CN106834358B - 一种高效转化海藻多糖制备生物乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效转化海藻多糖制备生物乙醇的方法，所述的方法包括如下步骤：（1）物理法预处理原料；（2）水浴蒸煮；（3）纤维素酶酶解；（4）分离过滤；（5）糖化酶和液化酶处理；（6）酸解；（7）发酵、蒸馏。本发明以液化酶、糖化酶、纤维素酶以及β‑葡萄糖苷酶按科学的配比添加，对原料进行预处理，有利于提高海藻多糖的转化率；同时利用转化后的海藻多糖制备燃料乙醇，提高了乙醇的产率。实现了海藻多糖的高值化利用，开发了海洋生物能源。
Description
技术领域
本发明属于海藻利用领域，具体涉及一种高效转化海藻多糖制备生物乙醇的方法。
背景技术
能源短缺和环境污染是当今世界必须面临的两大难题，减少化石燃料的使用，开发清洁的可再生能源已成为解决这两大难题的唯一途径。生物乙醇因具有清洁、可再生的特点，尤其是其可以部分代替化石燃料的优势，近年来被广泛研究。到目前为止，已有很多国家实现了生物乙醇的大量生产，但这些国家大都以玉米，小麦和甘蔗等粮食作物和糖料作物为原料来生产第一代生物乙醇，严重违背了“不与人争粮，不与粮争地”的能源发展原则。后来又发展了第二代生物乙醇，主要以秸秆和木材废屑等木质纤维素为原料制备，避免了第一代生物乙醇的缺陷。但研究依然发现，木质纤维素原料在纤维素和木质素降解方面受技术和成本的限制非常大，而且这些原料对环境存在巨大的风险，同时也会破坏生物的多样性，因此不可能实现长期的稳定发展。随之出现的是以海洋生物质为原料的第三代生物乙醇，在解决两大难题方面具有很大优势。
海洋面积广阔，蕴藏着巨大的海藻资源，其光合作用效率高，生长周期短。据统计，每年通过光合作用生产的生物质产量可达上百千万吨，是一种巨大的可再生资源，也是生产生物质能源的潜在资源。若充分利用现有的海洋生物质能源，将大大缓解人类面临的环境、能源和粮食三大危机的压力。目前，以海洋生物质为原料生产新能源的研究较少，主要原因是受到能源成本和设备技术的限制。尤其是用海藻发酵生产乙醇的研究，更为少见。
乙醇，俗称酒精，具有易燃、而且燃烧后几乎没有污染物排放的优势，被视为最有发展前景的新型可持续燃料。目前，乙醇大都通过发酵的途径来制得。公开号为CN101638671A的专利公开了一种浒苔为原料制取生物乙醇的方法。公开号为CN 101802206A的专利公开了一种在高压下从海藻中得到液体萃取物以及利用酵母发酵液体萃取物生产生物乙醇的方法。公开号为CN 101880693A的专利公开了一种利用海带加工废弃物制备生物乙醇的方法。这些方法利用海藻原料发酵制备生物乙醇，操作复杂，条件要求高，对环境污染大，制得的乙醇中杂质含量高，浓度低。此外，还有多种方法往往都采用较单一的酶类酶解，外加蛋白酶和果胶酶等去除蛋白质、果胶等妨碍物，并不能实际地提高发酵原液的糖浓度。因此，提高海藻糖解液的浓度，才是提高目标产物生物乙醇的关键。故目前需要研究一种高效转化海藻多糖制备生物乙醇的方法。
发明内容
为了克服现有技术中制备生物乙醇方法的不足，本发明提供了一种高效转化海藻多糖制备生物乙醇的方法，该方法具有简单易行、快速和高效的优点。
本发明采用的技术方案如下：
一种高效转化海藻多糖制备生物乙醇的方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：除去海藻原料中的杂质，然后进行干燥，粉碎并过筛；
(2)水浴蒸煮：将过筛后的海藻粉末按照1：20～1：30的质量比加水进行蒸煮；
(3)纤维素酶酶解：用HCl调液体pH值至4-6，同时加入纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，40-80℃酶解8-12h；
(4)分离过滤：酶解后，固液分离，收集上清液；
(5)糖化酶和液化酶酶解：纤维素酶解后，调液体pH值至5-6，先在上清液中加入液化酶，50-70℃水浴加热酶解1-3天；然后用酸调节pH至4-5，加入糖化酶，50-70℃水浴加热酶解1-2天；
(6)酸解：酶解后，加入酸溶液酸解；酸解后，离心，收集上清液，将上清液高温灭菌；
(7)发酵、蒸馏：采用活化后的酵母厌氧发酵步骤(6)中得到的糖解液，发酵结束后进行减压蒸馏得到乙醇。
步骤(1)中，具体的步骤为：去除海藻原料中的杂质，然后在阳光下暴晒3-4天蒸发水分，再于60-70℃下充分烘干，粉碎并过筛。
所述的海藻原料为绿藻、褐藻或红藻。例如：石莼、浒苔、海带、巨藻、马尾藻、麒麟菜、石花菜、紫菜或龙须菜。选择它们最大的优势是含有的木质素非常少，几乎为零，省去了去除木质素的耗能步骤。
步骤(2)中，60-90℃水浴中蒸煮2-5h。
步骤(3)中，所述纤维素酶的酶活力为10～30万U/g；所述β-葡萄糖苷酶的酶活力为20万～40万U/g。
纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的加入量为：所述海藻原料与纤维素酶的质量比例为(10-20)：(0.03-0.05)，所述海藻原料与β-葡萄糖苷酶的质量比例为(10-20)：(0.01-0.03)。
步骤(4)中，分离采用离心方法，离心条件优选为3000-5000r/min离心10-20min。
步骤(5)中，优选采用Ca(OH)2调节pH。
糖化酶的使用量为：每克上清液中加入600～800U的糖化酶。
液化酶的使用量为：每克糖化酶酶解后的酶解液加入300～600U的液化酶。
步骤(6)中，加入2.0％-4.0％(w/w)的硫酸溶液酸解。离心条件为：3000-5000r/min离心10-20min。
步骤(7)中，所述酵母为酿酒酵母。发酵前，进行酵母菌活化，活化条件为30-60℃水浴0.5-1.5h，然后移至30-50℃振摇2-4h进行活化。
优选的，将得到的活化酵母按5％-30％的体积比接入糖解液，在30-50℃下厌氧发酵1-5天。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：
(1)本发明以液化酶、糖化酶、纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶按科学的配比添加，对原料进行预处理，有利于提高海藻多糖转化率的同时，也充分利用了海藻中的淀粉，使其转化成葡萄糖，提高了发酵原液中葡萄糖的含量，从而提高了海藻多糖制备生物乙醇的产率。纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、糖化酶和液化酶同时使用，未见报道；同时利用木质素含量极少的海藻制备燃料乙醇，实现了海藻多糖的高值化利用，开发了海洋生物能源。
(2)本发明采用了水浴蒸煮的预处理技术，大大降低了酶解时间，提高了酶解效率。
(3)本发明的技术工艺简单、安全、易于操作和控制，非常适合工业化大规模生产，提高海藻相关产业经济效益。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
解释：
乙醇产率的计算公式为：乙醇产率(％)＝蒸馏后乙醇的体积/发酵糖解液的体积×100％。
正如背景技术中所介绍的，现有技术中以海藻为原料制备生物乙醇的方法存在较多的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提供一种高效转化海藻多糖制备生物乙醇的方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：去除海藻原料中的泥沙等杂质，阳光下暴晒3-4天蒸发掉大部分水分，再于60-70℃下充分烘干，粉碎并过筛；其中：
所述的海藻原料为绿藻、褐藻或红藻。例如：石莼、浒苔、海带、巨藻、马尾藻、麒麟菜、石花菜、紫菜、龙须菜等。选择它们最大的优势是含有的木质素非常少，几乎为零，省去了去除木质素的耗能步骤。对于绿藻的成分，其碳水化合物含量大约在30～60％，例如浒苔；对于褐藻的成分，其含有大约30-40％的藻酸和5-6％的纤维素；对于红藻的成分，其含有大约50～60％的多糖类和粗纤维，例如龙须菜。
在本发明最优选的实施例中选择浒苔原料，其乙醇产率高达21.2％。浒苔属于绿藻的一种，藻体鲜绿色、柔软，由单层细胞组成，含有的木质素含量极低，干浒苔含有50％以上的多糖和10％左右的纤维素。
(2)水浴蒸煮：称取过筛后的海藻粉末于烧瓶中，按1:20-1:30质量比例加入蒸馏水，60-90℃水浴中蒸煮2-5h；
将海藻原料进行2-5h的水浴蒸煮，可以将海藻原料充分浸渍，使得原料中的纤维素和淀粉中的化学键活化和部分水解，为后续进行酶解处理作好基础。经过试验验证，采用水浴蒸煮原料后再采用纤维素酶和β-葡萄糖苷酶进行酶解，可以大幅度缩减每次酶解的时间，使得酶解8-12h后的葡糖糖浓度达到峰值，而不需要长达几天的酶解时间，提高了生产效率。
本发明研究了底物浓度对酶解效率和最终乙醇得率的影响，经试验得到料液比为1:20-1:30时，随着底物浓度增加，酶促反应速率逐渐加快，但增加到1:20时，其酶解速度不再增加，综合考虑选择料液比为1:20-1:30，其酶解效率和乙醇产率效果最佳，能够使得乙醇产率最高能达到21.2％。
(3)纤维素酶酶解：用HCl调液体pH值至4-6，同时加入纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，40-80℃酶解8-12h；
纤维素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶。本发明中使用的纤维素酶的酶活力为10～30万U/g。本发明优先选择丝状真菌产的纤维素酶，这是由于丝状真菌产生的纤维素酶酶系结构较为合理。
β-葡萄糖苷酶，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。本发明中使用的β-葡萄糖苷酶的酶活力为20万～40万U/g。
所述纤维素酶和β-葡萄糖苷酶可通过商业途径进行购买得到，例如：纤维素酶可通过河北百味生物科技有限公司购买得到，其酶活力为20万U/g；β-葡萄糖苷酶可通过河北浩展生物科技有限公司购买得到，其酶活力为20～40万U/g。
虽然纤维素酶含有一定含量的β-葡聚糖酶，但针对海藻类原料的酶解，只是采用纤维素酶的话，酶解并不彻底，可发酵性糖的含量较低，经试验验证，当纤维素酶和β-葡萄糖苷酶协同作用时，可使得原料中的海藻多糖最大程度的转化成可发酵单糖。而对于两种酶的含量，基于成本和酶解效率的综合考虑，采用最少量的酶发挥其最大效果，加入的量为：所述海藻原料与纤维素酶的质量比例为(10-20)：(0.03-0.05)，所述海藻原料与β-葡萄糖苷酶的质量比例为(10-20)：(0.01-0.03)。可见，加入的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的质量很少，但是经过8-12h的酶解能够将原料中的碳水化合物得到最大程度的水解。
(4)离心过滤：酶解后，3000-5000r/min离心10-20min，收集上清液；
(5)糖化酶和液化酶酶解：纤维素酶酶解后，Ca(OH)2调液体pH值至5-6，先在上清液中加入液化酶600-800U，50-70℃水浴加热酶解36-48h。然后用酸调节pH至4-5，加入糖化酶300-600U，50-70℃水浴加热酶解36h天。
糖化酶又称葡萄糖淀粉酶，学名为α-1,4-葡萄糖水解酶，可使多糖类(淀粉、糖原等)的α-1，4-和α-1，6-配糖键水解而成葡萄糖；该酶可通过常规商业途径进行购买得到。本发明中糖化酶的使用量为：每克上清液中加入600～800U的糖化酶。
液化酶又称α-淀粉酶，可以水解淀粉内部的α-1,4-糖苷键，水解产物为糊精、低聚糖和单糖，酶作用后可使糊化淀粉的黏度迅速降低，变成液化淀粉；该酶可通过常规的商业途径进行购买得到。本发明中的液化酶的使用量为：每克糖化酶酶解后的酶解液加入300～600U的液化酶。
本发明的核心技术之一是采用多种酶对原料进行预处理，其中，关键的是酶的种类、酶的添加量和酶的添加顺序。本发明基于对海藻原料中的成分特点以及最大程度的得到浓度较高的糖解液，本发明依次采用设定配比量的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶、糖化酶、液化酶对原料进行预处理。其中，首先采用纤维素酶和β-葡萄糖苷酶进行协同酶解，将海藻原料中的纤维素最大程度地酶解成葡萄糖和相应的配基，降低液体的粘度，再采用糖化酶将纤维素酶酶解后的海藻原料中的淀粉的α-1，4-和α-1，6-配糖键水解而成葡萄糖，最后采用液化酶，将糖化酶酶解后得原料中的淀粉内部的α-1,4-糖苷键水解为糊精、低聚糖和单糖。实验发现，这四种酶的酶解顺序特定而且唯一，其酶解顺序变化后会影响酶解效果，从而影响最终乙醇的产率和生产效率。
本发明优选采用Ca(OH)2调节pH，其迟滞期比NaOH调节pH要短，此外，Ca(OH)2对一些发酵抑制物如糠醛，甲酸和乙酰丙酸具有沉淀作用，相比于其他碱液，钙离子能够提高酶解效率。
(6)酸解处理：酶解后，加入2.0％-4.0％(w/w)的硫酸溶液酸解。酸解后，3000-5000r/min离心10-20min，收集上清液。
酶解之后，本发明采用了酸解处理，对酶解之后的低聚糖、糊精等小分子糖类进一步进行水解，进一步提高可发酵性糖的浓度，进而最大程度的提高乙醇的产率。经试验验证，酶解之后采用2.0％-4.0％的硫酸溶液酸解是提高乙醇产量的最佳方案。
(7)高温灭菌：100-120℃灭菌0.5-1.5h。
(8)酵母活化：用酵母培养基在30-40℃，pH4-6的条件下，接种酿酒酵母，置于30-60℃水浴0.5-1.5h，然后移至30-50℃恒温水浴中振摇2-4h进行活化。
从乙醇产量最大化来讲，本发明对多种酵母种类进行筛选优化，得到适合海藻原料发酵的酵母种类，其为酿酒酵母。
活化后的混合酵母菌能够尽快适应并发酵糖解液，提高乙醇的生产效率。
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae为常规市售产品，本发明使用的酿酒酵母为粉状，其活菌数为1～2×109cfu/g。其中酿酒酵母具有菌种来源广，能直接代谢葡聚糖发酵为乙醇，发酵条件简单，不需要补充额外的氧气等优点。
(9)直接发酵制乙醇：将步骤(8)得到的活化酵母按5％-30％的体积比接入步骤(7)中得到的糖解液中，在设定温度为30-50℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵1-5天生产乙醇。
经过试验验证，发酵36h时，乙醇的浓度最高。
(10)蒸馏测定：发酵完成后，用减压蒸馏的方法将乙醇蒸馏出来，然后测得其浓度。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1：
称取10g干燥石莼粉末于500ml烧瓶中，加入300ml蒸馏水，90℃水浴中蒸煮5h；用HCl调pH至4.0，加入纤维素酶30mg和β-葡萄糖苷酶15mg，40℃酶解8h。用Ca(OH)2调pH至5.0，加入液化酶600IU，50℃水浴加热酶解48h，HCl调节pH至4.0，再加入糖化酶300IU，50℃水浴加热酶解24h。酶解后，用2.0％的硫酸进行酸解，于100℃处理1h。3000r离心10min，收集上清液。100℃灭菌40分钟后，在上清液中按15％的体积比接入活化后的酿酒酵母，然后放入设定温度为30℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵，发酵48h后，通过减压蒸馏的方法蒸馏出乙醇，得到乙醇产率为18.8％，所得乙醇杂质含量低。
实施例2：
称取15g干燥浒苔粉末于500ml烧瓶中，加入450ml蒸馏水，95℃水浴中蒸煮3h；用HCl调pH至4.5，加入纤维素酶40mg和β-葡萄糖苷酶20mg，50℃酶解10h。用Ca(OH)2调pH至5.5，加入液化酶600IU，50℃水浴加热酶解48h，HCl调节pH至4.5，再加入糖化酶400IU，60℃水浴加热酶解24h。酶解后，用2.5％的硫酸进行酸解，于105℃处理2h。3000r离心15min，收集上清液。105℃灭菌30分钟后，在上清液中按20％的体积比接入活化后的酿酒酵母，然后放入设定温度为30℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵，发酵36h后，通过减压蒸馏的方法蒸馏出乙醇，得到乙醇产率为19.1％，所得乙醇杂质含量低。
实施例3：
称取10g干燥石花菜粉末于500ml烧瓶中，加入350ml蒸馏水，95℃水浴中蒸煮5h；用HCl调pH至4.5，加入纤维素酶40mg和β-葡萄糖苷酶20mg，60℃酶解10h。用Ca(OH)2调pH至6，加入液化酶800IU，60℃水浴加热酶解36h，HCl调节pH至5.5，再加入糖化酶600IU，70℃水浴加热酶解24h。酶解后，用2.0％的硫酸进行酸解，于110℃处理2h。4000r离心10min，收集上清液。110℃灭菌40分钟后，在上清液中按25％的体积比接入活化后的酿酒酵母，然后放入设定温度为35℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵，发酵24h后，通过减压蒸馏的方法蒸馏出乙醇，得到乙醇产率为16.3％，所得乙醇杂质含量低。
实施例4：
称取20g干燥紫菜粉末于500ml烧瓶中，加入400ml蒸馏水，90℃水浴中蒸煮5h；用HCl调pH至4.5，加入纤维素酶50mg和β-葡萄糖苷酶30mg，50℃酶解10h。用Ca(OH)2调pH至5.5，加入液化酶700IU，50℃水浴加热酶解50h，HCl调节pH至4.5，再加入糖化酶500IU，70℃水浴加热酶解24h。酶解后，用3.0％的硫酸进行酸解，于120℃处理2h。3000r离心15min，收集上清液。110℃灭菌30分钟后，在上清液中按10％的体积比接入活化后的酿酒酵母，然后放入设定温度为40℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵，发酵36h后，通过减压蒸馏的方法蒸馏出乙醇，得到乙醇产率为17.0％，所得乙醇杂质含量低。
实施例5：
称取15g干燥海带粉末于500ml烧瓶中，加入300ml蒸馏水，100℃水浴中蒸煮3h；用HCl调pH至4.5，加入纤维素酶50mg和β-葡萄糖苷酶20mg，40℃酶解12h。用Ca(OH)2调pH至5.5，加入液化酶600IU，55℃水浴加热酶解45h，HCl调节pH至4.0，再加入糖化酶300IU，50℃水浴加热酶解24h。酶解后，用3.5％的硫酸进行酸解，于120℃处理1.5h。4000r离心15min，收集上清液。120℃灭菌30分钟后，在上清液中按15％的体积比接入活化后的酿酒酵母，然后放入设定温度为45℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵，发酵48h后，通过减压蒸馏的方法蒸馏出乙醇，得到乙醇产率为16.6％，所得乙醇杂质含量低。
实施例6：
称取10g干燥浒苔粉末于500ml烧瓶中，加入300ml蒸馏水，95℃水浴中蒸煮5h；用HCl调pH至4.5，加入纤维素酶50mg和β-葡萄糖苷酶20mg，60℃酶解12h。用Ca(OH)2调pH至6，加入液化酶800IU，60℃水浴加热酶解48h，HCl调节pH至4.0，再加入糖化酶400IU，60℃水浴加热酶解48h。酶解后，用2％的硫酸进行酸解，于120℃处理2h。4000r离心15min，收集上清液。120℃灭菌1小时后，在上清液中按15％的体积比接入活化后的酿酒酵母，然后放入设定温度为30℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵，发酵36h后，通过减压蒸馏的方法蒸馏出乙醇，得到乙醇产率为21.2％，所得乙醇杂质含量低。
浒苔属于绿藻的一种，藻体鲜绿色、柔软，由单层细胞组成，含有的木质素含量极低，干浒苔含有50％以上的多糖和10％左右的纤维素。经过试验发现，针对浒苔原料的组织结构和成分特点，本发明的方法特别适用于浒苔原料，最终可得到高达21.2％产率的乙醇。
实施例7：
称取10g干燥海带粉末于500ml烧瓶中，加入300ml蒸馏水，90℃水浴中蒸煮5h；用HCl调pH至4.0，加入纤维素酶40mg和β-葡萄糖苷酶20mg，50℃酶解10h。用Ca(OH)2调pH至6，加入液化酶800IU，60℃水浴加热酶解48h，HCl调节pH至4.5，再加入糖化酶400IU，60℃水浴加热酶解36h。酶解后，用2％的硫酸进行酸解，于120℃处理2h。3000r离心10min，收集上清液。106℃灭菌30分钟后，在上清液中按10％的体积比接入活化后的酿酒酵母，然后放入设定温度为30℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵，发酵36h后，通过减压蒸馏的方法蒸馏出乙醇，得到乙醇产率为17.3％，所得乙醇杂质含量低。
实施例8：
称取10g干燥马尾藻粉末于500ml烧瓶中，加入300ml蒸馏水，95℃水浴中蒸煮5h；用HCl调pH至4.5，加入纤维素酶50mg和β-葡萄糖苷酶18mg，50℃酶解15h。用Ca(OH)2调pH至6，加入液化酶800IU，60℃水浴加热酶解48h，HCl调节pH至4.0，再加入糖化酶400IU，60℃水浴加热酶解36h。酶解后，用2％的硫酸进行酸解，于110℃处理2h。4000r离心10min，收集上清液。110℃灭菌40分钟后，在上清液中按15％的体积比接入活化后的酿酒酵母，然后放入设定温度为40℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵，发酵50h后，通过减压蒸馏的方法蒸馏出乙醇，得到乙醇产率为16.9％，所得乙醇杂质含量低。
实施例9
称取15g干燥巨藻粉末于500ml烧瓶中，加入400ml蒸馏水，90℃水浴中蒸煮10h；用HCl调pH至4.5，加入纤维素酶40mg和β-葡萄糖苷酶20mg，60℃酶解15h。用Ca(OH)2调pH至6.5，加入液化酶700IU，65℃水浴加热酶解48h，HCl调节pH至4.5，再加入糖化酶400IU，60℃水浴加热酶解36h。酶解后，用2％的硫酸进行酸解，于120℃处理2h。3000r离心15min，收集上清液。120℃灭菌30分钟后，在上清液中按10％的体积比接入活化后的酿酒酵母，然后放入设定温度为30℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵，发酵36h后，通过减压蒸馏的方法蒸馏出乙醇，得到乙醇产率为18.2％，所得乙醇杂质含量低。
实施例10
称取15g干燥石花菜粉末于500ml烧瓶中，加入300ml蒸馏水，100℃水浴中蒸煮5h；用HCl调pH至4.0，加入纤维素酶50mg和β-葡萄糖苷酶20mg，50℃酶解10h。用Ca(OH)2调pH至6，加入液化酶1000IU，60℃水浴加热酶解36h，HCl调节pH至4.5，再加入糖化酶500IU，60℃水浴加热酶解24h。酶解后，用4％的硫酸进行酸解，于100℃处理2h。4000r离心10min，收集上清液。115℃灭菌30分钟后，在上清液中按14.8％的体积比接入活化后的酿酒酵母，然后放入设定温度为30℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵，发酵48h后，通过减压蒸馏的方法蒸馏出乙醇，得到乙醇产率为17.5％，所得乙醇杂质含量低。
对比例1
称取10g干燥浒苔粉末于500ml烧瓶中，加入300ml蒸馏水；用HCl调pH至4.5，加入纤维素酶50mg和β-葡萄糖苷酶20mg，60℃酶解12h。用Ca(OH)2调pH至6，加入液化酶800IU，60℃水浴加热酶解48h，HCl调节pH至4.0，再加入糖化酶400IU，60℃水浴加热酶解48h。酶解后，用2％的硫酸进行酸解，于120℃处理2h。4000r离心15min，收集上清液。120℃灭菌1小时后，在上清液中按15％的体积比接入活化后的酿酒酵母，然后放入设定温度为30℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵，发酵36h后，通过减压蒸馏的方法蒸馏出乙醇，得到乙醇产率为10～15％。
从以上结果可以看出，在酶解之前不采用水浴蒸煮处理的话，会使得乙醇的产率显著降低。
对比例2
称取10g干燥浒苔粉末于500ml烧瓶中，加入300ml蒸馏水，95℃水浴中蒸煮5h；用HCl调pH至4.5，加入纤维素酶50mg和β-葡萄糖苷酶20mg，60℃酶解12h。用HCl调节pH至4.0，再加入糖化酶400IU，60℃水浴加热酶解48h；用Ca(OH)2调pH至6，加入液化酶800IU，60℃水浴加热酶解48h。酶解后，用2％的硫酸进行酸解，于120℃处理2h。4000r离心15min，收集上清液。120℃灭菌1小时后，在上清液中按15％的体积比接入活化后的酿酒酵母，然后放入设定温度为30℃的恒温水浴振荡器中进行厌氧发酵，发酵36h后，通过减压蒸馏的方法蒸馏出乙醇，得到乙醇产率为13.1％。
从以上结果可以看出，酶解时，若是不采用特定的顺序加入各种酶，会使得乙醇的产率显著降低。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种高效转化海藻多糖制备生物乙醇的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)原料预处理：除去海藻原料中的杂质，然后进行干燥，粉碎并过筛；
其中，所述海藻原料为绿藻、褐藻或红藻；
(2)水浴蒸煮：将过筛后的海藻粉末按照1：20～1：30的质量比例加入水进行蒸煮；
(3)纤维素酶酶解：用HCl调液体pH值至4-6，同时加入纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，40-80℃酶解8-12h；
其中，纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的加入量为：所述海藻原料与纤维素酶的质量比例为(10-20)：(0.03-0.05)，所述海藻原料与β-葡萄糖苷酶的质量比例为(10-20)：(0.01-0.03)；
(4)分离过滤：酶解后，固液分离，收集上清液；
(5)糖化酶和液化酶酶解：纤维素酶解后，调液体pH值至5-6，先在上清液中加入液化酶，50-70℃水浴加热酶解1-3天；然后用酸调节pH至4-5，加入糖化酶，50-70℃水浴加热酶解1-2天；
其中，糖化酶的使用量为：每克上清液中加入600～800U的糖化酶；液化酶的使用量为：每克糖化酶酶解后的酶解液加入300～600U的液化酶；
(6)酸解：酶解后，加入酸溶液酸解；酸解后，离心，收集上清液，将上清液高温灭菌；
(7)发酵、蒸馏：采用活化后的酵母厌氧发酵步骤(6)中得到的糖解液，发酵结束后进行减压蒸馏得到乙醇。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中，所述海藻原料为石莼、浒苔、海带、巨藻、马尾藻、麒麟菜、石花菜、紫菜或龙须菜。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(2)中，60-90℃水浴中蒸煮2-5h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(3)中，所述纤维素酶的酶活力为10～30万U/g；所述β-葡萄糖苷酶的酶活力为20万～40万U/g。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(4)中，分离采用离心方法，离心条件为3000-5000r/min离心10-20min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(5)中，采用Ca(OH)2调节pH。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(6)中，加入2.0％-4.0％(w/w)的硫酸溶液酸解。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(7)中，所述酵母为酿酒酵母。
9.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(7)中，发酵前，进行酵母菌活化，活化条件为30-60℃水浴0.5-1.5h，然后移至30-50℃振摇2-4h进行活化；将得到的活化酵母按5％-30％的体积比接入糖解液，在30-50℃下厌氧发酵1-5天。
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