KR102586165B1

KR102586165B1 - 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102586165B1
Application number: KR1020200120854A
Authority: KR
Inventors: 민병현; 박인수
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-10-02
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2023-10-10
Anticipated expiration: 2040-09-18
Also published as: KR20210039940A

Abstract

본 발명은 접착 관련 유전자를 이용하여 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 VCAN, CTGF 또는 EXT1을 삽입하여 발현이 증가된 태아 연골조직 유래 줄기세포로 제작한 연골 조직 유합제 조성물은 상기 유전자가 삽입되지 않은 태아 연골조직 유래 줄기세포로 제작된 연골 조직 유합제 조성물과 비교하여 현저하게 우수한 접착 강도를 나타내는 것을 확인함에 따라, 상기 VCAN, CTGF 또는 EXT1을 발현 증가시킨 세포 조성물은 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물로 제조될 수 있으며, VCAN, CTGF 또는 EXT1은 조직 유합제 첨가용 조성물로 제공될 수 있다.

Description

생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물 및 이의 제조방법{Tissue consolidant composition with increased adhesion and binding force to biological tissues and preparing method thereof}

본 발명은 접착 관련 유전자의 발현을 증가시킨 세포를 이용한 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제에 관한 것이다.

생체 접착제(bioadhesive) 및 실란트는 수술시 조직을 봉합 또는 도포하거나, 출혈 방지제, 체액과 혈액 차단제 등으로 사용되는 것으로, 피부테 접촉하므로 생체 적합성이 요구되며, 생체 내에서 독성과 위해성이 없어야 하고, 생체의 치유를 방해하지 않아야 한다.

현재 실용화되고 있는 의료용 접착 소재로는 시아노아크릴레이트계, 피부린 글루계, 젤라틴 글루계, 폴리우레탄계 등이 있으며, 미국의 Closure Medical사는 Dermabond라는 옥틸시아노아크릴레이트의 의료용 조직접착제를 상품화하여 1997년 8월 유럽공동체의 판매승인을 얻은 데 이어 1998년 미국 FDA로부터 승인을 받은바 있다.

그러나, 시아노아크릴레이트계 접착제는 고화물이 유연성이 부족하고 단단하므로 창상 치유를 방해하는 경우가 있고, 또한 생체 내에서 분해되기 어려우므로 피포화되어 이물질이 되기 쉬운 문제가 있다. 피브린 글루는 접착력이 상당히 낮아 생성된 피부린 덩어리가 조직으로부터 떨어지는 경우가 있으며, 혈액 제제이므로 바이러스 감염이 우려되는 문제가 있다.

또한, 젤라틴 글루는 생체 유래의 조직 접착제로 젤라틴-레조시놀-포르말린으로 가료시킨 것이 개발되었으며, 그 외에 젤라틴-글루타알데하이드와 같은 조직접착제가 개발되었으나, 가교제로 사용되는 포르말린이나 글루타알데하이드가 생체 내의 단백질과도 가교 반응을 일으켜 조직 독성을 일으키는 단점이 있다.

이러한 문제점을 극복하기 위해 생체 적합성이 우수하고 수분 존재하에서 우수한 기계적 강도와 빠르고 강한 접착력을 갖는 생체 조직 접착제에 대한 개발 필요성이 요구되고 있다.

대한민국 공개특허 제10-2013-0093769호 (2013.08.23. 공개)

본 발명은 조직 접착력 및 결합력을 갖는 접착 관련 유전자를 제공하며, 상기 유전자를 이용하여 조직 손상 또는 장기의 외과 수술 후 손상된 조직 또는 장기의 재생 치료용 접착제 개발에 이용될 수 있다.

본 발명은 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현이 증가된 세포를 유효성분으로 함유하며, 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물을 제공한다.

본 발명은 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 유효성분으로 함유하는 조직 유합제 첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명은 세포에 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 하나 이상의 유전자를 삽입하는 단계; 상기 유전자가 삽입된 세포를 연골분화 배지가 포함된 배지에서 5 내지 10일 간 1차 배양하는 단계; 상기 1차 배양된 세포를 2차 단층배양하는 단계; 및 상기 2차 단층배양된 세포와 세포외기질이 결합된 세포막을 수득하는 단계를 포함하는 조직 유합제 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, VCAN, CTGF 또는 EXT1을 삽입하여 발현이 증가된 태아 연골조직 유래 줄기세포로 제작한 연골 조직 유합제 조성물은 상기 유전자가 삽입되지 않은 태아 연골조직 유래 줄기세포로 제작된 연골 조직 유합제 조성물과 비교하여 현저하게 우수한 접착 강도를 나타내는 것을 확인함에 따라, 상기 VCAN, CTGF 또는 EXT1을 발현 증가시킨 세포 조성물은 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물로 제조될 수 있으며, VCAN, CTGF 또는 EXT1은 조직 유합제 첨가용 조성물로 제공될 수 있다.

도 1은 사람 태아연골조직 유래 세포를 이용하여 시트 배양된 접착제에서 발현된 접착 제어 기전 관련 유전자와 사람 성인 연골조직 유래 세포를 이용하여 시트 배양된 접착제에서 발현된 접착 제어 기전 관련 유전자를 비교한 마이크로 어레이 분석 결과이다.
도 2는 사람 태아연골조직 유래 세포를 이용하여 시트 배양된 접착제에서 발현된 접착 제어 기전 관련 유전자와 사람 성인 연골조직 유래 세포를 일반적인 세포배양법으로 배양하였을 때 발현하는 접착 관련 유전자를 비교한 마이크로 어레이 분석 결과이다.
도 3은 사람 태아연골조직 유래 세포를 이용하여 시트 배양된 접착제에서 발현된 접착 제어 기전 관련 유전자와 사람 골수유래 중간엽 줄기세포를 일반적인 세포배양법으로 배양하였을 때 발현된 접착 관련 유전자를 비교한 마이크로 어레이 분석 결과이다.
도 4는 접착력에 관련한 목표 유전자인 CTGF, EXT1 또는 VCAN을 pCMV-HA 백터에(Vector) 각각 결합한후 유전자 클로닝을(DNA Cloning) 진행한 결과이다.
도 5는 사람 연골세포을 목표 유전자 삽입하고 똑같은 조건하에 배양한 이미지 결과이다.
도 6은 사람 연골 세포에서 목표 유전자를 삽입하고 RT-PCR(Real Time Polymerase Chain Reaction)로 유전자 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 7은 태아 연골조직 유래 줄기세포에 목표 유전자를 삽입하고 똑같은 조건하에 배양한 이미지 결과이다.
도 8은 태아 연골조직 유래 줄기세포에 목표 유전자를 삽입하고 RT-PCR(Real Time Polymerase Chain Reaction) 실험을 한 결과이다.
도 9는 본 발명의 태아 연골조직 유래 줄기 세포를 목표 유전자의 siRNA 삽입을 통하여 처리한후 똑같은 조건하에 배양한 이미지 결과이다.
도 10은 본 발명의 태아 연골조직 유래 줄기세포에 목표 유전자의 siRNA 삽입하여 배양한 후 RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 유전자 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 11은 태아 연골조직 유래 줄기세포를 이용하여 만든 연골 조직 유합제 조성물(TAP-C)의 접착 강도를 확인한 과정이다.
도 12는 CTGF 또는 EXT1 유전자가 삽입되거나 삽입되지 않은 사람 연골 세포(chondrocyte) 및 태아 연골조직 유래 줄기세포(FCPC)를 각각 이용하여 만든 연골 조직 유합제 조성물의 접착 강도를 확인한 결과이다.
도 13은 접착관련 유전자 VCAN을 이용하여 제조된 생체 조직 접합체의 조직 접합능을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 사람 태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하며 젤 형태(gel type)인 세포 시트(sheet) 형태의 조직 접착제에서 발현이 증가된 접착 제어 기전 관련 유전자를 확인하고 이를 이용한 손상된 조직의 접합용 접합체를 제공하고자 한다.

본 발명은 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현이 증가된 세포를 유효성분으로 함유하며, 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물을 제공할 수 있다.

상기 세포는 사람 연골조직 세포 및 사람 태아 연골조직 유래 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 조직 유합제 조성물은 조직 접착제, 조직 봉합제, 유착 방지제, 지혈제 또는 창상 피복제로 사용되는 것일 수 있다.

본 발명은 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 유효성분으로 함유하는 조직 유합제 첨가용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, VCAN, CTGF 또는 EXT1 유전자를 삽입시켜 발현 증가시킨 사람 태아 연골조직 유래 줄기세포로 제조된 조직 유합제 조성물(TAP)을 기증받은 환자의 연골조직으로 제작된 연골손상 모델에 삽입한 후 직경 5 mm의 지그가 삽입된 TAP에 접촉하여 부착시킨 후 1.3 mm/분으로 속도로 끌어 당기면서 지그가 TAP와 분리될 때까지의 저항력을 확인하였으며, 태아 연골조직 유래 줄기세포를 이용하여 제작된 연골 조직 유합제 조성물 (TAP-C)과 비교한 결과, 도 9와 같이 배양 1주차 및 배양 2주차에서는 뚜렷한 차이점이 확인되지 않았으나, 배양 3주차에서 TAP-C 군과 비교하여 유전자 삽입군에서 접착 강도가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었으며, siRNA 삽입을 통하여 유전자 넉다운(Knock-down)된 세포로 제작된 연골 조직 유합제 조성물의 접착 강도는 TAP-C 군보다 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19 발현을 증가시킨 세포 조성물은 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 유전자들은 조직 유합제 첨가용 조성물로 제공될 수 있음이 확인되었다.

또한, 본 발명은 세포에 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 하나 이상의 유전자를 삽입하는 단계; 상기 유전자가 삽입된 세포를 연골분화 배지가 포함된 배지에서 5 내지 10일 간 1차 배양하는 단계; 상기 1차 배양된 세포를 2차 단층배양하는 단계; 및 상기 2차 단층배양된 세포와 세포외기질이 결합된 세포막을 수득하는 단계를 포함하는 조직 유합제 제조방법을 제공할 수 있다.

상기 1차 배양된 세포를 2차 단층배양하는 단계는 성장배지에서 1차 배양된 세포를 15 내지 20일간 단층배양하는 것일 수 있다.

상기 세포막은 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현이 증가된 세포를 포함하며, 조직 접착성 및 결합력이 증가된 것일 수 있다.

본 발명의 "유합제" 는 피부나 근육 조직이 나아서 아물어 붙는 것을 촉진하는 약물을 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 사람 연골조직 세포의 분리 및 배양

무릎 관절로부터 분리된 연골조직을 인산완충식염수(phosphated buffered saline: PBS)로 세척한 후, 0.2%(w/v) 콜라게나제(collagenase, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ)가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Egle Medium, Gibco, Grand Island, NY) 배지를 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 연골조직이 완전히 소화되어 방출된 연골조직 유래 줄기세포를 1700 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 침전된 연골조직 세포를 수득하였으며, 조직 배양접시[150 mm(dia.) × 20 mm(h)]에 1 × 10⁶ 세포 밀도로 접종하였다.

<실시예 2> 사람 태아 연골조직 유래 줄기세포(FCPC)의 분리 및 배양

12~15주된 태아(출처: 아주대학교병원 윤리위원회에서 승인한 IRB NO. AJIRB-CRO-07-139)의 무릎 관절로부터 연골조직 유래 줄기세포를 분리하였다. 간략하게, 무릎 관절로부터 분리된 연골조직을 인산완충식염수(phosphated buffered saline; PBS)로 세척한 후, 0.2%(w/v) 콜라게나제(collagenase, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ)가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Egle Medium, Gibco, Grand Island, NY) 배지를 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 연골조직이 완전히 소화되어 방출된 연골조직 유래 줄기세포를 1700 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 침전된 연골조직 유래 줄기세포(fetal cartilage derived progenitor cell; FCPC)를 수득하였으며, 조직 배양접시[150 mm(dia.) × 20 mm(h)]에 1 × 10⁶ 세포 밀도로 접종하였다.

<실시예 3> 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합용 조성물 제조(TAP)

상기 실시예 1 및 2에서 수득한 연골 세포를 1 × 10⁶ 세포 밀도로 희석한 후, 연골 분화배지[1% 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic), 1.0 mg/mL 인슐린(insulin), 0.55 mg/mL 인간 트랜스페린(human transferrin), 0.5 mg/mL 소듐 셀레나이트(sodium selenite), 50㎍/mL 아스코르빈산(Ascorbic acid), 1.25 mg/mL 우혈청알부민(bovine serum albumin; BSA), 100 nM 덱사메타손(dexamethasone), 40 ㎍/mL 프롤린(proline) 및 10 ng/ml TGF-β가 첨가된 DMEM-HG]가 포함된 배지를 이용하여 6 웰에서 일주일동안 37℃, 5% CO₂ 배양기로 배양하였으며, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 50 units/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 15~18일 동안 단층 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, PBS을 첨가하여 세포외기질과 결합된 시트(sheet) 형태의 세포막을 수득하였다.

<실시예 4> 마이크로 어레이 분석

실시예 3에서 제조된 TAP의 유전자 발현 프로파일을 비교하였다. 전체 사람 게놈 Agilent 4 × 44K Oligonucleotide Microarray (Macrogen, Korea)를 이용하여 실시예 3에서 제조된 두 개의 TAP에서 매우 발현이 증가된 유전자들을 선택하였다.

간략하게, TAP, 사람 연골세포 또는 골수 기질 세포로부터 전체 RNA를 추출하고 마이크로 어레이 칩 하이드리드화에 적용하였다. 건강한 사람 연골 세포와 TAP의 유전자 발현 프로파일을 비교하기 위해, 조직 적합에 대한 대표 유전자를 선택하고 마이크로 어레 분석을 수행하였다.

이후, 사람 태아 연골조직 유래 세포를 생체 접착성이 뛰어난 시트로 배양하였을 때 발현하는 유전자와 사람 성인 연골조직 유래 세포를 시트로 배양하였을 때 발현된 전착 관련 유전자를 비교하여 도 1과 같은 유전자 발현을 확인하였다.

또한, 사람 태아연골 조직 유래 세포를 생체 접착성이 뛰어난 시트로 배양하였을 때 발현하는 유전자와 사람 성인 연골조직 유래 세포를 일반적인 세포배양법으로 배양하였을 때 발현하는 접착 관련 유전자 발현 비교한 결과, 도 2와 같은 유전자 발현 결과를 확인하였다.

마지막으로 사람 태아연골 조직 유래 세포를 생체 접착성이 뛰어난 시트로 배양하였을 때 발현하는 유전자와 사람 골수유래 중간엽 줄기세포를 일반적인 세포배양법으로 배양하였을 때 발현하는 접착 관련 유전자 발현 비교하여, 도 3과 같은 유전자 발현 결과를 확인하였다.

상기 결과들로부터 사람 태아연골조직 유래 세포를 이용하여 시트 형태로 배양하였을 때 발현된 유전자를 확인하여 하기 표 1과 같이 특이적으로 발현된 접착 관련 유전자를 확인할 수 있었다.

유전자		유전자 번호 Sequence
CTGF	CCN2 또는 connective tissue growth factor	HM015591
NDST1	Bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase 1	U17970
EXT1	Exostosin-1	Q16394
ITGA3	Integrin alpha-3	AC002401
CYTL1	Cytokine-like protein 1	BC031391
TGFB1	Transforming growth factor beta-1 proprotein	BT007245
SOCS3	Suppressor of cytokine signaling 3	AF159854
VCAN	Versican	U26555
CHI3L2	Chitinase-3-like protein 2	U49835
KRT19	Keratin, type I cytoskeletal 19	AF202321

<실시예 5> 목표 유전자를 처리한 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합용 조성물 제조(TAP)

상기 실시예 4에서 확인된 CTGF(CCN2) 및 EXT1을 도 4에서 표기된 것과 같이 벡터와 결합한 후 클로닝을 통하여 삽입 유전자를 제조하였다. 유전자 삽입(gene knock-in)은 Gene Transfection Reagent(Lipofectamine 3000 Thermo)을 이용하여 수행하였다. 동일한 조건으로 각 유전자의 siRNA(바이오닉스) 처리하여 유전자 넉다운 (Knock-down) 실험을 수행하였다.

도 5 및 도 7과 같이 사람 연골세포(chondrocyte)와 태아 연골조직 유래 줄기세포(FCPC)에 상기 삽입 유전자를 3일 동안 처리하여 세포에 삽입하고 실시예 3과 같은 방법으로 세포막 수득하였다.

상기 과정으로 제조된 조직 유합용 조성물에서 유전자 발현을 확인하기 위해, 각 유전자를 처리하여 배양한 연골세포와 태아 연골조직 유래 줄기세포(FCPC)로부터 수득된 세포막을 이용하여 실시간 PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행하였다.

그 결과, 도 6과 같이 목표 유전자가 삽입된 연골세포에 EXT1와 CTGF 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 도 8과 같이 목표 유전자가 삽입된 태아 연골조직 유래 줄기세포에서도 EXT1와 CTGF 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 도 7과 같이 목표 유전자의 siRNA가 삽입된 태아 연골조직 유래 줄기세포에서는 EXT1와 CTGF 발현이 억제된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 EXT1와 CTGF이 연골세포와 태아 연골조직 유래 줄기세포에 효과적으로 삽입되어 EXT1와 CTGF 유전자의 발현이 증가된 세포막이 수득된 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 6> 조직 유합용 조성물의 접착강도 확인

상기 실시예 3 및 5에서 제조된 TAP 및 각 유전자를 처리한 조직 유합용 조성물의 접착강도를 확인하기 위해 접착력을 비교하였다.

먼저, 인공관절 수술 후 폐기되는 환자의 연골조직을 동의서와 함께 기증받았다. 기증받은 환자의 연골조직 표면에 6mm biopsy punch를 이용하여 연골손상 모델을 제작하고, 제조된 유합용 조성물을 삽입하였다.

다음으로 도 11과 같은 과정으로 직경 5 mm의 지그가 삽입된 TAP에 접촉하여 부착시킨 후 1.3 mm/분으로 속도로 끌어 당기면서 지그가 TAP와 분리될 때까지의 저항력을 확인하였다.

태아 연골조직 유래 줄기세포를 이용하여 제작된 연골 조직 유합제 조성물 (TAP-C)와 각 유전자를 처리한 세포막을 비교한 결과, 도 12와 같이 배양 1주차 및 배양 2주차에서는 뚜렷한 차이점이 확인되지 않았으나, 배양 3주차에서 TAP-C 군과 비교하여 유전자 삽입군에서 접착 강도가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었으며, siRNA 삽입을 통하여 유전자 넉다운(Knock-down)된 세포로 제작된 연골 조직 유합제 조성물의 접착 강도는 TAP-C 군보다 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 동일한 방법으로 VCAN을 연골세포에 삽입한 후 생체 조직 접합체를 제조하고 접착능을 확인한 결과, 도 13과 같이 생체 조직 접합체의 연골-뼈 접착력이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

Claims

CTGF, EXT1 및 VCAN로 이루어진 유전자 발현이 증가된 세포를 유효성분으로 함유하며,
상기 세포는 사람 연골조직 세포인 것을 특징으로 하는 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 연골조직 유합제 약학 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 연골조직 유합제 조성물은 연골조직 접착제, 연골조직 봉합제, 또는 연골유착 방지제로 사용되는 것을 특징으로 하는 연골조직 유합제 약학 조성물.
삭제
세포에 CTGF, EXT1 및 VCAN로 이루어진 유전자를 삽입하는 단계;
상기 유전자가 삽입된 세포를 연골분화 배지가 포함된 배지에서 5 내지 10일 간 1차 배양하는 단계;
상기 1차 배양된 세포를 2차 단층배양하는 단계; 및
상기 2차 단층배양된 세포와 세포외기질이 결합된 세포막을 수득하는 단계를 포함하고,
상기 세포는 사람 연골조직 세포인 것을 특징으로 하는 연골조직 유합제 제조방법.
삭제
청구항 5에 있어서, 상기 1차 배양된 세포를 2차 단층배양하는 단계는 성장배지에서 1차 배양된 세포를 15 내지 20일간 단층배양하는 것을 특징으로 하는 연골조직 유합제 제조방법.
청구항 5에 있어서, 상기 세포막은 CTGF, EXT1 및 VCAN로 이루어진 유전자 발현이 증가된 세포를 포함하며, 조직 접착성 및 결합력이 증가된 것을 특징으로 하는 연골조직 유합제 제조방법.