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CN107072243A - 生产含油种子蛋白质混合物的方法 - Google Patents

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CN107072243A
CN107072243A CN201580050025.5A CN201580050025A CN107072243A CN 107072243 A CN107072243 A CN 107072243A CN 201580050025 A CN201580050025 A CN 201580050025A CN 107072243 A CN107072243 A CN 107072243A
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加百利·埃斯特万·哈拉米约·佛雷戴尔
安东尼奥·高神·玛丽亚·维凯克
格拉尔杜斯·约翰尼斯·弗朗西斯库斯·思莫德尔斯
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Abstract

本发明涉及获得含油种子蛋白质混合物的方法。本发明还描述了从含油种子粗粉、优选从冷压的含油种子粗粉选择性地优先于油提取蛋白质，以生产中间水性蛋白质溶液，所述中间水性蛋白质溶液适合制备由天然蛋白质构成的含油种子蛋白质混合物，所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液。

Description

生产含油种子蛋白质混合物的方法
发明领域
本发明涉及获得含油种子蛋白质混合物的方法。
本发明还描述了从含油种子(oil seed)粗粉(meal)、优选从冷压的含油种子粗粉选择性地优先于油提取蛋白质，以生产中间水性蛋白质溶液(intermediate aqueousprotein solution)，所述中间水性蛋白质溶液适合制备由天然蛋白质构成的含油种子蛋白质混合物。
发明背景
含油种子(例如，向日葵、油菜籽(rapeseed)/菜籽(canola)、芥菜籽、玉米种子、亚麻籽)和大豆通常不仅是食用油的极好来源，而且还是蛋白质的极好来源。例如，菜籽是世界上最大的含油种子作物之一，其被认为是第三位的最丰富的食用油来源。
传统上，对于具有相对高的油含量(基于干物质>35％，油菜籽约40％)的材料而言，使用机械压榨和溶剂提取的组合来有效提取油[Rosenthal等人，Enzyme andMicrobial Technology 19(1996)402-420]。提取油之后，对经压榨的材料进行热处理以除去溶剂，从而产生油和蛋白质含量分别为干物质的1-5％和40-50％的饼(cake)。虽然所述饼具有相对高的蛋白质含量，但油提取期间所应用的苛刻条件(即，提高的温度、溶剂)显著降低了存在的蛋白质的质量。这些苛刻条件导致蛋白质变性，从而负面影响所纯化的蛋白质的功能性性质[Khattab等人，LWT-Food Science and Technology 42(2009)1119-1124]，从而降低了它们的价值。这些油提取条件不利于蛋白质的质量这一认识是支持冷压技术改进的因素之一。在冷压期间，不使用溶剂且在温和条件下榨出油，从而产生质量更好的油和质量更高的含油种子压榨的粗粉。
这种粗粉具有相对高的油含量(基于干物质，通常>8％，例如>10％)，且是功能性得到保留的蛋白质的极好来源。可通过例如水性提取容易地从粗粉中提取这些蛋白质[Rosenthal等人，Enzyme and Microbial Technology 19(1996)402-420，Rosenthal等人，Trans IChemE，Part C，76(1998)224-230和Lawhon等人，Journal of Food Science 46(1981)912-916]。这类工艺的最大挑战之一是：在提取期间，蛋白质和油被同时提取[Rosenthal等人，Trans IChemE，Part C，76(1998)224-230]。这导致含有显著量油的提取物，所述油在大多数情况下部分作为稳定乳剂存在，从而使其去除相当困难。
本发明通过证明可通过使用温和提取方法选择性提取蛋白质来生产富含蛋白质且几乎(practically)不含脂肪的提取物解决了这个挑战。如以下将更详细解释的：温和提取方法是在提取期间产生最低剪切至不产生剪切的提取方法，这对于选择性提取蛋白质而基本上不提取脂肪很重要。
对于从基于干物质具有至少8％油含量的含油种子粗粉中提取蛋白质而言，本发明的方法特别有用。
本发明还描述了从所述富含蛋白质且几乎不含脂肪的提取物获得含油种子蛋白质混合物的步骤。
US 2012/0252065描述了从含油种子粗粉制备蛋白质分离物和水解的蛋白质浓缩物的水性方法。将含油种子粗粉与水性溶剂混合以形成浆体。根据图4A，所使用的混合时间是1小时，从而导致中间蛋白质水性蛋白质溶液中不期望的脂肪与蛋白质之比。
US 6,005,076描述了制备蛋白质分离物的方法，其包含多个步骤。蛋白质提取通过将含油种子粗粉与盐溶液混合并在76rpm下混合/搅拌来进行。根据说明书，蛋白质提取具有在菜籽粗粉中溶解一定脂肪的额外效果，这导致脂肪存在于含水相中。其它步骤之一是从含水相中除去脂肪。
Klockeman等人(1997，J.Agric.Food Chem，45，3867-3870，Isolation andcharacterization of defatted canola meal protein)描述了通过在180-200rpm下进行搅拌60分钟来从商业化己烷脱脂菜籽粗粉中提取蛋白质。
WO 95/27406描述了通过将基于脱脂(不含脂肪)大豆的材料悬浮在水中并使悬浮物经受酶处理来生产基于膳食大豆的产品的方法。
GB 2461093描述了从油质植物材料制备植物蛋白质浓缩物的方法，其包括使用非极性溶剂(例如己烷)和使用乙醇。
GB 1 502 959描述了通过使用有机溶剂处理脱油的油质种子材料以生产蛋白质浓缩物和提取物溶液的方法。
Rosenthal等人(1998，Trans iChemE，第76卷，C部分，Simultaneous aqueousextraction of oil and protein from soybean：mechanisms for process design)研究了从大豆粉水性提取油和蛋白质。蛋白质和油的提取率显示出密切相关。图10显示了搅拌速度对从大豆粉提取油和蛋白质的影响。
附图说明
图1：作为蛋白质和油的提取率的函数的脂肪与蛋白质之比。
(A)具有为基于干重(DWB)1％的油含量、基于DWB38％的蛋白质含量和92％的干物质(DM)的脱脂油菜籽饼；
(B)具有为基于DWB2.6％的油含量、基于DWB36.2％的蛋白质含量和89.2％的DM的脱脂油菜籽饼[Shahidi F，Canola and Rapeseed：Production，Chemistry，Nutrition andProcessing Technology.1990Van Nostrand Reinhold，ISBN 0-442-00295-5]；
(C)具有为基于DWB5％的油含量、基于DWB38％的蛋白质含量和92％的DM的脱脂油菜籽饼；
(D)具有为基于DWB5％的油含量、基于DWB38％的蛋白质含量和92％的DM的冷压油菜籽饼。
实粗线：油提取率为5％；
短划线：油提取率为10％；
点划线：油提取率为20％；
实细线：油提取率为50％；
灰线：油提取率为80％。
插图：脂肪与蛋白质之比具有低值的区域被放大。使用方程(3)来计算脂肪与蛋白质之比(参见实验部分)。
图2：在搅拌的容器中期间的脂肪与蛋白质之比(也参见实施例3)。
图3：示意性提取柱。
发明概述
在一个其实施方式中，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使具有基于干物质至少8％的油含量的含油种子粗粉经受重力引起的固-液提取，以及任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩和洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液。
发明详述
本发明证明，可通过使用温和提取方法选择性提取蛋白质来从压榨的含油种子粗粉中生产富含蛋白质且几乎不含脂肪的提取物。温和提取方法是在提取期间产生最低剪切至不产生剪切的提取方法，这对于选择性提取蛋白质而基本上不提取脂肪很重要。
通过多步骤方法来生产含油种子蛋白质分离物。一般而言，这种从含油种子生产蛋白质分离物的方法包括：
-获得含油种子
-对含油种子进行筛选、清洗和任选地脱壳
-从脱壳的含油种子中至少部分地(溶剂或冷)提取油，产生油产物和至少部分脱脂的含油种子粗粉
-使所述油产物与所述部分脱脂的含油种子粗粉分离
-提取所述部分脱脂的含油种子粗粉以使所述部分脱脂的含油种子粗粉中的蛋白质溶解，这通常也使所述部分脱脂的含油种子粗粉中的(部分)剩余脂肪溶解
-将水性蛋白质溶液与残留的含油种子粗粉分离以获得中间水性蛋白质溶液；如上文所述，这种溶液通常包含共提取的脂肪，因此，在总体生产方法的这个阶段，脂肪与蛋白质之比通常远高于0.5％
-使产生的中间水性蛋白质溶液经受这样的步骤，例如：
·色素去除步骤和/或脂肪去除步骤(这些步骤的顺序可颠倒)
-浓缩获得的蛋白质溶液以增加蛋白质浓度
-另外的脂肪去除步骤
-干燥浓缩的蛋白质溶液以获得含油种子蛋白质分离物；或者，通过改变包括温度、pH、离子强度、盐浓度和/或溶剂的因素使溶液中的蛋白质沉淀，使蛋白质沉淀物沉降，使沉淀的蛋白质与残留的含水相分离，以及干燥蛋白质以获得含油种子蛋白质分离物。
在油菜籽的实例中，通常利用稀释来使蛋白质沉淀，例如利用冷水稀释以降低所有组分的溶解度，或进行稀释以将离子强度降至最低，从而降低在相对高的离子强度下可溶的那些组分的溶解度。
或者，直接洗涤并干燥浓缩的蛋白质(即，不沉淀)。
根据所使用的确切条件和源材料(即，特定的含油种子粗粉)，并非所有步骤都需要执行且一些步骤可以以不同的顺序执行。此外，并非所有步骤都需要一起执行和在相同场所执行。通常，在一个场所中从含油种子提取油(油制造商)，且在另一个场所中进行从含油种子粗粉/饼提取蛋白质。
为了避免任何混淆，本发明描述了获得含油种子蛋白质混合物的方法，其中使用中间水性蛋白质溶液(或者，蛋白质提取物流或蛋白质提取物，所述术语在本文中可交换使用)。这种中间水性蛋白质溶液是作为水性提取(部分脱脂的)含油种子粗粉之后的直接生成产物的蛋白质溶液。取决于温和提取的类型和这种温和提取是否以分批或连续方式进行，在得到中间水性蛋白质溶液之前可能需要进行固/液提取。换言之，中间水性蛋白质溶液是包含溶解的源自(部分脱脂的)含油种子粗粉的蛋白质的蛋白质溶液，其是提取的直接结果。中间水性蛋白质溶液是尚未经受浓缩、沉淀和/或干燥的蛋白质级分。换言之，中间水性蛋白质溶液是在提取步骤结束时存在于固/液混合物中的液相。为了避免任何误解，中间水性蛋白质溶液不是作为脱脂、脱油或脱乳脂(decreaming)步骤的结果的蛋白质溶液，例如离心后获得的提取物。本文所述的中间水性蛋白质溶液不同于现有技术的蛋白质提取方法中所产生的浆体。术语“浆体”通常是指这样的含油种子粗粉，其已与水性溶剂充分混合(或搅拌)从而形成含有溶解蛋白质和液体中的蛋白质悬浮物、油和任选地纤维和抗营养化合物的液体。
中间蛋白质溶液中脂肪的存在是不期望的，因为这导致部分作为稳定乳剂存在的蛋白质提取物。此外，脂肪的存在可导致在蛋白质和脂肪/乳剂的进一步分离期间蛋白质产物损失。中间蛋白质溶液中(高水平)脂肪的存在可导致终产物(含油种子蛋白质混合物)中相对高的脂肪含量，这也是不期望的。本发明通过证明可通过使用温和的蛋白质提取方法选择性提取蛋白质来生产富含蛋白质且几乎不含脂肪的提取物来解决这些问题。
本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使具有基于干物质至少8％的油含量的含油种子粗粉在最低剪切条件下经受水性提取，优选重力引起的固-液提取，以及任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液。
本发明还描述了从基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉中选择性提取蛋白质(优先于油)的方法，所述方法包括：使所述粗粉在最低剪切条件下经受水性提取，优选重力引起的固-液提取。优选地，本发明描述了从基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉中选择性提取蛋白质(优先于油)以获得具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比的中间水性蛋白质溶液的方法，所述方法包括：使所述粗粉在最低剪切条件下经受水性提取，优选重力引起的固-液提取。
本发明的方法可对任何含油种子或大豆粗粉进行。含油种子粗粉的例子是油菜籽、亚麻、索林(linola)、向日葵或芥菜种子粗粉。本文所述发明尤其涉及油菜籽粗粉。油菜籽又名油菜、芸苔、芜菁和菜籽(rape、oilseed rape、rapa、rappi和canola)。在一个优选的实施方式中，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油油菜籽粗粉生产中间水性油菜籽蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油油菜籽粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性油菜籽蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液。
所使用的含油种子粗粉可包含天然存在的蛋白质或可包含经遗传修饰的含油种子，即其中至少一种蛋白质被遗传修饰的含油种子。
含油种子粗粉(或者含油种子饼；所述术语在本文中可交换使用)可以是由从种子中除去油而产生的任何粗粉(或饼)。含油种子粗粉可包含不同水平的残留油。例如，含油种子粗粉是己烷提取的结果，其通常包含基于干物质(DWB)在1-5％之间的油。或者，含油种子粗粉是冷压法的结果，其通常包含基于DWB在10-25％之间的油或通常包含基于干物质为至少8％的油。在一个优选的实施方式中，含油种子粗粉具有至少8％或至少10％的油含量，因此，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从基于干物质具有至少8％(或至少10％)(优选地在8-25％或10-25％DWB的范围内)的油含量的含油种子粗粉生产中间水性含油种子蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使具有至少为8％的油含量的含油种子粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性含油种子蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液。在一个甚至更优选的实施方式中，所述含油种子粗粉是基于干物质具有至少8％(或至少10％)的油含量的含油油菜籽粗粉，因此，本发明还提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从基于干物质具有至少8％(或至少10％)的油含量的含油油菜籽粗粉生产中间水性油菜籽蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使所述含油油菜籽粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性油菜籽蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液。
基于干物质具有至少8％或至少10％的油含量的含油种子粗粉的例子是冷压的含油种子粗粉。本发明还提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从冷压的含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使所述冷压的含油种子粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液。在一个甚至更优选的实施方式中，所述冷压的含油种子粗粉是冷压的含油油菜籽粗粉，因此，本发明还提供生产含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从冷压的含油油菜籽粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使所述冷压的含油油菜籽粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液。所使用的含油种子粗粉由其制备而来的种子可以是有壳的或可经受脱壳步骤(即，将壳从含油种子除去)。
如本文的实验部分中所述，易于计算中间水性蛋白质溶液中脂肪与蛋白质之比。实验部分还提供了现有技术中所述的中间水性蛋白质溶液中脂肪与蛋白质之比的理论计算。现有技术的提取方法不是很有选择性，即，现有技术的提取方法在蛋白质提取期间共提取脂肪，因此认为现有技术的中间水性蛋白质溶液中脂肪与蛋白质之比远低于1∶12(一般而言，现有技术的中间水性蛋白质溶液具有1∶3左右的脂肪与蛋白质之比，也参见本文所述的实验部分)。本发明描述了从含油种子粗粉中选择性提取蛋白质的水性方法，因此可以获得更令人满意的中间水性蛋白质溶液中脂肪与蛋白质之比。本发明描述了获得中间水性蛋白质溶液的水性方法。优选地，本发明描述了获得具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比的中间水性蛋白质溶液的水性方法。短语“至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比”应被解读为其中蛋白质的量为12倍或更高的比率。更优选地，所述脂肪与蛋白质之比为至少1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19或1∶20。本文中还包括更令人满意的脂肪与蛋白质之比，其中蛋白质的量高于20倍。因此，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从(优选冷压的)含油种子粗粉(优选油菜籽粗粉)生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有为至少1∶12或更优选至少1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19或1∶20的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液。
本文所使用的短语“使含油种子粗粉经受水性提取”通常是指使水性溶液与含油种子粗粉接触的步骤。例如，这是通过下述来实现的：将含油种子粗粉装入容器(例如柱)中，所述容器配备有用于保持所述含油种子粗粉在其内部的穿孔支持件，从而创造了含油种子粗粉的固定床。然后，泵送水性溶液穿过固定床，从而使固相和液相二者接触并在最低剪切条件下启动提取过程。或者，将含油种子粗粉和水性溶液同时加入管或柱中。结果，含油种子粗粉浸入在水性溶液中且所述粗粉分成(基本均匀的)颗粒。在另一种替代方法中，将水性溶液放入管或柱中并将含油种子粗粉加入其中。同样，含油种子粗粉被浸入且所述粗粉分成(基本均匀的)颗粒。
术语“在最低剪切条件下提取”在本文中用于描述应该如何进行提取。优选地，进行含油种子粗粉提取以使对含油种子粗粉的物理力是温和的/轻柔的。如Rosenthal等人[Trans IChemE，Part C，76(1998)224-230和Lawhon等人，Journal of Food Science 46(1981)912-916]所述，蛋白质提取期间的最大挑战之一是蛋白质和油被同时提取。这导致不期望的含显著量油的提取物，所述油在大部分情况下作为稳定乳剂存在，从而使得其去除相当困难。此外，脂肪的存在会导致总体降低的蛋白质产率或导致具有相对高脂肪含量的蛋白质产物。这些都是不期望的结果。本发明证明了可通过采用最低剪切条件选择性提取(优先于脂肪)蛋白质。所述最低剪切条件例如可通过在以低rpm运行的搅拌容器中进行提取来获得。在从含油种子粗粉提取蛋白质的领域中，通常采用在(大规模)搅拌容器中搅拌30-120分钟。实验室规模的从含油种子粗粉提取蛋白质通常采用机械搅拌来进行。不依赖于规模大小，现有技术中从含油种子粗粉/饼提取蛋白质在相对高的剪切条件下进行，结果是从含油种子粗粉中共-提取蛋白质和脂肪。
(在搅拌的容器中)使用相对低的rpm值已导致从含油种子粗粉中选择性提取蛋白质。当从含油种子粗粉中提取蛋白质在非机械混合条件下进行时或换言之当含油种子粗粉的固体未暴露于机械应力时，得到更令人印象深刻(和出乎意料)且工业上更有意义的结果。在一种其实施方式中，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉在最低剪切条件下经受水性提取和任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，且其中所述在最低剪切条件的提取包括在非机械混合条件下的提取。关于从含油种子粗粉中提取蛋白质，机械混合条件是其中含油种子粗粉的固体和水性提取溶液被不断搅拌的条件。因此，固体被搅拌/搅动的力破坏。本发明显示：当含油种子粗粉的固体未暴露于机械应力时，可从含油种子粗粉中选择性提取蛋白质。因此，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性含油种子蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性含油种子蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，且其中所述在最低剪切条件的提取包括其中(含油种子粗粉的)固体不被或几乎不被机械搅拌的提取。术语“几乎不被机械搅拌”用于明确：在提取期间，通过机械装置的固体的一些运动是允许的，只要它不或几乎不导致固体被破坏。例如，低剪切泵(如蠕动泵或单螺杆泵或本领域技术人员已知的类似的低剪切泵)的使用是不或几乎不导致固体被破坏的装置的例子。不限于此，目前认为：通过使用温和提取方法从含油种子粗粉中提取蛋白质，固体未被破坏，因此不从破坏的固体中释放油，从而导致选择性的蛋白质提取。
在一个优选的实施方式中，短语“在最低剪切条件下的提取”包括重力引起的固-液提取，即，其中固体(和液体)基本上仅由于重力而移动或换言之固体基本上仅以垂直方式移动的提取。重力引起的固-液提取在提取期间不采用搅拌和/或搅动。“重力引起的固-液提取”的一些优选实施方式是
-重力引起的质量流固-液提取，或
-共流(co-current)重力引起的固-液提取，或
-共流重力引起的质量流固-液提取，或
-逆流(counter-current)重力引起的固-液提取，或
-逆流引起的质量流固-液提取。
在共流固-液提取期间，固体和液体朝相同方向移动；在逆流固-液提取期间，固体和液体朝相反方向移动，在这种情况下，固体仅由于重力而移动。
重力引起的固-液提取应被理解为指的是“基本上仅”重力引起的固-液提取，即，不排除提取过程的很小部分包括非重力引起的步骤。
重力引起的固-液提取可在具有合适直径的柱或管中进行，其中所述直径可由本领域技术人员容易地确定。如果柱或管的长度足够长以致允许液体和固体接触(即，导致固体和液体足够长的接触时间)以从固体中选择性提取蛋白质，则整个提取过程能在一个步骤中进行，其中固体和液体同时加入柱或管中或者首先加入液体，之后加入固体。或者，使用过短而不能在一个步骤中提取足够蛋白质的柱或管(即，固体和液体之间的接触时间不足)，并通过在相同或不同的柱或管中再循环来增加接触时间。在这种情况下，固体和液体同时加入柱或管中或者首先加入液体，之后加入固体。在固体已沉降在柱或管的底部之后，借助于低剪切泵(例如蠕动泵或单螺杆泵或本领域技术人员已知的类似的低剪切泵)除去柱或管的内容物，并将所述内容物移至相同或另一柱或管的顶部。取决于柱或管的长度和直径，重复该过程以获得固体和液体之间足量的接触时间。在固体沉降在柱或管的底部期间，固体与液体接触且蛋白质通过渗透和/或浸入被提取。在另一替代方法中，使用过短而不能在一个步骤中提取足够蛋白质的柱或管(即，固体和液体之间的接触时间不足)并通过如下来增加接触时间：提供具有可在另一柱或管上方打开的底部的柱或管，从而允许固体再次与液体接触和沉降。如上文所述，重力引起的固-液提取应被理解为指的是“基本上仅”重力引起的固-液提取，即，不排除提取过程的很小部分包括非重力引起的步骤。从所述方法中显而易见的是：非重力引起的步骤的一个例子是使用低剪切泵以在柱或管的顶部引入固体-液体。在一个优选的实施方式中，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉经受重力引起的固-液提取和使所述含油种子粗粉经受低剪切装置(优选低剪切泵)和任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液。
为了从含油种子粗粉中提取蛋白质并避免固体被破坏，通过使用例如(但不限于)渗透和/或浸入的技术来使含油种子粗粉与水性溶液接触。因此，本发明还提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，且其中所述在最低剪切条件下的提取包括渗透和/或浸入。在一个优选的实施方式中，所述含油种子是油菜籽。因此，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油油菜籽粗粉生产中间水性油菜籽蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油油菜籽粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，且其中所述在最低剪切条件下的提取包括渗透和/或浸入。在另一优选的实施方式中，含油油菜籽粗粉具有基于干物质为至少10％的油含量，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油油菜籽粗粉生产中间水性油菜籽蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少10％的油含量的含油油菜籽粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，且其中所述在最低剪切条件下的提取包括渗透和/或浸入。优选地，所述含油油菜籽粗粉是冷压的含油种子粗粉。浸入和渗透是众所周知的技术，它们被用于不同技术领域中，例如从种子中提取油的领域。在渗透提取中，溶剂例如分布在含油种子片或饼的床上，其穿过所述床向下渗透并通过某种被支持的过滤装置(例如带孔板或网筛)从底部离开床。渗透过程又名连续提取过程，其基于不间断地润湿提取材料的原理。此处，溶剂流经过提取材料，从而允许其和提取它的自由流动溶剂之间间断的交换。恒定溶剂流的维持确保：局部饱和的溶剂流走并被不饱和的溶剂代替。该过程需要提取材料内部自由的提取剂流。在一种浸入类型的提取中，含油种子粗粉分散在之前填充有含水相的容器中。随着含油种子粗粉接触液体，它将膨胀并下沉。在下沉过程期间，水化的含油种子与新鲜的液体体积接触，从而导致可溶性组分的提取。在容器的底部，使用运送系统来将水化的含油种子粗粉运出容器，同时富含蛋白质的液体通过例如溢流系统离开。
如上所述，渗透和/或浸入的使用在油提取领域中众所周知。本发明现在显示：出乎意料地，这些技术对于从(部分脱脂的)含油种子粗粉中选择性提取蛋白质(与脂肪相比)非常有用。优选的渗透和/或浸入类型是喷洒渗透、浸入渗透、固体分散或正压渗透或它们的组合。另一优选的渗透类型是再循环渗透或多级渗透。因此，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，且其中利用水性溶液通过喷洒渗透、浸入渗透、固体分散或正压渗透或再循环渗透或多级渗透或它们的组合来提取含油种子粗粉。在一个优选的实施方式中，所述种子是油菜籽，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油油菜籽粗粉生产中间水性油菜籽蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油油菜籽粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性油菜籽蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，且其中利用水性溶液通过喷洒渗透、浸入渗透、固体分散或正压渗透或再循环渗透或多级渗透或它们的组合来提取含油油菜籽粗粉。更优选地，所述含油种子粗粉具有基于干物质为至少10％的油含量，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油油菜籽粗粉生产中间水性油菜籽蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使具有至少10％的油含量的含油油菜籽粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性油菜籽蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，且其中利用水性溶液通过喷洒渗透、浸入渗透、固体分散或正压渗透或再循环渗透或多级渗透或它们的组合来提取含油油菜籽粗粉。甚至更优选地，所述含油种子粗粉是冷压的含油种子粗粉。含油种子粗粉可来自有壳的或脱壳的含油种子。
合适的设备在例如Perry化学工程师手册(Perry’s Chemical Engineer’sHandbook)(更具体地在题目为“过滤(Leaching)”的章节)中被描述，其包括但不限于分批渗滤器、压力分批渗滤器(又名扩散器)、移动床渗滤器(例如斗式提升渗滤器、水平带式输送机或肯尼迪提取器)、帕丘卡槽(Pachua tanks)、波诺托抽提器(Bonotto extractor)、希德布朗特总浸入式提取器(Hildebrandt total-immersionextractor)和螺旋-输送机提取器。
蛋白质溶解中所使用的水性提取优选在盐溶液存在下进行。可使用所有种类的不同盐溶液，但优选地，盐是氯化钠。另一种合适的盐是氯化钾。优选地，盐溶液的离子强度为至少约0.10，更优选地至少约0.15，以能够造成显著量蛋白质被溶解。随着盐溶液的离子强度增加，源材料中蛋白质的溶解度起初增加，直至达到最大值。任何随后的离子强度增加不增加所溶解的总蛋白质。导致最大蛋白质溶解的食品级盐溶液的离子强度因所涉及的盐和所选择的蛋白质源而异。为了避免任何误解，本文所使用的术语“水性提取”或“水性溶液”指的是不含有机溶剂(例如甲醇、丙醇、异丙醇、四氢呋喃或己烷)的提取或溶液，因为这些溶剂作为用于人消耗的蛋白质提取物中的残留物是不期望的。因此，本文所述中间水性蛋白质溶液不或几乎不含变性蛋白质。
在一个优选的实施方式中，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，且其中所述水性提取包括水性盐溶液，优选的是离子强度至少0.10M的水性盐溶液，更优选的是离子强度至少0.15M的水性盐溶液。优选的范围是离子强度在0.10-0.8M范围内的水性盐溶液，或更优选地，离子强度在0.15-0.8M范围内的水性盐溶液。甚至更优选的是离子强度为0.43M的2％NaCl提取溶液。
含油种子粗粉与水性溶液的合适比率由本领域技术人员容易地确定，其通常在1∶5至1∶12的范围内。更优选的在1∶8-1∶10(w/w)范围内的比率。
溶解优选地在提高的温度、优选高于5℃、一般高至约65℃下进行。正确的上限将由待被提取的具体蛋白质的变性温度决定，并可由本领域技术人员容易地确定和调整。对于油菜籽，上限为约65℃。在另一优选的实施方式中，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，且其中所述水性提取在高于5℃、一般低于65℃的温度下进行。合适的温度范围为5-65℃。
在另一优选的实施方式中，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉在最低剪切条件下经受水性提取(优选重力引起的固-液提取)和任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，且其中所述水性提取包括水性盐溶液、优选离子强度在0.10-0.80M(更优选地是0.15-0.8M)范围内的水性盐溶液且其中所述水性提取在5-65℃范围内的温度下进行。
最高蛋白质产率的最适pH值因蛋白质来源材料(例如，溶剂处理的或冷压的，脱壳的或未脱壳的)而异，其通常高于pH 5.0且低于pH 8.0。对于提取的油菜籽蛋白质，约6.0-7.0的pH值是优选的。对于用于提取步骤，可通过使用任何便利的酸或碱将盐溶液的pH调节至约5-8.0范围内的任何期望值。优选地，在提取期间不调节pH，在这种情况下，pH自然达到约pH6的值。
最佳提取时间取决于所使用的实验设置，其可由本领域技术人员容易地确定。合适的提取时间可例如在约5-10分钟或更长的范围内。可接受的提取时间在30-60分钟的范围内。
水性提取优选以连续过程进行，从而赋予大规模通量。但分批或半连续提取也是合适的。半连续提取的一个例子是使用多个柱的提取，其中所述柱一个接一个被填充、提取和清空。
“任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液”步骤是否必要取决于所使用的温和/轻柔的提取方法。如果使用搅拌的容器(在低rpm值下运行)，则需要固/液分离以获得中间水性蛋白质溶液。可使用任何固/液分离技术，例如应用真空过滤，随后离心并/或过滤以除去残留的粗粉。
当在具有固定的穿孔底部的柱中采用渗透提取时(如实施例2中)，含油种子粗粉留在提取容器中，而提取液通常穿过含油种子粗粉床流动。在连续模式中，使用多个含油种子粗粉固定床。这些固定床以一个方向移动，而液流改变以实现液相和固相(含油种子粗粉固定床)的共流或逆流接触。使床暴露于液体持续给定量的时间，且在提取结束时，打开、冲洗含使用完的床的容器并用新鲜的含油种子粗粉填充。与此同时，几乎不含悬浮固体的液流不断离开提取单元。这种具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比的液体可任选地在被转移至收集容器之前被澄清，但通常不被收集。如果使用柱或管，则可使用任何上述的固-液分离技术。如果使用再循环渗透，则还可以使用最终柱或管，其具有某种被支持的过滤装置(例如打孔板或网筛)，液体可通过其离开柱或管。
本发明的方法优选在大规模基础上进行，例如每小时使用至少1-10kg或更多油菜籽粗粉的方法。优选地，本发明的方法每小时使用至少10kg含油种子粗粉。
通常在维持蛋白质溶液的离子强度基本恒定的同时进行浓缩步骤。最终的蛋白质含量例如为至少约50g/L，更优选地至少约200g/L，甚至更优选地至少约250g/L。换言之，通常进行浓缩直至达到5-20％的干物质值。
浓缩步骤可以通过任何与连续操作一致的便利方式来完成，例如应用任何便利的选择性膜技术，例如超滤，考虑到不同的膜材料和配置，使用具有合适的分子量截取值(例如从约3000道尔顿至约50000道尔顿)的膜(例如中空纤维膜或螺旋卷式膜)，其尺寸随着水性蛋白质溶液通过膜允许所述水性蛋白的期望浓缩程度。
浓缩步骤可在任何便利的温度(一般约20℃至约60℃)下完成，并持续一定时间以达到期望的浓缩程度。所使用的温度和其它条件在某种程度上取决于用于达到溶液浓度和期望的蛋白质浓度所使用的膜设备。
众所周知，超滤和类似的选择性膜技术允许低分子量物质通过，同时阻止高分子量物质通过。低分子量物质不仅包括食品级盐的离子物质，还包括从源材料中提取的低分子量材料(例如，碳水化合物、色素和抗营养因子)，以及任何低分子量形式的蛋白质。考虑到不同的膜材料和配置，通常选择膜的分子量截取值以确保保留大部分溶液中的蛋白质，同时允许污染物通过。
可通过本领域技术人员已知的任何方法进行洗涤步骤。在一个优选的实施方式中，通过渗滤进行洗涤。甚至更优选地，利用其离子强度低于中间水性蛋白质溶液的离子强度的洗涤缓冲液进行洗涤步骤(优选渗滤)。甚至更优选的是：
-用例如10体积的1-10％NaCl洗涤，任选地随后用例如5体积的≥0.001-1％NaCl洗涤，这导致蛋白质溶液的离子强度降低；
-在浓缩和洗涤步骤结束时，浓度高达10-25％、更优选地15-25％的干物质。
术语含油种子蛋白质混合物是指这样的蛋白质溶液，其是对中间水性蛋白质溶液至少进行浓缩和洗涤步骤的结果。
虽然产生的含油种子蛋白质混合物可以以液体形式使用和运输，但优选干燥含油种子蛋白质混合物。因此，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉经受重力引起的固-液提取，以及任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液；所述方法还包括干燥所述含油种子蛋白质混合物溶液以产生干燥的含油种子蛋白质混合物。可通过任何方便的技术来实现干燥，所述技术例如喷雾干燥、冷冻干燥、闪速干燥或真空转鼓干燥。在一个优选的实施方式中，通过喷雾干燥实现干燥。因此，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉经受重力引起的固-液提取，以及任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液；所述方法还包括喷雾干燥所述含油种子蛋白质混合物溶液以产生干燥的含油种子蛋白质混合物。优选的喷雾干燥参数可由本领域技术人员容易地确定，并且通常导致水分含量＜8％且颗粒粒径为80-600微米的干燥产品。
通过任何上述方法获得的含油种子蛋白质混合物具有完全可以接受的特征。通过向所述方法增加额外的步骤可以改善一些特征。额外方法步骤的实例有脱色步骤和/或降低微生物水平的步骤和/或脱乳脂步骤和/或多酚去除步骤。因此，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉经受重力引起的固-液提取，以及任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，以及任选地干燥所述含油种子蛋白质混合物；所述方法还包括脱色步骤和/或降低微生物水平的步骤和/或脱乳脂步骤和/或多酚去除步骤。
脱色步骤(或者色素去除步骤)通过使例如活性炭或其它色素吸附剂与任何液相接触来改善产品的颜色。优选地，脱色步骤使用亚硫酸盐(例如偏亚硫酸氢钠)，其在方法中的任何时间加入。优选地，将亚硫酸盐加入用于提取的溶液中。因此，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉经受重力引起的固-液提取，以及任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，以及任选地干燥所述含油种子蛋白质混合物；所述方法还包括脱色步骤和/或降低微生物水平的步骤和/或脱乳脂步骤和/或多酚去除步骤，其中通过向用于提取的液体中添加脱色剂来进行所述脱色步骤。脱色步骤中脱色剂的合适浓度可以由技术人员容易地确定。亚硫酸盐的合适浓度是最高0.05％的浓度。
优选地，尽可能降低微生物水平，优选地降低至总平板计数(TPL)≤103。这将改善产品的微生物指标，并且该步骤可以在方法中的任何时间进行。优选地，对中间水性蛋白质溶液(即在提取后直接)进行降低微生物水平的步骤。因此，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉经受重力引起的固-液提取，以及任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，以及任选地干燥所述含油种子蛋白质混合物；所述方法还包括脱色步骤和/或降低微生物水平的步骤和/或脱乳脂步骤和/或多酚去除步骤，其中对所述中间水性蛋白质溶液进行所述降低微生物水平的步骤。降低微生物水平的步骤的实例有细菌过滤或UHT处理。合适的UHT条件可由本领域技术人员容易地确定。合适的UHT条件的实例是在70-71.5℃下孵育15-20秒。
虽然进行的提取产生了具有非常有利的脂肪与蛋白质之比的中间水性蛋白质溶液，但有时可能有必要通过利用脱乳脂步骤来除去少量提取的脂肪。本领域技术人员能够选择合适的脂肪去除方法。一个例子是使用碟式离心机(disk stack centrifuge)。可以在方法中的任何时间进行脱乳脂步骤。优选地，在浓缩之前(例如在超滤之前)对中间水性蛋白质溶液进行脱乳脂步骤。因此，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉经受重力引起的固-液提取，以及任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，以及任选地干燥所述含油种子蛋白质混合物；所述方法还包括脱色步骤和/或降低微生物水平的步骤和/或脱乳脂步骤和/或多酚去除步骤，其中在浓缩之前进行所述脱乳脂步骤。如果微生物减少步骤也是期望方法的一部分，则在所述微生物减少步骤之后但在浓缩之前进行所述脱乳脂步骤。
对于某些应用，期望含油种子蛋白质混合物中含有多酚的量低。多酚可以通过多种不同的方法除去，本领域技术人员能够容易地选择合适的方法。一个例子是使用吸附树脂或离子交换树脂。优选地，使脱脂后获得的材料经受精细过滤(polish filtration)以产生不含颗粒的提取物。然后使清澈滤液通过填充有树脂(吸附树脂或IEX树脂)的柱。多酚被树脂材料捕获，并且蛋白质穿过树脂。优选地，在超滤之前进行所述多酚去除步骤。因此，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉经受重力引起的固-液提取，以及任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩并洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液，以及任选地干燥所述含油种子蛋白质混合物；所述方法还包括脱色步骤和/或降低微生物水平的步骤和/或脱乳脂步骤和/或多酚去除步骤，其中在浓缩之前进行所述多酚去除步骤。如果脱乳脂步骤也是所述方法的一部分，则在所述脱乳脂步骤之后进行所述酚去除步骤。
在一个优选的实施方式中，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：
(i)从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉经受重力引起的固-液提取，其中向用于提取的水性溶液中加入脱色剂；和
(ii)任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；
(iii)降低微生物水平的步骤；
(iv)脱乳脂步骤；
(v)多酚去除步骤；
(vi)所述方法还包括浓缩并洗涤经处理的中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液；和
(vii)任选地干燥所述含油种子蛋白质混合物。
为了避免任何误解，上文提供的步骤的编号意在表示进行所述方法的步骤顺序，即步骤(i)的产物被用作步骤(ii)中的起始材料，步骤(ii)的产物被用作步骤(iii)中的起始材料等。
在另一个更优选的实施方式中，本发明提供获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：
(i)从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有至少1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉经受重力引起的固-液提取，其中向用于提取的水性溶液中加入脱色剂；和
(ii)任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；
(iii)降低微生物水平的步骤；
(iv)通过使用碟式离心机的脱乳脂步骤；
(v)通过使用吸附树脂或离子交换树脂的多酚去除步骤；
(vi)所述方法还包括：使经处理的中间水性蛋白质溶液经受超滤和渗滤以产生含油种子蛋白质混合物溶液；和
(vii)任选地喷雾干燥所述含油种子蛋白质混合物。
术语“含油种子蛋白质分离物”在本文中用于指这样的蛋白质产物，其是通过从含油种子粗粉中提取蛋白质；浓缩产生的中间水性含油种子蛋白质溶液；从浓缩的蛋白质溶液中沉淀蛋白质和任选地干燥经沉淀、浓缩的蛋白质得到的。
在另一个实施方式中，本发明提供通过任何一种所述方法能够获得的含油种子蛋白质混合物。
此处通过利用下列非限制性实施例来阐释本发明。
实验部分
材料和方法
蛋白质含量
根据AOAC官方方法991.20牛奶中的(总)氮(AOAC OfficialMethod991.20Nitrogen(Total)in Milk)通过凯氏(Kjeldahl)方法来测定蛋白质含量，使用换算因数6.25来确定蛋白质的量(％(重量/重量))。
水分含量
根据：食品化学法典(Food Chemical Codex)，第7版，一般试验和测定(Generaltests and assays)，附录II，第1133-1134页来测定水分含量。
脂肪含量
根据AOCS第6版，Ce 1-62来测定脂肪含量。
蛋白质提取率
蛋白质提取率被定义如下
脂肪提取率
脂肪提取率被定义如下
脂肪与蛋白质之比
脂肪与蛋白质之比被定义如下
其中，RC代表油菜籽饼的量，DM是油菜籽饼干物质含量，X蛋白质，DWB是作为干物质的分数的油菜籽饼蛋白质含量，Y蛋白质，提取物是蛋白质提取率，X脂肪，DWB是是作为干物质的分数的油菜籽饼脂肪含量且Y脂肪，提取物是脂肪提取率。
或者，脂肪与蛋白质之比被定义如下：
脂肪：蛋白质->每X份蛋白质中1份脂肪
提取后的脂肪与蛋白质之比：通过压榨脱脂和溶剂处理的油菜籽饼相比于冷压的油菜籽饼
图1展示了对于脱脂溶剂处理的油菜籽饼(图1A中1％；图1B中2.6％；图1C中5％的油含量(以％DWB计))和冷压的饼(图1D)，作为蛋白质提取率的函数的脂肪与蛋白质之比。冷压饼被用来产生本发明中所示的实施例。基于干重(DWB)，脱脂的溶剂提取的油菜籽饼的典型油含量在1-5％的范围内，通常约3％DWB[Shahidi F，Canola and Rapeseed：Production，Chemistry，Nutrition and Processing Technology.1990Van NostrandReinhold，ISBN 0-442-00295-5和Rozenszain等人，WO 2012/135955A1]。相比之下，冷压的油菜籽饼具有基于DWB在10-25％范围内的油含量[Rozenszain等人，WO 2012/135955A1]。
我们的研究中所使用的脱壳的冷压油菜籽饼具有分别为约17％和38％的油含量和蛋白质含量。
图1A
由图1A能够看出：利用基于DWB具有1％的油含量的脱脂的溶剂处理的油菜籽饼理论上能够得到在0.3％-0.5％(利用方程4计算出为1∶333-1∶200)范围内的脂肪与蛋白质之比。然而，这种相对低的值仅仅在油提取率落在5-10％的范围内且蛋白质提取率位于0.5-0.70范围内时可信。但这种情况的可能性很小，因为在非变性条件下，脱脂的溶剂处理的粗粉的蛋白质水性提取率已被报道为在0.30-0.50范围内[Klockeman等人，Journal ofAgricultural and Food Chemistry，45(1997)3867-3870]，且搅拌容器系统中的油提取率不太可能低于10％。因此，使用基于DWB具有1％的油含量的脱脂的溶剂处理的粗粉获得的脂肪与蛋白质之比极有可能高于0.5％，最可能高于1％(图1A)。
图1B和1C
考虑到上述蛋白质提取率和油提取率的限制，当使用2.6％和5％时，预期脂肪与蛋白质之比分别高于3％(图1B)和4％(图1C)。
图1D
在冷压粗粉的情况下，预期脂肪与蛋白质之比高于5％(图1D)。当采用渗透/温和提取时，数据显示：低于0.4％的脂肪与蛋白质之比是可行的(参见表2)。
实施例1(现有技术)
该实施例描述了常规现有技术的水性提取方法的结果。将600g脱壳的冷压油菜籽饼加入3000g不含氯化钠或含有浓度为2％(重量/重量)的氯化钠的含水溶液中。通过以150RPM搅拌溶液来产生悬浮物。在15℃或50℃下进行提取。混合60分钟。然后，通过在4℃下离心30分钟使悬浮物分级。离心导致使用完的饼(depleted cake)与水性提取物和提取的脂肪分离。通过使用150-250μm的筛子筛选来使水性提取物和脂肪分离。表1展示了：就蛋白质和脂肪含量而言，提取物的组成；以及脂肪和蛋白质的提取率。如材料和方法部分中所述来确定蛋白质和脂肪的提取率。
表1：搅拌的容器提取：产率和提取物组成
a)利用方程(3)估算
b)利用方程4计算
本领域技术人员能够由以％表示的脂肪与蛋白质之比计算以[1：X]表示的脂肪与蛋白质之比。例如，如果脂肪/蛋白质(％)为34.10，这表示：存在0.341脂肪和1蛋白质。需要将脂肪值0.341通过除以0.341而变成1，并对蛋白质值也这样做，即，将1除以0.341，从而产生蛋白质值2.93。
由该实验能够得出如下结论：(a)对于固定的混合速度和搅拌器类型，脂肪提取率几乎对温度和盐浓度不敏感；和(b)对于给定的提取温度，脂肪与蛋白质之比随提取盐浓度的增加而降低。这种降低通过蛋白质提取率增加被合理解释，其中对于给定的提取温度，其作为盐浓度的函数增加。
实施例2(本发明的方法)
该实施例阐释了本发明的方法。
将12kg脱壳的冷压油菜籽饼装入内径为56cm的带夹套不锈钢柱中。柱底部和顶部的转接器配备有5μm的柱筛。单独配制150L 2％(重量/重量)的氯化钠水溶液。将该溶液设置为温度为50℃，随后用泵使其通过含有脱壳的冷压油菜籽饼的柱。在泵送水性盐溶液之前，将柱的温度调节至50℃。再循环液体持续2小时。然后，分析澄清液体的蛋白质和脂肪。表2展示了利用和不利用水性盐溶液的再循环，使用不同量的脱壳的冷压油菜籽饼获得的结果。使用20g的实验在内径为5cm的带夹套柱中完成且使用1kg的实验使用带夹套的赛氏滤器来完成。
表2：在50℃、2％(重量/重量)的NaCl浓度下，从脱壳油菜籽中渗透提取蛋白质
b.d.1：低于检测极限
a)利用方程(3)估算
表3：参见表2，但现在利用以[1∶X]表示的脂肪与蛋白质之比
由这些数据可以得出如下结论：与在机械混合下提取(参见实施例1)相比，利用最低剪切(无机械混合)提取导致相当的或甚至更高的蛋白质提取率，和相对低的脂肪提取率。因此，通过利用温和提取，产生具有低于或等于0.5％的脂肪/蛋白质比率的提取物。换言之(表3)，实施例2中所使用的温和提取的类型导致至少为1∶200的脂肪与蛋白质之比[1∶X]。
实施例3(现有技术)
该实施例描述了常规现有技术(搅拌的容器)水性提取方法的结果。
设置
搅拌的容器装置由体积为4L的双壁容器组成。容器的内径为14.5cm，这等于容器被填满时液体的高度。不安装挡板。利用配备有带数字屏的发动机的上封头的搅拌器来控制搅拌，所述数字屏提供精确的搅拌器速度(以RPM计)。叶轮位于液体高度的中间(距离底部7cm)。所使用的速度是100rpm。使用水浴来控制温度。所应用的溶剂是去离子水，大多含有30mM的磷酸(钾)缓冲液。手动测量pH，且如果需要，利用4M HCl和4M NaOH来设置和调节pH。在将水性溶剂加入容器中并使其处于恰当的温度和缓冲强度下之后，将油菜籽饼材料转移至容器中。
分析
基于凯氏(Kjeldahl)方法来测定蛋白质含量，使用乘法因数6.25来确定蛋白质的量(％(重量/重量))。通过使用红外线天平或在105℃的烘箱中过夜孵育来干燥至恒重，从而测定干重。利用脂肪酸甲酯(FAME)分析来测定样品中的脂肪含量。
结果
在表4中，可以看到随时间和在不同温度下的蛋白质与脂肪之比。结果还在图2中被描述。结果显示：在所有情况下，脂肪与蛋白质之比均低于11；在提取多于1小时之后，比率均低于8.2且平均值为5.7。
表4：在搅拌的容器中期间的脂肪与蛋白质之比[1∶X]，通过利用方程(4)来确定值
实施例4：现有技术实例
实验设置
将油菜籽饼与提取溶剂(工艺用水)混合以增加蛋白质溶解度。提取变量为提取温度、pH、添加剂和混合技术。参数描述于表5中。
表5：实施例4的实验参数
分析
利用凯氏(Kjeldahl)方法(流动注射分析)来测定蛋白质含量。将氮含量转换为蛋白质含量所使用的计算因数为6.25。
使用Mettler Toledo HG53Halogen湿度分析器来进行干物质分析(2g样品在一次性玻璃纤维过滤器上，105℃)。
通过脂肪酸甲酯(FAME)分析来测定脂肪。
运行1
在运行1中，使用带有小螺旋桨型搅拌器叶片的顶置式搅拌器将(60kg)油菜籽饼混入含水相中。所应用的搅拌器速度非常高(950rpm)。
运行2
在较低的混合剪切(由于较低的搅拌器速度)和高温(为了避免提取中微生物生长)下，虽然提取物中的脂肪水平比之前实验中低，但蛋白质与脂肪之比未充分提高。
表6总结了来自实施例4的所有数据。
表6：来自实施例4的数据
实施例5：根据本发明的实施例(温和提取)
分析
通过离心(10分钟，4000g)样品来制备样品，分析上清液中的干物质、脂肪和蛋白质。基于凯氏方法来测定蛋白质含量，使用乘法因数6.25来确定蛋白质的量(％(重量/重量))。通过使用红外线天平或在105℃的烘箱中过夜孵育来干燥至恒重，从而测定干重。利用脂肪酸甲酯(FAME)分析来测定样品中的脂肪含量。
实验设置
测试运送(conveyance)对脂肪和蛋白质提取的影响。使用2L的量筒(内径为10cm，高度为35em)作为液体和油菜籽饼的容器。在室温下使用200g筛过的油菜籽饼和1800g 2％的NaCl溶液。使用两种设置：
·低频率混合：每30分钟旋转量筒180°并折回(总时间：150分钟)
·高频率混合：每5分钟旋转量筒180°并折回(总时间：150分钟)
该实施例不包括机械混合和/或搅拌。
表7：150分钟后的蛋白质与脂肪之比
温和提取导致至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比[1：X]。
实施例6：根据本发明的实施例(温和提取；逆流)
方法
级联或多级提取器的原理是在如下系统中的温和的(温度范围为10-60℃，pH为6-7)逆流提取，所述系统为油菜籽颗粒提供充足降落高度以使完全破碎并允许油菜籽蛋白质最大程度地溶解。基本上，它涉及：在高的圆柱形容器的顶部定量加入油菜籽饼，并从容器的底部注入提取液。油菜籽饼颗粒将水化并在穿过圆柱状物沉降时破碎。使用完的颗粒将沉积在容器的底部，其中浓缩的固体级分通过蠕动泵被抽走。由于溢出机制，饱和液体将从容器的顶部被收集。
图3示意性提取柱的说明
将管底部的沉积物收集在狭窄的转接器中，并可建立起水化固体床。床的高度由固体清除泵被激活的时刻和固体清除流决定。
通过硅管和固体清除泵1(P1)，称为“固体1”的固体级分被运送至第二个管的顶部。在管2(阶段2)中，固体将仍沉积，且将在管2的底部浓缩。通过另一个蠕动泵(P2)和硅管，称为“固体2”的使用完的固体将从系统中被清除。
提取溶剂是2％的NaCl溶液，其通过蠕动泵(P3)被注入靠近第2个管底部的入口。该泵的流速决定了NaCl溶液的输入流。在操作之前，利用2％的NaCl溶液填充管。管的体积为约9L。阶段2的提取物(称为“提取物1”)通过位于管1顶部的溢出结构从管中被清除。应用隔膜来限制固体进入提取物流。将提取物1收集在充当缓冲储蓄池的较小管中以避免空气被引入管1中(如果提取物1的清除比离开管2的提取物流快)和管2的溢出(如果储蓄池充满后(体积为约1L)，离开管2的提取物流比提取物1的清除快)。提取物1通过第4个蠕动泵(P4)被运送至管2中。在运行期间调节该泵的流速以安排储蓄池的部分填充。
提取物1被注入位于管2底部的入口。管2也配备有溢出系统。来自管2的提取物作为产物流被收集，其被称为“提取物2”。
材料
NaCl(GEF盐，批次：U-09143，SupraSel精盐)
油菜籽饼：Teutoburger(TO)，批次：P071410
DIVOS 117，7509021，批号：RSA09014
Gronfa 200 1容器(04198)
Reko筛弓(sieve bow)(ZBM0304/001/W)
天平：
Mettler Toledo PR8002(F-BB-133)
Ohaus DA(F-BB-174)
Sartorius TE 12000(F-BB-197和D-BL-080)
温度控制：
Julabo F12(F-BW-145)和F25(D-BW-129)水浴
Thermomix BU(T-BW-08)
热交换器
泵：
Watson Marlow泵520U(D-SP-045)和520S(D-SP-054)
Watson Marlow泵603U(I-SP-044)和603S(I-SP-002)
Masterflex泵7
Watson Marlow泵501U(I-AE-041)
Mettler Toledo Halogen湿度分析器HG63(F-BL-014)
筛：1.4mm
离心机Harrier 18/80(F-CF-064)
Retch Vibra漏斗(F-OA-023)
运行
为了测试系统的生产力，将NaCl溶液的流速增加至约30L/小时。为了维持提取物的固体含量，将油菜籽的剂量速率增加至500g/小时。在实验开始时激活固体清除泵P1和P2，但调节流速以允许床的建立。床的尺寸为管体积的约50％。在这种床尺寸下，增加泵P1和P2的流速直至床的尺寸稳定(约6L/小时)。
在左侧管的顶部手动加入油菜籽饼。由于油菜籽饼的颗粒尺寸分布非常广泛(在μ范围直至若干mm)，所以使用之前，穿过1.4mm筛筛选油菜籽饼。
手动进行油菜籽饼的定量加入，其中借助于振动漏斗以安排随时间逐渐定量加入。每10分钟用固定量的油菜籽饼填充储蓄池，调节振动频率以在10分钟间隔内加入该剂量。由于油菜籽饼的性质，定量加入无法被安排为比5-10分钟更精确。
分析
利用凯氏方法(流动注射分析)来测定蛋白质含量。将氮含量转换为蛋白质含量所使用的计算因数为6.25。
使用Mettler Toledo HG53Halogen湿度分析器来进行干物质分析(2g样品在一次性玻璃纤维过滤器上，105℃)。
通过脂肪酸甲酯(FAME)分析来测定脂肪。
结果
表8：实施例6的数据(1个柱的体积为9升)
再循环渗透的使用导致脂肪与蛋白质之比[1∶X]为至少1∶20。重复的实验导致脂肪与蛋白质之比[1∶X]在1∶20-1∶30范围内。
实施例7：根据本发明的实施例(温和提取)
材料
NaCl(Merck批次：N10-0305)
冷压的油菜籽饼
实验设置
提取：
在4L 2％NaCl溶液中提取400g油菜籽饼。这通过在水浴(30-55℃)中孵育存储在封闭烧瓶中的提取混合物来进行。
使用中频率混合：每15分钟旋转烧瓶180°并折回。
总时间：30分钟。
该实施例不包括机械混合和/或搅拌。
过滤：
在0.1bar真空下通过30mμ过滤器过滤提取混合物。每个循环处理200cm3提取混合物。
这种温和提取导致脂肪与蛋白质之比[1∶X]为至少1∶12。
将获得的经过滤的提取物储存在冰箱中用于第二天脱脂。
脱脂：
通过离心使经过滤的提取物脱脂，其中除去脂肪(上层)。
浓缩经脱脂的提取物直至达到10％干物质(浓缩系数为～6)。
通过用1-3体积的1-10％NaCl洗涤浓缩物，然后用1-3体积的≥0.001-1％NaCl洗涤来洗涤(渗滤)浓缩物，这导致含油种子蛋白质混合溶液的离子强度降低。
总共获得300g浓缩物，其干物质含量为10％。
在干燥器中干燥所述含油种子蛋白质混合物浓缩物，产生了基于干物质纯度为92％蛋白质的干燥含油种子蛋白质混合物产物。

Claims (15)

1.一种用于获得含油种子蛋白质混合物的方法，所述方法包括：从含油种子粗粉生产中间水性蛋白质溶液，所述中间水性蛋白质溶液具有至少为1∶12的脂肪与蛋白质之比，其包括使基于干物质具有至少8％的油含量的含油种子粗粉经受重力引起的固-液提取，以及任选地收集产生的中间水性蛋白质溶液；所述方法还包括浓缩和洗涤所述中间水性蛋白质溶液以产生含油种子蛋白质混合物溶液。
2.根据权利要求1的方法，其中利用离子强度低于所述中间水性蛋白质溶液的离子强度的洗涤缓冲液进行所述洗涤。
3.根据权利要求1或2的方法，所述方法还包括：干燥所述含油种子蛋白质混合物溶液以产生干燥的含油种子蛋白质混合物。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，所述方法还包括脱色步骤和/或降低微生物水平的步骤和/或脱乳脂步骤和/或多酚去除步骤。
5.根据权利要求4的方法，其中通过向用于提取的液体中添加脱色剂来进行所述脱色步骤。
6.根据权利要求4的方法，其中对所述中间水性蛋白质溶液进行所述降低微生物水平的步骤。
7.根据权利要求4的方法，其中在浓缩之前进行所述脱乳脂步骤。
8.根据权利要求4的方法，其中在浓缩之前进行所述多酚去除步骤。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述含油种子粗粉是冷压的含油种子粗粉。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述重力引起的固-液提取包括固体不被或几乎不被机械搅拌的提取。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述重力引起的固-液提取包括渗透和/或浸入。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中利用水性溶液通过喷洒渗透、浸入渗透、固体分散或正压渗透或再循环渗透或多级渗透或其组合来提取所述含油种子粗粉。
13.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述渗透是再循环渗透。
14.根据权利要求1-13中任一项的方法，其中所述提取包括水性盐溶液，优选包含在0.10-0.8范围内的离子强度的水性盐溶液。
15.根据权利要求1-14中任一项的方法，其中所述提取在5-65℃范围内的温度下进行。
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