CN107208103A

CN107208103A - 酰基‑acp硫酯酶及其突变体

Info

Publication number: CN107208103A
Application number: CN201580050296.0A
Authority: CN
Inventors: J·加索拉里; X·赵; G·N·鲁丹科; S·富兰克林
Original assignee: Tara Rhea Holding Co
Current assignee: Kirbyn Biotech Corp
Priority date: 2014-09-18
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2017-09-26
Also published as: BR112017005370A2; US20160083758A1; WO2016044779A2; EP3194582A2; WO2016044779A3; US10125382B2; US20190194703A1

Abstract

披露了FatB和FatA类型的新型植物酰基‑ACP硫酯酶基因和由这些基因编码的蛋白质。这些基因可用于构建具有改变的脂肪酸谱的重组宿主细胞。证实了新型和/或突变的FATB和FATA基因在产油微藻宿主细胞中的表达。此外，用于产生在C12:0、C14:0、C16:0、C18:0和/或C18:1脂肪酸中的一种或多种中升高的油的方法包括用诸如具有N端缺失的新型和/或突变的FATB和/或FATA基因转化细胞。这些细胞产生具有改变的且有用的脂肪酸谱的甘油三酯。

Description

酰基-ACP硫酯酶及其突变体

相关申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2014年9月18日提交的美国临时申请号62/052,440和2014年11月4日提交的美国临时申请号62/075,168的权益，将二者特此以其全文结合在此。

背景

某些有机体(包括植物和一些微藻)使用II型脂肪酸生物合成途径，该途径特征在于使用离散的单功能酶用于脂肪酸合成。相比之下，哺乳动物和真菌使用一种单一的大的多功能蛋白。

II型脂肪酸生物合成典型地涉及将生长的酰基-ACP(酰基-载体蛋白)链延长两个碳单位，随后由酰基-ACP硫酯酶裂解。在植物中，已经鉴定了两种主要类别的酰基-ACP硫酯酶：(i)由FatA类别的基因编码的那些酰基-ACP硫酯酶，它们倾向于将油酰基-ACP水解为油酸(一种18:1脂肪酸)和ACP，以及(ii)由FatB类别的基因编码的那些酰基-ACP硫酯酶，它们从对应的酰基-ACP分子中释放C8-C16脂肪酸。

来自不同植物的不同FatB基因对不同酰基链长具有特异性。其结果是，不同基因产物将在植物种子中产生不同的脂肪酸谱。参见美国专利号5,850,022；5,723,761；5,639,790；5,807,893；5,455,167；5,654,495；5,512,482；5,298,421；5,667,997；和5,344,771；5,304,481。最近，已经将FatB基因克隆进产油微藻中，以产生具有改变的脂肪酸谱的甘油三酯。参见，WO 2010/063032、WO 2011/150411、WO 2012/106560以及WO 2013/158938。

概述

根据一个实施例，存在核酸构建体，该核酸构建体包含编码异源调节元件的多核苷酸序列和FatB酰基-ACP硫酯酶基因，其可操作以在由表达核酸构建体的细胞产生的油中产生改变的脂肪酸谱。FatB基因表达具有与SEQ ID NO:1-18中任一项具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列或编码融合在SEQ ID NO:10-18上游的质体靶向肽的氨基酸序列的蛋白质。

任选地，核酸构建体的酰基-ACP硫酯酶编码序列包含与SEQ ID NO:19-36中任一项或因遗传密码的简并性而致的任何等效序列至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在不同的实施例中，蛋白质在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处还包含丙氨酸(A)。

在不同的实施例中，构建体可具有与SEQ ID NO:37具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的质体靶向肽。在不同的实施例中，构建体可具有与SEQ ID NO:40具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的质体靶向肽。

FatB基因可表达具有以下氨基酸序列的活性酰基-ACP-硫酯酶蛋白，该氨基酸序列具有：

(a)与SEQ ID NO:5大于94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95％或95.1％的一致性；

(b)与SEQ ID NO:14大于95.7％、95.8％、95.9％、96％、96.1％或96.2％的一致性；

(c)与SEQ ID NO:3大于95.4％、95.5％、95.6％、95.7％、95.8％、95.9％或96％的一致性；

(d)与SEQ ID NO:12大于94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95％或95.1％的一致性；

(e)与SEQ ID NO:1大于94.8％、94.9％、95％、95.1％、95.2％、95.3％或95.4％的一致性；

(f)与SEQ ID NO:10大于95.9％、96.0％、96.1％、96.2％、96.3％或96.4％的一致性；

(g)与SEQ ID NO:6大于94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95％或95.1％的一致性；

(h)与SEQ ID NO:15大于95.7％、95.8％、95.9％、96％、96.1％或96.2％的一致性；

(i)与SEQ ID NO:4大于94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95％或95.1％的一致性；

(j)与SEQ ID NO:13大于95.7％、95.8％、95.9％、96％、96.1％或96.2％的一致性；

(k)与SEQ ID NO:2大于94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％或94.9％的一致性；

(l)与SEQ ID NO:11大于94.9％、95％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％或95.5％的一致性；

(m)与SEQ ID NO:7大于93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94.0％或94.1％的一致性；

(n)与SEQ ID NO:16大于92.8％、92.9％、93.0％、93.1％、93.2％、93.3％或93.4％的一致性；

(o)与SEQ ID NO:8大于86.5％、86.6％、86.7％、86.8％、86.9％、87％或87.1％的一致性；

(p)与SEQ ID NO:17大于85.1％、85.2％、85.3％、85.4％、85.5％、85.6％或85.7％的一致性；

(q)与SEQ ID NO:9大于88％、88.1％、88.2％、88.3％、88.4％、88.5％或88.6％的一致性；或

(r)与SEQ ID NO:18大于87.6％、87.7％、87.8％、87.9％、88％、88.1％或88.2％的一致性。

在另一个实施例中，一种宿主细胞能够表达核酸构建体，以产生相对于没有该构建体的对照细胞具有改变的组成的甘油三酯油。任选地，该油具有增加的C8-C12脂肪酸。

该宿主细胞可选自而不限于植物细胞、微生物细胞和微藻细胞。

在第三实施例中，使用包括用核酸构建体转化该宿主细胞的方法，重组宿主细胞产生改变的脂肪酸谱。宿主细胞可以是而不限于微生物细胞、植物细胞或微藻细胞。在不同的实施例中，宿主细胞表达编码在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置具有丙氨酸(A)的蛋白质的核酸，并且与表达野生型蛋白质的宿主细胞相比，产生至少2倍量的C18:0和/或C18:1脂肪酸。

在第四实施例中，一种方法通过培养上述宿主细胞和提取产生的油来产生油或油衍生产品。任选地，该培养是通过在糖上进行的异养生长。任选地，该方法还包括从该油产生脂肪酸、燃料、化学品、食品或其他油衍生产品。任选地，产生具有包含至少20％C8、C10、C12、C14、C16或C18(例如，C18:0和/或C18:1)脂肪酸的脂肪酸谱的油。其中该油是由微藻产生，该油可具有微藻固醇谱，并且任选地缺乏C24-α固醇。该油可用于从通过上述方法产生的油产生油衍生产品，任选地脂肪酸、燃料、化学品、食品或其他油衍生产品。

在第五实施例中，存在用于生产油的方法。该方法包括提供质体产油细胞，任选地表达由FATB基因编码的功能性酰基-ACP硫酯酶基因的微生物细胞，该FATB基因在对应于编码SEQ ID NO:8的氨基酸66-98的区域的区域中具有缺失突变；培养细胞以产生细胞-油；和从细胞中分离细胞-油。该细胞-油由于该缺失而富含C12。该FATB基因可编码与SEQ ID NO:40至43具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的蛋白质。该FATB基因可与SEQ ID NO:44或45或因遗传密码的简并性而致的等效序列具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。

在第六实施例中，一种包含编码FATB蛋白质的多核苷酸的cDNA、基因、表达盒或宿主细胞，该FATB蛋白质与SEQ ID NO:40至43中任一项具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。

在第七实施例中，一种cDNA、基因、表达盒或宿主细胞包含多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO:44或45或因遗传密码的简并性而致的等效序列具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。

在第八实施例中，一种遗传工程改造细胞的方法，包括在细胞中表达多核苷酸，该多核苷酸(a)编码与SEQ ID NO:40至43中任一项具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的蛋白质；或(b)与SEQ ID NO:47或48或因遗传密码的简并性而致的等效序列具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。

在其他方面中，提供了一种包含编码FATA蛋白质的多核苷酸的cDNA、基因、表达盒或宿主细胞，该FATA蛋白质与SEQ ID NO:61具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，并且其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)。在其他方面中，提供了一种包含编码FATA蛋白质的多核苷酸的cDNA、基因、表达盒或宿主细胞，该FATA蛋白质与SEQ ID NO:61或因遗传密码的简并性而致的等效序列具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，并且其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)。在其他方面中，提供了一种遗传工程改造细胞的方法，包括在细胞中表达多核苷酸，该多核苷酸(a)编码与SEQ ID NO:61具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的蛋白质，其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)。

在其他方面中，提供了能够表达编码FATA蛋白质的核酸构建体的宿主细胞，该FATA蛋白与SEQ ID NO:61具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，并且其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)，以产生相对于没有构建体的对照细胞具有改变的组成的甘油三酯油，该油任选地具有增加的C18脂肪酸，包括C18:0和C18:1脂肪酸。在不同的实施例中，该宿主细胞选自植物细胞、微生物细胞和微藻细胞。在其他方面中，提供了一种产生重组细胞的方法，该重组细胞产生改变的脂肪酸谱，该方法包括使用编码FATA蛋白质的核酸转化细胞，该FATA蛋白质与SEQ ID NO:61具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，并且其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)。在其他方面中，提供了一种根据这种方法产生的宿主细胞。在一些实施例中，该宿主细胞选自植物细胞、微生物细胞和微藻细胞。在其他方面中，提供了一种用于产生油或油衍生产品的方法，该方法包括培养编码FATA蛋白质的宿主细胞，该FATA蛋白质与SEQ ID NO:61具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，并且其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)，和提取由此产生的油，任选地其中该培养是通过在糖上进行的异养生长。在不同的实施例中，该方法还包括从该油产生脂肪酸、燃料、化学品、食品或其他油衍生产品。在不同的实施例中，该宿主细胞产生与表达野生型蛋白质的宿主细胞相比，至少2倍量的C18:0和/或C18:1脂肪酸。在其他方面中，还提供了一种通过在宿主细胞中表达编码FATA蛋白质的多核苷酸的方法产生的油，该FATA蛋白质与SEQ ID NO:61具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，并且其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ IDNO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)，任选地具有包含至少20％C8、C10、C12、C14、C16或C18(例如，C18:0和/或C18:1)脂肪酸的脂肪酸谱。在不同的实施例中，该油是由微藻产生，具有微藻固醇谱，和/或任选地缺乏C24-α固醇。还提供了一种来自通过在宿主细胞中表达编码FATA蛋白质的多核苷酸的方法产生的油的油衍生产品，任选地脂肪酸、燃料、化学品、食品或其他油衍生产品，该FATA蛋白质与SEQ ID NO:61具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，并且其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)。

说明性实施方案的描述

定义

如关于核酸所使用，术语“分离的”是指核酸不含典型地与天然存在的核酸一起存在的至少一种其他组分。因此，如果一种天然存在的核酸已经被纯化而远离至少一种与该核酸一起天然存在的其他组分，则它是分离的。

“细胞油”或“天然脂肪”应当是指从有机体获得的主要含甘油三酯的油，其中该油未经历与另一种天然油或合成油掺混，或分馏以实质上改变该甘油三酯的脂肪酸谱。结合一种包括了具有特定区域特异性的甘油三酯的油，该细胞油或天然脂肪未经历酯交换或其他合成工艺以致未获得该区域特异性甘油三酯谱，而是由一个细胞或细胞群天然地产生区域特异性。结合细胞油或天然脂肪，并且如本披露通篇总体上所使用，术语油和脂肪可互换地使用，除非另作注释。因此，“油”或“脂肪”取决于该物质的组成和其他条件，在室温下可以是液体、固体或部分固体的。在此，术语“分馏”表示以相对于由有机体所产生的谱而改变其脂肪酸谱的方式来从该油去除物质，不管用何种方法完成。术语“细胞油”和“天然脂肪”包括如从有机体获得的油，其中该油已经历最低限度的不实质上改变其甘油三酯谱的加工，包括精炼、漂白和/或脱胶。细胞油还可以是“非酯交换的细胞油”，表示该细胞油未经历这样一种加工，其中脂肪酸与甘油的酰基连接被重新分布且基本上保持了与从有机体中回收时相同的构型。

“外源基因”应当意指已经被引入细胞中(例如通过转化/转染)的编码RNA和/或蛋白质的表达的核酸，并且还被称为“转基因”。包含外源基因的细胞可以被称为重组细胞，可以向其中引入另外的外源基因。相对于正在转化的细胞，外源基因可以来自不同的物种(并因此是异源的)，或来自相同的物种(并因此是同源的)。因此，外源基因相对于该基因的内源副本，可以包括占据了细胞基因组中不同位置或处于不同控制下的同源基因。外源基因可以在细胞中以多于一个副本存在。外源基因可以在细胞中例如作为基因组(核或质体)中的插入物或作为游离型分子而维持。

“脂肪酸”应当表示游离脂肪酸、脂肪酸盐、或甘油脂中的脂肪酰基部分。应理解的是，甘油脂的脂酰基可以根据甘油三酯水解或皂化时产生的羧酸或羧酸阴离子来描述。

“微藻”是含有叶绿体或其他质体并且任选地能够进行光合作用的微生物有机体，或能够进行光合作用的原核微生物有机体。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物，以及能够仅以固定碳源为生的异养生物。微藻包括细胞分裂后不久与姊妹细胞分开的单细胞有机体，如衣藻属，连同微生物，例如像，团藻属，它是两种不同细胞类型的简单多细胞光合性微生物。微藻包括细胞例如小球藻属、杜氏藻属和无绿藻属。微藻还包括了展现出细胞-细胞粘附的其他微生物光合有机体，例如阿格门氏藻属(Agmenellum)、鱼腥藻属、以及桑椹藻属(Pyrobotrys)。微藻还包括专性异养微生物，它们已经丧失进行光合作用的能力，如某些双鞭甲藻属(dinoflagellate)藻类物种和无绿藻属物种。

“产油”细胞是能够天然地或通过重组或经典品系改良而产生以干细胞重量计至少20％的脂质的一种细胞。“产油微生物(oleaginous microbe)”或“产油微生物(oleaginous microorganism)”是一种微生物，包括产油的微藻。

在两个或更多个氨基酸或核酸序列的背景下，术语“序列一致性百分比”是指如使用序列比较算法或通过目测进行测量，当比较和比对最大对应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。关于确定核苷酸或氨基酸一致性百分比的序列比较，典型地以一个序列作为参考序列，将测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，把测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。基于指定的程序参数，序列比较算法随后相对于参考序列计算检验序列的序列一致性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以使用设置为默认参数的NCBIBLAST软件(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行。例如，为了比较两个核酸序列，可以使用blastn，其采用设置为以下默认参数的“BLAST 2序列”工具版本2.0.12(2000年4月21日)：矩阵：BLOSUM62；匹配加分：1；错配罚分：-2；开放空位：5个罚分和延伸空位：2个罚分；空位x下降(drop-off)：50；期望：10；字长：11；滤波器：开。对于两个氨基酸序列的成对比较，可以使用“BLAST 2序列”工具版本2.0.12(2000年4月21日)与blastp设置，例如，设置为以下默认参数：矩阵：BLOSUM62；开放空位：11个罚分和延伸空位：1个罚分；空位x下降50；期望：10；字长：3；滤波器：开。

当任何给定聚合物组分(例如氨基酸、核苷酸，也通称为“残基”)的位置是通过参照所选择的氨基酸或核酸聚合物中的相同或等效位置(例如基于最优比对或共有序列)而指定，而并非通过在该给定聚合物中该组分的实际编号位置而指定时，一种给定的氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号“对应于”或是“相对于”一种所选择的氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号。

一种“变体”是一种包括如下序列的多肽，该序列与一种亲本多肽序列的序列具有一个或多个氨基酸位置差异(例如，通过取代、缺失、或插入)。变体可以包括如下的序列，该序列与亲本多肽序列具有多达40％的该亲本多肽序列残基总数如多达40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的亲本多肽序列残基总数的差异。例如，400个氨基酸多肽序列的变体包括如下的序列，该序列具有多达40％的该亲本多肽序列残基总数的差异，即在该400个氨基酸多肽序列之内具有多达160个氨基酸位置(如在参考序列之内具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78、79、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、或160个氨基酸位置)的差异。

“天然存在的”当应用于一种组合物时，该组合物可在自然界中被发现，有别于由人类人工产生的那种。例如，有机体(包括病毒、细菌、原生动物、昆虫、植物或哺乳动物的组织)中存在的、可从自然界中的来源中分离的并且尚未被人类在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸是天然存在的。“非天然存在的”(还称作“合成的”或“人工的”)当应用于一种对象时，意指该对象不是天然存在的-即，该对象不能在自然界中被发现而有别于由人类人工产生的那种。

结合细胞油，“谱”是在该油内特定种类或甘油三酯或脂肪酰基的分布。“脂肪酸谱”是在不参考与甘油主链的连接的情况下，该油的甘油三酯中脂肪酰基的分布。脂肪酸谱典型地是通过转化成脂肪酸甲酯(FAME)，随后进行气相色谱(GC)分析与火焰离子化检测(FID)来确定。脂肪酸谱可以表示为由一种脂肪酸的曲线下面积测定的总脂肪酸信号中该脂肪酸的一个或多个百分比。FAME-GC-FID测量值近似为这些脂肪酸的重量百分含量。

如在此所使用，如果相对于非富含油，在一种油中一种或多种特定脂肪酸的质量增加至少10％，则将该油说成“富含”该脂肪酸。例如，在表达在此描述的异源FatB基因的细胞的情况下，如果例如C8和C16脂肪酸在由该细胞产生的油中的质量比由相同类型的不表达该异源FatB基因的细胞产生的油(例如，野生型油)中的质量大至少10％，则将该油说成富含这些脂肪酸。

“重组体”是因引入外源核酸或改变天然核酸而已经被修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体。因而，例如，重组(宿主)细胞可以表达在天然(非重组)形式的细胞内部找不到的基因，或以与非重组细胞表达这些基因不同的方式表达天然基因。重组细胞可以但不限于包括编码基因产物或抑制元件(如降低细胞中的活性基因产物的水平的突变、敲除、反义、干扰RNA(RNAi)或dsRNA)的重组核酸。“重组核酸”是最初在体外形成(总体来说，通过操作核酸，例如使用聚合酶、连接酶、核酸外切酶及核酸内切酶)、使用化学合成的核酸，或另外地呈通常未见于自然界中的形式。可以产生重组核酸，例如，以使两个或更多个核酸处于可操作连接。因此，在体外通过连接正常情况下自然界中不接合的DNA分子所形成的分离核酸或表达载体在本文均视为重组。还可以按其他方式产生重组核酸；例如，使用化学DNA合成。一旦重组核酸被制备并且导入到宿主细胞或有机体中，它可以使用该宿主细胞的体内细胞机器来复制；然而，此类核酸一旦被重组产生，即使随后经细胞内复制，在本文仍然被视为重组的。类似地，“重组蛋白”是使用重组技术，即，通过表达重组核酸所产生的蛋白质。

实施例涉及新型FatB酰基-ACP硫酯酶基因(例如，在体外或在宿主细胞中为cDNA、载体和构建体的形式)基因变体和从植物分离的肽(其可在宿主细胞中表达)的使用以改变由细胞产生的油的脂肪酸谱。通过从各种植物物种获得cDNA并转化模式生物-专性异养微藻(桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis))来发现基因。尽管使用桑椹型无绿藻筛选FatB基因改变脂肪酸谱的能力，但这些基因和相应的基因产物在多种多样的宿主细胞中是有用的。例如，这些基因可以被表达于细菌、其他微藻或高等植物中。可根据美国专利号5,850,022；5,723,761；5,639,790；5,807,893；5,455,167；5,654,495；5,512,482；5,298,421；5,667,997；5,344,771；以及5,304,481的方法在高等植物中表达这些基因。脂肪酸可以被进一步合成地或生物合成地转化成甘油三酯、脂肪醛、脂肪醇以及其他油脂化学品。

此外，在获得新型FatB序列的过程中，我们发现FatB cDNA中的某些N-端缺失导致微藻模型中理想改变的脂肪酸谱。

在一个实施例中，存在包含与异源表达控制序列可操作地连接的核酸序列的多核苷酸，其中所述核酸序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:19-36，编码由SEQ IDNO:1-18组成的组的氨基酸序列的序列或当在质体产油细胞中表达时其具有酰基-ACP硫酯酶活性的变体。

在一个实施例中，由表达表1的新型FatB基因的宿主细胞产生甘油三酯。可从宿主细胞中回收包含甘油三酯的细胞油。可将细胞油精炼、脱胶、漂白和/或除臭。处于其天然或加工形式的油可以用于食品、化学品、燃料、化妆品、塑料以及其他用途。

这些基因可以用于多种遗传构建体(包括质粒或其他载体)中，以用于在宿主细胞中表达或重组。基因可以经密码子优化以用于在靶宿主细胞中表达(例如，使用表2-5的密码子使用表)。例如，根据表2、3、4或5，所使用的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的密码子可以是最优选的密码子。或者，根据表2、3或5，所使用的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的密码子可以是第一或第二最优选的密码子。由这些基因产生的蛋白质可以在体内或以纯化形式使用。

例如，可以在包含可操作连接的启动子和5’UTR的表达载体中制备该基因。在质体细胞被用作宿主的情况下，如在以下实例中，可以将适当活性的质体靶向肽(还称为“转运肽”)融合至FATB基因。在下面出现的一些FATB肽序列中，转运肽由带下划线或带轮廓的文本表示。通常，对于新鉴定的FATB基因，在N-末端存在大致50个氨基酸，构成质体转运肽，它负责将酶转运到叶绿体。在以下实例中，这种转运肽被一个38氨基酸序列(SEQ ID NO:37)替代，该38氨基酸序列在桑椹型无绿藻宿主细胞中对于将酶转运到那些细胞的质体是有效的。因此，我们考虑了缺失以及融合蛋白，以便优化给定宿主细胞中的酶活性。例如，可以使用来自宿主或相关物种的转运肽替代在此描述的新发现的植物基因的转运肽。大体上，与FATB基因的酶结构域相比，质体靶向肽不太保守。质体靶向肽可以被其他序列取代，所述其他序列例如在由爱荷华州立大学/美国国家科学基金会生物可再生化学品工程技术研究中心主办的硫酯活性酶的ThYme数据库中的质体靶向基因的植物来源序列(例如，用于FATA、FATB、SAD或KAS基因的那些)中发现的那些。因此，某些实施例描述了与缺乏质体靶向肽的FATB基因的基因或蛋白质序列的百分比一致性。

选择性标记基因可以被包括在载体中，以帮助分离转化的细胞。用于微藻的选择性标记的实例包括蔗糖转化酶、抗生素抗性和硫胺合成基因。

还可以使用披露的基因序列制备反义或抑制RNA(例如，RNAi或发夹RNA)，以在植物或其他有机体中抑制互补基因。

发现有用于在细胞中产生希望的脂肪酸谱的FatB基因总结于下表1中。可以使用具有SEQ ID NO:19-36的序列的核酸或蛋白质改变重组细胞的脂肪酸谱。也可使用变体核酸；例如，与SEQ ID NO:19-36具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的变体。考虑了针对多种宿主有机体的基因的密码子优化，同样考虑了基因片段的使用。无绿藻属株系和原壳小球藻的偏好密码子分别示于表2和3中。赖特氏萼距花(Cuphea wrightii)的密码子使用示于表4中。拟南芥属的密码子使用示于表5中；例如，可以选择每种氨基酸的最偏好的密码子。其他有机体(包括微藻和高等植物)的密码子表在本领域是已知的。在一些实施例中，使用第一和/或第二最偏好无绿藻属密码子进行密码子优化。在特定实施例中，根据如表2至5所述的无绿藻属、小球藻属、赖特氏萼距花或拟南芥属中的偏好密码子使用，将包含在以下序列表中的新型氨基酸序列转化成核酸序列或与这些衍生的核酸序列具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸序列。

在实施例中，存在以下蛋白质或编码具有SEQ ID NO:1-18中任一项的蛋白质的核酸。在一个实施例中，存在蛋白质或编码以下蛋白质的核酸，该蛋白质与SEQ ID NO:1-18中任一项具有至少80％、85％、85.1％、85.2％、85.3％、85.4％、85.5％、86％、86.5％、86.6％、86.7％、87％、87.5％、87.6％、87.7％、87.8％、87.9％、88％、89％、90％、91％、92％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、94％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％、95％、95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.6％、95.7％、95.8％、95.9％、96％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、97％、98％、99％或100％序列一致性。一个实施例包括上述蛋白质或核酸的任一种的片段(包括蛋白质或核酸变体的片段)，其中该蛋白质片段具有酰基-ACP硫酯酶活性或该核酸片段编码这样一个蛋白质片段。在其他实施例中，该片段包括一个酰基-ACP硫酯酶结构域，其介导一种具体功能，例如，特异性决定结构域。示意性片段可以通过C-末端和/或N-末端截短产生并且包括在此披露的全长序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

在某些实施例中，可通过使用全长核酸序列(例如，SEQ ID NO:19-36中的一个)或全长氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:1-18中的一个)作为参考序列并将全长测试序列与该参考序列进行比较，计算以上文讨论的核酸或蛋白质的变体的百分比序列一致性。在涉及片段的一些实施例中，可以在片段的整个长度上计算核酸或蛋白片段的变体的序列一致性百分比。

核酸可以处于分离形式，或作为载体或其他构建体、染色体或宿主细胞的一部分。已经发现，在许多情况下不需要全长基因(和蛋白质)；例如，缺失一些或所有N-端疏水结构域(典型地为从LPDW开始的18个氨基酸结构域)产生仍然有功能的基因。此外，将表1中的基因的特异性决定区与其他酰基-ACP硫酯酶的催化结构域融合可以产生功能基因。某些实施例包括分别与异源酰基-ACP硫酯酶核酸或氨基酸序列融合的所披露的核酸或氨基酸的功能片段(例如，特异性决定区)。

表1

根据实施例的FatB基因和蛋白质

表2：无绿藻属株系中的偏好密码子使用

表3：原壳小球藻中的偏好密码子使用

表4：

赖特氏萼距花的密码子使用(密码子、氨基酸、频率、千分之……、数字)

表5：

拟南芥属的密码子使用(密码子、氨基酸、频率、千分之……)

宿主细胞

宿主细胞可以是单个细胞(例如，微藻、细菌、酵母)或多细胞有机体(如植物或真菌)的一部分。用于在植物中表达Fatb基因的方法描述于例如美国专利号5,850,022；5,723,761；5,639,790；5,807,893；5,455,167；5,654,495；5,512,482；5,298,421；5,667,997；5,344,771；和5,304,481中，或者可以使用植物生物技术中通常已知的其他技术获得。产油微生物(包括绿藻门的那些)的工程化披露于WO 2010/063032、WO 2011/150411和WO2012/106560以及以下实例中。

产油宿主细胞的实例包括具有II型脂肪酸生物合成途径的植物细胞和微生物细胞，包括质体产油细胞，如产油藻类的那些。微藻细胞的具体实例包括绿藻门、四胞藻纲(class Trebouxiophytae)、小球藻目或小球藻科的异养或专性异养微藻。产油微藻的实例提供于公开的PCT专利申请WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410及WO 2011/150411中，包括了小球藻属和无绿藻属(包括专性异养生物的属)的物种。产油细胞可以例如能够产生以细胞重量计20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％或约90％±5％的油。任选地，所产生的油可以具有较少的DHA或EPA脂肪酸。举例来说，这些油可以包含不到5％、2％或1％的DHA和/或EPA。上述公开物还披露了用于培养此类细胞和提取油，尤其是从微藻细胞中提取油的方法；此类方法适用于本文披露的细胞并且有关这些传授内容通过引用结合。当使用微藻细胞时，可以将它们自养地培养(除非是专性异养生物)或在黑暗中使用糖(例如，葡萄糖、果糖和/或蔗糖)培养。在此所描述的实施例的任一个中，这些细胞可以是包含外源转化酶基因的异养细胞，以便使这些细胞能够从蔗糖原料中生产油。作为替代方案，或此外，这些细胞可以由纤维素原料代谢木糖。举例来说，这些细胞可以被遗传工程改造成表达一个或多个木糖代谢基因，如编码活性木糖转运蛋白、木酮糖-5-磷酸转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖醇脱氢酶及木糖还原酶的那些。参看2012年11月15日公开的WO 2012/154626，“经过遗传工程改造的代谢木糖的微生物(GENETICALLYENGINEERED MICROORGANISMS THAT METABOLIZE XYLOSE)”。可在诸如酸或酶水解的蔗渣、甜菜渣、玉米秸秆、木屑、锯屑或柳枝稷的解聚的纤维素原料上培养细胞。任选地，可以在包含葡萄糖和至少5％、10％、20％、30％或40％木糖的解聚纤维素原料上培养细胞，同时以干重计产生至少20％的脂质。任选地，脂质包含具有特征为至少10％、15％或20％的C12:0的脂肪酸谱的甘油三酯。

油和相关产品

产油细胞表达一个或多个编码脂肪酸生物合酶的外源基因。因此，一些实施例的特征在于从非植物或非种子油无法获得或根本无法获得的细胞油。

产油细胞产生一种储存油，该油主要是三酰甘油酯并且可以被储存在细胞的储存体中。可以由细胞，通过破坏细胞并分离出油来获得粗油。WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410及WO 2011/1504披露了异养培养和油分离技术。例如，可以通过培养、干燥并压榨这些细胞来获得油。WO 2010/120939中给出了用于压榨细胞的方法。如本领域中所知或如WO 2010/120939中所描述，所产生的油可以进行精炼、漂白并除臭(RBD)。粗油或RBD油可以被用于多种食品、化学品或工业产品或工艺中。在回收油之后，有价值的残留生物质保留下来。残留生物质的用途包括制造纸、塑料、吸收剂、吸附剂、作为动物饲料、用于人类营养或用于肥料。

在此处给出甘油三酯(又称为“三酰甘油酯”或“TAG”)细胞油的脂肪酸谱的情况下，应了解的是，这是指从细胞提取的储存油的未分馏样品，该样品在已经去除磷脂的条件下或用实质上对磷脂的脂肪酸不敏感的分析方法(例如，使用色谱法和质谱法)进行分析。该油可以经历RBD工艺以去除磷脂，游离脂肪酸和气味对于该油中甘油三酯的脂肪酸谱仅具有微小或可忽略的改变。由于这些细胞是产油的，故在一些情形中，储存油将构成该细胞中全部TAG的大部分。

稳定碳同位素值δ13C是相对于标准品(例如，PDB，来自美国南卡罗来纳州皮迪组(Peedee formation)的美洲箭石的化石骨架的天然焦)的13C/12C的比率的表示。油的稳定碳同位素值δ13C(0/00)可以与所用原料的δ13C值相关。在一些实施例中，这些油衍生自异养地生长于衍生自C4植物(如玉米或甘蔗)的糖上的产油有机体。在一些实施例中，油的δ13C(0/00)是从-10至-17 0/00或从-13至-16 0/00。

根据以上方法生产的油在一些情形中是使用微藻宿主细胞制造。如上所述，微藻可以但不限于落入以下分类：绿藻门、共球藻纲、小球藻目、小球藻科、或绿藻纲。已经发现，四胞藻纲的微藻基于其固醇谱而可以与植物油相区别。发现由原壳小球藻产生的油可产生固醇，当通过GC-MS检测时，这些固醇看来为菜籽固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇及β-谷固醇。然而，据信由小球藻产生的所有固醇都具有C24β立体化学。因此，据信被检测为菜油固醇、豆固醇及β-谷固醇的分子实际上对应地为22,23-二氢菜籽固醇、多孔固醇及穿贝海绵甾醇。因此，由以上描述的微藻产生的油因具有C24β立体化学的固醇的存在以及所存在的固醇中C24α立体化学的不存在而可以与植物油相区分。举例来说，产生的油可能含有22,23-二氢菜籽固醇，但缺乏菜油固醇；含有穿贝海绵甾醇，但缺乏β-谷固醇，和/或含有多孔甾醇但缺乏豆固醇。作为替代方案，或此外，这些油可以含有大量的Δ⁷-多孔固醇。

在一个实施例中，在此提供的这些油不是植物油。植物油是从植物和植物种子提取的油。植物油可以基于其油含量而与在此提供的非植物油相区分。用于分析油含量的多种方式都可以用于确定该油的来源或在此提供的油是否掺杂了具有不同(例如植物)起源的油。该确定可以基于分析方法之一或组合来作出。这些测试包括但不限于以下各项中一种或多种的分析：游离脂肪酸、脂肪酸谱、总三酰基甘油含量、二酰基甘油含量、过氧化物值、光谱特性(例如UV吸收)、固醇谱、固醇降解产物、抗氧化剂(例如生育酚)、颜料(例如叶绿素)、d13C值及感官分析(例如，味道、气味及口感)。许多此类测试已经针对商业油进行标准化，如食品法典有关可食用脂肪和油的标准。

固醇谱分析是一种特别众所周知的用于确定有机物质的生物来源的方法。菜油固醇、b-谷固醇及豆固醇是常见的植物固醇，其中b-谷固醇是一种主要的植物固醇。举例来说，在某些种子油的分析中发现b-谷固醇是最丰富的，在玉米种接近64％，在油菜籽中为29％，在向日葵中为64％，在棉籽中为74％，在大豆中为26％并且在橄榄油中为79％(古尔(Gul)等,《细胞和分子生物学杂志》(J.Cell and Molecular Biology)5:71-79,2006)。

从桑椹型无绿藻品系UTEX1435分离的油单独地被澄清(CL)，精炼并漂白(RB)，或精炼，漂白并除臭(RBD)并且根据JAOCS第60卷,第8期,1983年8月中所描述的程序针对固醇含量进行测试。分析结果示于下文(单位mg/100g)：

表6

这些结果显示出三个显著特征。第一，发现麦角固醇是所有固醇中最丰富的，占总固醇约50％或更高。麦角固醇的量大于菜油固醇、β-谷固醇以及豆固醇组合的量。麦角固醇是常见于真菌中的类固醇并且不常见于植物中，并且它的特别大量的存在用作非植物油的有用标记物。第二，发现该油含有菜籽固醇。除油菜籽油外，菜籽固醇不常见于基于植物的油中。第三，发现存在不到2％的β-谷固醇。β-谷固醇是不常见于微藻中的一种重要的植物固醇，并且它的特别大量的存在用作植物起源的油的一种有用标记物。概括起来，已经发现桑椹型无绿藻品系UTEX1435以总固醇内含物的百分含量计含有大量的麦角固醇和仅痕量的β-谷固醇。因此，麦角固醇:β-谷固醇的比率或与菜籽固醇的存在组合可以被用于将这一油与植物油相区分。

在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计含有低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的β-谷固醇。在其他实施例中，该油不含β-谷固醇。

在一些实施例中，该油不含以下各项中的一种或多种：β-谷固醇、菜油固醇或豆固醇。在一些实施例中，该油不含β-谷固醇、菜油固醇及豆固醇。在一些实施例中，该油不含菜油固醇。在一些实施例中，该油不含豆固醇。

在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计包含低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的24-乙基胆固-5-烯-3-醇。在一些实施例中，该24-乙基胆固-5-烯-3-醇是穿贝海绵甾醇。在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计包含至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的穿贝海绵甾醇。

在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计含有低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的24-甲基胆固-5-烯-3-醇。在一些实施例中，该24-甲基胆甾-5-烯-3-醇是22,23-二氢菜籽固醇。在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计包含至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的22,23-二氢菜籽固醇。

在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计含有低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的5,22-二烯胆固-24-乙基-3-醇。在一些实施例中，该5,22-胆甾二烯-24-乙基-3-醇是多孔固醇。在一些实施例中，在此提供的油的油内含物以占总固醇的百分含量计包含至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的多孔固醇。

在一些实施例中，在此提供的油的油内含物含有麦角固醇或菜籽固醇或二者的组合。在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少5％、10％、20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％的麦角固醇。在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少25％的麦角固醇。在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少40％的麦角固醇。在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少5％、10％、20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％的麦角固醇与菜籽固醇的组合。

在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少1％、2％、3％、4％或5％的菜籽固醇。在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有低于10％、9％、8％、7％、6％或5％的菜籽固醇。

在一些实施例中，麦角固醇与菜籽固醇的比率为至少5:1、10:1、15:1或20:1。

在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少5％、10％、20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％的麦角固醇和低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的β-谷固醇。在一些实施例中，该油内含物以占总固醇的百分含量计含有至少25％的麦角固醇和低于5％的β-谷固醇。在一些实施例中，该油内含物另外包含菜籽固醇。

固醇含有27至29个碳原子(C27至C29)并且在所有真核生物中发现。动物仅产生C27固醇，因为他们缺乏进一步修饰C27固醇以产生C28和C29固醇的能力。然而，植物能够合成C28和C29固醇，并且C28/C29植物固醇通常被称为植物甾醇。给定植物的固醇谱富含C29固醇，并且植物中的主要固醇通常是C29固醇b-谷固醇和豆固醇。相比之下，非植物有机体的固醇谱含有更大百分比的C27和C28固醇。例如，真菌和许多微藻中的固醇主要是C28固醇。植物中的固醇谱并且特别是C29固醇相比C28固醇的突出优势已被用来确定土壤样品中植物和海洋物质的比例(Huang、Wen-Yen、Meinschein W.G.,“作为生态指示的固醇(Sterols as ecological indicators)”；地球化学与宇宙化学学报(Geochimica etCosmochimia Acta.)，第43卷，第739-745页)。

在一些实施例中，在此提供的微藻油中的主要固醇是b-谷固醇和豆固醇以外的固醇。在微藻油的一些实施例中，C29固醇以重量计占总固醇含量的小于50％、40％、30％、20％、10％、或5％。

在一些实施例中，在此提供的微藻油含有超过C29固醇的C28固醇。在微藻油的一些实施例中，C28固醇以重量计占总固醇含量的大于50％、60％、70％、80％、90％、或95％。在一些实施例中，C28固醇是麦角固醇。在一些实施例中，C28固醇是菜籽固醇。

在实施例中，表达表1的基因中的一种或多种的产油细胞可以产生具有至少20％、40％、60％或70％的C8、C10、C12、C14或C16脂肪酸的油。在一个特定实施例中，油中的豆蔻酸(C14:0)的水平大于30％。

因此，在实施例中，存在一种用于产生油、甘油三酯、脂肪酸或这些物质中的任一种的衍生物的工艺，该工艺包括用在此讨论的任何核酸转化细胞。在另一个实施例中，培养转化的细胞，以产生一种油，并且任选地，提取该油。以这种方式提取的油可以用于产生食品、油脂化学品或其他产品。

以上单独或组合论述的油可用于制造食品、燃料及化学品(包括塑料、泡沫、膜等)。这些油、甘油三酯、来自这些油的脂肪酸可以经历C-H活化、氢氨基甲基化反应、甲氧基-碳酸化反应、臭氧分解、酶促转化、环氧化反应、甲基化反应、二聚合反应、硫醇化反应、复分解反应、氢烷基化反应、内酯化反应或其他化学过程。

提取油后，可以留下残留生物质，其可以用作燃料、用作动物饲料或用作纸、塑料或其他产品的成分。例如，来自异养藻类的残留生物质可以用于此类产品。

增强宿主细胞中中链脂肪酸的产生的FATB基因的缺失突变体

在另一个实施例中，存在增加C12或C10脂肪酸的产生的方法。该方法包括产生具有编码FATB酰基-ACP硫酯酶但在对应于SalFATB2基因(SEQ ID NO:8)的氨基酸66-98的区域中编码缺失突变的序列的多核苷酸；即，在对应于以SEQ ID NO:42为特征的区域的FATB区域中的缺失。在一些情况下，用于起始FATB的缺失突变体的区域已经含有缺口；在这种情况下，可以去除该区域中的其他残基。例如，UcFATB2在相对于SalFatB2的位置95-96具有2-残基缺口，UcFatB1在相对于SalFatB2的位置92-97具有6-残基缺口，并且LbeFatB1在相对于SalFatB2的位置94-97具有4-残基缺口。完整的32个氨基酸缺失或更短的缺失(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个氨基酸残基的缺失)也可以有效地增加本文披露的FATB酶中或本领域已知的其他FATB酶(例如，与SEQ ID NO:1-18中的一个具有至少80％、85％、90％或95％一致性的那些)中的C12脂肪酸；这可以使用本文披露的技术(包括实例)容易地确定。

含有编码缺失突变体的基因的载体可以在产油宿主细胞(单或多细胞)中表达，并与未转化的细胞相比，以选择增加由细胞产生中链脂肪酸的突变体。这可以通过萃取油并使用色谱技术来确定。

因此，在一个实施例中，存在用于增加细胞中C10-C14脂肪酸的产生的方法。该方法包括产生或提供外源多核苷酸，该外源多核苷酸包含与编码质体靶向序列和突变体FATB酰基-ACP硫酯酶酶结构域的编码区融合的任选异源控制序列。FATB酰基-ACP硫酯酶酶结构域在对应于SEQ ID NO:8的氨基酸66-98的区域中具有缺失。外源多核苷酸在产油宿主细胞中表达。作为表达的结果，相对于缺乏外源多核苷酸的对照细胞，宿主细胞产生富含C12脂肪酸的油。在具体的实施例中，油的脂肪酸谱中的C10和C12脂肪酸的总和增加至少10％、20％、30％、50％、100％、150％或200％。例如，油中C12脂肪酸的量相对于对照细胞增加至少2倍。起始FATB基因不是CcFATB4基因(SEQ ID NO:46)，因为该基因已经具有跨越其中进行了缺失的结构域的缺口。在相关实施例中，缺失导致C8和/或C10脂肪酸的增加。

在一个实施例中，存在编码与SEQ ID NO:43-46、50、51、54或55中任一项具有至少75％、80％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％或99％的氨基酸一致性的蛋白质序列的多核苷酸。该多核苷酸可包含与SEQ ID NO:47、48、52或56中任一项或因遗传密码的简并性而致的等效序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％或99％序列一致性。该序列在对应于氨基酸66-98的区域中具有缺失，并且不是CcFatB4(SEQ ID NO:46)的缺失。在相关的实施例中，存在由上述序列之一编码的蛋白质、用于转化宿主细胞的载体或表达这些序列之一的宿主细胞。还有一种产生油的方法，包括在产油宿主细胞中表达这些序列之一、培养细胞、并从细胞中分离油。相对于缺乏多核苷酸的对照细胞，回收的油可在C12脂肪酸中升高10％、20％、50％、100％、150％、200％或更高。实例3证明了相对于缺乏缺失的对照，由于在真核微藻中表达缺失突变体而产生的C12:0脂肪酸的增加。

多核苷酸序列可以针对包括根据表2-5的多种有机体进行密码子优化。

表7：FatB缺失突变体序列

根据一个实施例，一种遗传工程改造细胞的方法，包括在细胞中表达多核苷酸，该多核苷酸(a)编码与SEQ ID NO:40至43、50、51、54或55中任一项具有至少65％、70％、80％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的蛋白质；或与SEQ ID NO:44、45、52或56或因遗传密码的简并性而致的等效序列具有至少65％、70％、80％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。在一个具体的实施例中，基因工程化细胞的方法包括在细胞中表达编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质与42具有至少86.7％的序列一致性，与43具有至少80.7％的序列一致性，与SEQ ID NO:51具有至少88.2％的序列一致性。

实例1.新型FATB序列的发现

将RNA从干燥的植物种子中提取并使用Illumina Hiseq 2000平台经受配对末端测序。使用Trinity软件包将RNA序列读数组装成对应的种子转录组并且通过采掘与已知硫酯酶具有同源性的序列的转录组而鉴定推定的包含硫酯酶的cDNA重叠群。在一些情况下，使用种子RNA和靶向全长硫酯酶cDNA的引物对，通过直接反转录PCR分析验证了这些计算机模拟鉴定的推定硫酯酶cDNA。将所得扩增产物克隆并从头测序，以确认鉴定的硫酯酶基因的可靠性并且以鉴定由不同等位基因的表达或种子群内的序列多样性产生的序列变体。对于一些序列，使用Trinity组装高置信度的全长转录物，并且认为不需要逆转录。使用公开的全长(迈耶(Mayer)和尚克林(Shanklin)，2007)和截短的(THYME数据库)序列以及在来自在许多油籽转录组中鉴定的FATB序列的索拉兹米公司(Solazyme)开发的广泛的内部系统进化对所有新推定的FATB硫酯酶的所得氨基酸序列进行系统进化分析。包含酰基-ACPFATB硫酯酶的内部系统进化允许在许多情况下预测每种硫酯酶的中链特异性；追踪了预测参与C8-C12脂肪酸的生物合成的FATB。

具有和不具有它们的N端质体靶向肽的新型FatB基因的氨基酸序列和核酸CDS(源自植物并针对桑椹型无绿藻进行密码子优化)示于上表1中。

实例2.表达酰基-ACP FATB硫酯酶的转化载体的表达

以密码子优化形式合成实例1的九个酰基-ACP FATB硫酯酶基因以反映桑椹型无绿藻(UTEX 1435)密码子使用。使用CcrasFATB1作为实例，在SEQ ID NO:38中提供代表性转化构建体和FATB酶的序列。用来自原壳小球藻(Cp)(SEQ ID NO:40)的修饰的转运肽代替天然转运肽合成新的硫酯酶。将来源于CpSAD1基因的“CpSAD1tp_修整的”修饰转运肽合成为至FATB硫酯酶的框内的、N-末端融合物，代替天然转运肽。

通过用编码12种FatB硫酯酶的1种的构建体转化基本菌株S7485产生转基因菌株。将编码CcrasFATB1的构建体pSZ5342/D4219显示为一个实例，但相同的方法用于产生编码不同的对应硫酯酶的剩余11种构建体中的每一种。构建体pSZ5342可以写作THI4A_5'::CrTUB2-ScSUC2-PmPGH:PmSAD2-2ver3-CpSAD1tp_trmd:CcrasFATB1-CvNR-THI4A_3'。以小写字母、粗体并加下划线指示分别在来自5’-3’、BspQ1、KpnI、BamHI、EcoRV、SpeI、XhoI、SacI、BspQ1的构建体中的相关限制性位点。BspQ1位点界定转化用DNA的5'和3'端。在该构建体的5’和3’端处的粗体、小写字母序列代表经由同源重组靶向整合至THI4A基因座的来自UTEX 1435的基因组DNA。沿5’至3’方向继续向前，选择盒具有驱动酿酒酵母基因SUC2(赋予在蔗糖上生长的能力)表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和桑椹型无绿藻PGH基因3'UTR。该启动子是以小写字母、带框文本指示。ScSUC2的起始子ATG和终止子TGA由粗体、大写字母斜体指示，同时编码区以小写字母斜体指示。3’UTR由小写字母加下划线文本指示。在两个盒之间的间隔子区由大写字母文本指示。包含与异源原壳小球藻SAD1质体靶向转运肽(CpSAD1tp_修整的)融合的、来自厚瓣萼距花的经密码子优化的CcrasFATB1基因的第二盒由桑椹型无绿藻SAD2-2ver3pH5响应型启动子驱动，并且具有普通小球藻硝酸还原酶(NR)基因3'UTR。在这一盒中，PmSAD2-2ver3启动子由小写字母、带框文本指示。CcrasFATB1基因的起始子ATG和终止子TGA以粗体、大写字母斜体指示，同时编码区由小写字母斜体指示。3’UTR由小写字母加下划线文本指示。

除了编码的硫酯酶外，所有硫酯酶构建体的序列相同。提供了pSZ5342/D4219整合构建体(SEQ ID NO:38)的完整序列。

将编码异源FATB基因的构建体转化到产生高脂质的无绿藻属株系中并针对在蔗糖上生长的能力进行选择。转化、细胞培养、脂质产生及脂肪酸分析都如WO 2013/158938中进行。进行多重转化。具有最高C10(对于所列出的前6个基因)或C12产生(对于剩余的基因)的菌株的脂肪酸谱在表8中报告。

来自千屈菜科群的六种硫酯酶对C10:0脂肪酸均显示特异性：CcrasFATB1，其展示4％的C10:0和1％的C12:0脂肪酸水平；CkoeFATB3，其展示9％的C10:0和2％的C12:0脂肪酸水平；CleptFATB1，其展示6％的C10:0和1％的C12:0脂肪酸水平；CangFATB1，其展示4％的C10:0和1％的C12:0脂肪酸水平；CllaFATB1，其展示9％的C10:0和1％的C12:0脂肪酸水平；和ClopFATB1，其展示7％的C10:0和1％的C12:0脂肪酸水平。

SalFATB1和LbeFATB1，两个均属于樟科，展示出对C12:0脂肪酸的实质性活性。

实例3：樟科FATB基因的FATB缺失突变体

使用实例2中描述的表达盒和转运肽，合成分别称为SalFATB1a和LbeFATB1a的SalFATB1和LbeFATB1的缺失变体的转化载体。缺失变体在对应于SalFATB2基因(SEQ IDNO:8)的氨基酸66-98的区域中具有缺失。对这些构建体进行密码子优化以反映UTEX 1435密码子使用。转化、细胞培养、脂质产生及脂肪酸分析都如实例2中进行。将编码异源FATB基因的构建体转化到桑椹型无绿藻株中并针对在蔗糖上生长的能力进行选择。两种新型FATB硫酯酶的结果显示在表9中。

表9.

与缺乏缺失的野生型基因(FATB1)相比，表达脂肪酰基-ACP FATB基因(FATB1a)的缺失突变体的菌株的脂肪酸谱。

基因	C8:0	C10:0	C12:0	C14:0	C16:0	C18:0	C18:1	C18:2	C18:3
										SalFATB1	0	0	7	3	32	4	47	5	1
SalFATB1a	0	0	15	3	27	3	45	5	1
										LbeFATB1	0	1	11	3	23	2	53	6	1
LbeFATB1a	0	3	28	5	18	2	37	4	0

SalFATB1和LbeFATB1，两个均属于樟科，展示出对C12:0脂肪酸的实质性活性。与野生型SalFATB1产生的7％相比，具有32个氨基酸LFAVITTIFSVAEKQWTNLEWKPKPKPRLPQL(SEQ ID NO:47)的缺失的SalFATB1a产生高达15％的C12:0。SalFATB1a中的平均C12:0水平为8.3％，与SalFATB1中的3.7％相比，证明在缺失32个氨基酸时活性增加大于2倍。与野生型LbeFATB1产生的11％相比，具有28个氨基酸LLTVITTIFSAAEKQWTNLERKPKPPHL(SEQ IDNO:48)的缺失的LbeFATB1a产生高达28％的C12:0。LbeFATB1a中的平均C12:0水平为17.2％，与LbeFATB1中的仅5.7％相比，证明在缺失28个氨基酸时活性增加大于3.0倍。数据表明，那些氨基酸的缺失显著地提高(例如，2-3倍)两种其他樟科硫酯酶SalFATB1和LbeFATB1的C12活性。

实例4：来自千屈菜科的FATB基因的另外的缺失突变体。

使用用于上述樟科FATB基因的千屈菜科FATB基因的另外的缺失突变体转化桑椹型无绿藻。鉴定出两个缺失突变体，其显示相对于缺乏缺失的等价转化，从微藻提取的细胞油中升高的中链(C8-14)脂肪酸水平。这些列出在上述表9中，其中它们显示为CpauFATB1Δ28和ChFATB2Δ27。在桑椹型无绿藻模型系统中获得的脂肪酸谱在下表10中报告。当与野生型相比时，ChFATB2Δ27证实C8和C10脂肪酸的增加，对应地与2.7％的C8:0和8.0％的C10:0相比，阐述了平均3.8％的C8:0和11.5％的C10:0。当与野生型相比时，CpauFATB1Δ28证实C10、C12和C14脂肪酸的增加，对应地与4.1％的C10:0相比，阐述了平均7.6％的C10:0。

实例5：通过定点突变修饰甘蓝型油菜硫酯酶(BnOTE)酶特异性

在下面的实例中，我们证明了通过靶向两个氨基酸位置(D124和D209)的定点突变来修饰最初从甘蓝型油菜分离的FATA硫酯酶(BnOTE，登记号CAA52070)的酶特异性的能力。

为了确定每个氨基酸取代对BnOTE的酶特异性的影响，将野生型和突变体BnOTE基因克隆到能够在下层棕榈酸桑椹型无绿藻菌株S8588中表达的载体中。将卡尔酵母MEL1基因(登录号：AAA34770)用作选择性标记，以通过使用先前描述的转化方法(基因枪法)的同源重组将野生型和突变体BnOTE基因引入到桑椹型无绿藻菌株S8588的FAD2-2基因座中。已经在S8588中表达的构建体列出于表11中。S8588是具有FATA敲除并表达FATA基因座中的外源SUC2基因和外源桑椹型无绿藻KASII基因的重组桑椹型无绿藻菌株。表达蔗糖转化酶和/或KASII的FATA敲除描述于共同拥有的申请WO 2012/106560、WO 2013/158938、WO 2015/051319及其各自的优先权申请中，所有这些申请通过引用并入本文。

构建体pSZ6315：FAD2-2::PmHXT1-ScarMEL1-PmPGK:PmSAD2-2V3-CpSADtp-BnOTE-PmSAD2-1utr::FAD2-2

pSZ6315转化用DNA的序列提供在SEQ ID NO:57中。pSZ6315中的相关限制性位点以小写、粗体和下划线表示，并且分别为5’-3’SgrAI、KpnI、SnaBI、AvrII、SpeI、AscI、ClaI、SacI、SbfI。SgrAI和SbfI位点界定转化用DNA的5’和3’端。粗体、小写字母序列代表允许经由同源重组在FAD2-2基因座处靶向整合的FAD2-2基因组DNA。沿5’到3’方向继续向前，驱动卡尔酵母MEL1基因表达的桑椹型无绿藻HXT1启动子以加框文本指示。MEL1基因的起始子ATG和终止子TGA由大写字母、粗斜体指示，同时编码区以小写字母斜体指示。桑椹型无绿藻PGK 3’UTR由小写字母加下划线文本指示，后接由加框斜体文本指示的桑椹型无绿藻SAD2-2V3启动子。野生型BnOTE的起始子ATG和终止子TGA密码子由大写字母、粗斜体指示，同时该编码区的其余部分以粗斜体指示。对应于目标两个氨基酸D124和D209的三核苷酸密码子加有双下划线。桑椹型无绿藻SAD2-1 3’UTR同样由小写字母加下划线文本指示，后接由粗体小写字母文本指示的FAD2-2基因组区域。构建体pSZ6316：FAD2-2::PmHXT1-ScarMEL1-PmPGK:PmSAD2-2V3-CpSADtp-BnOTE(D124A)-PmSAD2-1utr::FAD2-2

除了D124A点突变之外，pSZ6316转化用DNA的序列与pSZ6315相同，BnOTE D124ADNA序列提供在SEQ ID NO:58中。

构建体pSZ6317：FAD2-2::PmHXT1-ScarMEL1-PmPGK:PmSAD2-2V3-CpSADtp-BnOTE(D209A)-PmSAD2-1utr::FAD2-2

除了D209A点突变之外，pSZ6317转化用DNA的序列与pSZ6315相同，BnOTE D209ADNA序列提供在SEQ ID NO:59中。

构建体pSZ6318：FAD2-2::PmHXT1-ScarMEL1-PmPGK:PmSAD2-2V3-CpSADtp-BnOTE(D124A，D209A)-PmSAD2-1utr::FAD2-2

除了两个点突变D124A和D209A之外，pSZ6318转化用DNA的序列与pSZ6315相同，BnOTE(D124A、D209A)DNA序列提供在SEQ ID NO:60中。

结果

将含有野生型和突变体BnOTE基因的DNA构建体转化到低棕榈酸亲本菌株S8588中，将初级转化体克隆纯化，并在pH 5.0的标准脂质生产条件下生长。来自用pSZ6315、pSZ6316、pSZ6317和pSZ6318转化到S8588中而产生的代表性克隆的所得谱示出在表12中。当用表达野生型BnOTE的DNA盒转化时，亲本菌株S8588产生5.4％的C18:0，转基因品系产生约11％的C18:0。与野生型蛋白质相比，BnOTE突变体(D124A)使C18:0的量增加至少2倍。相比之下，BnOTE D209A突变显现对BnOTE硫酯酶的酶活性/特异性没有影响。最后，BnOTE(D124A、D209A)的表达导致与我们在来自表达BnOTE的S8588(S124A)的转化体中观察到的非常相似的脂肪酸谱，再次指示D209A对酶活性没有显著影响。

表12

S8588和用野生型和突变体BnOTE基因转化的衍生转基因株系中的脂肪酸谱

应当理解的是，在此描述的实例和实施例仅是出于说明性目的，并且根据它们进行的不同修改或变更将启发本领域技术人员并且将被包含在本申请的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围之内。在此引用的所有公开物、专利和专利申请都出于所有目的以其全部内容而特此结合。

非正式序列表

SEQ ID NO：1厚瓣萼距花FATB氨基酸序列(CcrasFATB1)

MVAAAASSAFFPVPAPGTSTKPRKSGNWPSRLSPSSKPKSIPNGGFQVKANASAHPKANGSAVNLKSGSLNTQEDTSSSPPPRAFLNQLPDWSMLLTAITTVFVAAEKQWTMLDRKSKRPDMLVDSVGLKSIVRDGLVSRQSFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETSINHCKSLGLLNDGFGRTPGMCKNDLIWVLTKMQIMVNRYPTWGDTVEINTWFSQSGKIGMGSDWLISDCNTGEILIRATSVWAMMNQKTRRFSRLPYEVRQELTPHFVDSPHVIEDNDRKLHKFDVKTGDSIRKGLTPRWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPIEVLETQELCSLTVEYRRECGMDSKLESVTAMDPSEEDGVRSQYNHLLRLEDGTDVVKGRTEWRPKNAGTNGAISTGKTSNGNSVS

SEQ ID NO：2克内萼距花FATB氨基酸序列(CkoeFATB3)

MVTAAASSAFFPVPAPGTSPKPGKSWPSSLSPSFKPKSIPNAGFQVKANASAHPKANGSAVNLKSGSLNTQEDTSSSPPPRAFLNQLPDWSMLLTAITTVFVAAEKQWTMRDRKSKRPDMLVDSVGSKSIVLDGLVSRQIFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETSINHCKSLGLLNDGFGRTPGMCKNDLIWVLTKMQIMVNRYPTWGDTVEINTWFSHSGKIGMASDWLITDCNTGEILIRATSVWAMMNQKTRRFSRLPYEVRQELTPHYVDSPHVIEDNDRKLHKFDVKTGDSIRKGLTPKWNDLDVNQHVNNVKYIGWILESMPIEVLETQELCSLTVEYRRECGMDSVLESVTAMDPSEDGGLSQYKHLLRLEDGTDIVKGRTEWRPKNAGTNGAISTAKPSNGNSVS

SEQ ID NO：3细长萼距花FATB氨基酸序列(CleptFATB1)

MVGAAASSAFFPAPAPGTSPKPGKSGNWPSSLSPSLKPKSIPNGGFQVKANASAHPKANGAAVNLKSGSLNTQEDTSSSPPPRAFLNQLPDWSMLLTAITTVFVAAEKQWTMLDRKSKRPDMLVDSVGLKNIVRDGLVSRQSFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETSINHCKSLGLLNDGFGRTPGMCKNDLIWVLTKMQILVNRYPAWGDTVEINTWFSQSGKIGMGSDWLISDCNTGEILIRATSVWAMMNQKTRRFSRLPYEVRQELTPHFVDSPHVIEDNDRKLHKFDVKTGDSIRKGLTPRWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPIEVLETQELCSLTVEYRRECGMDSVLESVTARDPSEDGGRSQYNHLLRLEDGTDVVKGRTEWRSKNAGTNGATSTAKTSNGNSVS

SEQ ID NO：4狭叶萼距花FATB氨基酸序列(CangFATB1)

MVAAAASSAFFPVPAPGTSLKPGKSGNWPSSLSPSFKPKTIPSGGLQVKANASAHPKANGSAVNLKSGSLDTQEDTSSSPPPRAFLNQLPDWSMLLTAITTVFVAAEKQWTMLDRKSKRPEMLVDSVGLKSSVRDGLVSRQSFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETSINHCKSLGLLNDGFGRTPGMCKNDLIWVLTKMQIMVNRYPTWGDTVEVNTWFSQSGKIGMASDWLISDCNTGEILIRATSVWAMMNQKTRRFSRLPYEVRQELTPHYVDSPHVIEDNDRKLHKFDVKTGDSIRKGLTPRWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPIEVLETQELCSLTVEYRRECGMDSVLESVTAMDPSEDGGVSQYKHLLRLEDGTDIVKGRTEWRPKNAGTNGATSKAKTSNGNSVS

SEQ ID NO：5朱红色萼距花FATB1氨基酸序列(CllaFATB1)

MVAAAASSAFFPAPAPGSSPKPGKPGNWPSSLSPSFKPKSIPNGRFQVKANASAHPKANGSAVNLKSGSLNTQEDTSSSPPPRAFLNQLPDWSMLLSAITTVFVAAEKQWTMLDRKSKRPDMLVDSVGLKNIVRDGLVSRQSFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETSINHCKSLGLLNDGFGRTPGMCKNDLIWVLTKMQIMVNRYPAWGDTVEINTWFSQSGKIGMGSDWLISDCNTGEILIRATSVWAMMNQKTRRFSRLPYEVRQELTPHFVDSPHVIEDNDRKLHKFDVKTGDSIRKGLTPRWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPIEVLETQELCSLTVEYRRECGMDSVLESVTAIDPSEDGGRSQYNHLLRLDDGTDVVKGRTEWRPKNAGTNGAISTGKTSNGNSVS

SEQ ID NO：6Cuphea lophostoma FATB1氨基酸序列(ClopFATB1)

MVAAAASSAFFPVPAPGTSLKPWKSGNWPSSLSPSFKPKTIPSGGFQVKANASAQPKANGSAVNLKSGSLNTQEDTTSSPPPRAFLNQLPDWSMLLTAITTVFVAAEKQWTMLDRKSKRPEKLVDSVGLKSSVRDGLVSRQSFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETSINHCKSLGLLNDGFGRTPGMCKNDLIWVLTKMQIMVNRYPTWGDTVEINTWFSQSGKIGMASDWLISDCNTGEILIRATSVWAMMNQKTRRFSRLPYEVRQELTPHYVDSPHVIEDNDRKLHKFDVKTGDSIRKGLTPRWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPIEVLETQELCSLTVEYRRECGMDSVLESVTAMDPSEDEGRSQYKHLLRLEDGTDIVKGRTEWRPKNAGTNGAISTAKNSNGNSVS

SEQ ID NO：7白色檫木FATB1氨基酸序列(SalFATB1)

MATTSLASAFCSMKAVMLARDGRGMKPRSSDLQLRAGNAQTPLKMINGTKFSYTESLKRLPDWSMLFAVITTIFSVAEKQWTNLEWKPKPKPRLPQLLDDHFGLHGLVFRRTFAIRSYEVGPDRSTSIVAVMNHLQEATLNHAKSVGILGDGFGTTLEMSKRDLAWVVRRTHVAVERYPAWGDTVEVECWIGASGNNGMRRDFLVRDCKTGEILTRCTSLSVMMNTRTRRLSKIPEEVRGEIGPLFIDNVAVKDEEIKKLQKLNDSSADYIQGGLTPRWNDLDVNQHVNNIKYVGWILETVPDSIFESHHISSITLEYRRECTRDSVLQSLTTVSGGSLEAGLVCDHLLQLEGGSEVLRARTEWRPKLTDSFRGIIVIPAEPSV

SEQ ID NO：8白色檫木FATB2氨基酸序列(SalFATB2)

NATTSLASAFCSMKAVMLARDGRGMKPRSSDLQLRAGNAQTPLKMINGTKFSYTESLKRLPDWSMLFAVITTIFSVAEKQWTNLEWKPKPKPRLPQLLDDHFGLHGLVFRRTFAIRSYEVGPDRSTSIVAVMNHLQEATLNHAKSVGILGDGFGTTLEMSKRDLAWVVRRTHVAVERYPAWGDTVEVEAWVGASGNIGMRRDFLVRDCKTGHILARCTSVSVMMNARTRRLSKIPQEVRAEIDPLFIEKVAVKEGEIKKLQKFNDSTADYIQGGWTPRWNDLDVNQHVNNIKYIGWIFKSVPDSISENHYLSSITLEYRRECTRGSALQSLTTVCGDSSEAGIICEHLLQLEDGPEVLRARTEWRPKLTDSFRGIIVIPAEPSV

SEQ ID NO：9桂皮钓樟FATB1氨基酸序列(LbeFATB1)

MVATSLASAFCSMKAVMLADDGRGMKPRSSDLQLRAGNAQTSLKMIDGTKFSYTESLKRLPDWSKLLTVITTIFSAAEKQWTNLERKPKPPHLLDDRFGLHGLVFRRTFAIRSYEVGPDRSASILAVLNHLQEATLNHAESVGILGDRFGETLEMSKRDLMWWRRTYVAVERYPAWGDTVEIESWIGASGNNGMRREFLVRDFKTGEILTRCTSLSVMMNTRTRRLSKIPEEVRGEIGPVFIDNVAVKDEEIKKLQKLNDSTADYIQGGLIPRWNDLDLNQHVNNIKYVSWILETVPDSILESYHMSSITLEYRRECTRDSVLQSLTTVSGGSSEAGLVCEHSLLLEGGSEVLRARTEWRPKLTDSFRGISVIPAEQSV

SEQ ID NO：10没有靶向肽的厚瓣萼距花FATB氨基酸序列(CcrasFATB1)

SEQ ID NO：11没有靶向肽的克内萼距花FATB氨基酸序列(CkoeFATB3)

SEQ ID NO：12没有靶向肽的细长萼距花FATB氨基酸序列(CleptFATB1)

SEQ ID NO：13没有靶向肽的狭叶萼距花FATB氨基酸序列(CangFATB1)

SEQ ID NO：14没有靶向肽的朱红色萼距花FATB1氨基酸序列(CllaFATB1)

MVAAAASSAFFPAPAPGSSPKPGKPGNWPSSLSPSFKPKSIPNGRFQVKANASAHPKANGSAVNLKSGSLNTQEDTSSSPPPRAFLNQLPDWSMLLSAITTVFVAAEKQWTMLDRKSKRPDMLVDSVGLKNIVRDGLVSRQSFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETSINHCKSLGLLNDGFGRTPGMCKNDLIWVLTKMQIMVNRYPAWGDTVEINTWFSQSGKIGMGSDWLISDCNTGEILIRATSVWAMMNQKTRRFSRLPYEVRQELTPHFVDSPHVIEDNDRKLHKFDVKTGDSIRKGLTPRWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPIEVLETQELCSLTVEYRRECGMDSVLESVTAIDPSEDGGRSQYNHLLRLDDGTDWKGRTEWRPKNAGTNGAISTGKTSNGNSVS

SEQ ID NO：15没有靶向肽的Cuphea lophostoma FATB1氨基酸序列(ClopFATB1)

SEQ ID NO：16没有靶向肽的白色檫木FATB1氨基酸序列(SalFATB1)

SEQ ID NO：17没有靶向肽的白色檫木FATB2氨基酸序列(SalFATB2)

MATTSLASAFCSMKAVMLARDGRGMKPRSSDLQLRAGNAQTPLKMINGTKFSYTESLKRLPDWSMLFAVITTIFSVAEKQWTNLEWKPKPKPRLPQLLDDHFGLHGLVFRRTFAIRSYEVGPDRSTSIVAVMNHLQEATLNHAKSVGILGDGFGTTLEMSKRDLAWVVRRTHVAVERYPAWGDTVEVEAWVGASGNIGMRRDFLVRDCKTGHILARCTSVSVMMNARTRRLSKIPQEVRAEIDPLFIEKVAVKEGEIKKLQKFNDSTADYIQGGWTPRWNDLDVNQHVNNIKYIGWIFKSVPDSISENHYLSSITLEYRRECTRGSALQSLTTVCGDSSEAGIICEHLLQLEDGPEVLRARTEWRPKLTDSFRGIIVIPAEPSV

SEQ ID NO：18没有靶向肽的桂皮钓樟FATB1氨基酸序列(LbeFATB1)

MVATSLASAFCSMKAVMLADDGRGMKPRSSDLQLRAGNAQTSLKMIDGTKFSYTESLKRLPDWSKLLTVITTIFSAAEKQWTNLERKPKPPHLLDDRFGLHGLVFRRTFAIRSYEVGPDRSASILAVLNHLQEATLNHAESVGILGDRFGETLEMSKRDLMWVVRRTYVAVERYPAWGDTVEIESWIGASGNNGMRREFLVRDFKTGEILTRCTSLSVMMNTRTRRLSKIPEEVRGEIGPVFIDNVAVKDEEIKKLQKLNDSTADYIQGGLIPRWNDLDLNQHVNNIKYVSWILETVPDSILESYHMSSITLEYRRECTRDSVLQSLTTVSGGSSEAGLVCEHSLLLEGGSEVLRARTEWRPKLTDSFRGISVIPAEQSV

SEQ ID NO：19厚瓣萼距花FATB天然CDS核酸序列(CcrasFATB1)

ATGGTGGCTGCTGCAGCAAGTTCTGCATTCTTCCCTGTTCCTGCCCCAGGAACCTCCACTAAACCCAGGAAGTCCGGCAATTGGCCATCGAGATTGAGCCCTTCCTCCAAGCCCAAGTCAATCCCCAATGGCGGATTTCAGGTTAAGGCAAATGCCAGTGCCCATCCTAAGGCTAACGGTTCTGCAGTAAATCTAAAGTCTGGCAGCCTCAACACTCAGGAGGACACTTCGTCGTCCCCTCCTCCTCGGGCTTTCCTTAACCAGTTGCCTGATTGGAGTATGCTTCTGACTGCAATCACGACCGTTTTCGTGGCGGCAGAGAAGCAGTGGACAATGCTTGATCGGAAATCTAAGAGGCCTGACATGCTCGTGGACTCGGTTGGGTTGAAGAGTATTGTTCGGGATGGGCTCGTGTCCAGACAAAGTTTTTCGATCAGGTCTTATGAAATAGGCGCTGATCGAACAGCCTCTATAGAGACGCTGATGAACCACTTGCAGGAAACATCTATTAATCATTGTAAGAGTTTGGGCCTTCTCAATGACGGCTTTGGTCGGACTCCTGGGATGTGTAAAAACGACCTCATTTGGGTGCTTACAAAAATGCAGATCATGGTGAATCGCTACCCAACTTGGGGCGATACTGTTGAGATCAATACCTGGTTCTCCCAGTCGGGGAAAATCGGTATGGGTAGCGATTGGCTAATAAGTGATTGCAATACAGGAGAAATTCTTATAAGGGCAACGAGCGTGTGGGCCATGATGAATCAAAAGACGAGAAGATTCTCAAGACTTCCATACGAGGTTCGCCAGGAGTTAACGCCTCATTTTGTGGACTCTCCTCATGTCATTGAAGACAATGATCGGAAATTGCATAAGTTTGATGTGAAGACTGGCGATTCTATTCGCAAGGGTCTAACTCCGAGGTGGAATGATTTGGATGTCAATCAGCACGTAAGCAACGTGAAGTACATTGGGTGGATTCTCGAGAGTATGCCAATAGAAGTTCTGGAGACCCAGGAGCTATGCTCTCTGACAGTTGAATATAGGCGGGAATGCGGAATGGACAGTAAGCTGGAGTCCGTGACTGCTATGGATCCCTCAGAAGAAGATGGAGTCCGGTCTCAGTACAATCACCTTCTGCGGCTTGAGGATGGGACTGATGTCGTGAAGGGCAGAACTGAGTGGCGACCGAAGAATGCAGGAACTAACGGGGCGATATCAACAGGAAAGACTTCAAATGGAAACTCGGTTTCTTAG

SEQ ID NO：20克内萼距花FATB FATB天然CDS核酸序列(CkoeFATB3)

ATGGTCACTGCTGCAGCAAGTTCTGCATTCTTCCCTGTTCCAGCCCCGGGAACCTCCCCTAAACCCGGGAAGTCCTGGCCATCGAGCTTGAGCCCTTCCTTCAAGCCCAAGTCAATCCCCAATGCCGGATTTCAGGTTAAGGCAAATGCCAGTGCCCATCCTAAGGCTAACGGTTCTGCAGTAAATCTAAAGTCTGGCAGCCTCAACACTCAGGAGGACACTTCGTCGTCCCCTCCTCCTCGGGCTTTCCTTAACCAGTTGCCTGATTGGAGTATGCTTCTGACTGCAATCACGACCGTCTTCGTGGCGGCAGAGAAGCAGTGGACTATGCGTGATCGGAAATCTAAGAGGCCTGACATGCTCGTGGACTCGGTTGGATCGAAGAGTATTGTTCTGGATGGGCTCGTGTCCAGACAGATTTTTTCGATTAGATCTTATGAAATAGGCGCTGATCGAACAGCCTCTATAGAGACGCTGATGAACCACTTGCAGGAAACATCTATCAATCATTGTAAGAGTTTGGGTCTTCTCAATGACGGCTTTGGTCGTACTCCTGGGATGTGTAAAAACGACCTCATTTGGGTGCTTACAAAAATGCAGATCATGGTGAATCGCTACCCAACTTGGGGCGATACTGTTGAGATCAATACCTGGTTCTCCCATTCGGGGAAAATCGGTATGGCTAGCGATTGGCTAATAACTGATTGCAACACAGGAGAAATTCTTATAAGAGCAACGAGCGTGTGGGCCATGATGAATCAAAAGACGAGAAGATTCTCAAGACTTCCATACGAGGTTCGCCAGGAGTTAACGCCTCATTATGTGGACTCTCCTCATGTCATTGAAGATAATGATCGGAAATTGCATAAGTTTGATGTGAAGACTGGTGATTCCATTCGTAAGGGTCTAACTCCGAAGTGGAATGACTTGGATGTCAATCAGCACGTCAACAACGTGAAGTACATCGGGTGGATTCTCGAGAGTATGCCAATAGAAGTTTTGGAGACTCAGGAGCTATGCTCTCTCACCGTTGAATATAGGCGGGAATGCGGAATGGACAGTGTGCTGGAGTCCGTGACTGCTATGGATCCCTCAGAAGATGGAGGCCTATCTCAGTACAAGCACCTTCTGCGGCTTGAGGATGGGACTGACATCGTGAAGGGCAGAACTGAGTGGCGACCGAAGAATGCAGGAACTAACGGGGCGATATCAACAGCAAAGCCTTCAAATGGAAACTCGGTCTCTTAG

SEQ ID NO：21细长萼距花FATB天然CDS核酸序列(CleptFATB1)

ATGGTGGGTGCTGCAGCAAGTTCTGCATTCTTCCCTGCTCCAGCCCCGGGAACCTCCCCTAAACCCGGGAAGTCCGGCAATTGGCCATCAAGCTTGAGCCCTTCCTTAAAGCCCAAGTCAATCCCCAATGGCGGATTTCAGGTTAAGGCAAATGCCAGTGCCCATCCTAAGGCTAACGGTGCTGCAGTAAATCTAAAGTCTGGCAGCCTCAACACTCAGGAGGACACTTCGTCGTCCCCTCCTCCTCGGGCTTTCCTTAACCAGTTGCCTGATTGGAGTATGCTTCTGACTGCAATCACGACCGTCTTCGTGGCGGCAGAGAAGCAGTGGACTATGCTTGATCGGAAATCTAAGAGGCCTGACATGCTCGTGGACTCGGTTGGGTTGAAGAATATTGTTCGGGATGGGCTCGTGTCCAGACAGAGTTTTTCGATCAGGTCTTATGAAATAGGCGCTGATCGAACAGCCTCTATAGAGACGCTGATGAACCACTTGCAGGAAACATCTATCAATCATTGTAAGAGTTTGGGTCTTCTCAATGACGGCTTTGGTCGTACTCCTGGGATGTGTAAAAACGACCTCATTTGGGTGCTTACAAAAATGCAGATCCTGGTGAATCGCTACCCAGCTTGGGGAGATACTGTTGAGATCAATACCTGGTTCTCTCAGTCGGGGAAAATCGGCATGGGTAGTGATTGGCTAATAAGTGATTGCAACACAGGAGAAATTCTTATAAGAGCAACGAGCGTGTGGGCAATGATGAATCAAAAGACGAGAAGATTCTCAAGACTTCCATACGAGGTTCGCCAGGAGTTAACGCCTCATTTTGTAGACTCACCTCATGTCATTGAAGACAATGATCGGAAATTGCATAAGTTTGATGTGAAGACTGGTGATTCTATTCGCAAGGGTCTAACTCCGAGGTGGAATGACTTGGATGTCAATCAACACGTAAGCAACGTGAAGTACATTGGGTGGATTCTCGAGAGTATGCCAATAGAAGTTTTGGAGACTCAGGAGCTATGCTCTCTCACCGTTGAATATAGGCGGGAATGCGGAATGGACAGTGTGCTGGAGTCCGTGACTGCTAGGGATCCCTCAGAAGATGGAGGCCGGTCTCAGTACAATCACCTTCTGCGGCTTGAGGATGGGACTGATGTCGTGAAGGGCAGAACTGAGTGGCGATCGAAGAATGCAGGAACTAACGGGGCGACATCAACAGCAAAGACTTCAAATGGAAACTCGGTCTCTTAG

SEQ ID NO：22狭叶萼距花FATB天然CDS核酸序列(CangFATB1)

ATGGTGGCTGCTGCAGCAAGTTCTGCATTCTTCCCTGTTCCAGCCCCGGGAACATCCCTTAAACCCGGGAAGTCCGGCAATTGGCCATCGAGCTTGAGCCCTTCCTTCAAGCCCAAGACAATCCCCAGTGGCGGACTTCAGGTTAAGGCAAATGCCAGTGCCCATCCTAAGGCTAACGGTTCTGCAGTAAATCTAAAGTCTGGCAGCCTCGACACTCAGGAGGACACTTCGTCGTCCCCTCCTCCTCGGGCTTTCCTTAACCAGTTGCCTGATTGGAGTATGCTTCTGACTGCAATCACGACCGTCTTCGTGGCGGCAGAGAAGCAGTGGACTATGCTTGATAGGAAATCTAAGAGGCCTGAAATGCTCGTGGACTCGGTTGGGTTGAAGAGTAGTGTTCGGGATGGGCTCGTGTCCAGACAGAGTTTTTCGATTAGGTCTTATGAAATAGGCGCTGATCGAACAGCCTCTATAGAGACGCTGATGAACCACTTGCAGGAAACATCTATCAATCATTGTAAGAGTTTGGGTCTTCTCAACGATGGCTTTGGTCGTACTCCTGGGATGTGTAAAAACGACCTCATTTGGGTGCTTACAAAAATGCAGATCATGGTGAATCGCTACCCAACTTGGGGCGATACTGTTGAGGTCAATACCTGGTTCTCCCAGTCGGGGAAAATCGGTATGGCTAGCGATTGGCTAATCAGTGATTGCAACACAGGAGAAATTCTTATAAGAGCAACAAGCGTGTGGGCCATGATGAATCAAAAGACGAGAAGATTCTCAAGACTTCCATACGAGGTTCGCCAGGAGCTAACACCTCATTATGTGGACTCTCCTCATGTCATTGAAGATAATGATCGGAAATTGCATAAGTTTGATGTGAAGACTGGTGATTCCATTCGCAAGGGTCTAACTCCGAGGTGGAATGACTTGGATGTCAATCAGCACGTAAGCAACGTGAAGTACATTGGGTGGATTCTTGAGAGTATGCCAATAGAAGTTTTGGAGACCCAGGAGCTATGCTCTCTCACCGTTGAATATAGGCGGGAATGCGGAATGGACAGTGTGCTGGAGTCCGTGACTGCTATGGATCCCTCAGAAGATGGAGGCGTGTCTCAGTACAAGCACCTTCTGCGGCTTGAGGATGGGACTGATATCGTGAAGGGCAGAACTGAATGGCGACCGAAGAATGCAGGAACTAATGGGGCGACATCAAAAGCAAAGACTTCAAATGGAAACTCGGTCTCTTAG

SEQ ID NO：23朱红色萼距花FATB1天然CDS核酸序列(CllaFATB1)

ATGGTGGCTGCTGCAGCAAGTTCTGCATTCTTCCCTGCTCCAGCCCCGGGATCCTCACCTAAACCCGGGAAGCCCGGTAATTGGCCATCGAGCTTGAGCCCTTCCTTCAAGCCCAAGTCAATCCCCAATGGCCGATTTCAGGTTAAGGCAAATGCGAGTGCCCATCCTAAGGCTAACGGTTCTGCAGTAAATCTAAAGTCTGGCAGCCTCAACACTCAGGAGGACACTTCGTCGTCCCCTCCTCCTCGGGCTTTCCTTAACCAGTTGCCTGATTGGAGTATGCTTCTGTCTGCAATCACGACTGTATTCGTGGCGGCAGAGAAGCAGTGGACTATGCTTGATCGGAAATCTAAGAGGCCTGACATGCTTGTGGACTCGGTTGGGTTGAAGAATATTGTTCGGGATGGGCTCGTGTCCAGACAGAGTTTTTCGATTAGATCTTATGAAATAGGCGCTGATCGAACAGCTTCTATAGAGACACTGATGAACCACTTGCAGGAAACATCTATCAATCATTGTAAGAGTTTGGGTCTTCTCAATGACGGCTTTGGTCGTACTCCTGGGATGTGTAAAAACGACCTCATTTGGGTGCTTACAAAAATGCAGATCATGGTGAATCGCTACCCAGCTTGGGGCGATACTGTTGAGATCAATACATGGTTCTCCCAGTCGGGGAAAATCGGTATGGGTAGCGATTGGCTAATAAGTGATTGCAACACAGGAGAAATTCTTATAAGAGCAACGAGCGTGTGGGCCATGATGAATCAAAAGACGAGAAGATTCTCAAGACTTCCATATGAGGTTCGCCAGGAGTTAACGCCTCATTTTGTGGACTCTCCTCATGTCATTGAAGACAATGATCGGAAATTGCATAAGTTCGATGTGAAGACTGGTGATTCTATTCGCAAGGGTCTAACTCCGAGGTGGAATGACTTGGATGTCAATCAACACGTAAGCAACGTGAAGTACATTGGGTGGATTCTCGAGAGTATGCCAATAGAAGTTTTGGAGACCCAGGAACTATGCTCTCTCACAGTTGAATATAGGCGGGAATGCGGAATGGACAGTGTGCTGGAGTCCGTGACTGCTATAGATCCCTCAGAAGATGGAGGGCGGTCTCAGTACAATCACCTTCTGCGGCTTGATGATGGGACTGATGTCGTGAAGGGCAGAACAGAGTGGCGACCGAAGAATGCAGGAACTAACGGGGCGATATCAACAGGAAAGACTTCAAATGGGAACTCGGTCTCCTAG

SEQ ID NO：24Cuphea lophostoma FATB1天然CDS核酸序列(ClopFATB1)

ATGGTGGCTGCTGCAGCAAGTTCTGCATTCTTCCCTGTTCCAGCCCCGGGAACCTCCCTTAAACCCTGGAAGTCCGGAAATTGGCCATCGAGCTTGAGCCCTTCCTTCAAGCCCAAGACAATCCCCAGTGGCGGATTTCAGGTTAAGGCAAATGCCAGTGCCCAGCCTAAGGCTAACGGTTCTGCAGTAAATCTAAAGTCTGGCAGCCTCAACACTCAGGAGGACACAACGTCGTCGCCTCCTCCTCGGGCTTTCCTTAACCAGTTGCCTGATTGGAGTATGCTTCTGACTGCAATCACGACCGTCTTCGTGGCGGCGGAGAAGCAGTGGACAATGCTTGATAGGAAATCTAAGAGGCCTGAAAAGCTCGTGGACTCGGTTGGGTTGAAGAGTAGTGTTCGGGATGGGCTCGTGTCCAGACAGAGTTTTTCGATTAGGTCTTATGAAATAGGCGCTGATCGAACAGCCTCTATAGAGACGTTGATGAACCACTTGCAGGAAACATCTATCAATCATTGTAAGAGTTTGGGTCTTCTCAACGACGGCTTTGGTCGTACTCCTGGGATGTGTAAAAACGACCTCATTTGGGTGCTTACGAAAATGCAGATCATGGTGAATCGCTACCCAACTTGGGGCGATACTGTTGAGATCAATACCTGGTTCTCCCAGTCGGGGAAAATCGGTATGGCTAGCGATTGGCTAATAAGTGATTGCAACACAGGAGAAATTCTTATAAGAGCAACGAGCGTGTGGGCCATGATGAATCAAAAGACGAGAAGGTTCTCAAGACTTCCATACGAGGTTCGCCAGGAGTTAACGCCTCATTATGTGGACTCTCCTCATGTCATTGAAGACAATGATCGGAAATTGCATAAGTTTGATGTGAAGACTGGTGATTCCATTCGCAAGGGTCTGACTCCGAGGTGGAATGACTTGGATGTCAATCAGCACGTAAGCAACGTGAAGTACATTGGGTGGATTCTGGAGAGTATGCCAATAGAAGTTTTGGAGACCCAGGAGCTATGCTCTCTCACCGTTGAATATAGGCGGGAATGCGGGATGGACAGTGTGCTGGAGTCCGTGACTGCTATGGATCCCTCAGAAGATGAAGGCCGGTCTCAGTACAAGCACCTTCTGCGGCTTGAGGATGGGACTGATATCGTGAAGGGCAGAACTGAGTGGCGACCGAAGAATGCAGGAACTAACGGGGCGATATCAACAGCAAAGAATTCAAATGGAAACTCGGTCTCTTAG

SEQ ID NO：25白色檫木FATB1天然CDS核酸序列(SalFATB1)

ATGGCCACCACCTCTTTAGCTTCTGCTTTCTGCTCGATGAAAGCTGTAATGTTGGCTCGTGATGGCAGGGGCATGAAACCCAGGAGCAGTGATTTGCAGCTGAGGGCGGGAAATGCACAAACCCCTTTGAAGATGATCAATGGGACCAAGTTCAGTTACACGGAGAGCTTGAAAAGGTTGCCTGACTGGAGCATGCTCTTTGCAGTGATCACAACCATCTTTTCGGTTGCTGAGAAGCAGTGGACCAATCTAGAGTGGAAGCCGAAGCCGAAGCCGAGGCTACCCCAGTTGCTTGATGACCATTTTGGACTGCATGGGTTAGTTTTCAGGCGCACCTTTGCCATCAGATCTTATGAGGTCGGACCTGACCGCTCCACATCTATAGTGGCTGTTATGAATCACTTGCAGGAGGCTACACTTAATCATGCGAAGAGTGTGGGAATTCTAGGAGATGGATTCGGTACGACGCTAGAGATGAGTAAGAGAGATCTGGCGTGGGTTGTGAGACGCACGCATGTTGCTGTGGAACGGTACCCTGCTTGGGGTGATACTGTTGAAGTAGAGTGCTGGATTGGTGCATCTGGAAATAATGGCATGCGCCGTGATTTCCTTGTCCGGGACTGCAAAACAGGCGAAATTCTTACAAGATGTACCAGTCTTTCGGTGATGATGAATACAAGGACAAGGAGGTTGTCCAAAATCCCTGAAGAAGTTAGAGGGGAGATAGGGCCTCTATTCATTGATAATGTGGCTGTCAAGGACGAGGAAATTAAGAAACTACAGAAGCTCAATGACAGCTCTGCAGATTACATCCAAGGAGGTTTGACTCCTCGATGGAATGATTTGGATGTCAATCAGCATGTTAACAACATCAAATACGTTGGCTGGATTCTTGAGACTGTCCCAGACTCCATCTTTGAGAGTCATCATATTTCCAGCATCACTCTTGAATACAGGAGAGAGTGCACCAGGGATAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACTGTCTCCGGTGGCTCGTTGGAGGCTGGGTTAGTGTGCGATCACTTGCTCCAGCTTGAAGGTGGGTCTGAGGTATTGAGGGCAAGAACAGAGTGGAGGCCTAAGCTTACCGATAGTTTCAGAGGGATTATTGTGATACCCGCAGAACCGAGTGTGTAA

SEQ ID NO：26白色檫木FATB2天然CDS核酸序列(SalFATB2)

ATGGCCACCACCTCTTTAGCTTCTGCTTTCTGCTCGATGAAAGCTGTAATGTTGGCTCGTGATGGCAGGGGCATGAAACCCAGGAGCAGTGATTTGCAGCTGAGGGCGGGAAATGCACAAACCCCTTTGAAGATGATCAATGGGACCAAGTTCAGTTACACGGAGAGCTTGAAAAGGTTGCCTGACTGGAGCATGCTCTTTGCAGTGATCACAACCATCTTTTCGGTTGCTGAGAAGCAGTGGACCAATCTAGAGTGGAAGCCGAAGCCGAAGCCGAGGCTACCCCAGTTGCTTGATGACCATTTTGGACTGCATGGGTTAGTTTTCAGGCGCACCTTTGCCATCAGATCTTATGAGGTCGGACCTGACCGCTCCACATCTATAGTGGCTGTTATGAATCACTTGCAGGAGGCTACACTTAATCATGCGAAGAGTGTGGGAATTCTAGGAGATGGATTCGGTACGACGCTAGAGATGAGTAAGAGAGATCTGGCGTGGGTTGTGAGACGCACGCATGTTGCTGTGGAACGGTACCCCGCTTGGGGCGATACTGTTGAAGTCGAGGCCTGGGTCGGTGCATCTGGAAACATTGGCATGCGCCGCGATTTTCTTGTCCGCGACTGCAAAACTGGCCACATTCTTGCAAGATGTACCAGTGTTTCAGTGATGATGAATGCGAGGACACGGAGATTGTCCAAAATTCCCCAAGAAGTTAGAGCCGAGATTGACCCTCTTTTCATTGAAAAGGTTGCGGTCAAGGAAGGGGAAATTAAGAAATTACAGAAGTTCAATGATAGCACTGCAGATTACATTCAAGGGGGTTGGACTCCTCGATGGAATGATTTGGATGTCAATCAGCACGTGAACAATATCAAATACATTGGCTGGATTTTTAAGAGCGTCCCAGACTCTATCTCTGAGAATCATTATCTTTCTAGCATCACTCTCGAATACAGGAGAGAGTGCACAAGGGGCAGCGCGCTGCAGTCCCTGACCACTGTTTGTGGTGACTCGTCGGAAGCTGGGATCATATGTGAGCACCTACTCCAGCTTGAGGATGGGCCTGAGGTTTTGAGGGCAAGAACAGAGTGGAGGCCTAAGCTTACCGATAGTTTCAGAGGGATTATTGTGATACCCGCAGAACCGAGTGTGTAA

SEQ ID NO：27桂皮钓樟FATB1天然CDS核酸序列(LbeFATB1)

SEQ ID NO：28厚瓣萼距花FATB天然CDS密码子优化的核酸序列(CcrasFATB1)

ATGGTGGCCGCCGCCGCCTCCTCCGCCTTCTTCCCCGTGCCCGCCCCCGGCACCTCCACCAAGCCCCGCAAGTCCGGCAACTGGCCCTCCCGCCTGTCCCCCTCCTCCAAGCCCAAGTCCATCCCCAACGGCGGCTTCCAGGTGAAGGCCAACGCCTCCGCCCACCCCAAGGCCAACGGCTCCGCCGTGAACCTGAAGTCCGGCTCCCTGAACACCCAGGAGGACACCTCCTCCTCCCCCCCCCCCCGCGCCTTCCTGAACCAGCTGCCCGACTGGTCCATGCTGCTGACCGCCATCACCACCGTGTTCGTGGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCATGCTGGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACTCCGTGGGCCTGAAGTCCATCGTGCGCGACGGCCTGGTGTCCCGCCAGTCCTTCTCCATCCGCTCCTACGAGATCGGCGCCGACCGCACCGCCTCCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCTCCATCAACCACTGCAAGTCCCTGGGCCTGCTGAACGACGGCTTCGGCCGCACCCCCGGCATGTGCAAGAACGACCTGATCTGGGTGCTGACCAAGATGCAGATCATGGTGAACCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTGGAGATCAACACCTGGTTCTCCCAGTCCGGCAAGATCGGCATGGGCTCCGACTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGATCCGCGCCACCTCCGTGTGGGCCATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCTTCTCCCGCCTGCCCTACGAGGTGCGCCAGGAGCTGACCCCCCACTTCGTGGACTCCCCCCACGTGATCGAGGACAACGACCGCAAGCTGCACAAGTTCGACGTGAAGACCGGCGACTCCATCCGCAAGGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGTCCATGCCCATCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGACCGTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCATGGACTCCAAGCTGGAGTCCGTGACCGCCATGGACCCCTCCGAGGAGGACGGCGTGCGCTCCCAGTACAACCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGACGTGGTGAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCACCAACGGCGCCATCTCCACCGGCAAGACCTCCAACGGCAACTCCGTGTCCTGA

SEQ ID NO：29克内萼距花FATB FATB密码子优化的CDS核酸序列(CkoeFATB3)

ATGGTGACCGCCGCCGCCTCCTCCGCCTTCTTCCCCGTGCCCGCCCCCGGCACCTCCCCCAAGCCCGGCAAGTCCTGGCCCTCCTCCCTGTCCCCCTCCTTCAAGCCCAAGTCCATCCCCAACGCCGGCTTCCAGGTGAAGGCCAACGCCTCCGCCCACCCCAAGGCCAACGGCTCCGCCGTGAACCTGAAGTCCGGCTCCCTGAACACCCAGGAGGACACCTCCTCCTCCCCCCCCCCCCGCGCCTTCCTGAACCAGCTGCCCGACTGGTCCATGCTGCTGACCGCCATCACCACCGTGTTCGTGGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCATGCGCGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACTCCGTGGGCTCCAAGTCCATCGTGCTGGACGGCCTGGTGTCCCGCCAGATCTTCTCCATCCGCTCCTACGAGATCGGCGCCGACCGCACCGCCTCCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCTCCATCAACCACTGCAAGTCCCTGGGCCTGCTGAACGACGGCTTCGGCCGCACCCCCGGCATGTGCAAGAACGACCTGATCTGGGTGCTGACCAAGATGCAGATCATGGTGAACCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTGGAGATCAACACCTGGTTCTCCCACTCCGGCAAGATCGGCATGGCCTCCGACTGGCTGATCACCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGATCCGCGCCACCTCCGTGTGGGCCATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCTTCTCCCGCCTGCCCTACGAGGTGCGCCAGGAGCTGACCCCCCACTACGTGGACTCCCCCCACGTGATCGAGGACAACGACCGCAAGCTGCACAAGTTCGACGTGAAGACCGGCGACTCCATCCGCAAGGGCCTGACCCCCAAGTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAACAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGTCCATGCCCATCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGACCGTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCATGGACTCCGTGCTGGAGTCCGTGACCGCCATGGACCCCTCCGAGGACGGCGGCCTGTCCCAGTACAAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGACATCGTGAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCACCAACGGCGCCATCTCCACCGCCAAGCCCTCCAACGGCAACTCCGTGTCCTGA

SEQ ID NO：30细长萼距花FATB密码子优化的CDS核酸序列(CleptFATB1)

ATGGTGGGCGCCGCCGCCTCCTCCGCCTTCTTCCCCGCCCCCGCCCCCGGCACCTCCCCCAAGCCCGGCAAGTCCGGCAACTGGCCCTCCTCCCTGTCCCCCTCCCTGAAGCCCAAGTCCATCCCCAACGGCGGCTTCCAGGTGAAGGCCAACGCCTCCGCCCACCCCAAGGCCAACGGCGCCGCCGTGAACCTGAAGTCCGGCTCCCTGAACACCCAGGAGGACACCTCCTCCTCCCCCCCCCCCCGCGCCTTCCTGAACCAGCTGCCCGACTGGTCCATGCTGCTGACCGCCATCACCACCGTGTTCGTGGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCATGCTGGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACTCCGTGGGCCTGAAGAACATCGTGCGCGACGGCCTGGTGTCCCGCCAGTCCTTCTCCATCCGCTCCTACGAGATCGGCGCCGACCGCACCGCCTCCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCTCCATCAACCACTGCAAGTCCCTGGGCCTGCTGAACGACGGCTTCGGCCGCACCCCCGGCATGTGCAAGAACGACCTGATCTGGGTGCTGACCAAGATGCAGATCCTGGTGAACCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGATCAACACCTGGTTCTCCCAGTCCGGCAAGATCGGCATGGGCTCCGACTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGATCCGCGCCACCTCCGTGTGGGCCATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCTTCTCCCGCCTGCCCTACGAGGTGCGCCAGGAGCTGACCCCCCACTTCGTGGACTCCCCCCACGTGATCGAGGACAACGACCGCAAGCTGCACAAGTTCGACGTGAAGACCGGCGACTCCATCCGCAAGGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGTCCATGCCCATCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGACCGTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCATGGACTCCGTGCTGGAGTCCGTGACCGCCCGCGACCCCTCCGAGGACGGCGGCCGCTCCCAGTACAACCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGACGTGGTGAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCTCCAAGAACGCCGGCACCAACGGCGCCACCTCCACCGCCAAGACCTCCAACGGCAACTCCGTGTCCTGA

SEQ ID NO：31狭叶萼距花FATB密码子优化的CDS核酸序列(CangFATB1)

ATGGTGGCCGCCGCCGCCTCCTCCGCCTTCTTCCCCGTGCCCGCCCCCGGCACCTCCCTGAAGCCCGGCAAGTCCGGCAACTGGCCCTCCTCCCTGTCCCCCTCCTTCAAGCCCAAGACCATCCCCTCCGGCGGCCTGCAGGTGAAGGCCAACGCCTCCGCCCACCCCAAGGCCAACGGCTCCGCCGTGAACCTGAAGTCCGGCTCCCTGGACACCCAGGAGGACACCTCCTCCTCCCCCCCCCCCCGCGCCTTCCTGAACCAGCTGCCCGACTGGTCCATGCTGCTGACCGCCATCACCACCGTGTTCGTGGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCATGCTGGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGAGATGCTGGTGGACTCCGTGGGCCTGAAGTCCTCCGTGCGCGACGGCCTGGTGTCCCGCCAGTCCTTCTCCATCCGCTCCTACGAGATCGGCGCCGACCGCACCGCCTCCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCTCCATCAACCACTGCAAGTCCCTGGGCCTGCTGAACGACGGCTTCGGCCGCACCCCCGGCATGTGCAAGAACGACCTGATCTGGGTGCTGACCAAGATGCAGATCATGGTGAACCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGAACACCTGGTTCTCCCAGTCCGGCAAGATCGGCATGGCCTCCGACTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGATCCGCGCCACCTCCGTGTGGGCCATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCTTCTCCCGCCTGCCCTACGAGGTGCGCCAGGAGCTGACCCCCCACTACGTGGACTCCCCCCACGTGATCGAGGACAACGACCGCAAGCTGCACAAGTTCGACGTGAAGACCGGCGACTCCATCCGCAAGGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGTCCATGCCCATCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGACCGTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCATGGACTCCGTGCTGGAGTCCGTGACCGCCATGGACCCCTCCGAGGACGGCGGCGTGTCCCAGTACAAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGACATCGTGAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCACCAACGGCGCCACCTCCAAGGCCAAGACCTCCAACGGCAACTCCGTGTCCTGA

SEQ ID NO：32朱红色萼距花FATB1密码子优化的CDS核酸序列(CllaFATB1)

ATGGTGGCCGCCGCCGCCTCCTCCGCCTTCTTCCCCGCCCCCGCCCCCGGCTCCTCCCCCAAGCCCGGCAAGCCCGGCAACTGGCCCTCCTCCCTGTCCCCCTCCTTCAAGCCCAAGTCCATCCCCAACGGCCGCTTCCAGGTGAAGGCCAACGCCTCCGCCCACCCCAAGGCCAACGGCTCCGCCGTGAACCTGAAGTCCGGCTCCCTGAACACCCAGGAGGACACCTCCTCCTCCCCCCCCCCCCGCGCCTTCCTGAACCAGCTGCCCGACTGGTCCATGCTGCTGTCCGCCATCACCACCGTGTTCGTGGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCATGCTGGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACTCCGTGGGCCTGAAGAACATCGTGCGCGACGGCCTGGTGTCCCGCCAGTCCTTCTCCATCCGCTCCTACGAGATCGGCGCCGACCGCACCGCCTCCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCTCCATCAACCACTGCAAGTCCCTGGGCCTGCTGAACGACGGCTTCGGCCGCACCCCCGGCATGTGCAAGAACGACCTGATCTGGGTGCTGACCAAGATGCAGATCATGGTGAACCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGATCAACACCTGGTTCTCCCAGTCCGGCAAGATCGGCATGGGCTCCGACTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGATCCGCGCCACCTCCGTGTGGGCCATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCTTCTCCCGCCTGCCCTACGAGGTGCGCCAGGAGCTGACCCCCCACTTCGTGGACTCCCCCCACGTGATCGAGGACAACGACCGCAAGCTGCACAAGTTCGACGTGAAGACCGGCGACTCCATCCGCAAGGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGTCCATGCCCATCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGACCGTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCATGGACTCCGTGCTGGAGTCCGTGACCGCCATCGACCCCTCCGAGGACGGCGGCCGCTCCCAGTACAACCACCTGCTGCGCCTGGACGACGGCACCGACGTGGTGAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCACCAACGGCGCCATCTCCACCGGCAAGACCTCCAACGGCAACTCCGTGTCCTGA

SEQ ID NO：33Cuphea lophostoma FATB1密码子优化的CDS核酸序列(ClopFATB1)

ATGGTGGCCGCCGCCGCCTCCTCCGCCTTCTTCCCCGTGCCCGCCCCCGGCACCTCCCTGAAGCCCTGGAAGTCCGGCAACTGGCCCTCCTCCCTGTCCCCCTCCTTCAAGCCCAAGACCATCCCCTCCGGCGGCTTCCAGGTGAAGGCCAACGCCTCCGCCCAGCCCAAGGCCAACGGCTCCGCCGTGAACCTGAAGTCCGGCTCCCTGAACACCCAGGAGGACACCACCTCCTCCCCCCCCCCCCGCGCCTTCCTGAACCAGCTGCCCGACTGGTCCATGCTGCTGACCGCCATCACCACCGTGTTCGTGGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCATGCTGGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGAGAAGCTGGTGGACTCCGTGGGCCTGAAGTCCTCCGTGCGCGACGGCCTGGTGTCCCGCCAGTCCTTCTCCATCCGCTCCTACGAGATCGGCGCCGACCGCACCGCCTCCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCTCCATCAACCACTGCAAGTCCCTGGGCCTGCTGAACGACGGCTTCGGCCGCACCCCCGGCATGTGCAAGAACGACCTGATCTGGGTGCTGACCAAGATGCAGATCATGGTGAACCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTGGAGATCAACACCTGGTTCTCCCAGTCCGGCAAGATCGGCATGGCCTCCGACTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGATCCGCGCCACCTCCGTGTGGGCCATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCTTCTCCCGCCTGCCCTACGAGGTGCGCCAGGAGCTGACCCCCCACTACGTGGACTCCCCCCACGTGATCGAGGACAACGACCGCAAGCTGCACAAGTTCGACGTGAAGACCGGCGACTCCATCCGCAAGGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGTCCATGCCCATCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGACCGTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCATGGACTCCGTGCTGGAGTCCGTGACCGCCATGGACCCCTCCGAGGACGAGGGCCGCTCCCAGTACAAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGACATCGTGAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCACCAACGGCGCCATCTCCACCGCCAAGAACTCCAACGGCAACTCCGTGTCCTGA

SEQ ID NO：34白色檫木FATB1密码子优化的CDS核酸序列(SalFATB1)

ATGGCCACCACCTCCCTGGCCTCCGCCTTCTGCTCCATGAAGGCCGTGATGCTGGCCCGCGACGGCCGCGGCATGAAGCCCCGCTCCTCCGACCTGCAGCTGCGCGCCGGCAACGCCCAGACCCCCCTGAAGATGATCAACGGCACCAAGTTCTCCTACACCGAGTCCCTGAAGCGCCTGCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCCGTGGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAAGCCCCGCCTGCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGCCTGCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCTCCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCTCCACCTCCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCACCCTGAACCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGGCCTGGGTGGTGCGCCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGATCGGCGCCTCCGGCAACAACGGCATGCGCCGCGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGTCCGTGATGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTGTCCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCCTGTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGGACGAGGAGATCAAGAAGCTGCAGAAGCTGAACGACTCCTCCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACGTGGGCTGGATCCTGGAGACCGTGCCCGACTCCATCTTCGAGTCCCACCACATCTCCTCCATCACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCACCCGCGACTCCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGTCCGGCGGCTCCCTGGAGGCCGGCCTGGTGTGCGACCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCTCCGAGGTGCTGCGCGCCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCATCGTGATCCCCGCCGAGCCCTCCGTGTGA

SEQ ID NO：35白色檫木FATB2密码子优化的CDS核酸序列(SalFATB2)

ATGGCCACCACCTCCCTGGCCTCCGCCTTCTGCTCCATGAAGGCCGTGATGCTGGCCCGCGACGGCCGCGGCATGAAGCCCCGCTCCTCCGACCTGCAGCTGCGCGCCGGCAACGCCCAGACCCCCCTGAAGATGATCAACGGCACCAAGTTCTCCTACACCGAGTCCCTGAAGCGCCTGCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCCGTGGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAAGCCCCGCCTGCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGCCTGCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCTCCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCTCCACCTCCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCACCCTGAACCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGGCCTGGGTGGTGCGCCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGGCCTGGGTGGGCGCCTCCGGCAACATCGGCATGCGCCGCGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCCACATCCTGGCCCGCTGCACCTCCGTGTCCGTGATGATGAACGCCCGCACCCGCCGCCTGTCCAAGATCCCCCAGGAGGTGCGCGCCGAGATCGACCCCCTGTTCATCGAGAAGGTGGCCGTGAAGGAGGGCGAGATCAAGAAGCTGCAGAAGTTCAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCTGGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACATCGGCTGGATCTTCAAGTCCGTGCCCGACTCCATCTCCGAGAACCACTACCTGTCCTCCATCACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCACCCGCGGCTCCGCCCTGCAGTCCCTGACCACCGTGTGCGGCGACTCCTCCGAGGCCGGCATCATCTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGACGGCCCCGAGGTGCTGCGCGCCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCATCGTGATCCCCGCCGAGCCCTCCGTGTGA

SEQ ID NO：36桂皮钓樟FATB1密码子优化的CDS核酸序列(LbeFATB1)

SEQ ID NO：37CpSADtp_修整的转运(质体靶向)肽氨基酸序列

MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRAAI

SEQ ID NO:38硫酯酶转化构建体

SEQ ID NO：39

基于SalFATB2的缺失突变体区域的氨基酸序列

LFAVITTIFSVAEKQWTNLEWKPKPKPRLPQL

SEQ ID NO：40

SalFATB1a(白色檫木SalFATB1的缺失突变体)的氨基酸序列

MATTSLASAFCSMKAVMLARDGRGMKPRSSDLQLRAGNAQTPLKMINGTKFSYTESLKRLPDWSMLDDHFGLHGLVFRRTFAIRSYEVGPDRSTSIVAVMNHLQEATLNHAKSVGILGDGFGTTLEMSKRDLAWVVRRTHVAVERYPAWGDTVEVECWIGASGNNGMRRDFLVRDCKTGEILTRCTSLSVMMNTRTRRLSKIPEEVRGEIGPLFIDNVAVKDEEIKKLQKLNDSSADYIQGGLTPRWNDLDVNQHVNNIKYVGWILETVPDSIFESHHISSITLEYRRECTRDSVLQSLTTVSGGSLEAGLVCDHLLQLEGGSEVLRARTEWRPKLTDSFRGIIVIPAEPSV

SEQ ID NO：41

LbeFATB1a(LbeFATB1的缺失突变体)的氨基酸序列

MVATSLASAFCSMKAVMLADDGRGMKPRSSDLQLRAGNAQTSLKMIDGTKFSYTESLKRLPDWSKLDDRFGLHGLVFRRTFAIRSYEVGPDRSASILAVLNHLQEATLNHAESVGILGDRFGETLEMSKRDLMWWRRTYVAVERYPAWGDTVEIESWIGASGNNGMRREFLVRDFKTGEILTRCTSLSVMMNTRTRRLSKIPEEVRGEIGPVFIDNVAVKDEEIKKLQKLNDSTADYIQGGLIPRWNDLDLNQHVNNIKYVSWILETVPDSILESYHMSSITLEYRRECTRDSVLQSLTTVSGGSSEAGLVCEHSLLLEGGSEVLRARTEWRPKLTDSFRGISVIPAEQSV

SEQ ID NO：42

成熟的SalFATB1a(白色檫木SalFATB1的缺失突变体)的氨基酸序列

GNAQTPLKMINGTKFSYTESLKRLPDWSMLDDHFGLHGLVFRRTFAIRSYEVGPDRSTSIVAVMNHLQEATLNHAKSVGILGDGFGTTLEMSKRDLAWVVRRTHVAVERYPAWGDTVEVECWIGASGNNGMRRDFLVRDCKTGEILTRCTSLSVMMNTRTRRLSKIPEEVRGEIGPLFIDNVAVKDEEIKKLQKLNDSSADYIQGGLTPRWNDLDVNQHVNNIKYVGWILETVPDSIFESHHISSITLEYRRECTRDSVLQSLTTVSGGSLEAGLVCDHLLQLEGGSEVLRARTEWRPKLTDSFRGIIVIPAEPSV

SEQ ID NO：43

成熟的LbeFATB1a(LbeFATB1的缺失突变体)的氨基酸序列

GNAQTSLKMIDGTKFSYTESLKRLPDWSKLDDRFGLHGLVFRRTFAIRSYEVGPDRSASILAVLNHLQEATLNHAESVGILGDRFGETLEMSKRDLMWVVRRTYVAVERYPAWGDTVEIESWIGASGNNGMRREFLVRDFKTGEILTRCTSLSVMMNTRTRRLSKIPEEVRGEIGPVFIDNVAVKDEEIKKLQKLNDSTADYIQGGLIPRWNDLDLNQHVNNIKYVSWILETVPDSILESYHMSSITLEYRRECTRDSVLQSLTTVSGGSSEAGLVCEHSLLLEGGSEVLRARTEWRPKLTDSFRGISVIPAEQSV

SEQ ID NO：44

pSZ5176/D4053(SalFATB1a)

SEQ ID NO：45

pSZ5179/D4056(LbeFATB1a)

SEQ ID NO：46

CcFATB4樟树酰基-ACP硫酯酶CDS。

MVTTSLASAYFSMKAVMLAPDGRGIKPRSSGLQVRAGNERNSCKVINGTKVKDTEGLKGCSTLQGQSMLDDHFGLHGLVFRRTFAIRCYEVGPDRSTSIMAVMNHLQEAARNHAESLGLLGDGFGETLEMSKRDLIWVVRRTHVAVERYPAWGDTVEVEAWVGASGNTGMRRDFLVRDCKTGHILTRCTSVSVMMNMRTRRLSKIPQEVRAEIDPLFIEKVAVKEGEIKKLQKLNDSTADYIQGGWTPRWNDLDVNQHVNNIIYVGWIFKSVPDSISENHHLSSITLEYRRECTRGNKLQSLTTVCGGSSEAGIICEHLLQLEDGSEVLRARTEWRPKHTDSFQGISERFPQQEPHK

SEQ ID NO：47

SalFatB1a中不存在的SalFatB1的缺失部分

LFAVITTIFSVAEKQWTNLEWKPKPKPRLPQL

SEQ ID NO：48

LbeFATB1a中不存在的LbeFATB1的缺失部分

LLTVITTIFSAAEKQWTNLERKPKPPHL

SEQ ID NO：49

CpauFATB1(转运肽显示在带框的文本中)

NASAHPKANGSAVNLKSGSLNTQEDTSSSPPPRAFLNQLPDWSMLLTAITTVFVAAEKQWTMRDRKSKRPDMLVDSVGLKSVVLDGLVSRQIFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETSINHCKSLGLLNDGFGRTPGMCKNDLIWVLTKMQIMVNRYPTWGDTVEINTWFSHSGKIGMASDWLITDCNTGEILIRATSVWAMMNQKTRRFSRLPYEVRQELTPHYVDSPHVIEDNDRKLHKFDVKTGDSIRKGLTPRWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPIEVLETQELCSLTVEYRRECGMDSVLESVTAMDPSEDEGRSQYKHLLRLEDGTDIVKGRTEWRPKNAGTNGAISTAKPSNGNSVS

SEQ ID NO：50

寡瓣萼距花FATB1酰基-ACP硫酯酶的CpauFATB1Δ28缺失突变体

NASAHPKANGSAVNLKSGSLNTQEDTSSSPPPRAFLNQLPDWSMLVDSVGLKSVVLDGLVSRQIFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETSINHCKSLGLLNDGFGRTPGMCKNDLIWVLTKMQIMVNRYPTWGDTVEINTWFSHSGKIGMASDWLITDCNTGEILIRATSVWAMMNQKTRRFSRLPYEVRQELTPHYVDSPHVIEDNDRKLHKFDVKTGDSIRKGLTPRWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPIEVLETQELCSLTVEYRRECGMDSVLESVTAMDPSEDEGRSQYKHLLRLEDGTDIVKGRTEWRPKNAGTNGAISTAKPSNGNSVS

SEQ ID NO：51

寡瓣萼距花FATB1酰基-ACP硫酯酶的成熟CpauFATB1Δ28缺失突变体

SEQ ID NO：52

CpauFATB1Δ28 CDS

SEQ ID NO：53

ChFATB2(Uniprot Q39514)

MVAAAASSAFFPVPAPGASPKPGKFGNWPSSLSPSFKPKSIPNGGFQVKANDSAHPKANGSAVSLKSGSLNTQEDTSSSPPPRTFLHQLPDWSRLLTAITTVFVKSKRPDMHDRKSKRPDMLVDSFGLESTVQDGLVFRQSFSIRSYEIGTDRTASIETLMNHLQETSLNHCKSTGILLDGFGRTLEMCKRDLIWVVIKMQIKVNRYPAWGDTVEINTRFSRLGKIGMGRDWLISDCNTGEILVRATSAYAMMNQKTRRLSKLPYEVHQEIVPLFVDSPVIEDSDLKVHKFKVKTGDSIQKGLTPGWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGRDSVLESVTAMDPSKVGVRSQYQHLLRLEDGTAIVNGATEWRPKNAGANGAISTGKTSNGNSVS

SEQ ID NO：54

萼距花(Cuphea hookeriana)FATB2的缺失突变体ChFATB2Δ27

NDSAHPKANGSAVSLKSGSLNTQEDTSSSPPPRTFLHQLPDWSRLVDSFGLESTVQDGLVFRQSFSIRSYEIGTDRTASIETLMNHLQETSLNHCKSTGILLDGFGRTLEMCKRDLIWVVIKMQIKVNRYPAWGDTVEINTRFSRLGKIGMGRDWLISDCNTGEILVRATSAYAMMNQKTRRLSKLPYEVHQEIVPLFVDSPVIEDSDLKVHKFKVKTGDSIQKGLTPGWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGRDSVLESVTAMDPSKVGVRSQYQHLLRLEDGTAIVNGATEWRPKNAGANGAISTGKTSNGNSVS

SEQ ID NO：55

萼距花(Cuphea hookeriana)FATB2的成熟缺失突变体ChFATB2Δ27

SEQ ID NO：56

ChFATB2Δ27 CDS

SEQ ID NO:57

pSZ6315中包含的转化用DNA的核苷酸序列

SEQ ID NO：58

pSz6316中的BnOTE(D124A)的核苷酸序列

SEQ ID NO:59

pSZ6317中的BnOTE(D209A)的核苷酸序列

SEQ ID NO:60

pSZ6318中的BnOTE(D124A，D209A)的核苷酸序列

SEQ ID NO：61

野生型BnOTE的氨基酸序列；加下划线的位置D124和D209

MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRASQLRKPALDPLRAVISADQGSISPVNSCTPADRLRAGRLMEDGYSYKEKFIVRSYEVGINKTATVETIANLLQEVACNHVQKCGFSTGFATTLTMRKLHLIWVTARMHIEIYKYPAWSDVVEIETWCQSEGRIGTRRDWILRDSATNEVIGRATSKWVMMNQDTRRLQRVTEVRDEYLVFCPREPRLAFPEENNSSLKKIPKLEDPAQYSMLELKPRRADLDMNQHVNNVTYIGWVLESIPQEIIDTHELQVITLDYRRECQQDDIVDSLTTSEIPDDPISKFTGTNGSAMSSIQGHNESQFLHMLRLSENGQEINRGRTQWRKKSSR＊

Claims

1.一种包含编码异源调节元件和FatB酰基-ACP硫酯酶基因的多核苷酸序列的cDNA或核酸构建体，其可操作以在由表达该核酸构建体的细胞产生的油中产生改变的脂肪酸谱，其中该FatB基因表达蛋白质，该蛋白质具有与SEQ ID NO:1-18或61中的任一项具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列或编码融合在SEQ ID NO:10-18或61上游的质体靶向肽的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的核酸构建体，其中该酰基-ACP硫酯酶编码序列包含与SEQ IDNO:19-36、57-60中任一项或因遗传密码的简并性而致的任何等效序列至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性。

3.如权利要求1或2所述的核酸构建体，其中该蛋白质在对应于SEQ IDNO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)。

4.如权利要求1或2所述的核酸构建体，具有与SEQ ID NO:40具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的质体靶向肽。

5.如权利要求1或2所述的核酸构建体，其中该FatB基因表达具有氨基酸序列的活性酰基-ACP-硫酯酶蛋白，该氨基酸序列具有：

(c)与SEQ ID NO:3大于95.4％、95.6％、95.7％、95.8％、95.9％、96％或96.1％的一致性；

(f)与SEQ ID NO:10大于95.5％、95.6％、95.7％或95.8％、95.9％或96％的一致性；

6.一种宿主细胞，该宿主细胞能够表达如权利要求1-5中任一项所述的核酸构建体，以产生相对于没有该构建体的对照细胞具有改变的组成的甘油三酯油，该油任选地具有增加的C8-C12脂肪酸。

7.一种宿主细胞，该宿主细胞能够表达如权利要求1-5中任一项所述的核酸构建体，以产生相对于没有该构建体的对照细胞具有改变的组成的甘油三酯油，该油任选地具有增加的C18脂肪酸。

8.如权利要求6或7所述的宿主细胞，其中该宿主细胞选自植物细胞、微生物细胞和微藻细胞。

9.一种产生重组细胞的方法，该重组细胞产生改变的脂肪酸谱，该方法包括用根据权利要求1-5中任一项所述的核酸转化该细胞。

10.一种通过如权利要求9所述的方法产生的宿主细胞。

11.如权利要求10所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是选自植物细胞、微生物细胞和微藻细胞。

12.一种用于产生油或油衍生产品的方法，该方法包括培养如权利要求6-8和10-11中任一项所述的宿主细胞，并提取由此产生的油，任选地其中该培养是通过在糖上进行的异养生长。

13.如权利要求12所述的方法，进一步包括从该油产生脂肪酸、燃料、化学品、食品或其他油衍生产品。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中该宿主细胞表达编码在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)的蛋白质的核酸，并且与表达野生型蛋白质的宿主细胞相比，产生至少2倍量的C18:0和/或C18:1脂肪酸。

15.一种通过如权利要求12所述的方法产生的油，任选地具有包括至少20％的C8、C10、C12、C14、C16或C18脂肪酸的脂肪酸谱。

16.如权利要求14所述的油，其中该油是由微藻产生，具有微藻固醇谱，并且任选地缺乏C24-α固醇。

17.由通过如权利要求12或13所述的方法产生的油或如权利要求14或15所述的油产生的油衍生产品，任选地脂肪酸、燃料、化学品、食品或其他油衍生产品。

18.一种用于生产油的方法，该方法包括：

(a)提供质体产油细胞、任选地微生物细胞，该细胞表达由FATB基因编码的功能性酰基-ACP硫酯酶基因，该FATB基因在对应于编码SEQ ID NO:8的氨基酸66-98的区域中具有缺失突变；

(b)培养该细胞以产生细胞-油；并且

(c)从该细胞分离该细胞-油。

19.如权利要求17所述的方法，其中该细胞-油由于该缺失而富含C12。

20.如权利要求17或18所述的方法，其中该FATB基因编码与SEQ ID NO:40至43中任一项具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的蛋白质。

21.如权利要求17或18所述的方法，其中该FATB基因与SEQ ID NO:44、45或因遗传密码的简并性而致的等效序列具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。

22.一种包含编码FATB蛋白质的多核苷酸的cDNA、基因、表达盒或宿主细胞，该FATB蛋白质与SEQ ID NO:40至43中任一项具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。

23.一种包含多核苷酸的cDNA、基因、表达盒或宿主细胞，该多核苷酸与SEQ ID NO:44或45或因遗传密码的简并性而致的等效序列具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。

24.一种遗传工程改造细胞的方法，包括在该细胞中表达多核苷酸，该多核苷酸(a)编码与SEQ ID NO:40至43具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的蛋白质；或(b)与SEQ IDNO:44或45或因遗传密码的简并性而致的等效序列具有至少65％、70％、80％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。

25.一种包含编码FATA蛋白质的多核苷酸的cDNA、基因、表达盒或宿主细胞，该FATA蛋白质与SEQ ID NO:61具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，并且其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)。

26.一种包含编码FATA蛋白质的多核苷酸的cDNA、基因、表达盒或宿主细胞，该FATA蛋白质与SEQ ID NO:61或因遗传密码的简并性而致的等效序列具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，并且其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)。

27.一种遗传工程改造细胞的方法，包括在该细胞中表达多核苷酸，该多核苷酸(a)编码与SEQ ID NO:61具有至少65％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的蛋白质，其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:61(D124A)的位置126和SEQ ID NO:61(D209A)的位置211的一个或两个位置处具有丙氨酸(A)。

28.一种宿主细胞，该宿主细胞能够表达如权利要求25至26中任一项所述的核酸构建体，以产生相对于没有该构建体的对照细胞具有改变的组成的甘油三酯油，该油任选地具有增加的C18脂肪酸。

29.如权利要求28所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是选自植物细胞、微生物细胞和微藻细胞。

30.一种产生重组细胞的方法，该重组细胞产生改变的脂肪酸谱，该方法包括用根据权利要求25-26中任一项所述的核酸转化该细胞。

31.一种通过如权利要求30所述的方法产生的宿主细胞。

32.如权利要求31所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是选自植物细胞、微生物细胞和微藻细胞。

33.一种用于产生油或油衍生产品的方法，该方法包括培养如权利要求31至32中任一项所述的宿主细胞，并提取由此产生的油，任选地其中该培养是通过在糖上进行的异养生长。

34.如权利要求33所述的方法，进一步包括从该油产生脂肪酸、燃料、化学品、食品或其他油衍生产品。

35.如权利要求33至34所述的方法，其中该宿主细胞产生与表达野生型蛋白质的宿主细胞相比，至少2倍量的C18:0和/或C18:1脂肪酸。

36.一种通过如权利要求33至35中任一项所述的方法产生的油，任选地具有包括至少20％的C8、C10、C12、C14、C16或C18脂肪酸的脂肪酸谱。

37.如权利要求36所述的油，其中该油是由微藻产生，具有微藻固醇谱，并且任选地缺乏C24-α固醇。

38.由通过如权利要求33至35中任一项所述的方法产生的油或如权利要求36至37中任一项所述的油产生的油衍生产品，任选地脂肪酸、燃料、化学品、食品或其他油衍生产品。