CN107043784A - 一种慢病毒载体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种慢病毒载体的制备方法。本发明提供一种慢病毒载体的制备方法，包括如下步骤：（1）将含有慢病毒载体基因组序列的质粒转染入培养细胞；（2）培养步骤（1）所得细胞，收集细胞培养上清液，即为慢病毒载体培养液；（3）将步骤（2）培养所得的慢病毒载体培养液进行切向流过滤，所得切向流过滤滤液纯化后即得慢病毒载体产品。本发明生产的慢病毒载体产品具有高质量和高稳定性的特点，符合cGMP级（临床级）相关标准（标准来源中国药典和美国FDA），可用于I、II期临床实验以及国内外的学术研究、医疗机构的临床研究和规模化生产等。

Description

一种慢病毒载体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种慢病毒载体的制备方法。

背景技术

慢病毒载体(Lentivirus vector，LVs)是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒载体既可以感染处于有丝分裂活跃期的细胞，又可感染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞，包括造血干细胞，神经干细胞，处于分化终末的神经元，肝实质细胞等。在体外培养细胞实验和体内移植实验中，由慢病毒载体携带导入的目的基因可以得到长期而稳定的表达。此外，慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低。经过改建后的慢病毒载体可以容纳约10kb左右的外源基因，因此大多数的cDNA都能被克隆入慢病毒载体。这些优点使慢病毒载体成为体内和体外基因转移的一种有效工具。

慢病毒是一种有包膜结构的病毒，纯化工艺比较复杂，整个过程都要严格在低温环境下进行以保证病毒活性不受影响。不同的纯化工艺对最终慢病毒样品的纯度和质量起着重要作用，因此也影响了其最终应用范围的大小。慢病毒纯化工艺的选择对慢病毒产品的生产成本、生产时间和质量存在较大影响。目前，纯化慢病毒的方法主要分为四大类：物理方法、化学方法、生物方法以及分子筛方法。其中，超速离心法(物理学方法)和超滤法(分子筛方法)是应用最为广泛的慢病毒纯化方法。然而，通过这样的方法制备的慢病毒样品含有较多的宿主细胞成分、空的病毒衣壳蛋白和未被病毒衣壳蛋白包被的病毒核酸。这些非病毒杂质包括宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白、包含血清的培养基蛋白和来自病毒包装的残留的质粒DNA等。因此，最终制备的慢病毒产品可转导的宿主范围也较小，不适合动物实验/体内注射等临床级实验。开发多种慢病毒纯化工艺并满足细胞级、科研级和医疗级等不同级别的实验需求，是应用慢病毒产品进行科学研究的工作者的必然需求，尤其是符合cGMP级(临床级)的慢病毒产品的制备工艺的开发。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种慢病毒载体的制备方法及其用途，用于解决现有技术中的问题。本发明所提供的慢病毒载体的制备方法可制备高滴度和高纯度的慢病毒载体颗粒，且制备获得的慢病毒载体颗粒可应用于真核细胞的转导。由于具有高滴度和高纯度，本发明所提供的慢病毒载体的制备方法制备获得的慢病毒载体颗粒能够有效减少在转导真核细胞时引起的转导细胞死亡、生长抑制等有害表型的发生。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种慢病毒载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)将含有慢病毒载体基因组序列的质粒转染入培养细胞；

(2)在合适的条件下培养步骤(1)所得细胞，收集细胞培养上清液，即为慢病毒载体培养液；

(3)将步骤(2)培养所得的慢病毒载体培养液进行切向流过滤，所得切向流过滤滤液纯化后即得慢病毒载体产品。

优选的，所述步骤(1)中，慢病毒载体基因组序列分别位于三个不同的载体质粒上，三个载体质粒分别为：pHelper 1.0、pHelper 2.0、pLenti-EGFP。

所述pHelper 1.0含有病毒核心蛋白(gag)编码序列和病毒复制所需酶类(pol)编码序列；所述pHelper 2.0含有VSV-G(水疱性口炎病毒糖蛋白G)包膜蛋白编码序列；所述pLenti-EGFP含有慢病毒进行正常的生命活动所需的顺式作用序列的编码序列(如psi包装信号、整合信号、病毒启动子、增强子和多腺苷酸环化序列等)。pHelper 1.0、pHelper 2.0、pLenti-EGFP均为市售质粒，可购自上海吉凯基因化学技术有限公司。

优选的，所述步骤(1)中，所述培养细胞选自HEK293T。

所述步骤(2)中，本领域技术人员可根据培养细胞的种类，选择合适的培养条件对细胞进行培养，并在合适的时机收集细胞培养上清液，以最大程度降低初始污染物(包括核酸污染物(主要指DNA污染物)和蛋白污染物等)，并保证病毒粗提液(又称为细胞培养上清液)中有活性的病毒颗粒的水平。例如，可根据实际情况选择是否用无血清进行包装，可在有或没有氯喹或丁酸钠等诱导的情况下进行生产，且细胞培养上清液可以在转染后的多个时间点进行收集，如可在转染后48h/72h一次性收获或者分别于48h和72h各收获一次等。不同生产批次获得的慢病毒粗提液和最终产物的质量可通过测量纯度、滴度及安全性进行控制。

在本发明一实施例中，培养的具体条件为：采用DMEM培养基于37℃恒温培养，转染5-7h后，将细胞培养液换成无血清培养基或含FBS的DMEM培养基，并将细胞置于37℃，5％CO₂和饱和湿度的环境中继续进行培养，并收集培养所得的细胞上清液。优选的细胞上清液收集方案为，于转染48h后，收集含有慢病毒载体颗粒的细胞培养上清液，并加入细胞生长维持液，所述细胞生长维持液为常规的无血清培养基或添加了FBS的DMEM培养基，加入细胞生长维持液的72h后，再次收集细胞培养上清液。所得上清液(毒液)可立即进行后续的慢病毒载体的纯化和浓缩步骤，也可短暂放于4℃冰箱以备后用。

优选的，所述步骤(2)中，步骤(1)所得细胞在氯喹存在的条件下进行诱导培养，培养液中氯喹的浓度为20-30mmol/L。

为了尽量减少重组事件和可复制型慢病毒的生产，本发明中优选地将慢病毒的基因组序列分别克隆到了三个不同的载体质粒上面，使用辅助质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0和穿梭质粒pLenti-EGFP共转染HEK293T生产细胞，以在上清液中产生非复制型慢病毒载体颗粒。第一个载体质粒是辅助质粒pHelper 1.0，编码病毒核心蛋白(gag)和病毒复制所需酶类(pol)。第二个载体质粒是辅助质粒pHelper 2.0，编码VSV-G(水疱性口炎病毒糖蛋白G)包膜蛋白。第三个载体质粒是穿梭质粒pLenti-EGFP，提供了慢病毒进行正常的生命活动所需的psi包装信号、整合信号、病毒启动子、增强子和多腺苷酸环化序列等顺式作用序列。将这样的辅助质粒和穿梭质粒共转染HEK293T生产细胞以在上清液中产生非复制型慢病毒载体颗粒。

优选的，所述步骤(3)中，慢病毒载体培养液进行切向流过滤前，还使用微孔过滤器(属于滤膜过滤器)过滤慢病毒载体培养液。

更优选的，所述步骤(3)中，所述微孔过滤器的孔径为0.4-0.5μm，在本发明一实施例中，所述微孔过滤器的孔径为0.45μm。

更优选的，所述步骤(3)中，所述微孔过滤器为PES过滤器。

优选的，所述步骤(3)中，所述切向流过滤的具体条件为：使用截留分子量(MolecularWeight CutOff,MWCO)为100-300kDa的中空纤维柱，上样1-30L，流速0.1-5L/min，透过速度20-2000g/min，温度为室温。

优选的，所述步骤(3)中，将步骤(2)培养所得的慢病毒载体培养液进行切向流过滤时，先通过切向流过滤系统将慢病毒载体培养液浓缩，回收浓缩液后，再对切向流过滤系统进行洗脱，合并浓缩液和洗脱液，以获得切向流过滤滤液。

在本发明一实施例中，将步骤(2)所得的慢病毒载体培养液浓缩至其原体积的约1.5-6％。

进一步优选的，对切向流过滤系统进行洗脱时所使用的洗脱液为PBS缓冲液和/或DMEM培养基，更优选为pH范围在7.0-7.4的PBS缓冲液，进一步优选为pH＝7.2的PBS缓冲液。

在本发明一实施例中，洗脱液的使用量为步骤(2)所得的慢病毒载体培养液体积的约1.5-6％。

经过切向流过滤处理的慢病毒颗粒产品，其核酸污染物的相对去除率为66.2％，蛋白污染物的相对去除率为71.4％。(相对于未经过切向流过滤处理的慢病毒载体培养液)纯化所得的慢病毒载体颗粒能够转导永生化的细胞系、原代细胞和干细胞而不影响其生存活力，且不影响干细胞的分化能力。

优选的，所述步骤(3)中，切向流过滤所得产物还进一步进行纯化、浓缩，所述进一步进行纯化的方法选自阴离子交换层析法和/或凝胶层析法。

所述阴离子交换层析法可选用本领域各种适用于慢病毒载体纯化工艺的阴离子交换层析工艺。

所述凝胶层析法可选用本领域各种适用于慢病毒载体纯化工艺的凝胶层析工艺。

进一步优选的，所述切向流过滤所得产物还进一步进行纯化、浓缩，所述进一步进行纯化的方法为：将切向流过滤所得产物进行阴离子交换层析，再进行凝胶层析。

阴离子交换层析后所得的产物相比于上游切向流纯化工艺所得的产物，核酸污染物的相对去除率为96.7％，蛋白污染物的相对去除率为95.1％。

凝胶层析后所得的产物相比于上游阴离子交换层析工艺，核酸污染物的相对去除率为11.4％，蛋白污染物的相对去除率为0.0％。凝胶层析后所得的产物与初始的慢病毒载体培养液(切向流过滤前)相比，核酸污染物的相对去除率为11.4％，蛋白污染物的相对去除率为98.6％。凝胶层析后所得的产物多项检测结果均符合GMP标准，表明由此工艺纯化的慢病毒载体颗粒能够应用于动物实验/体内注射。

本发明第二方面提供所述慢病毒载体的制备方法在慢病毒载体制备领域的用途，具体为cGMP级慢病毒载体制备领域的用途。

本发明利用第二代三质粒慢病毒包装系统作为慢病毒载体的生产制备系统，探索建立一种可应用于临床治疗的cGMP级慢病毒的制备工艺和相应的检测平台。

本发明生产的慢病毒载体产品具有高质量和高稳定性的特点，符合cGMP级(临床级)相关标准(标准来源中国药典和美国FDA)，可用于I、II期临床实验以及国内外的学术研究、医疗机构的临床研究和规模化生产等。所述慢病毒载体颗粒，经活性滴度和物理滴度检测、核酸残留、血清蛋白残留、LDH(乳酸脱氢酶)检测、RCL(复制型慢病毒)检测、无菌检测和支原体检测等多种检测手段验证了其滴度、纯度和使用安全性。根据本发明的制备工艺而制备的慢病毒载体颗粒可用于动物实验/体内注射，转导真核细胞(这些细胞包括永生化细胞系、原代细胞和干细胞，转导时不影响其生存力)，将目的基因转入靶细胞中，并有效地整合到宿主细胞基因组中而实现持续、稳定的表达，且能达到良好的基因表达或RNAi干扰等作用，并能够有效减少在转导真核细胞时引起的转导细胞死亡、生长抑制等有害表型的发生。

附图说明

图1A-C分别显示为辅助质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0及pLenti-EGFP质粒图谱。

图2显示为本发明慢病毒载体生产流程图。

图3显示为本发明慢病毒载体纯化工艺步骤的流程图。

图4显示为活性滴度检测操作流程示意图。

图5显示为LDH检测结果示意图。

图6显示为RCL检测的DNA琼脂糖凝胶电泳结果图。

图7显示为支原体检测试剂盒检测支原体污染的DNA琼脂糖凝胶电泳结果图。

图8显示为慢病毒载体产品I、II、III、IV感染HEK293T细胞结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

cGMP级慢病毒载体颗粒的制备，包括以下步骤：

(1)HEK293T细胞的培养：

慢病毒载体颗粒的生产是在10层CellFactory(6320cm²,NUNC)中进行的。将HEK293T细胞以每孔2×10⁵/cm²的密度接种在含10％FBS的DMEM培养基中，并置于37℃，5％CO₂和饱和湿度的环境下进行培养，接种3天后实施转染。

(2)HEK293T细胞的转染：

转染前，配制580ml含2％FBS的DMEM培养基，并加入氯喹至终浓度为20-30mmol/L。配制磷酸钙转染体系：往5mlOpti-MEM内依次加入5865μgDNA质粒(pHelper 1.0：pHelper2.0：pLenti-EGFP＝15:12:24)，然后加入5750μl的2.5M CaCl₂，最后在搅拌振荡器上逐滴加入60ml 2x HBS。转染体系配制完毕后，加入到细胞培养基内，然后将CellFactory内的培养基更换为新混合好的细胞培养物。颠倒摇匀后放入培养箱内37℃恒温培养以为慢病毒载体颗粒的生产提供合适的培养环境。转染6h后，将细胞培养液换成1400ml含2％FBS的DMEM培养基，并将细胞置于37℃，5％CO₂和饱和湿度的环境中继续进行培养)。并采用DMEM培养基于37℃恒温培养，以为慢病毒载体颗粒的生产提供合适的培养环境。转染6h后，将细胞培养液换成1400ml含2％FBS的DMEM培养基，并将细胞置于37℃，5％CO₂和饱和湿度的环境中继续进行培养。

(3)细胞培养上清液的收集：

HEK293T细胞转染48h后，收集含有慢病毒载体颗粒的细胞培养上清液，并加入细胞生长维持液，维持液采用1400ml含2％FBS的DMEM培养基。在加入细胞生长维持液的72h后，再次收集细胞培养上清液。将两次收集到的毒液合并后准备做后续的纯化和浓缩步骤。

(4)慢病毒载体颗粒的纯化：

首先将合并后的慢病毒上清液通过直径为0.22μm的PES滤器过滤(milipore)，以进行慢病毒载体颗粒的初步澄清，获得毒液(I)2800ml。接着，将回收的澄清毒液(I)用中空纤维切向流过滤系统Versa flux 13(上样1-30L，流速0.1-5L/min，透过速度20-2000g/min，温度25℃)做进一步的纯化和浓缩，获得纯化和浓缩后的150ml病毒液，然后向纯化系统内加入PBS(hyclone)150ml，使PBS在中空纤维切向流过滤系统循环10-20min，然后再次回收洗脱下的病毒液150ml，与第一次收集获得的150ml病毒液合并后，获得毒液(II)300ml(将此处300ml病毒液，加入1-25KU的全能核酸酶，4℃过夜酶切，进一步去除核酸。

回收后的产品通过阴离子交换柱(capto Q,330ml,GE Healthcare)进行层析，阴离子交换层析在蛋白纯化系统(GE Healthcare)上完成，操作方法可参照产品说明书。具体操作过程包括泵清洗、安装层析柱、上样、洗脱、峰样品收集、清洗和卸下层析柱等主要实验流程，获得毒液(III)10ml。如此回收的产品(III)可通过凝胶层析柱(s300hr,900ml,GEHealthcare)而得到进一步的浓缩和分离纯化，凝胶层析过程也是在蛋白纯化系统上完成的，操作方法可参照产品说明书。具体操作过程同阴离子交换层析，至此即得到了纯化和浓缩的慢病毒产品(IV)10ml。(回收后的产品也可先通过凝胶层析(G-25，1L,GE Healthcare)，脱盐换为阴离子交换的缓冲液，在蛋白纯化系统(GE Healthcare)上进行，所得产物再通过阴离子交换柱(capto Q,330ml,GE Healthcare)进行层析，阴离子交换层析在蛋白纯化系统(GE Healthcare)上完成而得到进一步的浓缩和分离纯化，操作方法可参照产品说明书)

实施例2

对实施例1制备的慢病毒载体颗粒进行活性滴度和物理滴度检测、核酸残留检测、血清蛋白残留检测、LDH检测、RCL检测、无菌检测以及支原体检测。

(1)活性滴度检测：

将HEK293T细胞以每孔2×10³个细胞的密度接种于96孔板中，用含10％FBS的DMEM培养基进行培养。细胞铺板24h后，根据最佳MOI值将不同纯化工艺步骤获得的慢病毒载体颗粒产品I、II、III、IV分别转导细胞。对于I、II、III、IV四组样品，分别用含10％FBS的DMEM培养基进行连续五次10倍梯度稀释(MOI＝10)。并为每组样品添加一孔未转导的空细胞作为对照。转导24h后，向每孔细胞补充100μl含10％FBS的DMEM培养基。转导72h后，将96孔板置于Celigo全视野细胞扫描分析仪中，以对每组样品的荧光表达进行计数并拍照。最后通过计算获得慢病毒载体颗粒样品的滴度(单位TU/ml)，具体结果如表1A所示。

(2)物理滴度检测：

通过p24 ELISA对慢病毒载体颗粒的物理滴度进行定量。IBL International GmbH提供的HIV-1 p24 ELISA试剂盒采用双抗体夹心法检测样品中的p24蛋白水平。该试剂盒提供了预先包被了p24抗体的96孔微孔酶标板。根据供应商的说明书依次加入待测样品(产品I-IV)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，一起孵育后彻底洗涤。然后，加入底物TMB显色，TMB在HRP的催化作用下转化成蓝色，并最终在酸性终止液的作用下转化成黄色。最后，用BioTek酶标仪于15min内在450nm处测定各样品孔的吸光值，并根据标准曲线计算待测慢病毒载体样品中的p24蛋白浓度(PP/ml)，具体结果如表1A所示。

表1A

(3)核酸残留检测：

3.0荧光定量仪和灵敏特异的定量试剂盒用来测定慢病毒载体样品中的核酸残留。荧光定量仪采用荧光染料与特异性的靶分子结合。这些荧光染料只有与这些靶分子结合时才会发射荧光信号，即使在浓度很低时。因而能够精确定量靶分子的浓度。获取待测病毒样品后即可按照生产商提供的方案进行核酸残留检测，以表征不同纯化工艺步骤获得的慢病毒载体颗粒产品I、II、III、IV中游离于完整病毒颗粒以外的核酸残留总量(主要为DNA)。具体结果如表1B所示：

表1B

(4)血清蛋白残留检测：

使用牛血清白蛋白酶联免疫试剂盒定量检测慢病毒载体样品中的血清蛋白残留总量(RB001，博生医用)。该试剂盒提供了抗BSA单克隆抗体包被板，以酶标记抗BSA多抗为检测抗体，组成双抗体夹心ELISA检测试剂盒。根据供应商的说明书，先加入待测样品或标准品，使其中的BSA与固定在板上的抗体结合，彻底洗涤后加入HRP标记的抗BSA多抗孵育。洗涤后再加入TMB底物，TMB在HRP的催化作用下转化成蓝色，并最终在终止液(1mol/LHCl)的作用下转化成黄色。颜色的深浅与样品或标准品中的BSA数量相关。最后，用BioTek酶标仪测定各样品孔在450nm处的吸光值，通过BSA标准曲线计算待测慢病毒载体样品中的BSA浓度。具体结果如表1C所示：

表1C

(5)LDH细胞毒性检测：

CytoTox非放射性细胞毒性分析试剂盒(Promega)以比色方法替代放射性细胞毒性分析，本实施例中用来测定从转导后的细胞释放的LDH(乳酸脱氢酶)。将HEK293T细胞以每孔2×10³个细胞的密度接种于96孔板中(每组样品做三个复孔)，用含10％FBS的DMEM培养基进行培养。细胞铺板24h后，根据最佳MOI值将慢病毒载体颗粒产品IV转导细胞(MOI＝10)，转导72h后，收集细胞上清，然后按照试剂盒提供的方案进行LDH检测。LDH是一种稳定的胞质酶，细胞裂解时可以释放出来，释放出来的LDH在培养基上清中。CytoTox试剂盒可定量检测从损伤的细胞中释放的LDH的含量。30min的偶联酶学反应即可导致四唑盐(INT)转变成一种红色的甲臜产物，红色产物的形成量与死亡细胞的数目成比例。最后，用BioTek酶标仪测定490nm处的吸光值以定量LDH活性，具体结果如图5和表1D所示。经检测，慢病毒载体颗粒产品IV的LDH活性为7.33％(<10％)。

(6)RCL检测：

实施例中所使用的慢病毒载体属于第二代慢病毒载体，且各包装成分被分开构建在了不同的载体质粒上面，另一方面，采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒取代了HIV本身包膜蛋白Env的质粒，这些改造均降低了慢病毒载体恢复成野生型病毒的可能，使其具有较好的安全性。但该慢病毒载体依然仍具有潜在的产生复制型慢病毒(RCL)的风险。特别是该项检测对于cGMP级慢病毒产品的质量判定具有非常重要的意义。将慢病毒产品IV与HEK293T细胞共培养，期间，每2-3天收集一次细胞沉淀，并对细胞进行传代(共传代7次)，将7次传代后的细胞沉淀标记为RCL-C1-7。然后，对细胞沉淀抽提RNA，反转录为cDNA后用巢式PCR扩增法检测细胞中是否含有gag(541bp)序列。PCR具体条件如下，引物：正向序列：5’-GGAAATGTGGAAAGGAAGGA-3’,反向序列：5’-AAGAGTGATCTGAGGGAAGCTA-3’；PCR反应程序：94℃2min；94℃30s，62℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min，冷却至4℃。PCR结束后，取样品进行2％琼脂糖电泳根据检测结果判定慢病毒载体样品中是否存在RCL，检测结果如图6所示。图6中，1-7号条带分别代表慢病毒载体样品IV转导HEK293T细胞之后，七次收集的细胞沉淀RCL-C1-RCL-C7；8号泳道为5000DNA Marker，9-12号条带分别代表加IC的阴性对照、不加IC的阴性对照、加IC的阳性对照和不加IC的阳性对照(IC为阴性对照，PC为阳性对照，阳性对照和阴性对照均包含在试剂盒，且有对应说明)。由PCR结果可知，慢病毒载体样品IV的细胞沉淀中未检测到病毒颗粒的基因组，表明RCL检测结果呈阴性，即该批次的病毒不具有可复制性。

(7)无菌检测：

该项检测是在环境洁净度B级背景下的局部A级洁净度的单向流空气区域内进行的(《中国药典》第3部《无菌检查法》)，全程严格遵守无菌操作。样品(慢病毒产品IV)经薄膜过滤器过滤后(0.22μm，PVDF膜，milipore)(《GMP》2010版章节：《生物制品注入》)，加入到硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中(符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查要求，需厌氧及真菌生长，无菌检测的检测方法和培养基均参考自《中国药典》第三版)。置于适宜的温度培养14天，培养期间，逐日观察并记录是否有菌生长。通过观察有无微生物生长，以判定样品是否无菌，具体结果如表1D所示，检测结果为阴性。

(8)支原体检测：

本实施例采用高灵敏性的巢式PCR支原体检测试剂盒(CN101724693A巢氏PCR支原体检测用引物组、检测试剂盒及其使用方法，吉凯基因化学技术有限公司)进行慢病毒载体产品的支原体检测。该试剂盒检测用引物组包括内引物组和外引物组，通过两轮PCR反应扩增特异性的DNA片断。外引物组的正向序列为：5’-GATCCATGGGAGCTGGTAATGC-3’，反向引物序列为：5’-AGCGTTCATCGACTTTCAGACCCA-3’；内引物组的正向序列为：5’-TCATGTTCTTTGAAAACTGAATATCG-3’，反向序列为：5’-CAAGGCATCCACCAAAAACTC-3’。将HEK293T细胞以每孔2×10³个细胞的密度接种于96孔板中(每组样品做三个复孔)，用含10％FBS的DMEM培养基进行培养。细胞铺板24h后，根据最佳MOI值(MOI＝10)将不同纯化工艺步骤获得的慢病毒载体颗粒产品I、II、III、IV分别转导细胞，转导7天后，收集细胞上清。95℃水浴5-10min以灭火病毒，12000rpm离心2mim，收集上清。然后，以此上清为模板，配制PCR反应体系(50μl)，第一轮PCR程序为：94℃2min；94℃30s，62℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min，冷却至4℃。接下来，以第一轮PCR产物为模板配制PCR反应体系，进行第二轮PCR扩增，其PCR程序为：94℃2min；94℃30s，53℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃10min，冷却至4℃。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，以定性分析慢病毒载体样品中的支原体有/无情况，具体检测结果如图7所示，其中，1-4号条带分别代表慢病毒载体样品I、II、III、IV的支原体检测结果；5号泳道为5000DNA Marker，6-9号条带分别代表加IC的阴性对照、不加IC的阴性对照、加IC的阳性对照和不加IC的阳性对照。由PCR结果可知，四个慢病毒载体样品I、II、III、IV均没有支原体污染。

用经上述各项检测后符合cGMP要求的慢病毒载体产品I、II、III、IV感染HEK293T细胞，结果见图8，图8中左上角图片为未加入检测样品的HEK293T细胞对照。

表1D

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种慢病毒载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)将含有慢病毒载体基因组序列的质粒转染入培养细胞；

(2)培养步骤(1)所得细胞，收集细胞培养上清液，即为慢病毒载体培养液；

(3)将步骤(2)培养所得的慢病毒载体培养液进行切向流过滤，所得切向流过滤滤液纯化后即得慢病毒载体产品。

2.如权利要求1所述的一种慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，慢病毒载体基因组序列分别位于三个不同的载体质粒上，三个载体质粒分别为：pHelper 1.0、pHelper 2.0、pLenti-EGFP。

3.如权利要求1所述的一种慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述培养细胞选自HEK293T。

4.如权利要求1所述的一种慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，步骤(1)所得细胞在氯喹存在的条件下进行诱导培养，培养液中氯喹的浓度为20-30mmol/L。

5.如权利要求1所述的一种慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，慢病毒载体培养液进行切向流过滤前，还使用微孔过滤器过滤慢病毒载体培养液，所述微孔过滤器的孔径为0.4-0.5μm。

6.如权利要求1所述的一种慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述切向流过滤的具体条件为：使用截留分子量为100-300kDa的中空纤维柱。

7.如权利要求1所述的一种慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述步骤(3)中，将步骤(2)培养所得的慢病毒载体培养液进行切向流过滤时，先通过切向流过滤系统将慢病毒载体培养液浓缩，回收浓缩液后，再对切向流过滤系统进行洗脱，合并浓缩液和洗脱液，以获得切向流过滤滤液。

8.如权利要求7所述的一种慢病毒载体的制备方法，其特征在于，将步骤(2)所得的慢病毒载体培养液浓缩至其原体积的1.5-6％。

9.如权利要求7所述的一种慢病毒载体的制备方法，其特征在于，对切向流过滤系统进行洗脱时所使用的洗脱液为PBS和/或DMEM。

10.如权利要求1所述的一种慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，切向流过滤滤液通过阴离子交换层析法和/或凝胶层析法进行纯化。