CN108660119B - 一种伪狂犬病毒的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种伪狂犬病毒的纯化方法，将伪狂犬病毒粗提液通入装填有肝素的亲和柱，然后经洗脱、浓缩得到纯化的伪狂犬病毒浓缩液。本发明通过采用装填有肝素的亲和柱进行病毒的纯化，伪狂犬病毒能够被肝素吸附，其他物质则流出亲和柱，被吸附于肝素的伪狂犬病毒经洗脱从而能够实现伪狂犬病毒从伪狂犬病毒粗提液中分离出来，本发明的PRV病毒通过PRV基因编码的gC外膜糖蛋白与肝素具有特异性吸附，仅需要一步层析即可得到高滴度的伪狂犬病毒浓缩液，纯化方法简单，成本低，效果高，且无需采用复杂的分子筛、中空纤维过滤等步骤。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种伪狂犬病毒的纯化方法。
背景技术
在国家药监局制定的法规文件《动物源性医疗器械注册技术审查指导原则（2017年修订版）》及《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》中指出，为了提高动物源性医疗器械的安全性，生产过程中需存在特定的灭活/去除病毒工艺步骤。为确认这些工艺步骤对于灭活/去除病毒的有效性，需进行相应的验证工作。病毒灭活/去除有效性验证研究通常是将已知量的指示用活病毒，加入到待验证的工艺步骤处理前的模拟原材料或中间品中，然后定量测定经工艺步骤处理后指示病毒数量下降的幅度，由此评价生产工艺的去除/灭活病毒效果。
伪狂犬病毒（PRV）又名猪疱疹病毒1型，属疱疹病毒甲亚科的成员。猪为病毒的原始宿主，并作为贮主，可感染其他动物如马、牛、绵羊、山羊、犬、猫及多种野生动物。PRV作为猪的相关病毒，被广泛的用于猪来源的医疗器械生产工艺病毒灭活验证中。
在专利“一种猪伪狂犬病毒纯化方法（CN 103937758 A）”中，提供了一种猪伪狂犬病毒浓缩液成品用于制备疫苗，采用了微滤澄清纯化法，超滤浓缩纯化法，重复洗滤法等一系列工艺，最大限度的增大了 PRV 的回收效率，降低了纯化成本。
在专利“一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法（CN107254449 A）” 中，采用连续流离心、中空纤维澄清过滤、超滤浓缩、分子筛纯化工艺，制备用于疫苗的PRV浓缩液。
目前的技术中，采用了多步纯化，增加了工艺复杂度，使纯化时间长，纯化成本高，并降低了病毒的收率。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种方法简单的伪狂犬病毒的纯化方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种伪狂犬病毒的纯化方法，将伪狂犬病毒粗提液通入装填有肝素亲和填料的亲和柱，然后经洗脱、浓缩得到纯化的伪狂犬病毒浓缩液。
优选地，所述的肝素亲和填料为GE的Heparin Sepharose 6 Fast Flow或HeparinSepharose CL-6B亲和填料或者HiTrap Heparin预装柱。
优选地，控制所述的伪狂犬病毒粗提液通入所述的亲和柱的流速为0.8-1.2 cm/min。
优选地，控制所述的伪狂犬病毒粗提液在所述的亲和柱中停留的时间为25-40min。
优选地，所述的伪狂犬病毒粗提液的上样体积与所述的亲和柱的体积比为0.5~0.75:1。
优选地，采用洗脱液进行所述的洗脱，所述的洗脱液为pH 6~8、含有 0.8~1.0 M氯化钠的磷酸盐缓冲液或tris-盐酸缓冲液。
优选地，所述的洗脱液的上样体积与所述的亲和柱的体积比为1.5~2.5:1。
优选地，在进行所述的洗脱前，采用pH为6~8、含有0.5M及以下浓度的氯化钠或者8~10wt%硫酸铵的磷酸盐缓冲液或tris-盐酸缓冲液对所述的亲和柱进行清洗。
进一步优选地，采用清洗液进行所述的清洗时，所述的清洗液的上样体积与所述的亲和柱的体积比为1.5~2.5:1。优选地，采用截留分子量为10K~100K的超滤膜进行所述的浓缩。
优选地，所述的伪狂犬病毒粗提液为伪狂犬病毒细胞培养液经反复冻融裂解，离心除去细胞碎片制得。
本发明中，伪狂犬病毒细胞培养液可以采用本领域的常规方法获得。
本发明的另一个目的是提供一种所述的伪狂犬病毒的纯化方法制得的伪狂犬病毒浓缩液在猪源医疗器械的病毒灭活工艺验证中的应用。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明通过采用装填有肝素亲和填料的亲和柱进行病毒的纯化，伪狂犬病毒能够被肝素吸附，其他物质则流出亲和柱，被吸附于肝素的伪狂犬病毒经洗脱从而能够实现伪狂犬病毒从伪狂犬病毒粗提液中分离出来，本发明的PRV病毒通过PRV基因编码的gC外膜糖蛋白与肝素具有特异性吸附，仅需要一步层析即可得到高滴度的伪狂犬病毒浓缩液，纯化方法简单，成本低，效果高，且无需采用复杂的分子筛、中空纤维过滤等步骤。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
一种伪狂犬病毒的纯化方法包括如下步骤：
（1）伪狂犬病毒细胞培养液的制备方法为：取经培养2-3天，生长成片的ST 细胞一瓶，无菌条件下倒去培养液，然后用不含胎牛血清的MEM培养液5 ml/次洗涤二次，倒净剩余MEM培养液，加入PRV病毒悬液0.5 ml，放37℃，含5%二氧化碳培养箱吸附1小时，其中每15分钟摇动细胞培养瓶1次。取出细胞培养瓶，加入含2%胎牛血清的MEM细胞培养液10～15 ml，再放入37℃，含5%二氧化碳培养箱孵育。分别在24小时或48小时取出，显微镜下观察，见90%细胞出现病变即可终止培养。。
（2）放-25℃低温冰箱，冰冻后取出融解，重复冻融2～3次，经3000 rpm离心10～30分钟除去细胞碎片，取出上清，置于-70 ℃储存制得伪狂犬病毒粗提液。
（3）将20ml伪狂犬病毒粗提液通入装填有Heparin Sepharose 6 Fast Flow的亲和柱（装柱高度30 cm，柱体积40 ml），控制伪狂犬病毒粗提液通入亲和柱的流速为1 cm/min，控制伪狂犬病毒粗提液在亲和柱中停留的时间为30 min。
（4）采用80ml pH为7、含有0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液对亲和柱进行清洗。
（5）采用80ml pH为7、含有0.9M氯化钠的磷酸盐缓冲液对亲和柱进行洗脱，收集洗脱液。
（6）采用截留分子量为10K的超滤膜对收集的洗脱液进行浓缩得到伪狂犬病毒浓缩液。
病毒测试方法：
以ST细胞作为PRV的指示细胞，应用TCID50法测定处理前后各批次样品中的病毒滴度。将不同时间所取的样品用0.22 μm一次性滤器过滤，然后用细胞维持液（含2% FBS的MEM培养液）对样品做10倍梯度稀释，立即加入已接种Vero细胞或ST细胞的96孔板中，每稀释度接种8孔，置于5% CO2培养箱，37 ℃孵育72 h（PPV在ST细胞上孵育120 h，每48 h换液1次），倒置显微镜下观察细胞病变。按Reed-Muench法计算病毒滴度（以半数细胞感染剂量TCID50表示，TCID50 对数值= 病变率高于50%组稀释度的对数值 + 距离比例）。
未经纯化的病毒滴度（即伪狂犬病毒粗提液的病毒滴度）： 6 log10 TCID50/0.1ml，蛋白含量（以OD 280表示 2.5）。
纯化浓缩后的病毒滴度（即伪狂犬病毒浓缩液的病毒滴度）： 7.5 log10 TCID50/0.1ml，蛋白含量（以OD 280表示 0.2）。
病毒回收率：亲和层析步骤的病毒回收率80%。
其中，病毒回收率的计算方法如下：
回收率 =（洗脱液体积×洗脱液中病毒滴度）/（上样体积×上样液中的病毒滴度）
如：上样液中病毒滴度为6 log10，上样体积20ml。洗脱液中病毒滴度5.2 log10，洗脱液体积80 ml
回收率=(80 × 105.2 ) / (20 × 10 6 )= 63%
注意：病毒滴度的提高是在超滤浓缩步骤，亲和层析步骤的目的主要是纯化病毒，去除杂蛋白。为后面的超滤浓缩提供纯度更高的病毒液。
实施例2
与实施例1基本相同，不同之处在于：伪狂犬病毒粗提液的上样体积为20ml，控制伪狂犬病毒粗提液通入亲和柱的流速为0.8cm/min，控制伪狂犬病毒粗提液在亲和柱中停留的时间为40min；洗脱液的上样体积为80ml。
未经纯化的病毒滴度（即伪狂犬病毒粗提液的病毒滴度）：5 log10 TCID50/0.1ml，蛋白含量（以OD 280表示1.3）。
纯化浓缩后的病毒滴度（即伪狂犬病毒浓缩液的病毒滴度）：7 log10 TCID50/0.1ml，蛋白含量（以OD 280表示 0.5）。
病毒回收率：亲和层析步骤的病毒回收率63%。
实施例3
与实施例1基本相同，不同之处在于：伪狂犬病毒粗提液的上样体积为30ml，控制伪狂犬病毒粗提液通入亲和柱的流速为1.2cm/min，控制伪狂犬病毒粗提液在亲和柱中停留的时间为25min；洗脱液的上样体积为100ml。
未经纯化的病毒滴度（即伪狂犬病毒粗提液的病毒滴度）： 5.5 log10 TCID50/0.1ml，蛋白含量（以OD 280表示2）。
纯化浓缩后的病毒滴度（即伪狂犬病毒浓缩液的病毒滴度）：7.3 log10 TCID50/0.1ml，蛋白含量（以OD 280表示 0.3）。
病毒回收率：亲和层析步骤的病毒回收率67%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种伪狂犬病毒的纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：
将伪狂犬病毒粗提液通入装填有肝素亲和填料的亲和柱，控制所述的伪狂犬病毒粗提液通入所述的亲和柱的流速为1-1.2 cm/min，控制所述的伪狂犬病毒粗提液在所述的亲和柱中停留的时间为25-30 min；
采用pH为6~8、含有0.5M及以下浓度的氯化钠或者8~10wt%硫酸铵的磷酸盐缓冲液对所述的亲和柱进行清洗；
采用洗脱液对清洗后的亲和柱进行洗脱，收集洗脱液，所述的洗脱液为pH 6~8、含有0.8~1.0 M 氯化钠的磷酸盐缓冲液；
采用截留分子量为10K~100K的超滤膜对所述洗脱液进行浓缩得到纯化的伪狂犬病毒浓缩液。
2.根据权利要求1所述的伪狂犬病毒的纯化方法，其特征在于：所述的肝素亲和填料为GE的Heparin Sepharose 6 Fast Flow或Heparin Sepharose CL-6B亲和填料或者HiTrapHeparin预装柱。
3.根据权利要求1所述的伪狂犬病毒的纯化方法，其特征在于：所述的伪狂犬病毒粗提液的上样体积与所述的亲和柱的体积比为0.5~0.75:1。
4.根据权利要求1所述的伪狂犬病毒的纯化方法，其特征在于：所述的洗脱液的上样体积与所述的亲和柱的体积比为1.5~2.5:1。
5.根据权利要求1所述的伪狂犬病毒的纯化方法，其特征在于：所述的伪狂犬病毒粗提液为伪狂犬病毒细胞培养液经反复冻融裂解，离心除去细胞碎片制得。
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| Interaction of Glycoprotein glll with a Cellular Heparinlike Substance Mediates Adsorption of Pseudorabies Virus;THOMAS C. METTENLEITER等;《JOURNAL OF VIROLOGY》;19900131;第64卷(第1期);第278页摘要，第279页右栏第3段，第280页最后一段，第281页表1 * |
| Protective Effect of Glycoprotein gC-Rich Antigen against Pseudorabies Virus;Shigeji KATAYAMA等;《Journal of Veterinary Medical Science》;19971231;第59卷(第8期);第657页摘要，第658页左栏"Preparation of trial vaccine"部分 * |
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Denomination of invention: A purification method of pseudorabies virus Effective date of registration: 20230109 Granted publication date: 20210629 Pledgee: Jiangsu Jinmao Finance Leasing Co.,Ltd. Pledgor: LIANGCHEN BIO (SUZHOU) Corp. Registration number: Y2023320010019 |
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