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CN106831998B - 一种人il1rap特异性car及其应用 - Google Patents

一种人il1rap特异性car及其应用 Download PDF

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CN106831998B CN201610456859.2A CN201610456859A CN106831998B CN 106831998 B CN106831998 B CN 106831998B CN 201610456859 A CN201610456859 A CN 201610456859A CN 106831998 B CN106831998 B CN 106831998B
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袁姝姝
陈翀
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Suzhou Three Billion Intellectual Property Service Co ltd
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Xuzhou Medical College
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Abstract

本发明公开了一种人IL1RAP特异性CAR及其应用，所述CAR由IL1RAP特异性单链抗体scFV、共刺激分子和T细胞的活化CD3ζ链组成，其中scFV包含IL1RAP单克隆抗体McAb重链、轻链的可变区基因片段，共刺激分子为CD137。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述人IL1RAP特异性CAR引入CD137协同共刺激分子，提高了IL1RAP特异性CAR病毒转染T细胞后T细胞活化率，增强其对肿瘤细胞的杀伤能力；(2)本发明所述IL1RAP特异性CAR‑T细胞不仅可以发挥杀伤白血病细胞的作用，而且可在体内形成长寿的抗原特异性记忆T细胞，从而及时清除新生的白血病细胞。

Description

一种人IL1RAP特异性CAR及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种嵌合受体，尤其涉及一种人IL1RAP特异性CAR及其应用。
背景技术
慢性髓系白血病(Chronic Myelogenous Leukemia,CML)是一种发生在多能造血干细胞上的恶性骨髓增生性疾病，约占白血病的20％，以9号和22号染色体易位t(9；22)(q34；q11)形成的费城染色体(Ph)为特征。该易位形成一种新的融合基因BCR-ABL，此基因编码的融合蛋白p210或p190具有激活的酪氨酸激酶活性，导致髓系造血的异常克隆性增殖，是CML发生发展的根本原因，也是治疗CML的重要靶点。以伊马替尼为代表的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)，通过抑制BCR-ABL自身磷酸化和底物磷酸化而抑制细胞增殖和诱导凋亡，现已成为CML患者的一线治疗药物。尽管该药具有良好的疗效，但其对静息状态的白血病干细胞(leukemia stem cell,LSC)无效，使患者易产生耐药性及停药后复发，且存在部分患者原发耐药及可继发骨病等重大缺陷，导致其临床应用效果仍不能令人满意。因此，有效清除LSC可能在根本上改变CML的治疗现况，是当前治疗CML亟待解决的问题。
LSC自从被发现后就成为研究的热点，人们试图寻找到区分LSC和造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)的表面标志。IL-1受体辅助蛋白(IL-1receptoraccessory protein,IL1RAP)是Toll-like受体超家族的一名成员，是IL-1RⅠ的共受体。IL1RAP基因位于人3号染色体q28，位于小鼠的16号染色体，编码570个氨基酸。RNA不同的剪切形式可形成膜型IL1RAP和可溶型IL1RAP两种形式，膜型IL1RAP是IL-1受体复合物的重要组成部分。最近研究表明，IL1RAP蛋白在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)病人的LSC表面过表达，且IL1RAP表达水平和AML的临床预后密切相关，沉默IL1RAP可降低AML细胞克隆集落形成，促进细胞凋亡。2010年Jaras等研究发现，IL1RAP在CML病人的LSC上表达显著升高，但在CD34+CD38-的正常HSC上无表达或仅低表达。而在几乎所有正常的造血干细胞和成熟的各个细胞亚群上，IL1RAP的表达均为阴性或弱阳性。此外，研究表明胚胎期过度的IL-1/IL-1R1/IL1RAP信号限制HSC向髓系细胞正常分化，阻断IL1RAP则切断白血病细胞对外源和自分泌IL-1的利用，使白血病细胞增殖率、克隆形成率、克隆刺激活性明显下降。综上可见，在CML中IL1RAP是区分LSC和HSC特异的细胞表面标志，能诱导细胞免疫和体液免疫应答。针对IL1RAP设计药物或者疫苗，可避免正常组织损伤或自身免疫病。
在白血病的治疗上，应用抗体已很普遍。直接作用于CD20单抗的使用，是通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)杀伤白血病B淋巴细胞。最新研究表明，用IL1RAP单克隆抗体可特异性识别IL1RAP+的白血病细胞，并能杀伤IL1RAP+的白血病细胞系及CML患者体内的LSC。然而，体液中存在的可溶性IL1RAP与IL1RAP抗体结合，导致IL1RAP抗体浓度降低而达不到治疗效果。应用IL1RAP抗体需要不间断注射治疗，病人依从性较差。此外，抗IL1RAP抗体对机体肿瘤细胞无免疫监视功能，不能及时发现、有效杀伤新产生的LSC。鉴于此，寻求一种以IL1RAP为靶点治疗CML的新策略势在必行。
肿瘤的免疫细胞治疗及抗原特异性细胞疫苗的应用，为肿瘤治疗点亮了新的希望。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的出现，是人类在与肿瘤斗争中具有里程碑意义的事件。CAR是将抗体对肿瘤抗原的高度亲和性与T淋巴细胞的杀伤作用相结合，利用基因工程技术构建的嵌合型人工T细胞受体。CAR-T细胞包含识别肿瘤相关抗原的单链抗体、共刺激分子和T细胞的活化CD3ζ链，可通过非MHC限制性途径直接杀伤肿瘤细胞。目前，针对乳腺癌抗原ERBB2、结直肠癌抗原CEA和卵巢癌抗原FBP的CAR-T细胞疫苗的功能已分别在动物模型中得到证实。人CAR-T细胞疫苗作用的发挥，首次在含有人CD19抗原的Burkitt淋巴瘤模型中得到证实。2011年N Engl J Med杂志报道，采用包含B细胞特异性抗原CD19、共刺激受体CD137和CD3ζ信号区域的CAR，过继输入治疗慢性淋巴细胞白血病患者，已获得持续缓解长达一年以上的良好疗效。
另有研究发现，CAR-T细胞输入到慢性淋巴细胞白血病患者体内，不但可以发挥杀伤白血病细胞的作用，而且可在体内形成长寿的抗原特异性记忆T细胞，从而及时清除新生的白血病细胞。因此，IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗不但能避免IL1RAP抗体的应用缺陷，而且具有形成记忆性细胞的特有优势，在CML的治疗中具有广阔的应用前景。该技术采用CD28分子作为CAR共刺激分子，该方法制得的IL1RAP特异性CAR病毒转染T细胞后T细胞活化率不高，因而降低了其在体内的抗肿瘤能力。
发明内容
本发明解决的技术问题是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够提高IL1RAP特异性CAR病毒转染T细胞后T细胞活化率，增强其对肿瘤细胞的杀伤能力的受体，本发明提供了一种人IL1RAP特异性CAR及其应用。
技术方案：一种人IL1RAP特异性CAR，所述CAR由IL1RAP特异性单链抗体scFV、共刺激分子和T细胞的活化CD3ζ链组成，其中scFV包含IL1RAP单克隆抗体McAb重链、轻链的可变区基因片段，共刺激分子为CD137。
所述IL1RAP的全称为IL1受体辅助蛋白(IL-1receptor accessory protein,IL1RAP)；CAR的全称为嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)。
优选的，所述scFV的重链、轻链可变区片段的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～2，核苷酸序列为SEQ ID NO:3～4。
优选的，所述IL1RAP特异性CAR的核苷酸序列为SEQ ID NO:5。
优选的，所述IL1RAP特异性CAR的载体为LV-Lac。
优选的，所述IL1RAP特异性CAR的宿主菌为分泌鼠抗人IL1RAP McAb的杂交瘤细胞株10D8A7。
优选的，所述IL1RAP特异性CAR的靶细胞为KU812。
上述人IL1RAP特异性CAR在制备IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗中的应用。
有益效果：(1)本发明所述人IL1RAP特异性CAR引入CD137协同共刺激分子，提高了IL1RAP特异性CAR病毒转染T细胞后T细胞活化率，增强其对肿瘤细胞的杀伤能力；(2)本发明所述IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗不仅可以发挥杀伤白血病细胞的作用，而且可在体内形成长寿的抗原特异性记忆T细胞，从而及时清除新生的白血病细胞。
附图说明
图1.杂交瘤细胞总RNA及抗人IL1RAP单抗VH、VL片段PCR电泳图
A:DNA marker MarkerⅢ；B:M,DNA marker MarkerⅢ；lane R1,10D8A7细胞的总RNA；C:M,DNA marker MarkerⅢ；lane 1,10D8A7分泌抗体的VH片段；lane 2,10D8A7分泌抗体的VL片段。
图2.CAR及表达载体模式图
其中，A:CAR包括抗人IL1RAP单抗的VH和VL片段(由(G4S)3linker连接)、ICD(CD8α跨膜段-CD137胞内段-TCRζ链)、hCD8αSignal peptide、Stop codon、BamHI、SalI双酶切位点；B:LV-10D8A7scFv–ICD模式图。
图3.重组质粒BamHI/SalI双酶切电泳图
其中，lane 1-3:LV-10D8A7scFv-ICD重组质粒的BamHI/SalI双酶切产物(6670bp和1347bp)；lane 7:1kb Marker。
图4.三质粒包装系统转染293FT细胞的明场(A)和荧光(B)照片(×100)
图5.慢病毒感染CD3+T细胞的明场(A)和荧光(B)照片(×100)
图6.白血病细胞系细胞表面IL1RAP蛋白的表达图
其中，方框中所标数值为IL1RAP+细胞的百分比。
图7.CAR-T细胞对KU812细胞凋亡的影响图
包括*P<0.05vs BC组和LV-Gene组。
图8.流式细胞术检测CAR-T细胞对KU812细胞凋亡的影响
其中，A:CAR-T细胞群(R2)和KU812细胞群(R1)的设门示例图；B:BC组；C:LV-Ctrl组；D:LV-Gene组；图中所标数值为KU812晚期凋亡和早期凋亡细胞的百分比。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，如Sambrook等人所著《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中的条件进行操作，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1 VH和VL基因的克隆与鉴定
VH基因是指抗体重链的可变区基因，VL基因是指抗体轻链的可变区基因，VH基因与VL基因通过Linker连接后，形成scFv。VH和VL基因编码的抗体VH和VL片段是特异性识别抗原并与之结合的关键部位，因此克隆并鉴定特异性识别人IL1RAP蛋白的抗体VH和VL基因是首要步骤。
采用Trizol(购自Invitrogen)试剂法提取10D8A7杂交瘤细胞总RNA，对提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1中B所示。
用逆转录酶SuperScriptTMⅢ(购自Invitrogen)逆转录合成cDNA第一链，保存于-20℃备用。
以杂交瘤细胞cDNA为模板，按GenScript公司RACE标准操作指南扩增抗体VH和VL基因片段。特异性引物(由GenScript公司合成)：P42(10D8A7)重链上游引物SEQ ID NO:6：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，下游引物SEQ ID NO:75'-CAGGGGCCAGTGGATAGACAGATGG-3'，轻链上游引物SEQ ID NO:85'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，下游引物SEQ ID NO:95'-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3'。
反应条件：94℃变性1rnin，58℃退火1rnin，72℃延伸1.5min，共30个循环，最后72℃保温10min。取5μL PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。结果如图1中C所示，
采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omega公司)纯化回收PCR扩增产物，双酶切后克隆至载体pMD18T上(购自GenScript公司)，命名为pMD18-10D8A7 VH及pMD18-10D8A7 VL重组质粒。上述质粒分别转染大肠杆菌DH5α，用蓝白斑筛选阳性克隆并对VH和VL片段进行测序鉴定，测序结果与序列完全相符。
实施例2抗人IL1RAP scFv的构建
分别以pMD18-10D8A7VH和pMD18-10D8A7VL序列为模板，扩增VH和VL基因，通过overlap extension PCR扩增并连接为抗人IL1RAP scFv，命名为10D8A7scFv。引物序列为SEQ ID NO:6～9。
反应条件：94℃变性1rnin，58℃退火1rnin，72℃延伸1.5min，共30个循环，最后72℃保温10min。
分别提取抗人ILlRAP杂交瘤细胞的总RNA，并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。上面2个条带明亮、清晰、条带锐利,且第1个条带(28S)亮度约为第2个条(18S)亮度的2倍，最下面1个条带(5S)最淡，符合总RNA的特征。由杂交瘤细胞系总RNA扩增得到2种抗人ILlRAP抗体的VH和VL基因片段。琼脂糖凝胶电泳结果如图1C，由图1C可见获得的VH和VL基因片段长度均在400bp左右.进一步对目的基因测序结果显示,由10D8A7细胞系获得的VH基因全长423bp，可编码141个氨基酸，VL基因全长381bp，可编码127个氨基酸。电泳结果见图lB，由上至下可见3个条带，分别为28S、18S和5S rRNA由10D8A7细胞系获得的VH基因全长423bp，可编码141个氨基酸，VL基因全长381bp，可编码127个氨基酸。将扩增获得的包含识别IL1RAP的VH和VL片段的scFv进行基因测序，结果表明IL1RAP scFv测序结果准确，连接并构建抗人IL1RAPscFv成功。
实施例3抗人IL1RAP CAR稳定表达质粒的构建与鉴定
参考Uherek C等人的研究设计CAR的基因序列，合成ICD，包括CD8α跨膜段-CD137胞内段-TCRζ链，如图2中A所示，CAR由抗人IL1RAP抗体scFv、CD8α跨膜段、CD137胞内段及TCRζ链连接而成，在序列的两端分别引入BamHI和SalI限制性酶切位点，在BamHI位点后引入hCD8αSignal peptide，在SalI位点前引入Stop codon。
将CAR连入LV-Lac载体，连接产物模式如图2中B所示。将连接产物转化感受态细胞DH5α，涂布LB同体培养基(含150μg/mL氨苄青霉素)平板于37℃培养16h，挑取单克隆菌落于LB培养基(含150μg/mL氨苄青霉素)，37℃摇床剧烈摇菌培养16-18h，小量提取质粒，命名为LV-10D8A7scFv-ICD，BamHI和SalI双酶切，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳鉴定目的片段是否插入，结果如图3所示。取PCR鉴定正确的质粒送GenScript公司测序。
实施例4重组慢病毒的包装和浓缩
(1)转染前1天，用胰酶消化对数生长期的293FT细胞，调整细胞密度为1.2×106/mL，接种于多聚赖氨酸(Sigma公司)处理后的100mm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养，待细胞密度达70％～80％时进行转染。
(2)将转移质粒12μg、psPAX2 8μg，pMD2.G 4μg以1.5mL Opti-MEM培养基稀释；50μL Lipofectamine 2000以1.5mL Opti-MEM培养基稀释；孵育5min后将稀释后的质粒与Lipofectamine 2000充分混匀，室温孵育25min。
(3)将孵育后的质粒与Lipofectamine2000混和物加入细胞，轻轻混匀；37℃、5％CO2培养6h后以含2％FBS的H-DMEM全量换液，继续培养42h；
(4)分别观察培养24h、48h和72h后的GFP表达情况，荧光显微镜下可观察到GFP表达情况，GFP+细胞率＞85％，如图4所示。分别收集转染后48h和72h(转染即可为0小时计起)的293FT细胞上清液；以0.45μm滤器过滤上清液于40mL超速离心管中；以DMEM培养基配平后4℃70000g离心2h；弃上清，4℃静置4h，以总量为0.5mL的Opti-MEM培养基重悬病毒颗粒；-80℃保存备用。
实施例5慢病毒滴度测定
(1)测定前1天，293FT细胞铺板，96孔板，每孔加4×104个细胞，体积为100μL。
(2)取8个无菌EP管，每管中加入90μL的无血清培养基。取待测病毒原液10μL加入第一管中，混匀后，取10μL加入第二管中。继续相同的操作直到最后一管。
(3)96孔板中每孔吸去90μL培养基，丢弃。加入90μL稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养24h，加入完全培养基100μL。
(4)4天后，观察荧光表达情况：荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。病毒滴度公式为：病毒滴度＝(GFP阳性细胞个数×稀释倍数)/mL。两种病毒滴度分别为LV-10D8A7：(2.06±0.67)×108TU/mL；空载体LV-Ctrl：(8.03±0.18)×108TU/mL。
实施例6 IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗的制备
(1)人原代CD3+T细胞分离
采集健康志愿者外周血15mL，用等量Ficoll-Hypaque(购自GE Healthcare公司)离心(400g，30min)，吸取中间层，分离得到单个核细胞悬液，PBS洗两遍(800g，10min)；弃上清，按每107个细胞加入100μL PBS，10μL Ab-PE(human CD19antibodies、PE-Mouse Anti-Human CD56、PE-Mouse Anti-Human CD33)(购自BD Biosciences公司)混匀，4℃避光孵育10min；按每107个细胞加入PBS 1-2mL，300g离心10min 4℃；弃上清，按每107个细胞加入80μL PBS重悬，加20μL Anti-PE磁珠(德国美天旎公司)，混匀，4℃避光孵育15min；PBS洗细胞；细胞悬液由分选柱分选。
(2)CD3+T细胞的活化
以1×106/mL的密度将CD3+T细胞接种于固相包被抗CD3和CD28抗体(OKT3、CD28.2)，终浓度为5μg/mL(购自eBioscience公司)的RPMI1640培养液(购自美国GIBCO公司)中，培养48～72h。
(3)慢病毒感染CD3+T细胞
以感染复数(MOI)为20的病毒液(LV-Gene及LV-Ctrl)感染活化后的CD3+T细胞，并加入终浓度为8μg/mL的Polybrene(德国Fluke公司)促进病毒吸附，置37℃、5％CO2培养箱中培养24h后再次加入等量病毒液。重复感染24h后更换新鲜10％FBS的RPMI 1640培养液，继续培养。如图5所示，荧光镜下可见绿色荧光，且随着时间推移，48h、72h、96h荧光逐渐增强，GFP阳性率达30％-70％。
上述实验分3组：空白对照组BC(正常CD3+T细胞)、空载体对照组LV-Ctrl(CAR--T细胞)、实验组LV-Gene(CAR+-T细胞)。
实施例7IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗的功能鉴定
1.白血病细胞系细胞表面表达IL1RAP蛋白的检测
(1)收集KU812、K562、SUP-B15细胞各1×106个，1×PBS洗2次。
(2)用100μL 1×PBS重悬细胞，加2μL anti-hIL-1RAcP-PE(美国R&D公司)，室温避光孵育15min，2mL PBS洗1次。
(3)200μL 1×PBS重悬后流式细胞术检测。
流式检测结果显示，SUP-B15细胞表面基本检测不到IL1RAP表达量，K562细胞表达低水平的IL1RAP，而KU812细胞表面高表达IL1RAP蛋白，如图6所示。因此，在后续IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗杀伤实验中，我们选择KU812细胞作为靶细胞。
2.CCK-8法检测CAR-T细胞对KU812细胞增殖的影响
(1)取上述3组活化后的CD3+T细胞(正常CD3+T细胞、CAR--T细胞、CAR+-T细胞)及KU812细胞(各1×104个)，加入96孔板中，每孔加入100μL培养基。
(2)效靶细胞共培养24h后，向各孔中加入10μL CCK-8溶液(购自日本同仁化学研究所)，每组设3个复孔；同时设仅加培养基及CCK-8的空白对照孔。
(3)37℃，5％CO2细胞培养箱内孵育4h后酶标仪450nm处测OD值。
如图7，CCK-8法检测结果显示，LV-Gene组OD值(0.23±0.06)显著低于BC组(0.54±0.16)和LV-Ctrl组(0.48±0.12)，差异具有统计学意义(P<0.05)；而LV-Ctrl组OD值虽低于BC组，但差异无统计学意义。提示CAR+-T细胞对KU812细胞有杀伤作用。
3.流式细胞术检测KU812细胞凋亡
(1)取上述3组活化后的CD3+T细胞(正常CD3+T细胞、CAR--T细胞、CAR+-T细胞)及KU812细胞(1:1)，将细胞悬液调整密度为2×106/mL，加入24孔板中共培养24h后，1×PBS洗一次(800g离心3min)，弃上清后，加入1mL 1×缓冲液洗一次。
(2)上机管中分别加入各组细胞悬液100μL，加入5μL Annexin V(购自eBioscience公司)，轻轻混匀，避光孵育15min。
(3)1×缓冲液洗一次，弃上清，加入200μL 1×缓冲液重悬，加入7-AAD(eBioscience公司)5μL，避光孵育10min，上机检测。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限为正常细胞(AnnexinV-/7-AAD-)；右下象限为早期凋亡细胞(AnnexinV+/7-AAD-)；右上象限为晚期凋亡细胞(AnnexinV+/7-AAD+)。
如图8，AnnexinV/7-AAD标记流式细胞术检测显示，与BC组((9.26±1.30)％)相比，LV-Ctrl组早期凋亡细胞比例((11.16±1.27)％)无明显变化；LV-Gene组早期凋亡细胞比例((36.56±3.17)％)显著增高，与BC组及LV-Ctrl组相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。然而，三组间晚期凋亡细胞比例无显著差异。上述结果说明，CAR+-T细胞可表达识别IL1RAP蛋白的抗体，且能够有效结合靶细胞表面的IL1RAP蛋白，进而对IL1RAP阳性的细胞起到杀伤作用。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> 一种人IL1RAP特异性CAR及其应用
<140> 2016104568592
<141> 2016-06-22
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 141
<212> PRT
<213> human
<400> 1
Met Gly Trp Thr Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Phe Gly Gly Thr Val Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Ser Val Tyr Tyr Lys Tyr Asp Gly Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> human
<400> 2
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Lys Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Asn Asn
100 105 110
Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
115 120 125
<210> 3
<211> 423
<212> DNA
<213> human
<400> 3
atgggatgga cctggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgag 60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gagaagcctg gcgcttcagt gaggatatcc 120
tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tacaatatga actgggtgaa gcagagcaat 180
ggaaagagcc ttgaatggat tggaaatatt gatccttact ttggtggaac tgtctacaac 240
cagaagttca agggcaaggc ctcattgact gtagacaaat cctccagtac tgcctacatg 300
cagctcaaga gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag agggaactcc 360
gtctactata aatacgacgg atttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 420
tca 423
<210> 4
<211> 381
<212> DNA
<213> human
<400> 4
atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 180
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 240
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagaaa 300
gaggatattg ccacttactt ttgccaacac aataatacgc ttccgtggac gttcggtgga 360
ggcaccaagc tggatatcaa a 381
<210> 5
<211> 1347
<212> DNA
<213> human
<400> 5
ggatccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60
gccaggccgg aggtccagct gcagcagtct ggacctgagc tggagaagcc tggcgcttca 120
gtgaggatat cctgcaaggc ttctggttac tcattcactg gctacaatat gaactgggtg 180
aagcagagca atggaaagag ccttgaatgg attggaaata ttgatcctta ctttggtgga 240
actgtctaca accagaagtt caagggcaag gcctcattga ctgtagacaa atcctccagt 300
actgcctaca tgcagctcaa gagcctgaca tctgaggact ctgcagtcta ttactgtgca 360
agagggaact ccgtctacta taaatacgac ggatttgact actggggcca aggcaccact 420
ctcacagtct cctcaggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcgggtcg 480
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 540
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 600
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 660
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagaaa 720
gaggatattg ccacttactt ttgccaacac aataatacgc ttccgtggac gttcggtgga 780
ggcaccaagc tggatatcaa atacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 840
ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 900
ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 960
cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgctga gagtgaagtt cagcaggagc 1020
gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1080
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1140
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1200
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1260
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1320
gccctgcccc ctcgctaata agtcgac 1347
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagcagtggt atcaacgcag agt 23
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caggggccag tggatagaca gatgg 25
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagcagtggt atcaacgcag agt 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggatacagtt ggtgcagcat c 21

Claims (8)

1.一种人IL1 RAP特异性CAR，其特征在于，所述CAR主要由IL1RAP特异性单链抗体scFV、共刺激分子和T细胞的活化CD3 ζ链组成，其中scFV包含IL1RAP单克隆抗体McAb重链、轻链的可变区片段，共刺激分子为CD137；所述scFV的重链可变区片段的氨基酸序列为SEQID NO :1的第20-141位，scFV的轻链可变区片段的氨基酸序列为SEQ ID NO : 2的第21-127位。
2.根据权利要求1所述的一种人IL1 RAP特异性CAR，其特征在于，所述scFV的重链可变区片段的核苷酸序列为SEQ ID NO :3的第58-423位，scFV的轻链可变区片段的核苷酸序列为SEQ ID NO :4的第61-381位。
3.根据权利要求1所述的一种人IL1 RAP特异性CAR，其特征在于，所述IL1 RAP特异性CAR的核苷酸序列为SEQ ID NO :5。
4.含有权利要求1-3任一所述人IL1 RAP特异性CAR的载体，其特征在于，所述载体为LV-Lac。
5.含有权利要求1-3任一所述人IL1 RAP特异性CAR的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为分泌鼠抗人IL1RAP McAb的杂交瘤细胞株10D8A7。
6.权利要求1-3任一所述人IL1 RAP特异性CAR在制备IL1RAP特异性CAR-T细胞中的应用。
7.权利要求4所述载体在制备IL1RAP特异性CAR-T细胞中的应用。
8.权利要求5所述宿主菌在制备IL1RAP特异性CAR-T细胞中的应用。
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