细胞则与改变前的选择标记基因相比被取代的密码子数没有特别限制，优选对20个以上的氨基酸残基所对应的密码子进行取代。

弱化的选择标记基因中，与改变前的选择标记基因相比被改变的碱基数没有特别限制，优选对编码选择标记基因的碱基序列的10％以上进行改变。

另外，弱化的选择标记基因中取代的密码子所编码的氨基酸残基没有特别限制，可以优选列举亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸。

弱化的选择标记基因中，在对亮氨酸残基所对应的密码子进行取代的情况下，没有特别限制，优选对选择标记基因中含有的全部亮氨酸残基所对应的密码子中70％以上的亮氨酸残基所对应的密码子进行取代。

另外，弱化的选择标记基因中，在对丙氨酸残基所对应的密码子进行取代的情况下，没有特别限制，优选对选择标记基因中含有的全部丙氨酸残基所对应的密码子中70％以上的丙氨酸残基所对应的密码子进行取代。

作为这种通过取代成使用频率低的同义密码子而改变得到的、弱化的选择标记基因的例子，具体而言，可以列举：由序列号37、38或39表示的碱基序列构成的抗新霉素基因、由序列号41、43或44表示的碱基序列构成的抗嘌呤霉素基因、由序列号45或46表示的碱基序列构成的抗博莱霉素基因、由序列号47或48表示的碱基序列构成的抗潮霉素基因。

另外，也可以通过在抗体生产细胞的制作中使选择抗药性细胞时的药剂的浓度与通常使用的浓度相比显著提高或在药剂代谢、分解之前追加施用抗药性基因等来使选择标记基因弱化。

放线菌酮(以下，也有时简记为CHX)为蛋白质合成抑制剂，作为将抗CHX基因用作选择标记的例子，已知酵母[Kondo K.J.Bacteriol.,177,24,7171-7177(1995)]、动物细胞(日本特开2002-262879号公报)的例子。

对于动物细胞而言，明确了使由序列表的序列号5表示的碱基序列编码的人核糖体蛋白质亚单位的L36a的54位的脯氨酸被取代成谷氨酰胺的、表达由序列表的序列号7表示的碱基序列编码的蛋白质而得到的转化株赋予对放线菌酮的抗性。另外，作为抗放线菌酮标记，可以列举例如：人核糖体蛋白质亚单位L44的54位的脯氨酸被取代成谷氨酰胺的突变人核糖体蛋白质亚单位L44。

作为将包含上述转座子序列的蛋白质表达载体、表达转座酶的质粒载体或RNA导入宿主细胞中的方法，没有特别限定，可以列举例如磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、基因枪法和脂质体转染法等。

在将转座酶以蛋白质的形式直接导入的情况下，可以列举例如通过显微注射法或胞吞作用供给到细胞内的方法。基因导入可以通过新基因工程手册、村松正实、山本雅编著、羊土社、ISBN 9784897063737中记载的方法进行。

作为宿主细胞，可以列举能够传代培养且能够稳定地表达目标蛋白质的哺乳动物细胞。作为宿主细胞，可以列举例如：PER.C6细胞、人白血病细胞那马瓦(Namalwa)细胞、猴细胞COS细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14、叙利亚仓鼠细胞BHK、HBT5637(日本特开昭63-000299号公报)、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞[Journal of Experimental Medicine,108,945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,601275(1968)；Genetics,55,513(1968)；Chromosoma,41,129(1973)；Methods in Cell Science,18,115(1996)；RadiationResearch,148,260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.,60,1275(1968)；Cell,6,121(1975)；Molecular Cell Genetics,Appendix I,II(pp.883-900)]、CHO/DG44、CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies,Cat#11619)、Pro-3和CHO细胞的亚系。

另外，上述宿主细胞也可以通过改变染色体DNA和导入外源性基因等以适合蛋白质生产的方式进行改变后用于本发明的蛋白质的生产方法。

另外，作为宿主细胞，为了调控生产的目标蛋白质上结合的糖链结构，也可以使用获得了植物凝集素抗性的Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics,12,55(1986)]、α1,6-岩藻糖转移酶基因发生缺陷的CHO细胞(国际公开第05/35586号、国际公开第02/31140号)、GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)发生缺陷的细胞和Fx蛋白质发生缺陷的细胞。

本发明中，目标蛋白质也包括由至少一种多肽构成的蛋白质、由多种多肽或蛋白质构成的复合蛋白质中的任意一种。另外，本发明中，蛋白质与多肽的含义相同，但有时也将较低分子量的蛋白分子或者构成复合蛋白质的蛋白质定义为多肽。

本发明中，目标蛋白质只要能够通过本发明的方法表达，则可以为任意的蛋白质、多肽。具体而言，可以列举例如：人血清蛋白、白蛋白结合蛋白质、肽类激素、生长因子、细胞因子、血液凝固因子、纤溶类蛋白质、抗体、选择标记蛋白质、膜蛋白质和各种蛋白质的部分片段等。具体而言，可以列举例如：人静脉免疫球蛋白(IVIG)、红细胞生成素(EPO)、白蛋白、生长激素(GH)、卵泡刺激激素(FSH)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、干扰素(INF)、Fas配体、血液凝固因子(II、VII、VIII、IX、X)、凝血酶原、纤维蛋白原、蛋白C、蛋白S、抗凝血酶III(ATIII)、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)、单克隆抗体、多克隆抗体以及药剂选择(抗性)基因等。

抗体是由抗体重链(H链)多肽和两条抗体轻链(L链)多肽构成的分子，已知IgA、IgD、IgE、IgG和IgM亚类。另外，IgG分类成IgG1、IgG2、IgG3和IgG4类。

IgG抗体是指由两条H链多肽和两条L链多肽构成的异四聚体分子。H链和L链分别由与抗原结合相关的可变区(V)和恒定区(C)构成，被称为VH、CH、VL或CL。CH区进一步分类成CH1区、CH2区、CH3区，将CH2区和CH3区合并称为Fc区或者简称为Fc。

抗体包括与单一表位反应的单克隆抗体、与多个表位反应的多克隆抗体、基因重组抗体。

单克隆抗体是指单一克隆的抗体产生细胞分泌的抗体，仅识别一个表位(也称为抗原决定簇)，构成单克隆抗体的氨基酸序列(一级结构)是均匀的。

多克隆抗体是指单克隆抗体的混合物，能够与多个表位反应。

作为基因重组抗体，可以列举例如：嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、Fc融合蛋白、Fc氨基酸改变抗体、多价抗体及该部分片段等。氨基酸改变抗体可以对可变区或恒定区中的任意一个部分实施氨基酸残基改变，使抗体的活性得到调控。

多价抗体有与一个抗原上的两个以上不同的表位反应的多价抗体、与两个以上不同的抗原反应的多价抗体等，可以为其中的任意一种。另外，只要是维持与抗原的结合活性的多价抗体，则可以为任意结构的多价抗体(国际公开第2001/77342号、美国专利第7612181号说明书、国际公开第2009/131239号)。

根据本发明的制造方法，能够表达、制造上述任意的目标蛋白质和/或目标肽。

作为本发明的导入有至少一种编码目标蛋白质的DNA的细胞，可以列举通过以下的(A)和(B)的步骤制造的抗体产生细胞，

步骤(A)将选自以下的(a)～(c)中的一种表达载体的组合或表达载体(d)、以及表达载体(e)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，

(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；

(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；

(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和编码抗药性基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；

(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；

(e)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；

步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体(e)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的上述H链、L链和选择标记基因重组到上述哺乳动物细胞的染色体中，选择出表达抗体的悬浮性哺乳动物细胞。

作为本发明的制造抗体的方法，可以列举包括以下的步骤(A)～(C)的、生产目标蛋白质的方法，

(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，

(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和编码抗药性基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，

(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，

(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，

步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体(e)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的上述H链、L链和选择标记基因重组到上述哺乳动物细胞的染色体中，得到表达抗体的悬浮性哺乳动物细胞；

步骤(C)对步骤(B)中得到的表达抗体的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产抗体。

另外，本发明包括包含以下的(A)和(B)的步骤的抗体高生产株的制造方法以及筛选方法，

(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，

步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体(e)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的上述H链、L链和选择标记基因重组到上述哺乳动物细胞的染色体中，选择出高表达抗体的悬浮性哺乳动物细胞。

另外，本发明包括包含以下的(A)、(B)和(C)的步骤的抗体制造方法，

作为本发明的导入有至少一种编码目标蛋白质的DNA的哺乳动物细胞，可以列举例如：导入有多个不同的抗体基因的多克隆抗体产生细胞以及复合物分子产生细胞等。

作为多克隆抗体产生细胞，可以列举例如：导入有抗一种抗原的至少两种以上不同的单克隆抗体基因的细胞、导入有抗多种抗原的多种单克隆抗体基因的细胞、导入有抗原被免疫的来源于非人动物的抗体基因文库的细胞、以及导入有来源于患者的抗体基因文库的细胞等。

复合物分子生产细胞只要是导入有编码在细胞内共表达的各个分子形成复合物分子的蛋白质的DNA的细胞，则可以为任意一种细胞。具体而言，可以列举例如：共导入有FcγRIII(CD16)和共有γ链的细胞、共导入有新生儿Fc受体(FcRn)和β2巨球蛋白的细胞、以及共导入有CD98和LAT1的细胞(国际公开第2007/114496号)等。

通过本发明的抗体制造方法制造的抗体可以为任意的抗体，可以列举例如：识别肿瘤相关抗原的抗体、识别与过敏或炎症相关的抗原的抗体、识别与循环器官疾病相关的抗原的抗体、识别与自身免疫疾病相关的抗原的抗体、以及识别与病毒或细菌感染相关的抗原的抗体等。

作为肿瘤相关抗原，可以列举例如：CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD9、CD10、CD13、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD30、CD32、CD33、CD38、CD40、CD40配体(CD40L)、CD44、CD45、CD46、CD47、CD52、CD54、CD55、CD55、CD59、CD63、CD64、CD66b、CD69、CD70、CD74、CD80、CD89、CD95、CD98、CD105、CD134、CD137、CD138、CD147、CD158、CD160、CD162、CD164、CD200、CD227、肾上腺髓质素、血管生成素相关蛋白4(ARP4)、极光激酶、B7-H1、B7-DC、整合素、骨髓基质抗原2(BST2)、CA125、CA19.9、碳酸酐酶9(CA9)、钙粘蛋白、cc-趋化因子受体(CCR)4、CCR7、癌胚抗原(CEA)、富含半胱氨酸的成纤维细胞生长因子受体-1(CFR-1)、c-Met、c-Myc、胶原蛋白、CTA、结缔组织生长因子(CTGF)、CTLA-4、细胞角蛋白-18、DF3、E-钙粘蛋白、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、EGFR2(HER2)、EGFR3(HER3)、EGFR4(HER4)、细胞膜糖蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、血管内皮细胞蛋白C受体(EPCR)、肝配蛋白、肝配蛋白受体(Eph)、EphA2、endotheliase-2(ET2)、FAM3D、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fc受体同系物1(FcRH1)、铁蛋白、成纤维细胞生长因子-8(FGF-8)、FGF8受体、碱性FGF(bFGF)、bFGF受体、FGF受体(FGFR)3、FGFR4、FLT1、FLT3、叶酸受体、卷曲同源物10(FZD10)、卷曲受体4(FZD-4)、G250、G-CSF受体、神经节苷脂(例如，GD2、GD3、GM2和GM3等)、globo H、gp75、gp88、GPR-9-6、乙酰肝素酶I、肝细胞生长因子(HGF)、HGF受体、HLA抗原(例如，HLA-DR等)、HM1.24、人乳脂肪球蛋白(HMFG)、hRS7、热休克蛋白90(hsp90)、独特型表位、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF受体(IGFR)、白细胞介素(例如，IL-6和IL-15等)、白细胞介素受体(例如，IL-6R和IL-15R等)、整合素、免疫受体转运相关-4(IRTA-4)、激肽释放酶1、KDR、KIR2DL1、KIR2DL2/3、KS1/4、lamp-1、lamp-2、层粘连蛋白-5、路易斯寡糖y、唾液酸化的路易斯寡糖x、淋巴毒素β-受体(LTBR)、LUNX、黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、间皮素、MICA、苗勒管抑制物质II型受体(MISIIR)、粘蛋白、神经细胞粘附分子(NCAM)、Necl-5、Notch1、骨桥蛋白、血小板衍生生长因子(PDGF)、PDGF受体、血小板因子-4(PF-4)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、甲状旁腺激素相关蛋白/肽(PTHrP)、NF-κB配体的受体激活剂(RANKL)、透明质酸受体介导的细胞游走受体(RHAMM)、ROBO1、SART3、脑信号蛋白4B(SEMA4B)、白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)、SM5-1、1-磷酸鞘氨醇、肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)、转铁蛋白受体(TfR)、TGF-β、Thy-1、Tie-1、Tie2受体、T细胞免疫球蛋白域粘蛋白域1(TIM-1)、人组织因子(hTF)、Tn抗原、肿瘤坏死因子(TNF)、Thomsen-Friedenreich抗原(TF抗原)、TNF受体、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TRAIL受体(例如，DR4和DR5等)、系统ASC氨基酸转运蛋白2(ASCT2)、trkC、TROP-2、TWEAK受体Fn14、IV型胶原酶、尿激酶受体、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(例如，VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3等)、波形蛋白和VLA-4等，可以列举抗这些抗原的抗体等。

另外，作为识别肿瘤相关抗原的抗体，可以列举例如：抗GD2抗体[AnticancerRes.,13,331(1993)]、抗GD3抗体[Cancer Immunol.Immunother.,36,260(1993)]、抗GM2抗体[Cancer Res.,54,1511(1994)]、抗CD52抗体[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,4285(1992)]、抗MAGE抗体[British J.Cancer,83,493(2000)]、抗HM1.24抗体[MolecularImmunol.,36,387(1999)]、抗甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)抗体[Cancer,88,2909(2000)]、抗bFGF抗体、抗FGF-8抗体[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,9911(1989)]、抗bFGFR抗体、抗FGFR1抗体(国际公开第2005/037235号)、抗FGF-8R抗体[J.Biol.Chem.,265,16455(1990)]、抗IGF抗体[J.Neurosci.Res.,40,647(1995)]、抗IGF-IR抗体[J.Neurosci.Res),40,647(1995)]、抗PSMA抗体[J.Urology,160,2396(1998)]、抗VEGF抗体[Cancer Res),57,4593(1997)、Avastin^(R)]、抗VEGFR抗体[Oncogene,19,2138(2000)、国际公开第96/30046号]、抗CD20抗体[Curr.Opin.Oncol.,10,548(1998)、US5,736,137、Rituxan^(R)、Ocrelizumab、Ofatumumab]、抗EGFR抗体(Erbitux^(R)、Vectivix^(R))、抗HER2抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,4285(1992)、US5,725,856、Herceptin^(R)、Pertuzumab)、抗HER3抗体(US2008/0124345)、c-Met抗体(US6,468,529)、抗CD10抗体、抗EGFR抗体(国际公开第96/402010号)、抗Apo-2R抗体(国际公开第98/51793号)、抗ASCT2抗体(国际公开第2010/008075号)、抗CEA抗体[キャンサー·リサーチ(Cancer Res.),55(23suppl)：5935s-5945s,(1995)]、抗CD38抗体、抗CD33抗体、抗CD22抗体、抗CD20氨基酸改变抗体(Immunology,115,4393,2010.)、抗EpCAM抗体、抗A33抗体和抗叶酸受体抗体(MRAb-003)等。

作为识别与过敏或炎症相关的抗原的抗体，可以列举例如：抗白介素6抗体[Immunol.Rev.,127,5(1992)]、抗白介素6受体抗体[Molecular Immunol.,31,371(1994)、Actemura^(R)]、抗白介素5抗体[Immunol.Rev.,127,5(1992)]、抗白介素5受体抗体、抗白介素4抗体[Cytokine,3,562(1991)]、抗白介素4受体抗体[J.Immunol.Methods,217,41(1998)]、抗肿瘤坏死因子抗体[Hybridoma,13,183(1994)、Humira^(R)]、抗肿瘤坏死因子受体抗体[Molecular Pharmacol.,58,237(2000)]、抗CCR4抗体[Nature,400,776,(1999)]、抗趋化因子抗体(Peri et al.,J.Immunol.Meth.,174,249-257,1994)以及抗趋化因子受体抗体[J.Exp.Med.,186,1373(1997)]等。作为识别与循环器官疾病相关的抗原的抗体，可以列举例如：抗GPIIb/IIIa抗体[J.Immunol.,152,2968(1994)]、抗血小板来源的生长因子抗体[サイエンス(Science),253,1129(1991)]、抗血小板来源的生长因子受体抗体[J.Biol.Chem.,272,17400(1997)]、抗血液凝固因子抗体[CirculatioN,101,1158(2000)]、抗IgE抗体、抗αVβ3抗体以及α4β7抗体等。

作为识别与病毒或细菌感染相关的抗原的抗体，可以列举例如：抗gp120抗体[Structure,8,385(2000)]、抗CD4抗体[J.Rheumatology,25,2065(1998)]、抗CCR5抗体、抗志贺毒素抗体[J.Clin.Microbiol.,37,396(1999)]以及抗M2抗体(日本特开2003-235575号公报)等。

通过本发明的方法生产的单克隆抗体的效应活性可以通过各种方法进行调控。已知例如：对抗体的Fc区的第297位的天冬酰胺(Asn)上结合的N连接复合型糖链的还原末端上存在的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上α-1,6连接的岩藻糖(也称为核心岩藻糖)的量进行调控的方法(国际公开第05/035586号、国际公开第02/31140号、国际公开第00/61739号)；以及通过改变抗体的Fc区的氨基酸残基来进行调控的方法；等。通过本发明的方法生产的单克隆抗体可以使用任意一种方法调控效应活性。

“效应活性”是指经由抗体的Fc区而引起的抗体依赖性活性，已知抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)、补体依赖性细胞毒活性(CDC活性)或者巨噬细胞或树突细胞等吞噬细胞的抗体依赖性吞噬作用(Antibody-dependent phagocytosis，ADP活性)等。

另外，通过对利用本发明的方法生产的单克隆抗体的Fc区的N连接复合型糖链的核心岩藻糖的含量进行调控，能够增加或降低抗体的效应活性。

作为使抗体的Fc区上结合的N连接复合型糖链上结合的岩藻糖的含量降低的方法，可以通过使用α1,6-岩藻糖转移酶基因发生缺陷的CHO细胞表达抗体而获得未结合岩藻糖的抗体。未结合岩藻糖的抗体具有高ADCC活性。

另一方面，作为使抗体的Fc上结合的N连接复合型糖链上结合的岩藻糖的含量增加的方法，可以通过使用导入有α1,6-岩藻糖转移酶基因的宿主细胞表达抗体而获得结合有岩藻糖的抗体。结合有岩藻糖的抗体具有比未结合岩藻糖的抗体更低的ADCC活性。

另外，可以通过改变抗体的Fc区的氨基酸残基来增加或降低ADCC活性或CDC活性。例如，可以通过使用美国专利申请公开第2007/0148165号说明书中记载的抗体的Fc区的氨基酸序列来增加抗体的CDC活性。

另外，也可以通过进行美国专利第6737056号说明书、美国专利第7297775号说明书或美国专利第7317091号说明书中记载的氨基酸改变来增加或降低ADCC活性或CDC活性。

本发明中使用的“悬浮性哺乳动物细胞”是指不粘附于微珠或组织培养用培养器(也称为组织培养容器或粘附培养容器等)等培养细胞容易粘附且施加有涂层的细胞培养支持体上而能够悬浮于培养液中存活和增殖的细胞。

只要细胞不粘附于细胞培养支持体上，则可以是在培养液中以一个细胞的状态存活、增殖或者以多个细胞相互聚集而成的细胞团的状态存活、增殖中的任意一种状态。

另外，作为本发明中使用的悬浮性哺乳动物细胞，优选能够在不含胎牛血清(fetal calf serum，以下记作FCS)等的无血清培养基中不粘附于细胞培养支持体上而悬浮于培养液中存活和增殖的细胞，更优选能够在不含蛋白质的无蛋白培养基中以悬浮状态存活和增殖的哺乳动物细胞。

作为组织培养用培养器，只要是粘附培养用的施加有涂层的烧瓶、培养皿等则可以是任何一种培养器。具体而言，通过使用市售的组织培养烧瓶(グライナー公司制造)和粘附培养烧瓶(住友ベークライト公司制造)等，可以确认为悬浮性哺乳动物细胞。

作为本发明中使用的悬浮性哺乳动物细胞，可以是原来就具有悬浮性的性质的在悬浮培养中驯化而得到的细胞，也可以是使粘附性的哺乳动物细胞在悬浮性培养条件下驯化而得到的悬浮性哺乳动物细胞。

作为原来就具有悬浮性的性质的哺乳动物细胞，可以列举例如：PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和CHO-S细胞(Invitrogen公司制造)等。

上述“将粘附性的哺乳动物细胞在悬浮性培养条件下驯化而得到的悬浮性哺乳动物细胞”可以通过Mol.Biotechnol.2000,15(3),249-57中记载的方法或以下所示的方法等进行制作，可以通过建立与悬浮培养驯化前同样或者比悬浮培养驯化前更优良的增殖和存活的细胞来制作(J.Biotechnol.2007,130(3),282-90)。

“与悬浮培养驯化前同等”是指悬浮培养中驯化得到的细胞的存活率和增殖速度(倍增时间)等与悬浮培养驯化前的细胞相比实质上相同。

本发明中，作为使粘附性的哺乳动物细胞在悬浮性培养条件下驯化的方法，可以列举如下方法。将含有血清的培养基的血清含量减至1/10，以比较高的细胞浓度重复进行传代培养，在哺乳动物细胞能够存活和增殖的时刻进一步减少血清含量并重复进行传代培养。根据该方法，可以制作能够在无血清条件下存活、增殖的悬浮性哺乳动物细胞。

另外，也可以通过向培养液中添加适当的非离子性表面活性剂Pluronic-F68等并进行培养的方法来制作悬浮性哺乳动物细胞。

作为通过在悬浮性培养条件下驯化而成为悬浮性的粘附性的哺乳动物细胞，可以列举例如：小鼠骨髓瘤细胞NS0和CHO细胞等。

本发明中，作为悬浮性CHO细胞所具有的性质，在将该细胞以2×10⁵个细胞/mL进行悬浮培养的情况下，3～4天后培养结束时的细胞密度优选为5×10⁵个细胞/mL以上，更优选为8×10⁵个细胞/mL以上，特别优选为1×10⁶个细胞/mL以上，最优选为1.5×10⁶个细胞/mL以上。

另外，作为本发明的悬浮性哺乳动物细胞的倍增时间，优选为48小时以下，更优选为24小时以下，特别优选为18小时以下，最优选为11小时以下。

悬浮培养基可以使用例如CD-CHO培养基(Invitrogen公司)、EX-CELL 325-PF培养基(SAFC Biosciences公司)以及SFM4CHO培养基(HyClone公司)等市售的培养基。另外，也可以通过配合哺乳动物细胞的培养所需的糖类、氨基酸类等并进行制备而得到。

悬浮性哺乳动物细胞的培养可以使用能够进行悬浮培养的培养容器，通过能够进行悬浮培养的培养条件来进行。作为培养容器，可以使用例如：细胞培养用的96孔板(康宁公司)、T-烧瓶(BD公司)和三角烧瓶(康宁公司)等。

作为培养条件，例如可以在5％CO₂气氛中、37℃的培养温度下通过静置培养等来进行。也可以使用作为悬浮培养专用培养设备的Wave生物反应器(GE医疗集团生命科学部)等振荡培养装置等。

关于使用Wave生物反应装置的哺乳动物细胞的悬浮培养条件，可以通过GE医疗集团生命科学部主页http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/cellcult/wave_03_16.pdf中记载的方法进行。

除了振荡培养以外，也可以利用生物反应器等旋转搅拌装置进行培养。利用生物反应器的培养可以通过Cytotechnology(2006)52:199-207中记载的方法等进行。

本发明中，在使用悬浮性哺乳动物细胞以外的细胞株的情况下，也可以应用通过如上所述的方法在悬浮培养中驯化得到的且能够使用本发明的蛋白质生产方法的细胞株中的任意一种细胞株。

由悬浮性哺乳动物细胞生产的目标蛋白质的纯化可以通过从含有蛋白质的培养液或细胞破碎液中将目标蛋白质与目标蛋白质以外的杂质分离来进行。作为分离的方法，可以列举例如：离心、透析、硫酸铵沉淀、柱层析或过滤器等，可以利用目标蛋白质与杂质的物理化学性质的差异或在单一柱上的结合力的差异来进行。

纯化目标蛋白质的方法可以通过例如蛋白质实验记录(上)提取、分离和重组蛋白的表达(羊土社，冈田雅人、宫崎香编著，ISBN 9784897069180)中记载的方法来进行。

本说明书中引用的科学文献、专利、专利申请等参考文献的全部内容按照与各自具体记载的内容相同的程度作为参考援引到本说明书中。

以上，为便于理解，示出了优选实施方式对本发明进行了说明。以下，基于实施例对本发明更具体地进行说明，但上述说明和下述实施例只是为了例示的目的而提供，并不是为了限定本发明的目的而提供。因此，本发明的范围不受本说明书中具体记载的实施方式和实施例的限定而仅由权利要求书进行限定。

关于以下记载的克隆等与基因重组相关的各种实验技术，依据J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著、分子克隆第二版(Molecular Cloning 2nd edition)和Frederick M.Ausubel等编著、Current Protocols发行、Current Protocols inMolecular Biology(最新分子生物学实验操作指南)等中记载的基因工程方法进行。

实施例

[实施例1]抗人流感M2抗体表达转座子载体的制作

蛋白质表达用质粒载体使用包含含有插入在一对Tol2转座子序列之间的任意的人抗体基因和药剂选择标记基因的哺乳动物细胞用基因表达盒的质粒。

所使用的基因的DNA通过基于已知的碱基序列进行人工化学合成或者制作其两端序列的引物并以适当的DNA源为模板进行PCR来获得。为了之后的基因操作，在引物的端部附加限制性内切酶切割位点。

转座子序列使用由日本特开2003-235575号公报公开的非自主性Tol2转座子的碱基序列(序列号1)中第1位至第200位的碱基序列(Tol2-L序列)(序列号2)和第2285位至第2788位的碱基序列(Tol2-R序列)(序列号3)的碱基序列。

通过如下方法分别制作包含一对转座子序列的合成DNA片段(宝生物株式会社制造)。制作包含在Tol2-R序列的5’末端和3’末端这两个末端都连接有限制性内切酶NruI的识别序列的碱基序列的DNA片段。另外，制作包含在Tol2-L序列的5’末端连接有限制性内切酶FseI的识别序列且在3’末端连接有限制性内切酶AscI的识别序列的碱基序列的DNA片段。

接着，将制作的包含Tol2-R序列和Tol2-L序列的DNA片段插入包含编码抗人流感M2抗体Z3G1的氨基酸序列的碱基序列的表达载体N5LG1_M2_Z3载体(国际公开第06/061723号)中。

抗体基因表达盒使用在CMV增强子/启动子调控下插入编码抗人流感M2抗体Z3G1(ATCC Deposit No.PTA-5968；deposited March 13,2004,American Type CultureCollection,Manassas,VA,USA)的H链(序列号10)的碱基序列(序列号9)以及编码L链(序列号12)的碱基序列(序列号11)而得到的N5LG1_M2_Z3载体(国际公开第06/061723号)。

在M5LG1_M2_Z3载体的、包含抗体基因表达盒和选择标记基因表达盒的基因片段的5’末端侧存在的限制性内切酶NruI位点上插入包含Tol2-R序列的DNA片段。另外，在3’末端侧存在的限制性内切酶FseI和AscI位点上插入包含Tol2-L序列的DNA片段。

另外，在CMV增强子/启动子调控下将连接有编码抗放线菌酮基因(人核糖体蛋白质L36a的54位的脯氨酸突变为谷氨酰胺的基因)的碱基序列(序列号5)的抗放线菌酮基因表达盒插入到连接有Tol2转座子序列的N5LG1_M2_Z3载体的FseI识别位点，构建抗人流感M2抗体转座子表达载体(图1)。

另一方面，将不含转座子序列的载体命名为抗人流感M2抗体表达载体，作为对照载体使用(图2)。

[实施例2]转座酶表达载体的制作

转座酶使用与目标抗体的表达载体独立的表达载体来表达。即，将编码来源于青鳉的Tol2转座酶的基因(序列号4)插入到pCAGGS载体(Gene 108,193-200,1991)的CAGGS启动子的下游，制作Tol2转座酶表达载体(以下，简记为Tol2载体)(图3)。

[实施例3]使用哺乳动物细胞的转化体的制作

(1)悬浮化CHO细胞的制作

将在添加有10％血清(FCS)的α-MEM培养基(Invitrogen公司)中培养的粘附性CHO细胞通过胰蛋白酶处理进行剥离、回收，使用新的添加有10％FCS的α-MEM培养基，在37℃、5％CO₂孵育箱内进行振荡培养。几天后，确认这些细胞进行增殖后，以2×10⁵个/mL的浓度接种到添加有5％FCS的α-MEM培养基中并进行振荡培养。

再过几天后，使用添加有5％FCS的α-MEM培养基进行同样的接种操作。最后使用不含血清的α-MEM培养基重复进行传代、振荡培养，确认与血清存在下的培养具有同样的增殖能力，制作悬浮培养驯化株。

(2)生产抗体的CHO细胞的制作

作为表达载体，使用实施例1和实施例2的抗人流感M2抗体表达转座子载体(以下，简记为转座子载体)和Tol2载体pCAGGS-T2TP[图3、Kawakami K&Noda T.Genetics.166,895-899(2004)]。另外，作为对照，使用不具有转座子序列的抗人流感M2抗体表达载体。

将上述表达载体导入到在悬浮培养中驯化而得到的CHO-K1细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，目录号CCL-61)或HEK293细胞(Invitrogen公司，FreeStyle 293F细胞)中，并对得到抗放线菌酮克隆的频率进行比较。

使各4×10⁶个的细胞悬浊于400μL的PBS中，将抗人流感M2抗体表达转座子载体(10μg)与Tol2载体(25μg)通过电穿孔法以环状DNA的状态进行共导入。需要说明的是，Tol2载体使Tol2转座酶暂时性地表达，因此，为了防止重组到宿主染色体中而以环状DNA的状态导入。

另外，作为对照，根据利用标准的电穿孔的基因导入法，将抗人流感M2抗体表达载体(10μg)利用限制性内切酶形成为直链状后，导入各细胞中。

电穿孔使用电穿孔仪(Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司制造))，在电压300V、静电容量500μF、室温的条件下使用间隙宽度为4mm的小池(Bio-Rad公司制造)进行。

通过电穿孔导入基因后，将各细胞接种到3块96孔板上，并将CHO细胞使用SAFCBiosciences公司的EX-CELL 325-PF培养基在CO₂孵育箱内培养3天，将HEK293细胞使用freeStyle-293培养基(Invitrogen公司)在CO₂孵育箱内培养3天。

接着，从基因导入4天后的培养基更换开始，加入3μg/mL的放线菌酮，在放线菌酮存在下进行培养，每周进行培养基更换，并培养3周。

培养3周后，计数观察到抗放线菌酮菌落的孔数。

将该结果示于表1和表2。

表1抗放线菌酮细胞数的比较(CHO细胞)

表2抗放线菌酮细胞数的比较(NEK293细胞)

如表1所示，在悬浮性CHO-K1细胞中导入有抗人流感M2抗体表达转座子载体或抗人流感M2抗体表达载体后，与其他细胞株同样地不会由导入有抗人流感M2抗体表达载体的细胞获得放线菌酮抗性的转化株，但由抗人流感M2抗体表达转座子载体导入细胞以高频率得到放线菌酮抗性的转化株。

另一方面，如表2所示，即使在HEK293细胞中导入抗人流感M2抗体表达转座子载体或抗人流感M2抗体表达载体中的任意一种表达载体，也不会获得放线菌酮抗性的转化株。

由这些结果可知，悬浮性哺乳动物细胞中，插入在一对转座子序列之间的编码目标蛋白质的基因和抗放线菌酮基因高效地导入到宿主细胞的染色体内。

(3)悬浮性CHO细胞和粘附性CHO细胞中的抗体生产的研究

为了研究悬浮性CHO细胞或者粘附性CHO细胞中的抗体生产效率，对各细胞株中的抗体的产生量进行研究。作为悬浮性CHO细胞，使用在悬浮培养中驯化后的悬浮性CHO-K1细胞。另外，作为粘附性CHO细胞，使用悬浮培养驯化前的粘附性CHO-K1细胞。

分别以抗人流感M2抗体表达转座子载体(10μg)和Tol2载体(25μg)对悬浮性CHO-K1细胞和粘附性CHO-K1细胞进行电穿孔。然后，将悬浮性CHO-K1细胞和粘附性CHO-K1细胞分别接种到3块96孔板上。

对于悬浮性CHO-K1细胞，使用悬浮细胞用培养基(SAFC Biosciences公司的EX-CELL 325-PF)，对于粘附性CHO-K1细胞，使用添加有10％血清的α-MEM培养基(Invitrogen公司)。将各细胞在CO₂孵育箱内培养3天，从电穿孔4天后的培养基更换开始，在3μg/mL的放线菌酮存在下培养3周。此时，每周进行培养基更换。

对于悬浮性CHO-K1细胞，将1×10⁶个的细胞接种到6孔板上，在CO₂孵育箱内振荡培养3天，使用培养上清，通过HPLC测定抗人流感M2抗体的蛋白质量。

对于粘附性CHO-K1细胞，在6孔板中达到汇合成片后(2×10⁶个)进行培养基更换，静置培养3天后，使用培养上清，通过HPLC测定抗体蛋白质量。

培养上清中的抗体浓度的测定通过FEMS Yeast Res.,7,(2007),1307-1316中记载的方法进行。将结果示于图4。

如图4A所示，对于在悬浮培养中驯化后的CHO-K1细胞而言，多数得到显示出极高的抗体表达量的细胞。另一方面，如图4B所示，对于粘附性的CHO-K1细胞而言，仅得到显示出HPLC的检测限(5μg/mL)以下的表达量的细胞。

由这些结果发现，由于使用转座子载体来表达目标蛋白质，因此，能够在使用悬浮性哺乳动物细胞的情况下高表达目标蛋白质。

另外，由实施例1～3的结果可知，本发明的方法可以作为使用在悬浮培养中驯化后的悬浮性哺乳动物细胞来高效地制作高表达外源基因的生产细胞、生产目标蛋白质的新方法利用。

[实施例4]利用Tol1转座子的抗体表达细胞的制作以及抗体制造

(1)抗人流感M2抗体表达Tol1转座子载体的制作

与实施例1同样，蛋白质表达用质粒载体使用包含含有插入在一对Tol1转座子序列之间的任意的人抗体基因和药剂选择标记基因的、哺乳动物细胞用基因表达盒的质粒。

所使用的基因的DNA通过基于已知的序列信息进行人工化学合成或者制作其两端序列的引物并以适当的DNA源为模板进行PCR来获得。为了之后的基因操作，在引物的端部附加限制性内切酶切割位点。

转座子序列使用由序列表的序列号13表示的非自主性Tol1转座子的碱基序列(国际公开第2008/072540号)中第1位至第200位的碱基序列(Tol1-L序列)(序列号14)和第1351位至第1855位的碱基序列(Tol1-R序列)(序列号15)。

通过如下方法分别制作包含一对转座子序列的合成DNA片段。制作包含在Tol1-R序列的5’末端和3’末端这两个末端都连接有限制性内切酶NruI的识别序列的碱基序列的DNA片段。另外，制作包含在Tol1-L序列的5’末端连接有限制性内切酶FseI的识别序列且在3’末端连接有限制性内切酶AscI的识别序列的碱基序列的DNA片段。

接着，将制作的包含Tol1-R序列和Tol1-L序列的DNA片段插入到N5LG1_M2_Z3载体中。在N5LG1_M2_Z3载体的、包含抗体基因表达盒和选择标记基因表达盒的基因片段的5’末端侧存在的限制性内切酶NruI位点上插入包含Tol1-R序列的DNA片段，在3’末端侧存在的限制性内切酶FseI和AscI位点上插入包含Tol1-L序列的DNA片段。

另外，在CMV增强子/启动子调控下，将连接有抗放线菌酮基因(人核糖体蛋白质L36a的54位的脯氨酸突变为谷氨酰胺的基因)(序列号7)的抗放线菌酮基因表达盒插入到连接有Tol1转座子序列的N5LG1_M2_Z3载体的FseI识别位点，构建抗人流感M2抗体Tol1转座子表达载体(图5)。

(2)Tol1转座酶表达载体的制作

转座酶使用与目标抗体的表达载体独立的表达载体来表达。即，在CMV增强子/启动子调控下，将连接有由序列号16表示的碱基序列构成的编码来源于青鳉的Tol1转座酶(序列号17)的DNA片段的Tol1转座酶基因表达盒插入到pBluescriptII SK(+)(Stratagene公司制造)中，作为Tol1转座酶表达载体pTol1ase利用(图6)。

(3)生产抗体的CHO细胞的制作

使用上述(1)～(3)中制作的表达载体，通过与实施例3同样的方法对利用Tol1转座子的表达载体的导入效果进行研究。将该结果示于表3。

表3

如表3所示，在悬浮性CHO-K1细胞中导入抗人流感M2抗体表达Tol1转座子载体时，与导入有抗人流感M2抗体表达Tol2转座子载体的实施例3同样地，以高频率得到放线菌酮抗性的转化株。

由该结果可知，在悬浮性哺乳动物细胞中，即使使用来源于Tol1转座子的碱基序列即转座子序列，也会将插入在两个转座子序列之间的抗体基因和抗放线菌酮基因高效地导入宿主细胞的染色体内。

(4)悬浮性CHO细胞中的抗体生产的研究

使用Tol1转座子，与实施例3的(3)同样地对悬浮性CHO细胞中的抗体生产效率进行研究。

培养上清中的抗体浓度的测定通过FEMS Yeast Res.,7,(2007),1307-1316中记载的方法进行。将结果示于图7。

如图7所示，在使用来源于Tol1转座子的碱基序列即转座子序列的情况下，与Tol2同样地，多数也得到显示出极高的抗体表达量的细胞。由该结果可知，在使用来源于Tol1转座子的碱基序列作为转座子序列的情况下，与使用来源于Tol2转座子的碱基序列时同样地得到高表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。

[实施例5]抗人CD98抗体的制作

(1)抗人CD98抗体重链表达转座子载体和抗人CD98抗体轻链表达转座子载体的制作

为了制作具有由序列号20和23的氨基酸序列表示的可变区H链和L链的抗人CD98抗体，在各抗体可变区连接人IgG1抗体恒定区的氨基酸序列，制作H链和L链的氨基酸序列。

连接有信号序列的抗人CD98抗体重链可变区和轻链可变区的基因序列(序列号18、21)使用日本专利第4324637号公报中公开的重组到(N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L载体)中的序列，转座子序列、启动子等使用与实施例1同样的转座子序列、启动子，分别构建抗人CD98抗体重链表达转座子载体(简记为CD98H载体)和抗人CD98抗体轻链表达转座子载体(简记为CD98L载体)(图8、9)。

所使用的DNA片段通过基于已知的序列进行人工化学合成或者制作其两端序列的引物并以适当的DNA源为模板进行PCR来获得。为了之后的重组操作，在引物的端部附加限制性内切酶切割位点。

(2)抗放线菌酮基因表达转座子载体的制作

在实施例1中记载的CMV增强子/启动子调控下连接编码抗放线菌酮基因的序列(序列号7)，在该抗放线菌酮基因表达盒的两端插入一对转座子序列(Tol-2L、Tol2-R)，构建抗放线菌酮基因表达转座子载体(以下，简记为CHX载体)(图10)。

所使用的DNA片段通过基于已知的序列进行人工化学合成或者制作其两端序列的引物并以适当的DNA源为模板进行PCR来获得。为了之后的基因操作，在引物的端部附加限制性内切酶切割位点。

(3)生产抗人CD98抗体的CHO细胞的制作

将上述(1)和(2)中制作的CD98H载体(图8)、CD98L载体(图9)、CHX载体(图10)以及实施例2中制作的Tol2载体(图3)导入在悬浮培养中驯化后的CHO-K1细胞中，并对高表达抗体的细胞的出现数进行比较。

在实验区，使4×10⁶个CHO-K1细胞悬浊于400μL的PBS中，将CD98H载体(10μg)、CD98L载体(10μg)、CHX载体(10μg)和Tol2载体(10μg)通过电穿孔法以环状DNA的状态进行共导入。Tol2载体使Tol2转座酶暂时性地表达，因此，为了防止重组到宿主染色体中而以环状DNA的状态导入。电穿孔使用电穿孔仪(Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司制造))，在电压300V、静电容量500μF、室温的条件下使用间隙宽度为4mm的小池(Bio-Rad公司制造)进行。

另外，在对照区，将CD98H载体(10μg)、CD98L载体(10μg)和CHX载体(10μg)分别利用限制性内切酶PciI(宝生物公司)形成为直链状后，与上述同样地进行电穿孔。

通过电穿孔导入基因后，将各小池的细胞悬浊于添加有0.5％大豆水解物的CDOptiCHO培养基(Invitrogen公司)(以下记作0.5CD培养基)中，接种到1块96孔板上，在CO₂孵育箱内培养4天。接着，从基因导入后5天后的培养基更换开始，使用添加有3μg/mL的放线菌酮(Sigma-Aldrich公司，C4859)的0.5CD培养基，在放线菌酮存在下进行培养，每周进行培养基更换，并培养4周。

培养4周后，通过利用FRET(荧光共振能量转移)的夹心法(LENCE^TM、パーキンエルマー公司)对抗体的表达进行定量。关于抗体高表达细胞，将培养上清中的抗体浓度为5.0μg/mL以上的表达的克隆作为抗体表达的细胞进行测量，将其结果示于表4。

表4

如表4所示，将Tol2载体与抗人CD98抗体重链表达转座子载体、抗人CD98抗体轻链表达载体和抗放线菌酮基因载体一起共导入到悬浮性CHO-K1细胞的实验区中，观察到大量抗人CD98抗体表达细胞，但在没有共导入Tol2载体的对照区中，尽管使载体形成线状，也没有观察到抗人CD98抗体表达细胞。

[实施例6]抗人CD98抗体的制造

(1)包含抗人CD98抗体重链基因片段、抗人CD98抗体轻链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体的制作

在实施例5(1)中制作的抗人CD98抗体重链表达转座子载体中分别连接该实施例5(1)中制作的抗人CD98抗体轻链表达基因盒和实施例5(2)中制作的抗放线菌酮基因盒，与上述同样地使用合成DNA、PCR法，构建包含抗人CD98抗体重链基因片段、抗人CD98抗体轻链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(以下，简记为CD98-CHX串联载体)。

(2)包含抗人CD98抗体重链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体的制作

在实施例5(1)中制作的抗人CD98抗体重链表达转座子载体中分别连接实施例5(2)中所示的抗放线菌酮基因盒，与上述同样地使用合成DNA、PCR法，构建包含抗人CD98抗体重链和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(简记为CD98H-CHX表达转座子载体)。

(3)生产抗人CD98抗体的CHO细胞的制作

使用上述实施例5(1)和(2)以及上述实施例6(1)和(2)中制作的表达转座子载体，对将抗人CD98抗体的H链和L链利用同一表达载体进行基因导入的情况(对照区)、将抗人CD98抗体的H链、L链或抗放线菌酮基因分别利用不同的表达载体进行基因导入的情况(实验区1)、以及将H链或L链利用不同的表达载体进行基因导入的情况(实验区2)下的、高表达抗CD98抗体的细胞的出现数进行比较。

在实验区1，使4×10⁶个CHO-K1细胞悬浊于400μL的PBS中，将CD98H载体(10μg)、CD98L载体(10μg)、CHX载体(10μg)和Tol2载体(10μg)通过电穿孔法以环状DNA的状态进行共导入。

在实验区2，使4×10⁶个CHO-K1细胞悬浊于400μL的PBS中，将CD98H-CHX载体(10μg)、CD98L载体(10μg)和Tol2载体(10μg)通过电穿孔法以环状DNA的状态进行共导入。

在对照区，使4×10⁶个CHO-K1细胞悬浊于400μL的PBS中，将CD98-CHX串联载体(10μg)、Tol2载体(20μg)通过电穿孔法以环状DNA的状态进行共导入。另外，在全部实验中，为了暂时性地表达Tol2转座酶，并且为了防止重组到宿主染色体中，将Tol2载体以环状DNA的状态导入。

以下的方法中，通过与实施例5(3)同样的方法，进行抗体生产细胞的出现率的确认。对于抗体表达细胞，将培养上清中的抗体浓度为3.0μg/mL以上的克隆作为抗体表达的细胞进行测量。将其结果示于表5。

表5

在导入有CD98H载体、CD98L载体和CHX载体的实验区1、以及导入有CD98H载体和CD98L载体的实验区2，高表达抗人CD98抗体的细胞的出现率大幅增加。

以上的结果表明，与将抗体重链基因与抗体轻链基因重组到同一表达载体中而得到的表达载体导入悬浮性CHO细胞中时相比，在将抗体重链基因和抗体轻链基因分别插入在不同的转座子序列之间的表达载体共导入到悬浮性CHO细胞中的情况下，能够更容易地获得以及制造抗体高生产株。另外，由实验区1和实验区2的结果可知，即使在导入的载体为多个的情况下，抗药性基因(选择标记基因)为至少一个即足够。另外可知，抗药性基因可以位于重组有抗体重链基因的表达载体上，也可以位于分别独立的载体上。

以上的结果表明，作为以往困难的向悬浮性哺乳动物细胞中将配置在两个以上载体上的基因同时高效地导入细胞中的方法，转座子载体是有效的。另外表明，为了高生产由多个多肽构成的蛋白质和多个蛋白质，有效的是将各多肽或蛋白质利用不同的转座子载体导入细胞中。

(4)生产抗人CD98抗体的CHO细胞的培养

分别由上述实施例6(3)中得到的导入有CD98-CHX串联载体的细胞以及导入有CD98H-CHX载体和CD98L载体的细胞，对抗体表达量高的前3株比较抗体表达量。实验的细节如下所示。

将实施例6(3)中得到的利用放线菌酮抗性选择且表达抗人CD98抗体的CHO-K1细胞依次在96孔板、24孔板、6孔板(康宁公司)中放大培养。在放大培养后，测定培养上清中的抗体浓度，选择出高表达抗人CD98抗体的CHO细胞的前3株。接着，将选择出的3株以分别达到2×10⁵个/mL的方式悬浊于0.5％CD培养基(Invitrogen公司)0.5CD培养基3mL中，使用6孔板，在37℃、5％CO₂的气氛中旋转培养5天。通过HPLC(Waters公司)对培养5天后的培养基中的抗体量进行定量。将其结果示于表6。

表6

如表6所示可知，共导入有CD98H载体和CD98L载体的CHO-K1细胞与导入有CD98-CHX串联载体的CHO-K1细胞相比，抗体生产量更高。

以上的结果表明，通过将抗体重链基因与抗体轻链基因分别插入在不同的一对转座子序列之间的表达载体共导入到悬浮性CHO细胞中，不仅能够容易地获得以及制造抗体高生产株，而且所得到的细胞具有高抗体生产率。

[实施例7]抗人肿瘤坏死因子-α(TNFα)抗体的制造

(1)包含抗人TNFα抗体重链基因片段、抗人TNFα抗体轻链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体的制作

为了制作具有序列号26和29的氨基酸序列的抗人TNFα抗体，将实施例6(1)中制作的包含抗人CD98抗体重链基因片段、轻链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(CD98-CHX串联载体)的VH和VL基因片段分别取代成来源于抗人TNFα抗体的VH和VL，构建抗人TNFα抗体重链基因片段、抗人TNFα抗体轻链基因片段和抗放线菌酮基因表达转座子载体(以下，简记为TNFα-CHX串联载体)。

关于抗人TNFα抗体重链基因和轻链基因的序列，制作在ヒュミラ^(R)皮下注40mg审查报告书(独立行政法人药品医疗器械综合机构，2008年2月14日)图2和图1中记载的阿达木单抗(基因重组)的重链可变区亚单位或轻链可变区亚单位的氨基酸序列(序列号25、28)上连接有信号序列的氨基酸序列(序列号26、29)，以氨基酸序列不发生改变的方式确定碱基序列，使用合成DNA制作抗人TNFα抗体重链基因和轻链基因的序列(序列号24、27)。为了之后的基因操作，在人工序列的端部附加限制性内切酶切割位点。

(2)包含抗人TNFα抗体重链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体的制作

将实施例6(2)中制作的包含抗人CD98抗体重链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(CD98H-CHX载体)的VH基因片段位点改变成抗人TNFα抗体VH基因片段，构建包含抗人TNFα抗体重链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(以下，简记为TNFαH-CHX载体)。抗人TNFα抗体重链基因使用与本项(1)所示的序列相同的序列。

(3)抗人TNFα抗体轻链基因表达转座子载体的制作

将实施例6(1)中制作的抗人CD98抗体轻链基因表达转座子载体(CD98L载体)的轻链基因位点改变成抗人TNFα抗体轻链，构建抗人TNFα抗体轻链基因表达转座子载体(以下，简记为TNFαL载体)。抗人TNFα抗体VL基因使用与本项(1)所示的序列相同的序列。

(4)生产抗人TNFα抗体的CHO细胞的制作

为了制作生产抗人TNFα抗体的CHO-K1细胞，将上述(1)中制作的TNFα-CHX串联载体(20μg)与实施例2中制作的Tol2转座酶表达载体(Tol2载体)(10μg)导入实施例3(1)中制作的在悬浮培养中驯化而得到的CHO-K1细胞中(对照区)。

同样地，将上述(2)和(3)中制作的TNFαH-CHX载体(10μg)、TNFαL载体(10μg)、Tol2载体(10μg)分别以环状DNA的状态进行共导入(实验区)。用5块96孔板进行基因导入细胞的培养，除此以外，与实施例6同样地进行基因导入、细胞培养等，对高表达抗体的细胞的出现数进行比较。关于抗体高表达细胞，将培养上清中的抗体浓度为3.0μg/mL以上的克隆作为抗体表达的细胞进行测量。将该结果示于表7。

表7

如表7所示，与实施例6中进行的抗人CD98抗体的生产细胞同样地共导入有TNFαH-CHX载体和TNFαL载体的CHO-K1细胞与导入有TNFα-CHX串联载体的CHO-K1细胞相比，高表达抗人TNFα抗体的细胞的出现率高约4倍。

该结果表明，不论是何种抗体，通过将分别重组在不同的表达载体中的插入在一对转座子序列之间的抗体重链基因和抗体轻链基因共导入到悬浮性CHO细胞中，都能够容易地获得以及制造抗体高生产株。

(5)生产抗人TNFα抗体的CHO细胞的培养

从上述(4)中得到的导入有TNFα-CHX串联载体的细胞以及共导入有TNFαH-CHX载体和TNFαL载体的细胞中选择出利用放线菌酮抗性进行筛选且表达抗人TNFα抗体的细胞，依次在96孔板、24孔板、之后在6孔板上进行放大培养。对于成功进行放大培养后的导入有TNFα-CHX串联载体的4株细胞以及共导入有TNFαH-CHX载体和TNFαL载体的52株细胞，除了使培养期间为7天以外，与实施例6(4)同样地对细胞进行培养，测量抗体表达量。将结果示于图11。

结果，共导入有TNFαH-CHX载体和TNFαL载体的CHO-K1细胞与导入有TNFα-CHX串联载体的CHO-K1细胞相比，显示出高约2.4倍的抗体生产量。

结果，与实施例6(4)同样地，通过将抗体重链基因和抗体轻链基因分别重组在不同的一对转座子序列之间的表达载体共导入到悬浮性CHO细胞中，不仅能够容易地获得以及制造抗体高生产株，而且所得到的细胞具有高抗体生产率。

[实施例8]抗人CD20抗体的制造

(1)包含抗人CD20抗体重链基因片段、抗人CD20抗体轻链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体的制作

为了制作包含由序列号32和35的氨基酸序列表示的VH和VL的抗人CD20抗体，将实施例6(1)中制作的CD98-CHX串联载体的抗体VH或VL基因位点分别取代成来源于抗人CD20抗体的VH或VL，构建包含抗人CD20抗体重链基因片段、抗人CD20抗体轻链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(以下，简记为CD20-CHX串联载体)。

关于抗人CD20抗体VH区和VL区的基因序列，制作GenBank登录号AR000013中记载的碱基序列以及リツキサン^(R)注10mg/mL审查报告书(卫研发第3395号，2003年8月28日)附件中记载的利妥昔单抗的VH和VL的氨基酸序列(序列号32、35)上连接有信号序列的氨基酸序列(序列号31、34)，以氨基酸序列不发生改变的方式确定碱基序列，使用合成DNA制作抗人CD20抗体VH区和VL区的基因序列(序列号30、33)。为了之后的基因操作，在人工序列的端部附加限制性内切酶切割位点。

(2)包含抗人CD20抗体重链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体的制作

将实施例6(2)中制作的CD98H-CHX载体抗体VH基因位点改变为来源于抗人CD20抗体的VH，构建包含抗人CD20抗体重链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(以下，简记为CD20H-CHX载体)。抗人CD20抗体重链基因使用与上述(1)所示的序列相同的序列。

(3)抗人CD20抗体轻链基因表达转座子载体的制作

将实施例6(1)中制作的CD98L载体抗体VL基因位点改变为来源于抗人CD20抗体的VL，构建抗人CD20抗体轻链基因表达转座子载体(以下，称为CD20L载体)。抗人CD20抗体重轻基因使用与上述(1)所示的序列相同的序列。

(4)生产抗人CD20抗体的CHO细胞的制作

为了制作生产抗人CD20抗体的CHO-K1细胞，将上述(1)中制作的CD20-CHX串联载体和实施例2中制作的Tol2转座酶表达载体(Tol2载体)导入实施例3(1)中制作的在悬浮培养中驯化而得到的CHO-K1细胞中(对照区)。

同样地，将上述(2)和(3)中制作的CD20H-CHX载体(10μg)、CD20L载体(10μg)与Tol2载体(10μg)一起共导入到CHO-K1细胞中(实验区)。用5块96孔板进行基因导入细胞的培养，除此以外，与实施例6同样地进行基因导入、细胞培养等，对高表达抗体的细胞的出现数进行比较。另外，将抗体浓度为3.0μg/mL以上的孔作为表达抗体的孔进行测量。将其结果示于表8。

表8

结果，共导入有CD20H-CHX载体和CD20L载体的CHO-K1细胞与导入有CD20-CHX串联载体的CHO-K1细胞相比，高表达抗人CD20抗体的细胞的出现率高约3倍。

结果表明，得到与实施例6(3)或实施例7(3)中实施的抗人CD98抗体、抗人TNFα抗体同样的结果，不论是何种抗体，通过将抗体重链基因和抗体轻链基因分别重组在不同的转座子序列之间的表达载体共导入到悬浮性CHO细胞中，都能够容易地获得以及制造抗体高生产株。

(5)生产抗人CD20抗体的CHO细胞的培养

从上述(3)中得到的导入有CD20-CHX串联载体的细胞以及共导入有CD20H-CHX载体和CD20L载体的细胞中选择出利用放线菌酮抗性进行筛选且表达抗人CD20抗体的细胞，依次在96孔板、24孔板、之后在6孔板上进行放大培养。对于成功进行放大培养后的4株对照区细胞以及50株实验区细胞，除了使培养期间为7天以外，与实施例6(4)同样地对细胞进行培养，测量抗体表达量。将结果示于图12。

如图12所示可知，共导入有CD20H-CHX载体和CD20L载体的CHO-K1细胞与导入有CD20-CHX串联载体的CHO-K1细胞相比，具有高约1.6倍的抗体生产率。

结果，得到与实施例6(4)、实施例7(5)中实施的抗人CD98抗体、抗人TNFα抗体的生产率同样的结果，通过将抗体重链基因和抗体轻链基因分别重组在不同的转座子序列之间的表达载体共导入到悬浮性CHO细胞中，不仅能够容易地获得以及制造抗体高生产株，而且所得到的细胞具有高抗体生产率。

[实施例9]表达抗新霉素基因和抗人CD98表达抗体的转座子载体的制作

(1)野生型抗新霉素基因和抗人CD98表达抗体的转座子载体的制作

蛋白质表达用质粒载体使用包含含有插入在一对来源于Tol2的碱基序列之间的任意的人抗体基因和抗药性标记基因的哺乳动物细胞用基因表达盒的质粒。

分别合成包含Tol2-R序列或Tol2-L序列的DNA片段来使用。

作为抗体重链基因表达盒，制备基于抗人CD98抗体N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L载体(日本专利第4324637号公报)扩增得到的、含有在CMV启动子调控下编码抗体H链的碱基序列(序列号18)的DNA片段，作为抗体轻链基因表达盒，制备基于抗人CD98抗体N5KG1-ValC2IgG1NS/I117L载体扩增得到的、含有在SV40启动子调控下编码抗体轻链的碱基序列(序列号21)的DNA片段。

作为抗新霉素基因表达盒，制备具有由在SV40启动子调控下编码抗新霉素基因的碱基序列构成的DNA(由序列号36和Genbank登录号U47120.2表示的碱基序列构成的编码新霉素磷酸转移酶的DNA)的DNA片段。

将上述的抗体重链基因表达盒、抗体轻链基因表达盒和抗新霉素基因表达盒连接，再在其两端连接含有Tol2-R序列的DNA片段和含有Tol2-L序列的DNA片段，制作抗人CD98抗体表达载体A(图13)。

(2)具有改变型抗新霉素基因1的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作

将(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号37表示的碱基序列构成的改变型抗新霉素基因1，制作抗人CD98抗体表达转座子载体B。

改变型抗新霉素基因1与野生型抗新霉素基因编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的22％的167个碱基进行了改变。具体而言，以使全部32个亮氨酸残基中的25个亮氨酸残基所对应的密码子变为TTA的方式进行了改变。

(3)具有改变型抗新霉素基因2的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作

将(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号38表示的碱基序列构成的改变型抗新霉素基因2，制作抗人CD98抗体表达转座子载体C。

改变型抗新霉素基因2与野生型抗新霉素基因编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的23％的180个碱基进行了改变。具体而言，以使全部32个亮氨酸残基中的28个亮氨酸残基所对应的密码子变为TTA的方式进行了改变。

(4)具有改变型抗新霉素基因3的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作

将(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号39表示的碱基序列构成的改变型抗新霉素基因3，制作抗人CD98抗体表达转座子载体D。

改变型抗新霉素基因3与野生型抗新霉素基因编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的26％的203个碱基进行了改变。具体而言，以使全部32个亮氨酸残基中的30个亮氨酸残基所对应的密码子变为TTA的方式进行了改变。

[实施例10]利用表达改变型抗新霉素基因的抗体生产CHO细胞的抗体生产

将实施例9(1)～(4)中制作的抗人CD98抗体表达转座子载体A～D与表达由序列号40表示的氨基酸序列构成的Tol2转座酶的载体pCAGGS-T2TP[Kawakami K&NodaT.Genetics.166,895-899(2004)]一起分别导入悬浮化CHO-K1细胞中，制作抗体生产细胞A～D。

载体向悬浮CHO细胞中的导入通过如下方法进行：将CHO细胞(4×10⁶个)悬浊于400μL的PBS缓冲液中，通过电穿孔法将保持环状DNA状态的抗人CD98抗体表达转座子载体(10μg)和Tol2转座酶表达载体pCAGGS-T2TP(20μg)进行共导入。

在此，为了暂时性地表达Tol2转座酶，将Tol2转座酶表达载体也以环状DNA的状态导入。

另外，作为不使用Tol2转座酶的对照，利用限制性内切酶PciI(宝生物公司)使实施例19(4)的抗人CD98抗体表达转座子载体D(10μg)形成直链状后，通过电穿孔法导入悬浮化CHO-K1细胞中。

电穿孔使用电穿孔仪[Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司制造)]，在电压300V、静电容量500μF、室温的条件下使用间隙宽度为4mm的小池(Bio-Rad公司制造)进行。

通过电穿孔导入基因后，将各小池的细胞接种到1块96孔板中，使用添加有5％大豆水解物的CD OptiCHO培养基(Invitrogen公司)在CO₂孵育箱内培养3天。

接着，从基因导入4天后的培养基更换开始，添加G418(Geneticin^(R)，Invitrogen公司)使终浓度为500μg/mL，在G418存在下进行培养，每周进行培养基更换，并培养3周。

培养后，通过利用FRET(荧光共振能量转移)的夹心法使用LANCE^(R)分析试剂(パーキンエルマー公司)对抗体的表达进行定量。将其结果示于表9。

表9

如表9所示，表达改变型抗新霉素基因的细胞B～D中，与表达野生型抗新霉素基因的细胞A相比，抗人CD98抗体的表达量更高。

特别是，对于表达改变型抗新霉素基因3的抗人CD98抗体生产细胞D而言，得到了显示出表达野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体生产细胞A的10倍的表达的细胞株。

另外，对于即使使用改变型抗新霉素基因3但未共导入Tol2转座酶表达载体的对照细胞而言，尽管已使载体形成线状，但仍未能得到抗人CD98抗体表达细胞。

[实施例11]表达抗嘌呤霉素基因和抗人CD98抗体的转座子载体的制作

(1)具有改变型抗嘌呤霉素基因1的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作

将实施例9(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号41表示的碱基序列构成的改变型抗嘌呤霉素基因1，制作抗人CD98抗体表达转座子载体E。

改变型抗嘌呤霉素基因1与由序列号42表示的碱基序列构成的野生型抗嘌呤霉素基因(嘌呤霉素-N-乙酰转移酶基因，由Genbank登录号U07648.1中公开的碱基序列构成)编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的3％的17个碱基进行了改变。具体而言，通过改变使抗嘌呤霉素基因中含有的全部28个丙氨酸残基中的17个丙氨酸残基所对应的密码子成为GCG，与野生型中已为GCG的密码子合并，使全部丙氨酸残基所对应的密码子均为GCG。

(2)具有改变型抗嘌呤霉素基因2的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作

将实施例9(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号43表示的碱基序列构成的改变型抗嘌呤霉素基因2，制作抗人CD98抗体表达转座子载体F。改变型抗嘌呤霉素基因2与野生型抗嘌呤霉素基因编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的14％的79个碱基进行了改变。具体而言，在改变型抗嘌呤霉素基因1的丙氨酸残基所对应的密码子改变的基础上，使亮氨酸残基所对应的密码子为TTA、使缬氨酸残基所对应的密码子为GTA、使丝氨酸的密码子为TCG。

[实施例12]利用表达改变型抗嘌呤霉素基因的抗体生产CHO细胞生产抗体之1

将实施例11(1)的具有改变型抗嘌呤霉素基因1的抗人CD98抗体表达转座子载体E、实施例11(2)的具有改变型抗嘌呤霉素基因2的抗人CD98抗体表达转座子载体F、Tol2转座酶表达载体pCAGGS-T2TP导入悬浮化的CHO-K1细胞中，制作抗体生产细胞E和F。

载体向悬浮性CHO细胞中的导入通过如下方法进行：将悬浮化CHO细胞(4×10⁶个)悬浊于400μL的PBS缓冲液中，通过电穿孔法将保持环状DNA状态的具有改变型抗嘌呤霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体(10μg)和pCAGGS-T2TP(20μg)进行共导入。

在此，为了暂时性地表达Tol2转座酶，将Tol2转座酶表达载体pCAGGS-T2TP也以环状DNA的状态导入。

接着，从基因导入2天后的培养基更换开始，添加嘌呤霉素(P9620，Sigma-Aldrich公司)使终浓度为5μg/mL，每周用含有嘌呤霉素的培养基进行培养基更换，并培养4周。

培养后，通过利用FRET(荧光共振能量转移)的夹心法使用LANCE^(R)分析试剂(パーキンエルマー公司)对抗体的表达进行定量。将其结果示于表2。

表10

由表10所示，表达改变型抗嘌呤霉素基因2的抗体生产细胞F显示出表达改变型抗嘌呤霉素基因1的抗体生产细胞E的2倍以上的抗体生产量。

[实施例13]利用表达改变型抗嘌呤霉素基因的抗体生产CHO细胞的生产抗体之2

将实施例12中得到的表达改变型抗嘌呤霉素基因2的抗体生产细胞F在三角烧瓶中进行培养，生产抗人CD98抗体。

具体而言，将抗体生产细胞F依次在96孔板、24孔板、之后在6孔板中进行放大培养。选出细胞数充分增加后的抗体生产细胞F2株(细胞株1和细胞株2)，分别以2×10⁵个/ml悬浊于35ml添加有5％大豆水解物的CD OptiCHO培养基(Invitrogen公司)中，使用容量为125ml的三角烧瓶(带通气孔盖，康宁公司)，在37℃、5％CO₂的气氛中旋转培养1周，生产抗人CD98抗体。

使用HPLC(Waters公司)对培养后的培养基中的抗体量进行定量。将其结果示于表11。

表11

	细胞株1	细胞株2
			抗体表达量(mg/L)	15.6	14.8

以上的结果显示，悬浮性CHO细胞中，插入在一对转座子序列之间的抗体基因和改变型抗药性基因被高效地导入宿主的染色体内，而且对高表达细胞的筛选有效。另外可知，所得到的细胞能够进行放大培养，在悬浮培养条件下能够进行目标蛋白质的生产。

参考特定的方式对本发明进行了详细说明，但对本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的意图和范围的情况下可以进行各种变更和变形。

本申请基于2010年12月15日提出的日本专利申请2010-279849，其内容作为参考并入本说明书中。

产业上的可利用性

根据本发明的蛋白质的生产方法，能够使用悬浮性哺乳动物细胞高效地生产目标蛋白质。本发明的细胞能够作为用于生产基因重组蛋白质的蛋白质生产细胞使用。

序列表自由文本

序列号1-人工序列的说明；非自主性Tol2转座子的碱基序列

序列号2-人工序列的说明；Tol2-L序列

序列号3-人工序列的说明；Tol2-R序列

序列号7-人工序列的说明；抗放线菌酮基因的碱基序列

序列号8-人工序列的说明；抗放线菌酮基因所编码的蛋白质的氨基酸序列

序列号9-人工序列的说明；编码M2Z3抗体H链的碱基序列

序列号10-人工序列的说明；M2Z3抗体H链的氨基酸序列

序列号11-人工序列的说明；编码M2Z3抗体L链的碱基序列

序列号12-人工序列的说明；M2Z3抗体L链的氨基酸序列

序列号13-人工序列的说明；非自主性Tol1的碱基序列

序列号14-人工序列的说明；Tol1-L序列

序列号15-人工序列的说明；Tol1-R序列

序列号18-人工序列的说明；编码CD98抗体重链可变区的碱基序列

序列号19-人工序列的说明；CD98抗体重链可变区的氨基酸序列

序列号20-人工序列的说明；CD98抗体重链可变区的氨基酸序列

序列号21-人工序列的说明；编码CD98抗体轻链可变区的碱基序列

序列号22-人工序列的说明；CD98抗体轻链可变区的氨基酸序列

序列号23-人工序列的说明；CD98抗体轻链可变区的氨基酸序列

序列号24-人工序列的说明；编码抗人TNFα抗体重链可变区的碱基序列

序列号25-人工序列的说明；抗人TNFα抗体重链可变区的氨基酸序列

序列号26-人工序列的说明；抗人TNFα抗体重链可变区的氨基酸序列

序列号27-人工序列的说明；编码抗人TNFα抗体轻链可变区的碱基序列

序列号28-人工序列的说明；抗人TNFα抗体轻链可变区的氨基酸序列

序列号29-人工序列的说明；抗人TNFα抗体轻链可变区的氨基酸序列

序列号30-人工序列的说明；编码抗人CD20抗体重链可变区的碱基序列

序列号31-人工序列的说明；抗人CD20抗体重链可变区的氨基酸序列

序列号32-人工序列的说明；抗人CD20抗体重链可变区的氨基酸序列

序列号33-人工序列的说明；编码抗人CD20抗体轻链可变区的碱基序列

序列号34-人工序列的说明；抗人CD20抗体轻链可变区的氨基酸序列

序列号35-人工序列的说明；抗人CD20抗体轻链可变区的氨基酸序列

序列号36-人工序列的说明；野生型抗新霉素基因的碱基序列

序列号37-人工序列的说明；改变型抗新霉素基因的碱基序列

序列号38-人工序列的说明；改变型抗新霉素基因的碱基序列

序列号39-人工序列的说明；改变型抗新霉素基因的碱基序列

序列号41-人工序列的说明；改变型抗嘌呤霉素基因的碱基序列

序列号42-人工序列的说明；野生型抗嘌呤霉素基因的碱基序列

序列号43-人工序列的说明；改变型抗嘌呤霉素基因的碱基序列

序列号44-人工序列的说明；改变型抗嘌呤霉素基因的碱基序列

序列号45-人工序列的说明；改变型抗博莱霉素基因的碱基序列

序列号46-人工序列的说明；改变型抗博莱霉素基因的碱基序列

序列号47-人工序列的说明；改变型抗潮霉素基因的碱基序列

序列号48-人工序列的说明；改变型抗潮霉素基因的碱基序列

序列表

<110> 大学共同利用机关法人情报·系统研究机构（Inter-University ResearchInstitute Corporation Research Organization of Information and Systems）

协和发酵麒麟株式会社（Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.）

<120> 蛋白质的生产方法（Protein production method）

<130> SPI171689-31

<150> JP2010-279849

<151> 2010-12-15

<160> 60

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2788

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence; nonautologus Tol2 transposon

<400> 1

cagaggtgta aagtacttga gtaattttac ttgattactg tacttaagta ttatttttgg 60

ggatttttac tttacttgag tacaattaaa aatcaatact tttactttta cttaattaca 120

tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180

ttattttttg gagatcactt cattctattt tcccttgcta ttaccaaacc aattgaattg 240

cgctgatgcc cagtttaatt taaatgttat ttattctgcc tatgaaaatc gttttcacat 300

tatatgaaat tggtcagaca tgttcattgg tcctttggaa gtgacgtcat gtcacatcta 360

ttaccacaat gcacagcacc ttgacctgga aattagggaa attataacag tcaatcagtg 420

gaagaaaatg gaggaagtat gtgattcatc agcagctgcg agcagcacag tccaaaatca 480

gccacaggat caagagcacc cgtggccgta tcttcgcgaa ttcttttctt taagtggtgt 540

aaataaagat tcattcaaga tgaaatgtgt cctctgtctc ccgcttaata aagaaatatc 600

ggccttcaaa agttcgccat caaacctaag gaagcatatt gaggtaagta cattaagtat 660

tttgttttac tgatagtttt tttttttttt tttttttttt tttttgggtg tgcatgtttt 720

gacgttgatg gcgcgccttt tatatgtgta gtaggcctat tttcactaat gcatgcgatt 780

gacaatataa ggctcacgta ataaaatgct aaaatgcatt tgtaattggt aacgttaggt 840

ccacgggaaa tttggcgcct attgcagctt tgaataatca ttatcattcc gtgctctcat 900

tgtgtttgaa ttcatgcaaa acacaagaaa accaagcgag aaattttttt ccaaacatgt 960

tgtattgtca aaacggtaac actttacaat gaggttgatt agttcatgta ttaactaaca 1020

ttaaataacc atgagcaata catttgttac tgtatctgtt aatctttgtt aacgttagtt 1080

aatagaaata cagatgttca ttgtttgttc atgttagttc acagtgcatt aactaatgtt 1140

aacaagatat aaagtattag taaatgttga aattaacatg tatacgtgca gttcattatt 1200

agttcatgtt aactaatgta gttaactaac gaaccttatt gtaaaagtgt taccatcaaa 1260

actaatgtaa tgaaatcaat tcaccctgtc atgtcagcct tacagtcctg tgtttttgtc 1320

aatataatca gaaataaaat taatgtttga ttgtcactaa atgctactgt atttctaaaa 1380

tcaacaagta tttaacatta taaagtgtgc aattggctgc aaatgtcagt tttattaaag 1440

ggttagttca cccaaaaatg aaaataatgt cattaatgac tcgccctcat gtcgttccaa 1500

gcccgtaaga cctccgttca tcttcagaac acagtttaag atattttaga tttagtccga 1560

gagctttctg tgcctccatt gagaatgtat gtacggtata ctgtccatgt ccagaaaggt 1620

aataaaaaca tcaaagtagt ccatgtgaca tcagtgggtt agttagaatt ttttgaagca 1680

tcgaatacat tttggtccaa aaataacaaa acctacgact ttattcggca ttgtattctc 1740

ttccgggtct gttgtcaatc cgcgttcacg acttcgcagt gacgctacaa tgctgaataa 1800

agtcgtaggt tttgttattt ttggaccaaa atgtattttc gatgcttcaa ataattctac 1860

ctaacccact gatgtcacat ggactacttt gatgttttta ttacctttct ggacatggac 1920

agtataccgt acatacattt tcagtggagg gacagaaagc tctcggacta aatctaaaat 1980

atcttaaact gtgttccgaa gatgaacgga ggtgttacgg gcttggaacg acatgagggt 2040

gagtcattaa tgacatcttt tcatttttgg gtgaactaac cctttaatgc tgtaatcaga 2100

gagtgtatgt gtaattgtta catttattgc atacaatata aatatttatt tgttgttttt 2160

acagagaatg cacccaaatt acctcaaaaa ctactctaaa ttgacagcac agaagagaaa 2220

gatcgggaca gatctcatat gctcgagggc ccatctggcc tgtgtttcag acaccaggga 2280

gtctctgctc acgtttcctg ctatttgcag cctctctatc aagactaata cacctcttcc 2340

cgcatcggct gcctgtgaga ggcttttcag cactgcagga ttgcttttca gccccaaaag 2400

agctaggctt gacactaaca attttgagaa tcagcttcta ctgaagttaa atctgaggtt 2460

ttacaacttt gagtagcgtg tactggcatt agattgtctg tcttatagtt tgataattaa 2520

atacaaacag ttctaaagca ggataaaacc ttgtatgcat ttcatttaat gttttttgag 2580

attaaaagct taaacaagaa tctctagttt tctttcttgc ttttactttt acttccttaa 2640

tactcaagta caattttaat ggagtacttt tttactttta ctcaagtaag attctagcca 2700

gatactttta cttttaattg agtaaaattt tccctaagta cttgtacttt cacttgagta 2760

aaatttttga gtacttttta cacctctg 2788

<210> 2

<211> 200

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence; Tol2-L transposon sequence

<400> 2

cagaggtgta aagtacttga gtaattttac ttgattactg tacttaagta ttatttttgg 60

ggatttttac tttacttgag tacaattaaa aatcaatact tttactttta cttaattaca 120

tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180

ttattttttg gagatcactt 200

<210> 3

<211> 504

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence; Tol2-R transposon sequence

<400> 3

ctgctcacgt ttcctgctat ttgcagcctc tctatcaaga ctaatacacc tcttcccgca 60

tcggctgcct gtgagaggct tttcagcact gcaggattgc ttttcagccc caaaagagct 120

aggcttgaca ctaacaattt tgagaatcag cttctactga agttaaatct gaggttttac 180

aactttgagt agcgtgtact ggcattagat tgtctgtctt atagtttgat aattaaatac 240

aaacagttct aaagcaggat aaaaccttgt atgcatttca tttaatgttt tttgagatta 300

aaagcttaaa caagaatctc tagttttctt tcttgctttt acttttactt ccttaatact 360

caagtacaat tttaatggag tactttttta cttttactca agtaagattc tagccagata 420

cttttacttt taattgagta aaattttccc taagtacttg tactttcact tgagtaaaat 480

ttttgagtac tttttacacc tctg 504

<210> 4

<211> 2156

<212> DNA

<213> Oryzias latipes

<220>

<221> CDS

<222> (85)..(2034)

<400> 4

acgtcatgtc acatctatta ccacaatgca cagcaccttg acctggaaat tagggaaatt 60

ataacagtca atcagtggaa gaaa atg gag gaa gta tgt gat tca tca gca 111

Met Glu Glu Val Cys Asp Ser Ser Ala

1 5

gct gcg agc agc aca gtc caa aat cag cca cag gat caa gag cac ccg 159

Ala Ala Ser Ser Thr Val Gln Asn Gln Pro Gln Asp Gln Glu His Pro

10 15 20 25

tgg ccg tat ctt cgc gaa ttc ttt tct tta agt ggt gta aat aaa gat 207

Trp Pro Tyr Leu Arg Glu Phe Phe Ser Leu Ser Gly Val Asn Lys Asp

30 35 40

tca ttc aag atg aaa tgt gtc ctc tgt ctc ccg ctt aat aaa gaa ata 255

Ser Phe Lys Met Lys Cys Val Leu Cys Leu Pro Leu Asn Lys Glu Ile

45 50 55

tcg gcc ttc aaa agt tcg cca tca aac cta agg aag cat att gag aga 303

Ser Ala Phe Lys Ser Ser Pro Ser Asn Leu Arg Lys His Ile Glu Arg

60 65 70

atg cac cca aat tac ctc aaa aac tac tct aaa ttg aca gca cag aag 351

Met His Pro Asn Tyr Leu Lys Asn Tyr Ser Lys Leu Thr Ala Gln Lys

75 80 85

aga aag atc ggg acc tcc acc cat gct tcc agc agt aag caa ctg aaa 399

Arg Lys Ile Gly Thr Ser Thr His Ala Ser Ser Ser Lys Gln Leu Lys

90 95 100 105

gtt gac tca gtt ttc cca gtc aaa cat gtg tct cca gtc act gtg aac 447

Val Asp Ser Val Phe Pro Val Lys His Val Ser Pro Val Thr Val Asn

110 115 120

aaa gct ata tta agg tac atc att caa gga ctt cat cct ttc agc act 495

Lys Ala Ile Leu Arg Tyr Ile Ile Gln Gly Leu His Pro Phe Ser Thr

125 130 135

gtt gat ctg cca tca ttt aaa gag ctg att agt aca ctg cag cct ggc 543

Val Asp Leu Pro Ser Phe Lys Glu Leu Ile Ser Thr Leu Gln Pro Gly

140 145 150

att tct gtc att aca agg cct act tta cgc tcc aag ata gct gaa gct 591

Ile Ser Val Ile Thr Arg Pro Thr Leu Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ala

155 160 165

gct ctg atc atg aaa cag aaa gtg act gct gcc atg agt gaa gtt gaa 639

Ala Leu Ile Met Lys Gln Lys Val Thr Ala Ala Met Ser Glu Val Glu

170 175 180 185

tgg att gca acc aca acg gat tgt tgg act gca cgt aga aag tca ttc 687

Trp Ile Ala Thr Thr Thr Asp Cys Trp Thr Ala Arg Arg Lys Ser Phe

190 195 200

att ggt gta act gct cac tgg atc aac cct gga agt ctt gaa aga cat 735

Ile Gly Val Thr Ala His Trp Ile Asn Pro Gly Ser Leu Glu Arg His

205 210 215

tcc gct gca ctt gcc tgc aaa aga tta atg ggc tct cat act ttt gag 783

Ser Ala Ala Leu Ala Cys Lys Arg Leu Met Gly Ser His Thr Phe Glu

220 225 230

gta ctg gcc agt gcc atg aat gat atc cac tca gag tat gaa ata cgt 831

Val Leu Ala Ser Ala Met Asn Asp Ile His Ser Glu Tyr Glu Ile Arg

235 240 245

gac aag gtt gtt tgc aca acc aca gac agt ggt tcc aac ttt atg aag 879

Asp Lys Val Val Cys Thr Thr Thr Asp Ser Gly Ser Asn Phe Met Lys

250 255 260 265

gct ttc aga gtt ttt ggt gtg gaa aac aat gat atc gag act gag gca 927

Ala Phe Arg Val Phe Gly Val Glu Asn Asn Asp Ile Glu Thr Glu Ala

270 275 280

aga agg tgt gaa agt gat gac act gat tct gaa ggc tgt ggt gag gga 975

Arg Arg Cys Glu Ser Asp Asp Thr Asp Ser Glu Gly Cys Gly Glu Gly

285 290 295

agt gat ggt gtg gaa ttc caa gat gcc tca cga gtc ctg gac caa gac 1023

Ser Asp Gly Val Glu Phe Gln Asp Ala Ser Arg Val Leu Asp Gln Asp

300 305 310

gat ggc ttc gaa ttc cag cta cca aaa cat caa aag tgt gcc tgt cac 1071

Asp Gly Phe Glu Phe Gln Leu Pro Lys His Gln Lys Cys Ala Cys His

315 320 325

tta ctt aac cta gtc tca agc gtt gat gcc caa aaa gct ctc tca aat 1119

Leu Leu Asn Leu Val Ser Ser Val Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ser Asn

330 335 340 345

gaa cac tac aag aaa ctc tac aga tct gtc ttt ggc aaa tgc caa gct 1167

Glu His Tyr Lys Lys Leu Tyr Arg Ser Val Phe Gly Lys Cys Gln Ala

350 355 360

tta tgg aat aaa agc agc cga tcg gct cta gca gct gaa gct gtt gaa 1215

Leu Trp Asn Lys Ser Ser Arg Ser Ala Leu Ala Ala Glu Ala Val Glu

365 370 375

tca gaa agc cgg ctt cag ctt tta agg cca aac caa acg cgg tgg aat 1263

Ser Glu Ser Arg Leu Gln Leu Leu Arg Pro Asn Gln Thr Arg Trp Asn

380 385 390

tca act ttt atg gct gtt gac aga att ctt caa att tgc aaa gaa gca 1311

Ser Thr Phe Met Ala Val Asp Arg Ile Leu Gln Ile Cys Lys Glu Ala

395 400 405

gga gaa ggc gca ctt cgg aat ata tgc acc tct ctt gag gtt cca atg 1359

Gly Glu Gly Ala Leu Arg Asn Ile Cys Thr Ser Leu Glu Val Pro Met

410 415 420 425

ttt aat cca gca gaa atg ctg ttc ttg aca gag tgg gcc aac aca atg 1407

Phe Asn Pro Ala Glu Met Leu Phe Leu Thr Glu Trp Ala Asn Thr Met

430 435 440

cgt cca gtt gca aaa gta ctc gac atc ttg caa gcg gaa acg aat aca 1455

Arg Pro Val Ala Lys Val Leu Asp Ile Leu Gln Ala Glu Thr Asn Thr

445 450 455

cag ctg ggg tgg ctg ctg cct agt gtc cat cag tta agc ttg aaa ctt 1503

Gln Leu Gly Trp Leu Leu Pro Ser Val His Gln Leu Ser Leu Lys Leu

460 465 470

cag cga ctc cac cat tct ctc agg tac tgt gac cca ctt gtg gat gcc 1551

Gln Arg Leu His His Ser Leu Arg Tyr Cys Asp Pro Leu Val Asp Ala

475 480 485

cta caa caa gga atc caa aca cga ttc aag cat atg ttt gaa gat cct 1599

Leu Gln Gln Gly Ile Gln Thr Arg Phe Lys His Met Phe Glu Asp Pro

490 495 500 505

gag atc ata gca gct gcc atc ctt ctc cct aaa ttt cgg acc tct tgg 1647

Glu Ile Ile Ala Ala Ala Ile Leu Leu Pro Lys Phe Arg Thr Ser Trp

510 515 520

aca aat gat gaa acc atc ata aaa cga ggc atg gac tac atc aga gtg 1695

Thr Asn Asp Glu Thr Ile Ile Lys Arg Gly Met Asp Tyr Ile Arg Val

525 530 535

cat ctg gag cct ttg gac cac aag aag gaa ttg gcc aac agt tca tct 1743

His Leu Glu Pro Leu Asp His Lys Lys Glu Leu Ala Asn Ser Ser Ser

540 545 550

gat gat gaa gat ttt ttc gct tct ttg aaa ccg aca aca cat gaa gcc 1791

Asp Asp Glu Asp Phe Phe Ala Ser Leu Lys Pro Thr Thr His Glu Ala

555 560 565

agc aaa gag ttg gat gga tat ctg gcc tgt gtt tca gac acc agg gag 1839

Ser Lys Glu Leu Asp Gly Tyr Leu Ala Cys Val Ser Asp Thr Arg Glu

570 575 580 585

tct ctg ctc acg ttt cct gct att tgc agc ctc tct atc aag act aat 1887

Ser Leu Leu Thr Phe Pro Ala Ile Cys Ser Leu Ser Ile Lys Thr Asn

590 595 600

aca cct ctt ccc gca tcg gct gcc tgt gag agg ctt ttc agc act gca 1935

Thr Pro Leu Pro Ala Ser Ala Ala Cys Glu Arg Leu Phe Ser Thr Ala

605 610 615

gga ttg ctt ttc agc ccc aaa aga gct agg ctt gac act aac aat ttt 1983

Gly Leu Leu Phe Ser Pro Lys Arg Ala Arg Leu Asp Thr Asn Asn Phe

620 625 630

gag aat cag ctt cta ctg aag tta aat ctg agg ttt tac aac ttt gag 2031

Glu Asn Gln Leu Leu Leu Lys Leu Asn Leu Arg Phe Tyr Asn Phe Glu

635 640 645

tag cgtgtactgg cattagattg tctgtcttat agtttgataa ttaaatacaa 2084

acagttctaa agcaggataa aaccttgtat gcatttcatt taatgttttt tgagattaaa 2144

agcttaaaca ag 2156

<210> 5

<211> 649

<212> PRT

<213> Oryzias latipes

<400> 5

Met Glu Glu Val Cys Asp Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Thr Val Gln

1 5 10 15

Asn Gln Pro Gln Asp Gln Glu His Pro Trp Pro Tyr Leu Arg Glu Phe

20 25 30

Phe Ser Leu Ser Gly Val Asn Lys Asp Ser Phe Lys Met Lys Cys Val

35 40 45

Leu Cys Leu Pro Leu Asn Lys Glu Ile Ser Ala Phe Lys Ser Ser Pro

50 55 60

Ser Asn Leu Arg Lys His Ile Glu Arg Met His Pro Asn Tyr Leu Lys

65 70 75 80

Asn Tyr Ser Lys Leu Thr Ala Gln Lys Arg Lys Ile Gly Thr Ser Thr

85 90 95

His Ala Ser Ser Ser Lys Gln Leu Lys Val Asp Ser Val Phe Pro Val

100 105 110

Lys His Val Ser Pro Val Thr Val Asn Lys Ala Ile Leu Arg Tyr Ile

115 120 125

Ile Gln Gly Leu His Pro Phe Ser Thr Val Asp Leu Pro Ser Phe Lys

130 135 140

Glu Leu Ile Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Ser Val Ile Thr Arg Pro

145 150 155 160

Thr Leu Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ala Ala Leu Ile Met Lys Gln Lys

165 170 175

Val Thr Ala Ala Met Ser Glu Val Glu Trp Ile Ala Thr Thr Thr Asp

180 185 190

Cys Trp Thr Ala Arg Arg Lys Ser Phe Ile Gly Val Thr Ala His Trp

195 200 205

Ile Asn Pro Gly Ser Leu Glu Arg His Ser Ala Ala Leu Ala Cys Lys

210 215 220

Arg Leu Met Gly Ser His Thr Phe Glu Val Leu Ala Ser Ala Met Asn

225 230 235 240

Asp Ile His Ser Glu Tyr Glu Ile Arg Asp Lys Val Val Cys Thr Thr

245 250 255

Thr Asp Ser Gly Ser Asn Phe Met Lys Ala Phe Arg Val Phe Gly Val

260 265 270

Glu Asn Asn Asp Ile Glu Thr Glu Ala Arg Arg Cys Glu Ser Asp Asp

275 280 285

Thr Asp Ser Glu Gly Cys Gly Glu Gly Ser Asp Gly Val Glu Phe Gln

290 295 300

Asp Ala Ser Arg Val Leu Asp Gln Asp Asp Gly Phe Glu Phe Gln Leu

305 310 315 320

Pro Lys His Gln Lys Cys Ala Cys His Leu Leu Asn Leu Val Ser Ser

325 330 335

Val Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ser Asn Glu His Tyr Lys Lys Leu Tyr

340 345 350

Arg Ser Val Phe Gly Lys Cys Gln Ala Leu Trp Asn Lys Ser Ser Arg

355 360 365

Ser Ala Leu Ala Ala Glu Ala Val Glu Ser Glu Ser Arg Leu Gln Leu

370 375 380

Leu Arg Pro Asn Gln Thr Arg Trp Asn Ser Thr Phe Met Ala Val Asp

385 390 395 400

Arg Ile Leu Gln Ile Cys Lys Glu Ala Gly Glu Gly Ala Leu Arg Asn

405 410 415

Ile Cys Thr Ser Leu Glu Val Pro Met Phe Asn Pro Ala Glu Met Leu

420 425 430

Phe Leu Thr Glu Trp Ala Asn Thr Met Arg Pro Val Ala Lys Val Leu

435 440 445

Asp Ile Leu Gln Ala Glu Thr Asn Thr Gln Leu Gly Trp Leu Leu Pro

450 455 460

Ser Val His Gln Leu Ser Leu Lys Leu Gln Arg Leu His His Ser Leu

465 470 475 480

Arg Tyr Cys Asp Pro Leu Val Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ile Gln Thr

485 490 495

Arg Phe Lys His Met Phe Glu Asp Pro Glu Ile Ile Ala Ala Ala Ile

500 505 510

Leu Leu Pro Lys Phe Arg Thr Ser Trp Thr Asn Asp Glu Thr Ile Ile

515 520 525

Lys Arg Gly Met Asp Tyr Ile Arg Val His Leu Glu Pro Leu Asp His

530 535 540

Lys Lys Glu Leu Ala Asn Ser Ser Ser Asp Asp Glu Asp Phe Phe Ala

545 550 555 560

Ser Leu Lys Pro Thr Thr His Glu Ala Ser Lys Glu Leu Asp Gly Tyr

565 570 575

Leu Ala Cys Val Ser Asp Thr Arg Glu Ser Leu Leu Thr Phe Pro Ala

580 585 590

Ile Cys Ser Leu Ser Ile Lys Thr Asn Thr Pro Leu Pro Ala Ser Ala

595 600 605

Ala Cys Glu Arg Leu Phe Ser Thr Ala Gly Leu Leu Phe Ser Pro Lys

610 615 620

Arg Ala Arg Leu Asp Thr Asn Asn Phe Glu Asn Gln Leu Leu Leu Lys

625 630 635 640

Leu Asn Leu Arg Phe Tyr Asn Phe Glu

645

<210> 6

<211> 4682

<212> DNA

<213> Oryzias latipes

<400> 6

cagaggtgta aagtacttga gtaattttac ttgattactg tacttaagta ttatttttgg 60

ggatttttac tttacttgag tacaattaaa aatcaatact tttactttta cttaattaca 120

tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180

ttattttttg gagatcactt cattctattt tcccttgcta ttaccaaacc aattgaattg 240

cgctgatgcc cagtttaatt taaatgttat ttattctgcc tatgaaaatc gttttcacat 300

tatatgaaat tggtcagaca tgttcattgg tcctttggaa gtgacgtcat gtcacatcta 360

ttaccacaat gcacagcacc ttgacctgga aattagggaa attataacag tcaatcagtg 420

gaagaaaatg gaggaagtat gtgattcatc agcagctgcg agcagcacag tccaaaatca 480

gccacaggat caagagcacc cgtggccgta tcttcgcgaa ttcttttctt taagtggtgt 540

aaataaagat tcattcaaga tgaaatgtgt cctctgtctc ccgcttaata aagaaatatc 600

ggccttcaaa agttcgccat caaacctaag gaagcatatt gaggtaagta cattaagtat 660

tttgttttac tgatagtttt tttttttttt tttttttttt tttttgggtg tgcatgtttt 720

gacgttgatg gcgcgccttt tatatgtgta gtaggcctat tttcactaat gcatgcgatt 780

gacaatataa ggctcacgta ataaaatgct aaaatgcatt tgtaattggt aacgttaggt 840

ccacgggaaa tttggcgcct attgcagctt tgaataatca ttatcattcc gtgctctcat 900

tgtgtttgaa ttcatgcaaa acacaagaaa accaagcgag aaattttttt ccaaacatgt 960

tgtattgtca aaacggtaac actttacaat gaggttgatt agttcatgta ttaactaaca 1020

ttaaataacc atgagcaata catttgttac tgtatctgtt aatctttgtt aacgttagtt 1080

aatagaaata cagatgttca ttgtttgttc atgttagttc acagtgcatt aactaatgtt 1140

aacaagatat aaagtattag taaatgttga aattaacatg tatacgtgca gttcattatt 1200

agttcatgtt aactaatgta gttaactaac gaaccttatt gtaaaagtgt taccatcaaa 1260

actaatgtaa tgaaatcaat tcaccctgtc atgtcagcct tacagtcctg tgtttttgtc 1320

aatataatca gaaataaaat taatgtttga ttgtcactaa atgctactgt atttctaaaa 1380

tcaacaagta tttaacatta taaagtgtgc aattggctgc aaatgtcagt tttattaaag 1440

ggttagttca cccaaaaatg aaaataatgt cattaatgac tcgccctcat gtcgttccaa 1500

gcccgtaaga cctccgttca tcttcagaac acagtttaag atattttaga tttagtccga 1560

gagctttctg tgcctccatt gagaatgtat gtacggtata ctgtccatgt ccagaaaggt 1620

aataaaaaca tcaaagtagt ccatgtgaca tcagtgggtt agttagaatt ttttgaagca 1680

tcgaatacat tttggtccaa aaataacaaa acctacgact ttattcggca ttgtattctc 1740

ttccgggtct gttgtcaatc cgcgttcacg acttcgcagt gacgctacaa tgctgaataa 1800

agtcgtaggt tttgttattt ttggaccaaa atgtattttc gatgcttcaa ataattctac 1860

ctaacccact gatgtcacat ggactacttt gatgttttta ttacctttct ggacatggac 1920

agtataccgt acatacattt tcagtggagg gacagaaagc tctcggacta aatctaaaat 1980

atcttaaact gtgttccgaa gatgaacgga ggtgttacgg gcttggaacg acatgagggt 2040

gagtcattaa tgacatcttt tcatttttgg gtgaactaac cctttaatgc tgtaatcaga 2100

gagtgtatgt gtaattgtta catttattgc atacaatata aatatttatt tgttgttttt 2160

acagagaatg cacccaaatt acctcaaaaa ctactctaaa ttgacagcac agaagagaaa 2220

gatcgggacc tccacccatg cttccagcag taagcaactg aaagttgact cagttttccc 2280

agtcaaacat gtgtctccag tcactgtgaa caaagctata ttaaggtaca tcattcaagg 2340

acttcatcct ttcagcactg ttgatctgcc atcatttaaa gagctgatta gtacactgca 2400

gcctggcatt tctgtcatta caaggcctac tttacgctcc aagatagctg aagctgctct 2460

gatcatgaaa cagaaagtga ctgctgccat gagtgaagtt gaatggattg caaccacaac 2520

ggattgttgg actgcacgta gaaagtcatt cattggtgta actgctcact ggatcaaccc 2580

tggaagtctt gaaagacatt ccgctgcact tgcctgcaaa agattaatgg gctctcatac 2640

ttttgaggta ctggccagtg ccatgaatga tatccactca gagtatgaaa tacgtgacaa 2700

ggttgtttgc acaaccacag acagtggttc caactttatg aaggctttca gagtttttgg 2760

tgtggaaaac aatgatatcg agactgaggc aagaaggtgt gaaagtgatg acactgattc 2820

tgaaggctgt ggtgagggaa gtgatggtgt ggaattccaa gatgcctcac gagtcctgga 2880

ccaagacgat ggcttcgaat tccagctacc aaaacatcaa aagtgtgcct gtcacttact 2940

taacctagtc tcaagcgttg atgcccaaaa agctctctca aatgaacact acaagaaact 3000

ctacagatct gtctttggca aatgccaagc tttatggaat aaaagcagcc gatcggctct 3060

agcagctgaa gctgttgaat cagaaagccg gcttcagctt ttaaggccaa accaaacgcg 3120

gtggaattca acttttatgg ctgttgacag aattcttcaa atttgcaaag aagcaggaga 3180

aggcgcactt cggaatatat gcacctctct tgaggttcca atgtaagtgt ttttcccctc 3240

tatcgatgta aacaaatgtg ggttgttttt gtttaatact ctttgattat gctgatttct 3300

cctgtaggtt taatccagca gaaatgctgt tcttgacaga gtgggccaac acaatgcgtc 3360

cagttgcaaa agtactcgac atcttgcaag cggaaacgaa tacacagctg gggtggctgc 3420

tgcctagtgt ccatcagtta agcttgaaac ttcagcgact ccaccattct ctcaggtact 3480

gtgacccact tgtggatgcc ctacaacaag gaatccaaac acgattcaag catatgtttg 3540

aagatcctga gatcatagca gctgccatcc ttctccctaa atttcggacc tcttggacaa 3600

atgatgaaac catcataaaa cgaggtaaat gaatgcaagc aacatacact tgacgaattc 3660

taatctgggc aacctttgag ccataccaaa attattcttt tatttattta tttttgcact 3720

ttttaggaat gttatatccc atctttggct gtgatctcaa tatgaatatt gatgtaaagt 3780

attcttgcag caggttgtag ttatccctca gtgtttcttg aaaccaaact catatgtatc 3840

atatgtggtt tggaaatgca gttagatttt atgctaaaat aagggatttg catgatttta 3900

gatgtagatg actgcacgta aatgtagtta atgacaaaat ccataaaatt tgttcccagt 3960

cagaagcccc tcaaccaaac ttttctttgt gtctgctcac tgtgcttgta ggcatggact 4020

acatcagagt gcatctggag cctttggacc acaagaagga attggccaac agttcatctg 4080

atgatgaaga ttttttcgct tctttgaaac cgacaacaca tgaagccagc aaagagttgg 4140

atggatatct ggcctgtgtt tcagacacca gggagtctct gctcacgttt cctgctattt 4200

gcagcctctc tatcaagact aatacacctc ttcccgcatc ggctgcctgt gagaggcttt 4260

tcagcactgc aggattgctt ttcagcccca aaagagctag gcttgacact aacaattttg 4320

agaatcagct tctactgaag ttaaatctga ggttttacaa ctttgagtag cgtgtactgg 4380

cattagattg tctgtcttat agtttgataa ttaaatacaa acagttctaa agcaggataa 4440

aaccttgtat gcatttcatt taatgttttt tgagattaaa agcttaaaca agaatctcta 4500

gttttctttc ttgcttttac ttttacttcc ttaatactca agtacaattt taatggagta 4560

cttttttact tttactcaag taagattcta gccagatact tttactttta attgagtaaa 4620

attttcccta agtacttgta ctttcacttg agtaaaattt ttgagtactt tttacacctc 4680

tg 4682

<210> 7

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence; Cycloheximide resistant gene

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(321)

<400> 7

atg gtc aac gta cct aaa acc cga aga acc ttc tgt aag aag tgt ggc 48

Met Val Asn Val Pro Lys Thr Arg Arg Thr Phe Cys Lys Lys Cys Gly

1 5 10 15

aag cat cag cct cac aaa gtg aca cag tat aag aag ggc aag gat tct 96

Lys His Gln Pro His Lys Val Thr Gln Tyr Lys Lys Gly Lys Asp Ser

20 25 30

ttg tat gcc cag gga agg agg cgc tat gat cgg aag cag agt ggc tat 144

Leu Tyr Ala Gln Gly Arg Arg Arg Tyr Asp Arg Lys Gln Ser Gly Tyr

35 40 45

ggt ggg cag aca aag caa att ttc cgg aag aag gct aag acc aca aag 192

Gly Gly Gln Thr Lys Gln Ile Phe Arg Lys Lys Ala Lys Thr Thr Lys

50 55 60

aag att gtg cta agg ctg gaa tgt gtt gag cct aac tgc aga tcc aag 240

Lys Ile Val Leu Arg Leu Glu Cys Val Glu Pro Asn Cys Arg Ser Lys

65 70 75 80

agg atg ctg gcc att aag aga tgc aag cat ttt gaa ctg gga gga gat 288

Arg Met Leu Ala Ile Lys Arg Cys Lys His Phe Glu Leu Gly Gly Asp

85 90 95

aag aag aga aag ggc caa gtg atc cag ttc taa 321

Lys Lys Arg Lys Gly Gln Val Ile Gln Phe

100 105

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 8

Met Val Asn Val Pro Lys Thr Arg Arg Thr Phe Cys Lys Lys Cys Gly

1 5 10 15

Lys His Gln Pro His Lys Val Thr Gln Tyr Lys Lys Gly Lys Asp Ser

20 25 30

Leu Tyr Ala Gln Gly Arg Arg Arg Tyr Asp Arg Lys Gln Ser Gly Tyr

35 40 45

Gly Gly Gln Thr Lys Gln Ile Phe Arg Lys Lys Ala Lys Thr Thr Lys

50 55 60

Lys Ile Val Leu Arg Leu Glu Cys Val Glu Pro Asn Cys Arg Ser Lys

65 70 75 80

Arg Met Leu Ala Ile Lys Arg Cys Lys His Phe Glu Leu Gly Gly Asp

85 90 95

Lys Lys Arg Lys Gly Gln Val Ile Gln Phe

100 105

<210> 9

<211> 1404

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> M2Z3 Heavy chain

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1404)

<400> 9

atg gac tgg acc tgg agc atc ctt ttc ttg gtg gca gca gca aca ggt 48

Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

gcc cac tcc cag gtt cag ctg gtg cag tct gga gct gag gtg aag aag 96

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

cct ggg gcc tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct ggt tac acc ttt 144

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

acc agc tat ggt atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt 192

Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

gag tgg atg gga tgg atc agc gct tac aat ggt aac aca aac tat gca 240

Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala

65 70 75 80

cag aag ctc cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg agc 288

Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

aca gcc tac atg gag ctg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg 336

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

tat tac tgt gcg agg gca gca gct ggc gga tac ttc cag cac tgg ggc 384

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Phe Gln His Trp Gly

115 120 125

cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc acc aag ggc cca tcg 432

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 480

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 528

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct 576

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg 624

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac 672

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt 720

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg 768

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 816

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 864

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg 912

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac 960

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 1008

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc 1056

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 1104

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc 1152

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag 1200

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc 1248

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg 1296

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg 1344

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct 1392

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

ccg ggt aaa tga 1404

Pro Gly Lys

465

<210> 10

<211> 467

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 10

Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala

65 70 75 80

Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Phe Gln His Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210> 11

<211> 708

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> M2Z3 Light chian

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(708)

<400> 11

atg gcc agc ttc cct ctc ctc ctc acc ctc ctc act cac tgt gca ggg 48

Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly

1 5 10 15

tcc tgg gcc cag tct gtg ctg act cag cca ccc tca gcg tct ggg acc 96

Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr

20 25 30

ccc ggg cag agg gtc acc atc tct tgt tct gga agc aac tcc aac atc 144

Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile

35 40 45

gga agt aaa act gta aac tgg tac cag cag ctc cca gga acg gcc ccc 192

Gly Ser Lys Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro

50 55 60

aaa ctc ctc atc tct agt aat aat cag cgg ccc tca ggg gtc cct gac 240

Lys Leu Leu Ile Ser Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

cga ttc tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc agt 288

Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser

85 90 95

ggg ctc cag tct gag gat gag gct gat tat tac tgt gca gca tgg gat 336

Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp

100 105 110

gac agc ctg aat ggt gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc 384

Asp Ser Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

115 120 125

cta ggt cag ccc aag gct gcc ccc tcg gtc act ctg ttc cca ccc tcc 432

Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser

130 135 140

tct gag gag ctt caa gcc aac aag gcc aca ctg gtg tgt ctc ata agt 480

Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser

145 150 155 160

gac ttc tac ccg gga gcc gtg aca gtg gcc tgg aag gca gat agc agc 528

Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser

165 170 175

ccc gtc aag gcg gga gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa agc aac 576

Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn

180 185 190

aac aag tac gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gag cag tgg 624

Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp

195 200 205

aag tcc cac aaa agc tac agc tgc cag gtc acg cat gaa ggg agc acc 672

Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr

210 215 220

gtg gag aag aca gtg gcc cct aca gaa tgt tca tag 708

Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

225 230 235

<210> 12

<211> 235

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 12

Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly

1 5 10 15

Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr

20 25 30

Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile

35 40 45

Gly Ser Lys Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Ser Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser

85 90 95

Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp

100 105 110

Asp Ser Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

115 120 125

Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser

145 150 155 160

Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser

165 170 175

Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn

180 185 190

Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp

195 200 205

Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr

210 215 220

Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

225 230 235

<210> 13

<211> 1855

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> nonautologus Tol1 transposon

<400> 13

cagtagcggt tctaggcacg ggccgtccgg gcggtggcct ggggcggaaa actgaagggg 60

ggcggcaccg gcggctcagc cctttgtaat atattaatat gcaccactat tggtttactt 120

atgtcacagt ttgtaagttt gtaacagcct gaacctggcc gcgccgccgc cctcgccccg 180

cagctgcgct ctcctgtctt tgagaagtag acacaaatgt gtgtgaagaa ggagaaggga 240

gggggcgcgg ggtgagcacg gagcgtcgcc gcgtttgcgc atgcgcaaaa cctggctggc 300

tcatctttca ggggaggcga cggtcgcggg cttgatgaaa aaaataaaag taaaaactgc 360

gactgcgccg tcatgtagcg aatcagcgcc cctggctgta gctgcacgcg ctcctgctgg 420

aaatgtgtga agaggggggg gggggggggg gctgcgggga atcagttcaa ttgtgggacg 480

cttccaaatt aagtggctag gtggggacaa gggcgggggt ttgaatctac ttcataaaac 540

ctttttatat tataagtcag tcataaggtg acattctata acctacattt taataaaggt 600

ataaaaaata tattctgctt tttttgggtt aattttgtgt gaaatgtcca aataaaaaaa 660

atggcaacac aaaacaatgc tgtcactaag gtgacagttg gttcagtcga cggacttgat 720

gccttcttcg tgacgtgagg acatttatgc caaacaaacg ccaataaaca tctaaaatat 780

ggaaaagaaa aggtcaaagc catctggtgc ccaatttaga aagaaaagaa aagaagaaga 840

ggagaaaaga gataaagaaa agggtaagtc ctcacagctt gatgcatgtt ttttctaaat 900

tctaatgcta cctgccctac aacaacgttg ccgatgaaaa ctttattttg gtcgatgacc 960

aacactgaat taggcccaaa tgttgcaaat agcgtcattt tttttttttt ttttagattt 1020

tattcttaaa aatttgctct gccttaactt gtaacattag ttatgattca tgtgtctgtc 1080

tgctctgctg taacacaaag gttttgttgg gttttgctgt tgtatactag ctcataatgt 1140

taaaaaagct gtgatggtta cacagcatgc tggtgctgcc ataagatgct aatggggcaa 1200

ataatttgag attggtcatt aatttaataa tcatttgtgg cagcctaaac gttttcacaa 1260

tgtttttttg acatttaact ggggatttag gggttaattt tgagcctgca tatgaagttt 1320

attttttatt tgttttacaa atgtgggatt atatttttag ccaatagaat ttccataaat 1380

ctgtaggtag ttttaaaaat gaatatttac catttactgc aactctatgg ggacaaaaca 1440

taatgtaaca ggtcataact aaaaatgtgc caatcaaagg attgaagacg gaaaacatga 1500

gttaattttt cttctctgaa gtagagatcg atatagaaca tgacaattta aatttccaat 1560

tcataaatgt ttttaaaata tttattttat attatttatt taacattgag tttgattcaa 1620

tattttctta gctaactgta tttttgccat gcttatggtc ttttattttt tgtgttctga 1680

taacttttat aatgcttttc agaattttga catcttttgt atccacttct taatttcaat 1740

gacaataaaa catttcagtt gacgaagaca aacaaagttc tgttgtgact atgggggggg 1800

ggggcgcctg gggatggtct cgcccgggga gtaattcagg gtagaaccgc cactg 1855

<210> 14

<211> 200

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Tol1-L transposon sequence

<400> 14

cagtagcggt tctaggcacg ggccgtccgg gcggtggcct ggggcggaaa actgaagggg 60

ggcggcaccg gcggctcagc cctttgtaat atattaatat gcaccactat tggtttactt 120

atgtcacagt ttgtaagttt gtaacagcct gaacctggcc gcgccgccgc cctcgccccg 180

cagctgcgct ctcctgtctt 200

<210> 15

<211> 505

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Tol1-R transoposon sequence

<400> 15

atatttttag ccaatagaat ttccataaat ctgtaggtag ttttaaaaat gaatatttac 60

catttactgc aactctatgg ggacaaaaca taatgtaaca ggtcataact aaaaatgtgc 120

caatcaaagg attgaagacg gaaaacatga gttaattttt cttctctgaa gtagagatcg 180

atatagaaca tgacaattta aatttccaat tcataaatgt ttttaaaata tttattttat 240

attatttatt taacattgag tttgattcaa tattttctta gctaactgta tttttgccat 300

gcttatggtc ttttattttt tgtgttctga taacttttat aatgcttttc agaattttga 360

catcttttgt atccacttct taatttcaat gacaataaaa catttcagtt gacgaagaca 420

aacaaagttc tgttgtgact atgggggggg ggggcgcctg gggatggtct cgcccgggga 480

gtaattcagg gtagaaccgc cactg 505

<210> 16

<211> 2745

<212> DNA

<213> Oryzias latipes

<220>

<221> CDS

<222> (30)..(2585)

<400> 16

gccaaacaaa cgccaaaaac atctaaaat atg gag aaa aaa agg tca aag cca 53

Met Glu Lys Lys Arg Ser Lys Pro

1 5

tct ggt gcc caa ttt aga aag aaa aga aaa gaa gaa gag gag aaa aga 101

Ser Gly Ala Gln Phe Arg Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Lys Arg

10 15 20

gat aaa gaa aag ggg gca ctt cta aga tat ttt gga tcg tct acc act 149

Asp Lys Glu Lys Gly Ala Leu Leu Arg Tyr Phe Gly Ser Ser Thr Thr

25 30 35 40

gct caa gat gag aca tct acc tcc ctg cca gct atc tca tca gcc aca 197

Ala Gln Asp Glu Thr Ser Thr Ser Leu Pro Ala Ile Ser Ser Ala Thr

45 50 55

gtc aca gtc tca ccc cct cag gat gag cta cca tct aca tcc tct gct 245

Val Thr Val Ser Pro Pro Gln Asp Glu Leu Pro Ser Thr Ser Ser Ala

60 65 70

act cat gta gtt cca cag ttg tta cct gag caa agt ttt gat agt gag 293

Thr His Val Val Pro Gln Leu Leu Pro Glu Gln Ser Phe Asp Ser Glu

75 80 85

gct gaa gac gtt gtt cca tct acg tct acc cag ctt gag act tca gaa 341

Ala Glu Asp Val Val Pro Ser Thr Ser Thr Gln Leu Glu Thr Ser Glu

90 95 100

atg cct ggt gat gaa acc cca ctg acc ccg act gct gag gac cag cct 389

Met Pro Gly Asp Glu Thr Pro Leu Thr Pro Thr Ala Glu Asp Gln Pro

105 110 115 120

cta cca act gac cct gca aag tgg ccc tca cct ctg act gac agg ata 437

Leu Pro Thr Asp Pro Ala Lys Trp Pro Ser Pro Leu Thr Asp Arg Ile

125 130 135

cgg atg gag ctg gtt cga aga gga cca agt agc ata cca cct gac ttt 485

Arg Met Glu Leu Val Arg Arg Gly Pro Ser Ser Ile Pro Pro Asp Phe

140 145 150

gtt ttc cca aga aat gac agt gat ggg aga agt tgt cat cac cac tat 533

Val Phe Pro Arg Asn Asp Ser Asp Gly Arg Ser Cys His His His Tyr

155 160 165

ttc agg aag aca cta gta agt ggt gaa aaa ata gca aga act tgg ttg 581

Phe Arg Lys Thr Leu Val Ser Gly Glu Lys Ile Ala Arg Thr Trp Leu

170 175 180

atg tat tca aaa gtg aag aac agc ctc ttt tgc ttt tgt tgc aaa ttg 629

Met Tyr Ser Lys Val Lys Asn Ser Leu Phe Cys Phe Cys Cys Lys Leu

185 190 195 200

ttt tcc aac aaa aac att aat tta aca act tct ggt aca gca aac tgg 677

Phe Ser Asn Lys Asn Ile Asn Leu Thr Thr Ser Gly Thr Ala Asn Trp

205 210 215

aaa cat gca agc aca tac ctc aca gca cac gaa aaa agc cca gaa cac 725

Lys His Ala Ser Thr Tyr Leu Thr Ala His Glu Lys Ser Pro Glu His

220 225 230

ctc aat tgt atg aaa gca tgg aag gaa ctg tca ggg agg atc aga agt 773

Leu Asn Cys Met Lys Ala Trp Lys Glu Leu Ser Gly Arg Ile Arg Ser

235 240 245

ggg aaa aca att gat aag cag gag atg gca ctt ctg gaa gag gag cgg 821

Gly Lys Thr Ile Asp Lys Gln Glu Met Ala Leu Leu Glu Glu Glu Arg

250 255 260

gtg aga tgg aga gca gtg cta acc cgt ctc att gct att gtg cag tca 869

Val Arg Trp Arg Ala Val Leu Thr Arg Leu Ile Ala Ile Val Gln Ser

265 270 275 280

ctg gca gtt cgg aat ttg gct cta agg gga cac aca gaa aca ctg ttc 917

Leu Ala Val Arg Asn Leu Ala Leu Arg Gly His Thr Glu Thr Leu Phe

285 290 295

aca tca tca aat ggg aat ttt ttg aaa gag gtt gaa ctg atg gcc agg 965

Thr Ser Ser Asn Gly Asn Phe Leu Lys Glu Val Glu Leu Met Ala Arg

300 305 310

ttt gat ccc ata atg aaa gat cat ctt aac cgt gta tta aga gga aca 1013

Phe Asp Pro Ile Met Lys Asp His Leu Asn Arg Val Leu Arg Gly Thr

315 320 325

gca agt cac aac agc tac ata ggc cat cat gtg cag aat gaa ctt att 1061

Ala Ser His Asn Ser Tyr Ile Gly His His Val Gln Asn Glu Leu Ile

330 335 340

gat ttg ttg agc agc aaa atc cta tcc gct ata gtg gat gac atc aaa 1109

Asp Leu Leu Ser Ser Lys Ile Leu Ser Ala Ile Val Asp Asp Ile Lys

345 350 355 360

aag gca aaa tat ttt tca ata att ctg gac tgc act ctg gat ata agc 1157

Lys Ala Lys Tyr Phe Ser Ile Ile Leu Asp Cys Thr Leu Asp Ile Ser

365 370 375

cac aca gaa cag ttg tca gtt ata att aga gtg gtg tca ctg atg gag 1205

His Thr Glu Gln Leu Ser Val Ile Ile Arg Val Val Ser Leu Met Glu

380 385 390

aag cct cag atc agg gaa cat ttt atg ggg ttt ttg gag gca gag gag 1253

Lys Pro Gln Ile Arg Glu His Phe Met Gly Phe Leu Glu Ala Glu Glu

395 400 405

tcc aca ggc cag cac ttg gca tcc atg atc tta aac aga ctt gag gag 1301

Ser Thr Gly Gln His Leu Ala Ser Met Ile Leu Asn Arg Leu Glu Glu

410 415 420

tta gga att tct ttt gaa gac tgc aga gga caa tca tat gat aat ggg 1349

Leu Gly Ile Ser Phe Glu Asp Cys Arg Gly Gln Ser Tyr Asp Asn Gly

425 430 435 440

gca aat atg aaa ggc aaa aat aag gga gta caa gcc agg ctc tta gaa 1397

Ala Asn Met Lys Gly Lys Asn Lys Gly Val Gln Ala Arg Leu Leu Glu

445 450 455

aag aat ccc cgt gct ctg ttt ttg cca tgc ggt gca cac aca ttg aat 1445

Lys Asn Pro Arg Ala Leu Phe Leu Pro Cys Gly Ala His Thr Leu Asn

460 465 470

tta gtt gtg tgt gat gct gct aag aga tct gtt gat gct atg agc tac 1493

Leu Val Val Cys Asp Ala Ala Lys Arg Ser Val Asp Ala Met Ser Tyr

475 480 485

ttt ggt gtc ctg caa aag ctt tac act tta ttt tca gcc tct gcc caa 1541

Phe Gly Val Leu Gln Lys Leu Tyr Thr Leu Phe Ser Ala Ser Ala Gln

490 495 500

cga tgg gcc ata ctg aag agt cag gtg agc atc act cta aag tcg tgg 1589

Arg Trp Ala Ile Leu Lys Ser Gln Val Ser Ile Thr Leu Lys Ser Trp

505 510 515 520

aca gaa aca agg tgg gag agc aaa atc aaa agc atc gag ccc atg agg 1637

Thr Glu Thr Arg Trp Glu Ser Lys Ile Lys Ser Ile Glu Pro Met Arg

525 530 535

tac cag gga gct gca gtg aga gag gct tta ata gaa gtg aga gac aag 1685

Tyr Gln Gly Ala Ala Val Arg Glu Ala Leu Ile Glu Val Arg Asp Lys

540 545 550

acc aaa gac cca gtt ata aag gct gag gcc cag tct ttg tct gaa gag 1733

Thr Lys Asp Pro Val Ile Lys Ala Glu Ala Gln Ser Leu Ser Glu Glu

555 560 565

gta ggg tcg tac cgc ttc aac atc tgc aca gtc gta tgg cat gac att 1781

Val Gly Ser Tyr Arg Phe Asn Ile Cys Thr Val Val Trp His Asp Ile

570 575 580

cta tct aca ata aag cat gtc agc aaa ctc atg cag tct cca aat atg 1829

Leu Ser Thr Ile Lys His Val Ser Lys Leu Met Gln Ser Pro Asn Met

585 590 595 600

cat gtg gac cta gct gtg agt ctt ttg aag aag act gaa caa agt ctc 1877

His Val Asp Leu Ala Val Ser Leu Leu Lys Lys Thr Glu Gln Ser Leu

605 610 615

cag agc tac agg gca aat ggc ttt gtg aat gca cag atg gca gcc aaa 1925

Gln Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Phe Val Asn Ala Gln Met Ala Ala Lys

620 625 630

gaa atg tgc aag gaa atg aat gtc gag gct att ttg aaa caa aaa aga 1973

Glu Met Cys Lys Glu Met Asn Val Glu Ala Ile Leu Lys Gln Lys Arg

635 640 645

ata aga tcc aca aag tgc caa ttc tcg tat gaa tca cac gat gag cct 2021

Ile Arg Ser Thr Lys Cys Gln Phe Ser Tyr Glu Ser His Asp Glu Pro

650 655 660

ttc agt gac gca ctt aaa aag ttg gag gtt gaa ttt ttc aat gtt gtt 2069

Phe Ser Asp Ala Leu Lys Lys Leu Glu Val Glu Phe Phe Asn Val Val

665 670 675 680

gtt gat gaa gcc ttg tca gcc atc gcg gag agg ttt tcc aca ttg gaa 2117

Val Asp Glu Ala Leu Ser Ala Ile Ala Glu Arg Phe Ser Thr Leu Glu

685 690 695

gtt gta caa aac aga ttt ggg gtt ttg acc aat ttc cca agc ctt gga 2165

Val Val Gln Asn Arg Phe Gly Val Leu Thr Asn Phe Pro Ser Leu Gly

700 705 710

gac gag gag ctg acg gag caa tgc gag gca cta ggc aac ata ctc cat 2213

Asp Glu Glu Leu Thr Glu Gln Cys Glu Ala Leu Gly Asn Ile Leu His

715 720 725

ttt gag aag aac tgg gat ttg gac agt aga gag ctt gtt cag gaa atc 2261

Phe Glu Lys Asn Trp Asp Leu Asp Ser Arg Glu Leu Val Gln Glu Ile

730 735 740

aag aac ttg cct aac tta cca tca acg act cca agt ctc ctt gag ctc 2309

Lys Asn Leu Pro Asn Leu Pro Ser Thr Thr Pro Ser Leu Leu Glu Leu

745 750 755 760

atc tct ttc atg tct gat aag gat cta tca gaa atc tat ccg aac ttt 2357

Ile Ser Phe Met Ser Asp Lys Asp Leu Ser Glu Ile Tyr Pro Asn Phe

765 770 775

tgg act gct ctc agg att gca ctc acc ttg cca gtc act gtg gct caa 2405

Trp Thr Ala Leu Arg Ile Ala Leu Thr Leu Pro Val Thr Val Ala Gln

780 785 790

gca gag agg agc ttt tca aaa cta aaa ttg atc aag tcg tac ctg agg 2453

Ala Glu Arg Ser Phe Ser Lys Leu Lys Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Arg

795 800 805

tca aca atg tca cag gag cga ctc act aac ctt gcc gtt gtt agc atc 2501

Ser Thr Met Ser Gln Glu Arg Leu Thr Asn Leu Ala Val Val Ser Ile

810 815 820

aat cac tca gta ggg gag cag ata tca tat gat gat gtt att gac gag 2549

Asn His Ser Val Gly Glu Gln Ile Ser Tyr Asp Asp Val Ile Asp Glu

825 830 835 840

ttt gca tca aga aag gct agg aag gtt agg ttt tag ttggtgtttt 2595

Phe Ala Ser Arg Lys Ala Arg Lys Val Arg Phe

845 850

ctgttattgt attggtgctg cagttatatt tattttagcg tgtcatttgt gtgataaaag 2655

gtttgtgctt tataatattt attttatatt atttattcaa tattgagttt gattcaatat 2715

tttcttagct aactgtattt ttgccatgct 2745

<210> 17

<211> 851

<212> PRT

<213> Oryzias latipes

<400> 17

Met Glu Lys Lys Arg Ser Lys Pro Ser Gly Ala Gln Phe Arg Lys Lys

1 5 10 15

Arg Lys Glu Glu Glu Glu Lys Arg Asp Lys Glu Lys Gly Ala Leu Leu

20 25 30

Arg Tyr Phe Gly Ser Ser Thr Thr Ala Gln Asp Glu Thr Ser Thr Ser

35 40 45

Leu Pro Ala Ile Ser Ser Ala Thr Val Thr Val Ser Pro Pro Gln Asp

50 55 60

Glu Leu Pro Ser Thr Ser Ser Ala Thr His Val Val Pro Gln Leu Leu

65 70 75 80

Pro Glu Gln Ser Phe Asp Ser Glu Ala Glu Asp Val Val Pro Ser Thr

85 90 95

Ser Thr Gln Leu Glu Thr Ser Glu Met Pro Gly Asp Glu Thr Pro Leu

100 105 110

Thr Pro Thr Ala Glu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Asp Pro Ala Lys Trp

115 120 125

Pro Ser Pro Leu Thr Asp Arg Ile Arg Met Glu Leu Val Arg Arg Gly

130 135 140

Pro Ser Ser Ile Pro Pro Asp Phe Val Phe Pro Arg Asn Asp Ser Asp

145 150 155 160

Gly Arg Ser Cys His His His Tyr Phe Arg Lys Thr Leu Val Ser Gly

165 170 175

Glu Lys Ile Ala Arg Thr Trp Leu Met Tyr Ser Lys Val Lys Asn Ser

180 185 190

Leu Phe Cys Phe Cys Cys Lys Leu Phe Ser Asn Lys Asn Ile Asn Leu

195 200 205

Thr Thr Ser Gly Thr Ala Asn Trp Lys His Ala Ser Thr Tyr Leu Thr

210 215 220

Ala His Glu Lys Ser Pro Glu His Leu Asn Cys Met Lys Ala Trp Lys

225 230 235 240

Glu Leu Ser Gly Arg Ile Arg Ser Gly Lys Thr Ile Asp Lys Gln Glu

245 250 255

Met Ala Leu Leu Glu Glu Glu Arg Val Arg Trp Arg Ala Val Leu Thr

260 265 270

Arg Leu Ile Ala Ile Val Gln Ser Leu Ala Val Arg Asn Leu Ala Leu

275 280 285

Arg Gly His Thr Glu Thr Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gly Asn Phe Leu

290 295 300

Lys Glu Val Glu Leu Met Ala Arg Phe Asp Pro Ile Met Lys Asp His

305 310 315 320

Leu Asn Arg Val Leu Arg Gly Thr Ala Ser His Asn Ser Tyr Ile Gly

325 330 335

His His Val Gln Asn Glu Leu Ile Asp Leu Leu Ser Ser Lys Ile Leu

340 345 350

Ser Ala Ile Val Asp Asp Ile Lys Lys Ala Lys Tyr Phe Ser Ile Ile

355 360 365

Leu Asp Cys Thr Leu Asp Ile Ser His Thr Glu Gln Leu Ser Val Ile

370 375 380

Ile Arg Val Val Ser Leu Met Glu Lys Pro Gln Ile Arg Glu His Phe

385 390 395 400

Met Gly Phe Leu Glu Ala Glu Glu Ser Thr Gly Gln His Leu Ala Ser

405 410 415

Met Ile Leu Asn Arg Leu Glu Glu Leu Gly Ile Ser Phe Glu Asp Cys

420 425 430

Arg Gly Gln Ser Tyr Asp Asn Gly Ala Asn Met Lys Gly Lys Asn Lys

435 440 445

Gly Val Gln Ala Arg Leu Leu Glu Lys Asn Pro Arg Ala Leu Phe Leu

450 455 460

Pro Cys Gly Ala His Thr Leu Asn Leu Val Val Cys Asp Ala Ala Lys

465 470 475 480

Arg Ser Val Asp Ala Met Ser Tyr Phe Gly Val Leu Gln Lys Leu Tyr

485 490 495

Thr Leu Phe Ser Ala Ser Ala Gln Arg Trp Ala Ile Leu Lys Ser Gln

500 505 510

Val Ser Ile Thr Leu Lys Ser Trp Thr Glu Thr Arg Trp Glu Ser Lys

515 520 525

Ile Lys Ser Ile Glu Pro Met Arg Tyr Gln Gly Ala Ala Val Arg Glu

530 535 540

Ala Leu Ile Glu Val Arg Asp Lys Thr Lys Asp Pro Val Ile Lys Ala

545 550 555 560

Glu Ala Gln Ser Leu Ser Glu Glu Val Gly Ser Tyr Arg Phe Asn Ile

565 570 575

Cys Thr Val Val Trp His Asp Ile Leu Ser Thr Ile Lys His Val Ser

580 585 590

Lys Leu Met Gln Ser Pro Asn Met His Val Asp Leu Ala Val Ser Leu

595 600 605

Leu Lys Lys Thr Glu Gln Ser Leu Gln Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Phe

610 615 620

Val Asn Ala Gln Met Ala Ala Lys Glu Met Cys Lys Glu Met Asn Val

625 630 635 640

Glu Ala Ile Leu Lys Gln Lys Arg Ile Arg Ser Thr Lys Cys Gln Phe

645 650 655

Ser Tyr Glu Ser His Asp Glu Pro Phe Ser Asp Ala Leu Lys Lys Leu

660 665 670

Glu Val Glu Phe Phe Asn Val Val Val Asp Glu Ala Leu Ser Ala Ile

675 680 685

Ala Glu Arg Phe Ser Thr Leu Glu Val Val Gln Asn Arg Phe Gly Val

690 695 700

Leu Thr Asn Phe Pro Ser Leu Gly Asp Glu Glu Leu Thr Glu Gln Cys

705 710 715 720

Glu Ala Leu Gly Asn Ile Leu His Phe Glu Lys Asn Trp Asp Leu Asp

725 730 735

Ser Arg Glu Leu Val Gln Glu Ile Lys Asn Leu Pro Asn Leu Pro Ser

740 745 750

Thr Thr Pro Ser Leu Leu Glu Leu Ile Ser Phe Met Ser Asp Lys Asp

755 760 765

Leu Ser Glu Ile Tyr Pro Asn Phe Trp Thr Ala Leu Arg Ile Ala Leu

770 775 780

Thr Leu Pro Val Thr Val Ala Gln Ala Glu Arg Ser Phe Ser Lys Leu

785 790 795 800

Lys Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Thr Met Ser Gln Glu Arg Leu

805 810 815

Thr Asn Leu Ala Val Val Ser Ile Asn His Ser Val Gly Glu Gln Ile

820 825 830

Ser Tyr Asp Asp Val Ile Asp Glu Phe Ala Ser Arg Lys Ala Arg Lys

835 840 845

Val Arg Phe

850

<210> 18

<211> 417

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Description of the artificial sequence: VH region of anti-CD98

antibody

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(417)

<400> 18

atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc aga tgg 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

gtc ctg tcc cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag 96

Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

20 25 30

cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc 144

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile

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agc agt agt agt tac tac tgg ggc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag 192

Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

50 55 60

ggg ctg gag tgg att ggg agt atc tat tat agt ggg agt acc tac tac 240

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

aac ccg tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tcc gta gac acg tcc aag 288

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys

85 90 95

aac cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg gct 336

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

100 105 110

gtg tat tac tgt gcg aga caa ggg acg ggg ctc gcc cta ttt gac tac 384

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Thr Gly Leu Ala Leu Phe Asp Tyr

115 120 125

tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 417

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135

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<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

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Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile

35 40 45

Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

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Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys

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Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Thr Gly Leu Ala Leu Phe Asp Tyr

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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<220>

<223> Description of the artificial sequence: VH region of anti-CD98

antibody

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

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Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

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Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

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gat acc acc gga gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct 96

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser

20 25 30

ttg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt 144

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

gtt agc agc agc ttc tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct 192

Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

50 55 60

ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca 240

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro

65 70 75 80

gac agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc 288

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

agc aga ctg gag cct gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt cag cag tat 336

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

100 105 110

ggt agc tca cct cta ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc 384

Gly Ser Ser Pro Leu Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile

115 120 125

aaa 387

Lys

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<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 22

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Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

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Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

100 105 110

Gly Ser Ser Pro Leu Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile

115 120 125

Lys

<210> 23

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial

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<223> Description of the artificial sequence: VL region of anti-CD98

antibody

<400> 23

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1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> Description of the artificial sequence: VH region of anti-TNF

alpha antibody

<220>

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<400> 24

atg gag ttg gga ctg agc tgg att ttc ctt ttg gct att tta aaa ggt 48

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Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

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Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

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Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

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Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala

65 70 75 80

gac tct gtg gag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac 288

Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

tcc ctg tat ctg caa atg aac agt ctg aga gct gag gat acg gcc gta 336

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

tat tac tgt gcg aaa gtc tcg tac ctt agc acc gcg tcc tcc ctt gac 384

Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp

115 120 125

tat tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcg tca 420

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

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Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

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Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

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<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of the artificial sequence: VH region of anti-TNF

alpha antibody

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

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65 70 75 80

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100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 387

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Description of the artificial sequence: VL region of anti-TNF

alpha antibody

<220>

<221> CDS

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<400> 27

atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctt ctg ctg ctc tgg 48

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

ctc cca ggt gcc aga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc 96

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

ctg tct gca tct gta ggg gac aga gtc acc atc act tgt cgg gca agt 144

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

cag ggc atc aga aat tac tta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggg aaa 192

Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

gcc cct aag ctc ctg atc tat gct gca tcc act ttg caa tca ggg gtc 240

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val

65 70 75 80

cca tct cgg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc 288

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

atc agc agc cta cag cct gaa gat gtt gca act tat tac tgt caa agg 336

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg

100 105 110

tat aac cgt gca ccg tat act ttt ggc cag ggg acc aaa gtg gag atc 384

Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

aaa 387

Lys

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<211> 129

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<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

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Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

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Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

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Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg

100 105 110

Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys

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<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of the artificial sequence: VL region of anti-TNF

alpha antibody

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Description of the artificial sequence: VH region of anti-CD20

antibody

<220>

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<400> 30

atg ggt tgg agc ctc atc ttg ctc ttc ctt gtc gct gtt gct acg cgt 48

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg

1 5 10 15

gtc ctg tcc cag gta caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg aag 96

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

cct ggg gcc tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttt 144

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

acc agt tac aat atg cac tgg gta aaa cag aca cct ggt cgg ggc ctg 192

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu

50 55 60

gaa tgg att gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat 240

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

cag aag ttc aaa ggc aag gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc 288

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

aca gcc tac atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc 336

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

tat tac tgt gca aga tcg act tac tac ggc ggt gac tgg tac ttc aat 384

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn

115 120 125

gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tct gca 420

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

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<211> 140

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 31

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

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Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

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Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn

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Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

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<212> PRT

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<220>

<223> Description of the artificial sequence: VH region of anti-CD20

antibody

<400> 32

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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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100 105 110

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<211> 384

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Description of the artificial sequence: VL region of anti-CD20

antibody

<220>

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Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile

20 25 30

ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc agc 144

Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

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Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser

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Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

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Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg 336

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

100 105 110

act agt aac cca ccc acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa atc aaa 384

Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 34

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 34

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser

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Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser

50 55 60

Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

100 105 110

Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 35

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of the artificial sequence: VL region of anti-CD20

antibody

<400> 35

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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<210> 36

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<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> wild type neomycin resistant gene

<220>

<221> CDS

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<400> 36

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Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val

1 5 10 15

gag agg cta ttc ggc tat gac tgg gca caa cag aca atc ggc tgc tct 96

Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser

20 25 30

gat gcc gcc gtg ttc cgg ctg tca gcg cag ggg cgc ccg gtt ctt ttt 144

Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe

35 40 45

gtc aag acc gac ctg tcc ggt gcc ctg aat gaa ctg cag gac gag gca 192

Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala

50 55 60

gcg cgg cta tcg tgg ctg gcc acg acg ggc gtt cct tgc gca gct gtg 240

Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val

65 70 75 80

ctc gac gtt gtc act gaa gcg gga agg gac tgg ctg cta ttg ggc gaa 288

Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu

85 90 95

gtg ccg ggg cag gat ctc ctg tca tct cac ctt gct cct gcc gag aaa 336

Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys

100 105 110

gta tcc atc atg gct gat gca atg cgg cgg ctg cat acg ctt gat ccg 384

Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro

115 120 125

gct acc tgc cca ttc gac cac caa gcg aaa cat cgc atc gag cga gca 432

Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala

130 135 140

cgt act cgg atg gaa gcc ggt ctt gtc gat cag gat gat ctg gac gaa 480

Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu

145 150 155 160

gag cat cag ggg ctc gcg cca gcc gaa ctg ttc gcc agg ctc aag gcg 528

Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala

165 170 175

cgc atg ccc gac ggc gag gat ctc gtc gtg acc cat ggc gat gcc tgc 576

Arg Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys

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ttg ccg aat atc atg gtg gaa aat ggc cgc ttt tct gga ttc atc gac 624

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Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu

65 70 75 80

Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala

85 90 95

Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu

100 105 110

Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val

130 135 140

Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu

145 150 155 160

Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe

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65 70 75 80

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Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val

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130 135 140

Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu

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Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu

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65 70 75 80

Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln

85 90 95

Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu

100 105 110

Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser

115 120 125

Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr

130 135 140

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145 150 155 160

His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln

165 170 175

Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg

180 185 190

His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn

195 200 205

Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp

210 215 220

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225 230 235 240

Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu

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290 295 300

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325 330 335

Pro Arg Ala Lys Glu

340

Claims

1.一种生产抗体的方法，其中，将包含含有编码抗体的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入悬浮性CHO细胞中，将插入在一对转座子序列之间的含有编码所述抗体的DNA的基因片段重组到所述CHO细胞的染色体中，得到表达该抗体的CHO细胞，并且对该CHO细胞进行悬浮培养而生产该抗体，

其中表达载体选自下述(a)～(d)：

(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；和

(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，和

其中一对转座子序列为一对来源于Tol1转座子的核苷酸序列或者来源于Tol2转座子的核苷酸序列。

2.一种生产抗体的方法，其特征在于，包括以下的步骤(A)～(C)：

(A)将以下的表达载体(a)和(b)同时导入悬浮性CHO细胞中，

(a)包含含有编码抗体的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体，

(B)利用步骤(A)中导入到CHO细胞中的表达载体(b)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该CHO细胞的染色体中而得到表达所述抗体的悬浮性哺乳动物细胞；以及

(C)对步骤(B)中得到的表达抗体的CHO细胞进行悬浮培养而生产所述抗体，

其中表达载体选自下述(a0)～(d0)：

(a0)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；

(b0)包含含有编码抗体的H链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；

(c0)包含含有编码抗体的L链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；和

(d0)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，和

3.一种得到生产抗体的悬浮性CHO细胞的方法，其中，将包含含有编码抗体的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入悬浮性CHO细胞中，将插入在一对转座子序列之间的含有编码抗体的DNA的基因片段重组到该CHO细胞的染色体中，

其中表达载体选自下述(a)～(d)：

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，悬浮性CHO细胞为能够在无血清培养条件下存活和增殖的细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其中，CHO细胞为选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S中的任意一种细胞。

6.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，选择标记基因为抗放线菌酮基因。

7.如权利要求6所述的方法，其中，抗放线菌酮基因为核糖体蛋白质。

8.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，一对来源于Tol2转座子的核苷酸序列为由序列号2表示的核苷酸序列和由序列号3表示的核苷酸序列。

9.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，一对来源于Tol1转座子的核苷酸序列为由序列号14表示的核苷酸序列和由序列号15表示的核苷酸序列。

10.一种悬浮性CHO细胞，其通过将包含含有编码抗体的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体(a)和含有编码识别该转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶(转移酶)的DNA的表达载体(b)同时导入而将插入在该一对转座子序列之间的该基因片段重组到染色体中并且生产该抗体，

其中表达载体选自下述(a0)～(d0)：

11.如权利要求10所述的CHO细胞，其为能够在无血清培养条件下存活和增殖的悬浮性CHO细胞。

12.如权利要求10或11所述的CHO细胞，其中，CHO细胞为选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S中的任意一种细胞。

13.如权利要求10所述的CHO细胞，其中，选择标记基因为抗放线菌酮基因。

14.如权利要求13所述的CHO细胞，其中，抗放线菌酮基因为编码人核糖体蛋白质L36a的突变体的基因。

15.如权利要求10所述的CHO细胞，其中，一对来源于Tol2转座子的核苷酸序列为由序列号2表示的核苷酸序列和由序列号3表示的核苷酸序列。

16.如权利要求10所述的CHO细胞，其中，一对来源于Tol1转座子的核苷酸序列为由序列号14表示的核苷酸序列和由序列号15表示的核苷酸序列。

17.一种表达载体，其选自下述(a)到(b)：

其中，一对转座子序列为一对来源于Tol1转座子的核苷酸序列或者来源于Tol2转座子的核苷酸序列。

18.如权利要求17所述的表达载体，其中，一对来源于Tol2转座子的核苷酸序列为由序列号2表示的核苷酸序列和由序列号3表示的核苷酸序列。

19.如权利要求17所述的表达载体，其中，一对来源于Tol1转座子的序列为由序列号14表示的核苷酸序列和由序列号15表示的核苷酸序列。