CN106883306A - 一种具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖的提取分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖及其提取分离方法，首先采用水提醇沉发提取粗多糖，粗多糖除蛋白后用离子交换柱层析法，分别用不同浓度的NaCI溶液梯度洗脱进行分离，经透析袋透析除盐后浓缩，冷冻干燥，即得抗肿瘤活性高的向日葵茎芯多糖HALWP‑4。与现有技术相比，本发明采用活性跟踪分离方法从向日葵的茎芯中分离纯化出具有抗肿瘤作用的水溶性活性多糖成分，和传统的先分离纯化单体化学成分再进行活性测试方法相比，能大大减少分离工作中的盲目性和在分离过程中造成的活性成分丢失。
Description
技术领域
本发明涉及向日葵茎芯多糖技术领域，特别是涉及具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖及四种分级组分HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3、HALWP-4及其提取分离方法。
背景技术
自21世纪以来，癌症严重威胁着人类的生命，据报导我国每年因癌症死亡的人数约为150万，因此寻找一种可以高效的杀伤或者抑制肿瘤细胞，而对正常细胞不具有毒性或具有保护作用的药物十分重要。目前用于治疗癌症的化学药物有许多不足之处，例如药物在作用于癌症肿瘤细胞的同时也对正常细胞产生了毒副作用，使患者产生严重的不良反应，或有在治疗肿瘤的同时诱发了另外一种肿瘤的可能性。近年来基于天然植物药具有毒副作用较低、无致突变性及可以通过增强自身免疫力而促进癌症肿瘤细胞凋亡等特点，对其抗癌抗肿瘤作用的研究不断深入。
向日葵(拉丁文：Helianthus annuus.L)为菊科向日葵属植物，别名望日莲、太阳花、向阳花。向日葵现于我国的东、西部地区和内蒙古等地均有广泛栽培。据我国药典记载，向日葵的茎、叶、盘、根均有治疗疾病的作用。向日葵茎芯为向日葵的茎内髓芯，又名向日葵茎髓、向日葵瓤、葵花秆心、葵秆。其化学成分主要为多糖类，同时也含黄酮、酚酸、不饱和脂肪酸、萜、香豆素类等。向日葵茎芯水煎液可以明显抑制小鼠的移植瘤，它还可以破坏亚硝胺，从而达到防治癌症的目的。多年以来，杭州市第二人民利用向日葵茎芯煎液治疗胃癌的结果表明，胃癌转移的患者可以通过口服葵芯煎液来使病情得到有效的缓解。据研究表明，向日葵的茎心多糖能够增强小鼠免疫功能。向日葵茎芯中主要的活性成分可能是多糖。
目前，向日葵茎芯多糖的提取主要是先提取粗多糖，然后再进一步分离纯化，再进行活性检测。这种方法具有较多的不确定因素，而且分离过程中容易导致活性成分丢失，且提取分离的向日葵茎芯多糖不一定具有抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖的提取分离方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖的提取分离方法：
(1)取于秋季采收的向日葵的秆，将向日葵茎芯剥离出来，置于阴凉处自然风干，再放入40℃烘箱中干燥8h。将干燥的向日葵茎芯用粉碎机粉碎后备用。
(2)取一定量干燥的向日葵茎芯粉末，过筛，用95％乙醇回流提取两次，以去除脂溶性成分；再用80％乙醇回流提取两次，以除去单糖和低聚糖。所得残渣烘干，挥发去除有机溶剂后，在一定的料液比、浸提时间和浸提温度下，对向日葵茎芯多糖进行多次浸煮提取。
(3)收集合并多次浸煮提取所得提取液，将提取液过滤后减压浓缩后加入95％乙醇，静置24h，3000r/min离心15min得沉淀，将所得沉淀用丙酮、乙醇洗涤并烘干，即得到向日葵茎芯多糖粗产品。
(4)根据苯酚-硫酸法测定上述多糖粗产品在490nm波长处的吸光度，并以多糖提取率为考察指标，测定得到的多糖粗产品中多糖的含量为85.37％。
(5)取上述多糖粗产品，经过除蛋白后，溶解于纯化水中，过DEAE纤维素DE-52离子交换柱进行分离，以一定的流速，依次用4种不同浓度的NaCI溶液梯度洗脱，收集四种洗脱组分，经透析、浓缩、冷冻干燥，得到四种不同的洗脱组分HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3和HALWP-4，分别测定各不同洗脱组分的体内外抗肿瘤活性，其中抗肿瘤活性最好的为HALWP-4。
优选的，步骤(2)中向日葵茎芯粉末所过筛目数为20-100目。
优选的，步骤(2)中向日葵茎芯粉末与纯化水的比例为1:30-1:70。
优选的，步骤(2)中向日葵茎芯粉末的浸提时间为2.0-4.0h。
优选的，步骤(2)中向日葵茎芯粉末的浸提温度为60-100℃。
优选的，步骤(5)中NaCI溶液的流速为0.5-2.0mL/min。
优选的，步骤(5)中NaCI溶液的浓度为0.1-0.4mol/L。
本发明的有益效果：
本发明还提供了一种抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖，以抗肿瘤活性为依据，采用离子交换柱层析法对粗多糖进一步分离纯化，经试验证明，所得到的向日葵茎芯多糖具有更好的抗肿瘤活性。为制备抗肿瘤药物或保健类食品提供了新的选择。
具体实施方式
实施例1
(1)取于秋季采收的向日葵的秆，将向日葵茎芯剥离出来，置于阴凉处自然风干，再放入40℃烘箱中干燥8h。将干燥的向日葵茎芯用粉碎机粉碎后备用。
(2)取一定量干燥的向日葵茎芯粉末，过60目筛，用95％乙醇回流提取两次，以去除脂溶性成分；再用80％乙醇回流提取两次，以除去单糖和低聚糖。所得残渣烘干，挥发去除有机溶剂后，在料液比为1：30，浸提时间为3.0h，和浸提温度为80℃的条件下，对向日葵茎芯多糖进行多次浸煮提取。
(3)收集合并多次浸煮提取所得提取液，将提取液过滤后减压浓缩后加入95％乙醇，静置24h，3000r/min离心15min得沉淀，将所得沉淀用丙酮、乙醇洗涤并烘干，即得到向日葵茎芯多糖粗产品。
(4)取上述多糖粗产品，经过除蛋白后，溶解于纯化水中，过DEAE纤维素DE-52离子交换柱进行分离，以0.5mL/min的流速，依次用4种不同浓度的NaCI溶液梯度洗脱，收集四种洗脱组分，经透析、浓缩、冷冻干燥，得到四种不同的洗脱组分HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3和HALWP-4。
实施例2
(1)取于秋季采收的向日葵的秆，将向日葵茎芯剥离出来，置于阴凉处自然风干，再放入40℃烘箱中干燥8h。将干燥的向日葵茎芯用粉碎机粉碎后备用。
(2)取一定量干燥的向日葵茎芯粉末，过80目筛，用95％乙醇回流提取两次，以去除脂溶性成分；再用80％乙醇回流提取两次，以除去单糖和低聚糖。所得残渣烘干，挥发去除有机溶剂后，在料液比为1：40，浸提时间为3.5h，和浸提温度为90℃的条件下，对向日葵茎芯多糖进行多次浸煮提取。
(3)收集合并多次浸煮提取所得提取液，将提取液过滤后减压浓缩后加入95％乙醇，静置24h，3000r/min离心15min得沉淀，将所得沉淀用丙酮、乙醇洗涤并烘干，即得到向日葵茎芯多糖粗产品。
(4)取上述多糖粗产品，经过除蛋白后，溶解于纯化水中，过DEAE纤维素DE-52离子交换柱进行分离，以1.0mL/min的流速，依次用4种不同浓度的NaCI溶液梯度洗脱，收集四种洗脱组分，经透析、浓缩、冷冻干燥，得到四种不同的洗脱组分HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3和HALWP-4。
实施例3
(1)取于秋季采收的向日葵的秆，将向日葵茎芯剥离出来，置于阴凉处自然风干，再放入40℃烘箱中干燥8h。将干燥的向日葵茎芯用粉碎机粉碎后备用。
(2)取一定量干燥的向日葵茎芯粉末，过100目筛，用95％乙醇回流提取两次，以去除脂溶性成分；再用80％乙醇回流提取两次，以除去单糖和低聚糖。所得残渣烘干，挥发去除有机溶剂后，在料液比为1：50，浸提时间为4.0h，和浸提温度为100℃的条件下，对向日葵茎芯多糖进行多次浸煮提取。
(3)收集合并多次浸煮提取所得提取液，将提取液过滤后减压浓缩后加入95％乙醇，静置24h，3000r/min离心15min得沉淀，将所得沉淀用丙酮、乙醇洗涤并烘干，即得到向日葵茎芯多糖粗产品。
(4)取上述多糖粗产品，经过除蛋白后，溶解于纯化水中，过DEAE纤维素DE-52离子交换柱进行分离，以1.5mL/min的流速，依次用4种不同浓度的NaCI溶液梯度洗脱，收集四种洗脱组分，经透析、浓缩、冷冻干燥，得到四种不同的洗脱组分HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3和HALWP-4。
Claims (8)
1.一种具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖的提取分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取于秋季采收的向日葵的秆，将向日葵茎芯剥离出来，置于阴凉处自然风干，再放入40℃烘箱中干燥8h。将干燥的向日葵茎芯用粉碎机粉碎后备用。
(2)取一定量干燥的向日葵茎芯粉末，过筛，用95％乙醇回流提取两次，以去除脂溶性成分；再用80％乙醇回流提取两次，以除去单糖和低聚糖。所得残渣烘干，挥发去除有机溶剂后，在一定的料液比、浸提时间和浸提温度下，对向日葵茎芯多糖进行多次浸煮提取。
(3)收集合并多次浸煮提取所得提取液，将提取液过滤后减压浓缩后加入95％乙醇，静置24h，3000r/min离心15min得沉淀，将所得沉淀用丙酮、乙醇洗涤并烘干，即得到向日葵茎芯多糖粗产品。
(4)根据苯酚-硫酸法测定上述多糖粗产品在490nm波长处的吸光度，并以多糖提取率为考察指标，测定得到的多糖粗产品中多糖的含量为85.37％。
(5)取上述多糖粗产品，经过除蛋白后，溶解于纯化水中，过DEAE纤维素DE-52离子交换柱进行分离，以一定的流速，依次用4种不同浓度的NaCI溶液梯度洗脱，收集四种洗脱组分，经透析、浓缩、冷冻干燥，得到四种不同的洗脱组分HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3和HALWP-4，分别测定各不同洗脱组分的体内抗肿瘤活性，其中抗肿瘤活性最好的为HALWP-4。
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖的提取分离方法，其特征在于：步骤(2)中向日葵茎芯粉末所过筛目数为20-100目，与纯化水的比例为1:30-1:70，。
3.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖的提取分离方法，其特征在于：步骤(2)中向日葵茎芯粉末的浸提时间为1.0-4.0h，浸提温度为50-100℃。
4.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖的提取分离方法，其特征在于：步骤(3)中所得的向日葵茎芯多糖，在细胞培养液中，向日葵茎芯多糖以3.0-5.0mg/mL的浓度能对人胃癌细胞SGC-7901的生长抑制率可达50％。
5.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖的提取分离方法，其特征在于：步骤(3)中所得的向日葵茎芯多糖，在细胞培养液中，向日葵茎芯多糖以4.0-6.0mg/mL的浓度能对人结肠癌细胞HCT-8的生长抑制率可达50％。
6.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖的提取分离方法，其特征在于：步骤(3)中所得的向日葵茎芯多糖，在细胞培养液中，向日葵茎芯多糖以1.5-3.5mg/mL的浓度能对人类口腔上皮癌细胞KB的生长抑制率可达50％。
7.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖的提取分离方法，其特征在于：步骤(5)中NaCI溶液的流速为0.5-2.0mL/min，浓度为0.1-0.4mol/L。
8.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖的提取分离方法，其特征在于：步骤(5)所述的具有抗肿瘤活性的向日葵茎芯多糖及其四种分级组分在制备治疗肿瘤药物或制剂中的应用。
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