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CN106754602B - 一种生产胞苷的重组微生物及生产胞苷的方法 - Google Patents

一种生产胞苷的重组微生物及生产胞苷的方法 Download PDF

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CN106754602B CN201710003833.7A CN201710003833A CN106754602B CN 106754602 B CN106754602 B CN 106754602B CN 201710003833 A CN201710003833 A CN 201710003833A CN 106754602 B CN106754602 B CN 106754602B
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Abstract

本发明提供了一种生产胞苷的重组微生物以及利用该重组微生物生产胞苷的方法。其中，对胞苷的降解及利用基因进行了敲除，这些基因编码胞苷脱氨酶、核糖核苷水解酶，胞苷/尿苷激酶以及核苷转运蛋白。同时，对胞苷生物合成途径中的关键酶进行了过表达，包括降解胞苷三磷酸到胞苷单磷酸的胞苷三磷酸焦磷酸化酶，以及催化胞苷单磷酸到胞苷的胞苷单磷酸磷酸化酶。此外，对嘧啶核苷途径进行了基因工程改造，解除合成途径的反馈抑制。通过生物发酵方法将重组菌株在5升发酵罐可达到20g/L以上的胞苷产量，可以实现工业化的量产，同时胞苷的生产成本低和减少污染少，绿色环保，具有较高的推广应用价值。

Description

一种生产胞苷的重组微生物及生产胞苷的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种生产胞苷的重组微生物，利用重组微生物生产胞苷以及利用该重组微生物通过生物方法生产胞苷。
背景技术
胞苷属于核苷的一种，是由胞嘧啶与核糖合成而成，两者之间由β-N1-配糖键相连。白色或类白色结晶性或粉末；溶于水，溶于酸和碱，微溶于乙醇，不溶于有机溶剂。分子式C9H13N3O5,相对分子质量243.22，熔点210.0~220.0，比旋+31~+35°。它主要用于胞苷三磷酸（CTP）、胞磷酸胆碱（钠盐）（Citicholine，CDP-choline）、2′、3′-二去氧胞苷以及阿糖胞苷等原料药的制备。
目前胞苷的生产主要集中在中国，利用四乙酰核糖、胞嘧啶和催化剂四氯化锡来合成, 生产中使用的催化剂四氯化锡不仅成本高，而且容易造成污染。同时化学合成胞苷中使用的原料胞嘧啶也来自高污染化学合成（冀亚飞2007,化学世界1,59-60）。
虽然目前全球的胞苷生产是采用化学合成方法生产，但是利用微生物发酵生产也有报道。但工业上的微生物发酵生产胞苷却未见报道。在1994-1996年间，Asahi报道过通过化学诱变，筛选出几株对多种化学品（如6-氮尿嘧啶、5-氟胞苷、3-Deazauraci），具有抗性的枯草芽孢杆菌菌种，该诱变后菌种同时缺失了高丝氨酸脱氢酶，提高了胞苷产量（Asahi1994 Biosci. Biotech. Biochem 58, 1339-1402; Asahi 1995 Biosci. Biotech.Biochem 59, 915-916; Asahi 1996 Biosci. Biotech. Biochem 60, 353-354）。2009年Li对枯草杆菌菌种进行了同样的化学诱变和筛选，但获得的突变菌种产胞苷只有每升6.2克（Li 2009 中国药科大学学报40,455-459）；Fang在2014年报道了在大肠杆菌K-12中对胞苷脱氨酶和高丝氨酸脱氢酶的编码基因进行敲除的同时，过量表达来源于解淀粉芽孢杆菌的pyrB-pyrA操纵子，胞苷的产量可以达到每升722毫克以上（Fang 2013 Biotechnol 35,245-251）。这些菌种的胞苷产量太低，难以满足工业生产的要求，虽然Asahi的诱变筛选菌株得到的产量较高，但是重复性差，并且菌株基因型未知，很难继续提高其产量。
因此，需要开发一种能替代化学合成、降低污染的胞苷合成方法。人类已经利用微生物来发酵生产核苷类的产品，如beta-胸苷、鸟苷、肌苷和腺苷。而胞苷和上述核苷一样，作为补救合成途径中的一种嘧啶核苷酸中间体，在生物中普遍存在着胞苷的代谢途径，但它很少积累在细胞中或细胞生物的基质中。改造生物，特别是微生物，使其增强胞苷的合成并积累在其生长的基质中，就可以有效地实现胞苷大规模工业化生产，从而降低胞苷的生产成本和减少污染。
目前全球的胞苷需求量每年在500-1500吨以上，本发明满足了上述需求并且还具有相关的优势。
发明内容
发明目的：设计和生产具有高产量胞苷生产合成和积累能力的重组微生物，并利用该重组微生物实现胞苷的高产量生物法生产。
技术方案：
1.去除利用和降解胞苷的酶的编码基因使胞苷不再参与细胞中的代谢
首先为了使微生物能够积累胞苷，1）对细胞中利用胞苷合成其它嘧啶核苷酸的第一个酶（胞苷/尿苷激酶）的编码基因进行阻断或敲除，这样胞苷就不能被磷酸化成CMP，CMP能够进一步被用来合成CDP， CTP等等。2）在微生物还存在着一系列的酶，它们具有降解胞苷的能力。比如胞苷脱氨酶（EC 3.5.4.5），催化胞苷到尿苷的转化反应，核糖核苷水解酶（EC 3.2.2.3）将胞苷水解成胞嘧啶和核糖。对这些基因进行敲除或阻断，使得胞苷能够积累。此外，位于微生物细胞膜上的核苷转运蛋白，如大肠杆菌的NupG/NupC，(Craig JE1994,Mol Microbiol.11(6):1159-68.），可将胞外的核苷转运至胞内。进一步对编码这些转运蛋白的基因进行敲除，就可使胞苷在胞外积累，同时也方便产品的纯化。
2.从 CMP的去磷酸化来合成胞苷
大多野生型的生物都能生产多种磷酸化酶或核苷酶，如酸性磷酸化酶、碱性磷酸化酶和核苷酶，例如大肠杆菌产生酸性磷酸化酶（AphA）、碱性磷酸化酶(PhoA)、和核苷酶（UshA，YjjG, UmpH , UmpG， SurE，YfbR）(see http://ecocyc.org/ ）。无论是在胞内还是在周质空间，这些酶对核苷的特异性都不强，但是这些酶在鸟苷、腺苷和肌苷的微生物发酵生产中担任着非常重要的角色。同样的，在重组细胞中这些酶也可以用来生产胞苷的。
另一方面，自然界生物中存在着对特定的核苷酸具有特异性的磷酸化酶或核苷酶， 比如工业上在重组大肠杆菌中生产Beta-胸苷就是利用对dTMP（脱氧胸苷单磷酸）具有特异性的dTMP磷酸化酶（TMPase，US专利 5213972）将dTMP去磷酸化来合成beta-胸苷的。在自然界中同样也存在对CMP有特异性的磷酸化酶或核苷酶（在这里统称为CMPase）。例如链球菌来源的S5NA （Zheng 2015 JBC 290, 31126-31137），酿酒酵母来源的PHM8（Kuznetsov2015 JBC 290, 18678-18698）,人体白细胞来源的核苷酸酶PN-1（Chiarelli 2004,Redcells 105, 3340-3345），果蝇来源的CG3362(Buschmann J 2013,J Biol Chem.,288(4):2441-51.)，PBS2 噬菌体来源的TMPase（Price AR1973,J Biol Chem.248(4):1372-80.），家鼠（murine）来源的mdNT1（Rampazzo C2000,J Biol Chem.Feb 25;275(8):5409-15）以及mdNT2 (Mootha VK2003,Cell.115(5):629-40.)，大肠杆菌来源的YjjG, YfdR, SurF，UmpG（Proudfoot M2004, J Biol Chem. 279(52):54687-94. ），UshA（Innes D2001, J BasicMicrobiol. 41(6):329-37.），UmpH(Tremblay LW 2006,Biochemistry.45(4):1183-93)，AphA（Passariello C2006, Biochim Biophys Acta. 2006 Jan;1764(1):13-9. ），PhoA(Engstrom1961,Biochim Biophys Acta 52;36-48. ) 等等 。
这些对CMP具有特异性的CMPase或/和它们同源的酶的编码基因可以用DNA合成的方法获得，也可以直接相应的生物中提取的mRNA 为模板，通过PCR的方法获得。因此，将上述获得的任何一个基因在重组细胞中进行表达，成功表达的CMPase就可以在重组细胞中以CMP为底物来产生CdR，显著增加胞苷的产量。
为了进一步获得特异性更高的某一CMPase，可以通过蛋白质工程的技术，也可以获得具有对CMP高特异性的CMPase突变体，用来在重组细胞中产生大量的CdR（如，通过蛋白质工程来提高芽孢杆菌中支链淀粉酶的热稳定性（Chang 2016,MPLoS One. 11(10):e0165006. ））。
3.增强细胞中CMP的供给
在生物中，胞苷单磷酸并不是嘧啶核苷酸从头合成途径中的中间体，它只是嘧啶核苷酸的补救合成中的中间体。它可能是RNA降解后的产物，细胞降解RNA后，所产生的CMP，被CMP激酶（Cmk）催化生成胞苷二磷酸 （EC 2.7.4.14 ， EC2.7.4.25），后者可以进一步磷酸化合成CTP， 或经核糖核酸还原酶用来合成脱氧胞苷二磷酸 （dCDP）。dCDP 是脱氧核糖核苷酸（DNA）合成的原料，脱氧胞苷三磷酸（dCTP）和脱氧胸苷三磷酸（dTTP）的前体物。
为了增加胞苷的合成，重组细胞具有持续的胞苷单磷酸的供给就很重要。为此1）首先就必须使细胞中缺少CMP激酶（Cmk），使CMP专门用来合成胞苷。2）其次是在重组细胞中表达或超量表达CTP和CDP磷酸化酶或相应的核苷酸酶, 从而增加CMP在胞内的浓度。有关的CTP和CDP磷酸化酶或相应的核苷酶可能并不存在于所有的、非基因改造过的细胞中。目前已知的能够催化CTP水解成CMP的磷酸化酶或核苷酶报道的有，大肠杆菌来源的NudG（O’Handley, et al 2000 JBC 276,5421-5426）, 分枝杆菌来源的Mut2（Sang 2013 ASM 195,1552-1560）, 枯草杆菌来源的Maf 蛋白-BSU28050（Tchigvintsev 2013 Chemistry &Biology 20,1386-1398），Deinococcus radiodurans来源的DR_0079(Buchko GW2008,Biochemistry. 47(25):6571-82.)，大肠杆菌来源的NudI（Xu W2006, J Biol Chem.281(32):22794-8.）,大肠杆菌来源的MazG(Zhang J2002, J Bacteriol.184(19):5323-9.),大肠杆菌来源的NudB（Suzuki Y1974, J Biol Chem.249(8):2405-10.）,大肠杆菌来源的PhnM（Kamat SS2011, Nature.480(7378):570-3.）,大肠杆菌来源的RppH（Deana A2008,Nature.451(7176):355-8. ）等等。
4.解除嘧啶核苷合成的反馈抑制，增加嘧啶核苷合成的代谢流和CdR的产量
嘧啶核苷酸合成途径催化第一步由氨基甲酰磷酸合成酶催化合成氨基甲酰磷酸。该酶的编码基因carAB分别受到代谢终产物嘌呤、嘧啶以及精氨酸的反馈阻遏作用（Devroede N2006, J Bacteriol.188(9):3236-45.），相应阻遏蛋白分别为PurR, PepA,ArgR（Kim2015. Microb Cell Fact 14:98），本发明通过对阻遏蛋白编码的基因purR,pepA, argR的敲除，进而解除了CarAB的转录的抑制，加快了氨基甲酰磷酸合成。同时氨基甲酰磷酸合成酶本身也会受到UMP的反馈抑制，根据文献报道（Delannay S1999，J MolBiol. 286(4):1217-28），将该酶的一个亚单位（CarB）的第948位氨基酸-丝氨酸突变成苯丙氨酸(S948F)就可有效解除UMP的抑制作用，本发明通过在染色体上对carB基因进行突变，获得携带编码CarB (S948F) 突变基因的重组菌株。
嘧啶核苷酸合成途径催化第二步是由天冬氨酸氨甲酰基转移酶催化合成氨基甲酰天冬氨酸。该酶由一个起调控作用的亚基（PyrI）和一个起催化亚基(PyrB) 组成，该酶在CTP浓度高的时候，CTP结合PyrI从而降低酶的活性。然而如果将编码天冬氨酸氨甲酰基转移酶调控亚基破坏掉，如将其编码基因的敲除，就解除终产物CTP对对其的反馈阻遏作用(Coudray L 2009, Bioorg Med Chem. 17(22):7680-9) 。
嘧啶核苷酸合成途径中pyrE编码乳清酸核糖磷酸转移酶，催化乳清酸合成乳清酸单磷酸，大肠杆菌W3110宿主菌中pyrE基因上游rph基因终止密码子附近存在移码突变（KajFrank Jensen1993, Journal Of Bacteriology,3401-3407.），导致部分rph基因转录无法终止，进而影响下游pyrE基因的表达，导致宿主菌中乳清酸的积累。pyrH编码的UMP激酶，催化UMP磷酸化合成UDP，但该酶受到其产物UDP的反馈抑制。对该酶第93位的天冬氨酸到丙氨酸的突变(D93A)能够有效解除相应的反馈抑制作用（Meyer P2008, J Biol Chem.283(51):36011-8.）。pyrG编码CTP合酶，催化UTP合成CTP，但该酶受到其产物CDP的反馈抑制，对该酶第160位天冬氨酸到谷氨酸(D160E)，或第162位谷氨酸到丙氨酸(E162A)或第168位谷氨酸到赖氨酸(E168K)的突变可有效解除CDP对其反馈抑制作用（Zhu2014,ProteinEngineering, Design & Selection 27(7 ). 225–233）。
另外在嘧啶核苷酸合成中，核糖是通过核糖磷酸焦磷酸为前体物合成到核苷上的，核糖磷酸焦磷酸激酶（Prs）催化5-磷酸核糖与ATP反应合成核糖磷酸焦磷酸PRPP。但是大肠杆菌来源的核糖磷酸焦磷酸激酶受到ADP的反馈抑制，而 Prs 上的第128位的天冬氨酸到丙氨酸的突变(D128A)可有效解除ADP对其反馈抑制作用(Shimaoka 2007 J BiosciBioeng 103(3):255-61.)。
有益效果：本发明具有以下优点：（化学合成）与现有技术相比，本发明所述的生产胞苷的重组微生物以及应用该重组微生物利用生物法生产实现胞苷的高产量生产方法，并具有以下有益效果：通过利用遗传操作的生物材料的方法建立重组微生物，改造微生物，并利用微生物发酵的方法，使其增强胞苷的合成并积累在其生长的基质中，就可以有效地实现胞苷大规模工业化生产，从而降低胞苷的生产成本和减少污染，绿色环保，具有较高的推广应用价值。
附图说明：
图1为大肠杆菌胞苷的代谢路径示意图；
图2为胞苷检测的HPLC图谱。
其中：carbamoyl phosphate：氨甲酰磷酸；carbamoyl aspartate：氨甲酰天冬氨酸；orotate：乳清酸盐；OMP：乳清酸-5'-单磷酸；UMP：尿苷-5'-单磷酸；UDP：尿苷-5'-二磷酸；UTP：尿苷-5'-三磷酸；UdR：尿苷；CdR：胞苷；CTP：胞苷-5'-三磷酸；CDP：胞苷-5'-二磷酸；CMP：胞苷-5'-单磷酸；Cytosine：胞嘧啶；PyrE：乳清酸磷酸核糖转移酶；PyrH：尿苷-5'-单磷酸激酶；PyrG：胞苷-5'-三磷酸合成酶；CTPase：胞苷-5'-三磷酸焦磷酸化酶；CMPase：胞苷-5'-单磷酸磷酸化酶；Cmk：胞苷-5'-单磷酸激酶；Udk：胞苷/尿苷激酶；Cdd：胞苷脱氨酶；RihA、B、C：嘧啶特异性核糖核苷水解酶1，2，3； XTPase：胞苷-5'-三磷酸磷酸化酶；PND：胞苷-5'-二磷酸磷酸化酶；Ndk：核苷二磷酸激酶。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
本发明的技术方案可以应用大肠杆菌，枯草杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳杆菌或者其他的微生物，下以大肠杆菌，枯草杆菌为例，对技术方案进行进一步说明。
实施例1在大肠杆菌中基因敲除的方法。
本发明采用Datsenko的方法在大肠杆菌中进行基因敲除（Datsenko KA2000.Proc Natl Acad Sci USA , 97(12):6640～6645），相应的基因敲除引物 见BabaT2006 Mol Syst Biol 2(1), 0008。
实施例2 摇瓶发酵验证重组菌株的方法。
验证重组菌株在摇瓶发酵中生产胞苷的发酵培养基，具体为每升培养基中YC溶液100ml，甘油20g，5倍的盐溶液200ml，TM2溶液1ml，柠檬酸铁10mg，无水硫酸镁120mg，氯化钙111mg，硫胺素1ug，以去离子水定容，其中5倍的盐溶液为磷酸氢二钠每升30g，磷酸二氢钾每升15g，氯化钠每升2.5g，氯化铵5.0g，以离子水定容；TM2溶液为四水氯化锌每升2.0g，六水氯化钙每升2.0g，两水钼酸钠每升2.0g，五水硫酸铜每升1.9g，硼酸每升0.5g，盐酸每升100ml。发酵培养基M10中YC溶液为蛋白胨3g，酵母粉1.5g，氯化钠3g，去离子水100ml；发酵培养基M11中YC溶液为蛋白胨5g，酵母粉2.5g，氯化钠5g，去离子水100ml；发酵培养基M21中YC溶液为蛋白胨0.7g，酵母粉0.35g，氯化钠0.7g，去离子水100ml；发酵培养基M20中YC溶液为蛋白胨0.7g，酵母粉0.35g，去离子水100ml；发酵培养基M28中YC溶液为蛋白胨2g，酵母粉1g，氯化钠2g，去离子水100ml；发酵培养基M29中YC溶液为蛋白胨0.3g，酵母粉0.15g，氯化钠0.5g，去离子水100ml；发酵培养基M31中YC溶液为蛋白胨0.6g，酵母粉0.2g，去离子水100ml。上面溶液灭菌为121 °C，20 -30分钟。
摇瓶发酵过程如下：首先接种重组菌株至含有抗生素的一定量的LB培养基（著[美]J.莎姆布鲁克 黄培堂译,子克隆指南2002，1595）中，置34℃摇床中，250 rpm培养过夜；取过夜种子100 μl转移到至2 ml 含有抗生素的LB，于34 ℃摇床中，250 rpm培养4-6 h至OD 600值为1.5 左右；随后将2 ml二级种子全部转入装有18 ml 发酵培养基M11的摇瓶中，置34℃摇床中，250 rpm培养OD600值为1左右时，添加IPTG至终浓度0.1mM后，继续培养20小时左右后，取1毫升的发酵液离心后 （7000 rmp，4分钟），取上清检测，检测方法见实施例4。
实施例3 5L发酵罐利用重组菌株发酵生产胞苷的方法。
验证重组菌株在发酵罐中发酵生产胞苷的发酵培养基为MF1.16，具体为每升培养基中含硫酸铵10g，氯化钠2g，磷酸二氢钾2g，七水硫酸镁2g，甘油 25g，氯化钙105 mg，氯化锌10mg，TM2微量元素溶液1mL，柠檬酸铁 9.4 mg，蛋白胨0-10g， 酵母粉0-10g，以去离子水定容。其中TM2微量元素溶液为氯化锌1.31 g，氯化钙1.01 g，四水合钼酸铵1.46 g，硫酸铜1.9 g，硼酸0.5 g，盐酸 10 mL，以去离子水定容。补料培养基为每升含甘油500g，蛋白胨0-10g，酵母粉0-10g。
发酵如下：首先准备种子，从LB平板上挑取单克隆到含有抗生素的LB试管34℃过夜培养，按接种量1%接入装100mL LB 的500 mL摇瓶，34℃培养4小时，OD至1.5~2；以接种量5%接种至装有2L发酵培养基MF1.16的5L发酵罐，37℃培养，用氨水调节pH为6.9，溶氧转速偶联，维持溶氧在30%，当溶氧高于40%时，开始偶联补料，使溶氧维持在30%-45%。发酵8小时，OD600至16~25时，降低温度至35℃，加入IPTG，使终浓度为0.5mmol/L 进行诱导，发酵27小时后开始取样检测，检测方法见实施例4。
实施例4 HPLC测定发酵液中的胞苷和相关副产物。
吸取1ml发酵液于2ml离心管中，100℃加热5分钟，冷却至室温，稀释一定的倍数，离心过0.22um的滤膜，用高效液相色谱（HPLC）检测，HPLC的参数如下：采用Agilent SB C184.6*150mm 5um，流动相为甲醇和10mM PBS(pH4.0)，流动相比例0.01-2.80分钟甲醇比例为2%，2.80-3.50分钟甲醇比例由2%上升到10%，3.50-3.60分钟甲醇比例由10%降至2%，3.60-8.5分钟甲醇比例为2%，利用紫外检测器检，测波长260 nm；初始流动相的流速为1.0 mL/min，发酵液的上样量5μL，柱温30℃。胞苷出峰时间为 3.580分钟，尿嘧啶出峰时间为2.581分钟，乳清酸出峰时间为1.780分钟，HPLC图谱如图2所示。
实施例5构建不能降解和利用胞苷的重组大肠杆菌。
微生物有两种途径来合成胞苷（CdR）和胞苷的衍生物(如CTP, CDP, CMP），一种是从头合成途径（利用葡萄糖等碳源和氮源，以5′-磷酸核糖为出发物质），一种是补救合成途径（由嘧啶碱基通过核糖基化及磷酸化而合成）。
如图1所示，在大肠杆菌中，细胞中胞苷的流向有三个，一个是胞苷被用在补救合成途径中，经胞苷/尿苷激酶（Udk）合成CMP，CMP在进一步被用来合成CDP和CTP；另一个途径是胞苷被胞苷脱氨酶（Cdd）降解为尿苷（UdR），尿苷进一步被尿苷磷酸化酶（UdP）降解为尿嘧啶。第三个流向是胞苷经核苷酸水解酶（RihA，RihB， RihC）水解为胞嘧啶（cytosine），胞嘧啶经过脱氨酶（CodA）产生尿嘧啶。本专利以大肠杆菌W3110（ATCC27325）为出发菌株，在W3110中敲除Udk、Cdd、RihA/RihB/RihC，获得了重组菌（表1），这些菌株利用和降解胞苷的能力逐渐减弱，其中重组菌HC4在摇瓶发酵中完全不能利用和降解胞苷（摇瓶中添加1g/L胞苷，发酵24h检测，剩余胞苷1g/L）。
在枯草杆菌中，胞苷经由嘧啶合成途径而来，会进一步在胞苷脱氨酶的催化下脱氨生成尿苷，本专利以ATCC21615为出发菌株，构建胞苷脱氨酶的缺失菌株（表1），在摇瓶中验证HB02不能利用和降解胞苷（摇瓶中添加1g/L胞苷，发酵24h检测，剩余胞苷1g/L）。
表 1菌株改造。
菌株 基因型
W3110 F- mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 lambda-
HC2 W3110ΔrihA
HC3 W3110ΔrihAΔudk
HC4 W3110ΔrihAΔudkΔcdd
HB02 ATCC21615Δcdd
实施例6过表达核苷酸磷酸水解酶能增加胞苷酸转化生成胞苷。
降解和利用胞苷的基因敲除之后胞苷的产量很低，说明代谢路径中生成胞苷的关键酶活性不足。大肠杆菌中的胞苷酸CMP经核苷磷酸水解酶（CMPase）水解生成胞苷和一份子磷酸。通过在重租菌种过表达CMPase，可以获得更多的胞苷。将表达不同携带编码CMPase基因的质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，通过随后在LB培养基中生长并IPTG诱导CMPase的表达后，用收集的菌体，超声破壁后用作粗酶溶液，以胞苷酸为底物进行体外转化实验，在Kuznetsova 2015 (The Journal Of Biological Chemistry Vol. 29(30),18678–18698)的条件及体系下，BL21(DE3)/pET30a-PHM8的细胞可转化CMP生成胞苷，反应1.5小时转化率可达31.3%。例如以HF8（HC4△purR△cmkΔfhuA::trc-pyrE）为宿主，分别表达pHS01、pHS01-PHM8后，在发酵培养基M21中进行摇瓶发酵后，HF8/pHS01胞苷产量只有114.12mg/L，而HF8/ pHS01-PHM8为188.35 mg/L，尿嘧啶的产量分别为35.1mg/L、132.7mg/L。实验结果表明过表达核苷酸磷酸水解酶能增加胞苷的生产。
实施例7 过表达胞苷三磷酸水解酶增加胞苷的产量。
如图1所示，大肠杆菌中的胞苷三磷酸CTP可以经三磷酸核苷焦磷酸水解酶（CTPase）水解生成胞苷酸CMP和焦磷酸，也会由核苷磷酸水解酶两步反应及经二磷酸胞苷CDP生成CMP。本专利通过过表达CTPase，来获得更多的胞苷酸 （CMP），从而增加生产胞苷的前提物。例如以HC5 (HC4ΔpurR)为宿主，表达pHS01-PHM8后，在发酵培养基M11中摇瓶发酵，胞苷产量只有16.2 mg/L，而表达pHS01-PHM8-nudG后产量增至217.1 mg/L，是之前的13.4倍；同时尿嘧啶的产量从66.7 mg/L增加到了296.9 mg/L。说明菌体自身的胞苷三磷酸焦磷酸水解酶的活性低，而CTPase的过表达能够大幅度的提高胞苷的产量。
实施例8胞苷酸激酶的缺失可增加重组菌中胞苷的产量。
细胞内的CTP、CDP及CMP三者之间可以互相转化，而CMP的回流一定程度上限制了胞苷的大量积累。胞苷酸激酶（EC2.7.4.14，EC2.7.4.25）能够催化CMP生成CDP同时消耗一份子ATP。将回流路径中编码胞苷酸激酶的基因阻断，从而促使CMP积累后，经CMP水解酶等酶促反应生成胞苷。例如在HC5 (HC4ΔpurR)、HF6 (HC5△cmk)宿主中，表达pHS01-PHM8-nudG-pyrE后，在发酵培养基M10中摇瓶发酵，胞苷产量HC5宿主只有133.8mg/L，而cmk基因敲除后HF6/pHS01-PHM8-nudG-pyrE的胞苷产量增加到为175.9 mg/L。副产物尿嘧啶的产量分别为107.6 mg/L、98.6 mg/L；乳清酸的产量分别为0 mg/L、17.8mg/L。
实施例9 过表达prs128提高胞苷的产量。
在大肠杆菌嘧啶合成途径中，核糖磷酸焦磷酸(PRPP)会在乳清酸核糖磷酸转移酶(PyrE)的作用下将磷酸基转移至乳清酸生成乳清酸单磷酸(OMP)。而PRPP的不足会成为嘧啶合成途径中的限速步骤，导致胞苷产量较低且造成副产物乳清酸的积累。核糖磷酸焦磷酸激酶（Prs）催化5-磷酸核糖与ATP反应合成PRPP。但Prs受到ADP的反馈抑制，将 Prs 的第128位的天冬氨酸突变为丙氨酸获得的Prs128, 就可以解除ADP的反馈抑制作用。例如以HF6为宿主，分别表达pX03（pHS01-PHM8-nudG-pyrE）、pHS01-PHM8-nudG-pyrE-prs128后，在发酵培养基M20中摇瓶发酵胞苷产量从429.1 mg/L提高到447.8 mg/L。
实施例10 通过过表达磷酸酶来提高胞苷的产量。
大肠杆菌中的酸性磷酸酶/磷酸转移酶(EC3.1.3.5，AphA)能够催化周质中的核苷单磷酸生成核苷 (Arsenis 1968 J Biol Chem. 243，5702-8; Passariello 2006Biochimica et Biophysica Acta 1764, 13-19 )。通过对aphA基因进行过表达，胞苷的产量得到了显著的提高。例如在HF10（W3110△rihA△udk△cdd△purR△cmkΔrihC::Ptrc-pyrE ΔnupC::Ptrc-PHM8-nudG)宿主中，分别表达pHS01-nudG、pHS01-nudG-aphA后，在5L罐中用培养基MF1.16中进行发酵，胞苷产量从19.5g/L提高到了23.4g/L。
实施例11 过表达pyrHm可以增加胞苷的产量。
UMP磷酸化生成UDP是在 pyrH编码的UMP激酶催化下进行的，但该酶（PyrH）受到其产物UTP, GTP的反馈抑制。根据Reaves 2013，通过对pyrH 的基因进行修改，使其编码酶的第93位为丙氨酸（而不是野生型PyrH的天冬氨酸）来获得不再受到UTP, GTP反馈抑制的PyrHm突变体。通过对编码pyrHm的基因进行过表达，胞苷的产量得到了提高。例如在HF10（W3110△rihA△udk△cdd△purR△cmk ΔrihC::Ptrc-pyrE ΔnupC::Ptrc-PHM8-nudG)中分别表达pHS01-nudG和pHS01-nudG-pyrHm，在发酵培养基MF1.16中5L罐发酵，胞苷产量从19.5g/L提高到26.9 g/L左右。
实施例12 过表达PyrHm可以降低副产物尿嘧啶的积累。
pyrHm的过表达，不仅可以增加胞苷的合成，而且可以减少副产物尿苷及尿嘧啶的积累。例如在HF9(W3110△rihA△udk△cdd△purR△cmkΔnupC::Ptrc-PHM8-nudG)宿主中(其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli.），该菌株已于2016年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.13427)，分别表达pHS01-nudG-PHM8-pyrE，pHS01-nudG-PHM8-pyrE-pyrHm ，在发酵培养基M31中摇瓶发酵，结果表明pyrHm的过表达在增加胞苷的同时，还明显减少尿苷及尿嘧啶的含量（见如表2）。该结果说明突变后的PyrH能够减少尿苷的前体UMP的积累，增加CTP的合成。因为胞内UMP浓度降低，所以尿苷和尿嘧啶的生产明显减少了。
表2 pyrHm的表达对重组菌株摇瓶发酵生产胞苷及副产物的影响。
菌株 胞苷(mg/L) 尿苷(mg/L) 尿嘧啶(mg/L)
HF9/pHS01-nudG-PHM8-pyrE 705 68.3 178
HF9/pHS01-nudG-PHM8-pyrE-pyrHm 847 24.6 62.8
实施例13 过表达pyrE增加胞苷的产量。
通过在质粒上和基因组上对pyrE基因进行超量表达来解除上游rph基因移码突变导致的表达缺陷，增加胞苷的产量。例如以HF8(W3110△rihA△udk△cdd△purR△cmkΔfhuA::trc-pyrE-Kan)为宿主，分别表达pHS01-nudG-PHM8、pHS01-nudG-PHM8-pyrE，在发酵培养基M21中摇瓶发酵，胞苷的产量从497.2mg/L提高到594.4mg/L。副产物尿嘧啶分别为55.2mg/L和49.1mg/L。说明过表达pyrE，可以进一步提高胞苷的产量。
实施例14 过表达pyrE可以减少乳清酸的积累。
在大肠杆菌嘧啶合成途径中， PyrE将焦磷酸核糖上磷酸核糖基转移至乳清酸生成OMP。在大肠杆菌K-12菌中，因为pyrE上游rph基因的移码导致PyrE的表达的不足，所以在嘧啶合成过程中会出现乳清酸的积累。本专利通过在大肠杆菌基因组上过表达pyrE基因来消除在产胞苷过程中积累的乳清酸。例如宿主HF6（W3110△rihA△udk△cdd△purR△cmk）和HF6ΔfhuA::pyrE的胞苷产量分别为 138.9 mg/L和235.4 mg/L，副产物乳清酸分别为310mg/L、0 mg/L，副产物尿嘧啶0mg/L、13.4mg/L。结果表明pyrE的过表达不仅消除了副产物乳清酸，而且提高了胞苷的产量。
实施例15 调整培养基中有机营养成分来优化胞苷生产。
有机营养成分（YC）为培养基中添加的有机物，不仅影响菌体的生长，而且影响胞苷和尿嘧啶的生产。本专利对发酵培养基中的YC溶液进行对比，获得了更适宜于重组大肠杆菌发酵生产胞苷的摇瓶发酵培养基。例如以HF6（W3110△rihA△udk△cdd△purR△cmk）/pHS01-PHM8-nudG-pyrE为对比菌株，分别在M9、M29、M21、M12、M28、M10中摇瓶发酵培养，胞苷及其副产物的产量如表3所示。YC比例过高会导致副产物乳清酸和尿嘧啶的大量积累，OD明显增高，同时产物胞苷的产量降低；而YC过低会导致菌体生长差，导致胞苷产量低。所以在发酵培养中，合适的有机营养成分的比例尤为重要。
表3 HF6/pX03重组菌株在不同发酵培养基发酵生产胞苷及副产物的产量。
培养基 胞苷(mg/L) 乳清酸(mg/L) 尿嘧啶(mg/L) OD<sub>600</sub>
M9 443.5 0 1.1 1.3
M29 599.8 0 2.1 1.9
M21 718.5 0 12.1 2.3
M12 480 0 76.1 2.3
M28 458.7 0 140.4 3.2
M10 175.9 17.8 98.6 3.2
实施例16 敲除编码阻遏蛋白PurR的基因可以提高胞苷产量。
嘧啶核苷合成途径第一步由氨基甲酰磷酸合成酶催化合成氨基甲酰磷酸。该酶的编码基因carAB受到代谢终产物嘌呤、嘧啶以及精氨酸的反馈阻遏作用。而嘧啶嘌呤核苷酸受由purR基因编码的阻遏蛋白的抑制。本发明通过对purR的敲除，进而解除了carAB的转录的抑制，加快了氨基甲酰磷酸的合成。例如在HC4、HC5（HC4DpurR）为宿主中表达pHS01-PHM8-nudG-pyrE，在发酵培养基M11中摇瓶发酵胞苷的产量从51.8mg/L提高到126.8mg/L，同时尿嘧啶分别为134.8mg/L和149.8mg/L。说明purR基因的敲除可以嘌呤对解除carAB的反馈阻遏，进而嘧啶的合成，提高胞苷的产量。
以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种使用重组微生物生产胞苷的方法，其特征在于：包括步骤为：
（1）在重组微生物内去除利用和降解胞苷的酶的编码基因使胞苷不再参与细胞中的代谢，所述的利用和降解胞苷的酶为胞苷/尿苷激酶Udk、胞苷脱氨酶Cdd、核糖核苷水解酶RihA和RihC、和核苷转运蛋白NupC；
（2）从CMP的去磷酸化来合成胞苷，在重组微生物内表达或超量表达对CMP有特异性的核苷酶，所述的核苷酶为酿酒酵母来源的PHM8；
（3）增强细胞中CMP的供给，在重组微生物内去除CMP激酶Cmk，表达或超量表达CTP和CDP磷酸化酶或相应的核苷酸酶，所述的CTP和CDP磷酸化酶或相应的核苷酸酶为大肠杆菌来源的NudG；
（4）对重组微生物的嘧啶合成途径的阻遏蛋白编码基因进行敲除和/或解除嘧啶合成途径终产物的反馈抑制，通过以下方法：
1）敲除氨甲酰磷酸合成酶的编码基因的转录抑制阻遏蛋白的编码基因，所述氨甲酰磷酸合成酶的编码基因的转录抑制阻遏蛋白的编码基因为PurR；
（5）过表达乳清酸核糖磷酸转移酶，所述的乳清酸核糖磷酸转移酶为大肠杆菌来源的PyrE；
（6）过表达大肠杆菌来源的尿苷-5'-单磷酸激酶PyrH的突变体D93A或对CMP有特异性的磷酸化酶，所述的磷酸化酶为大肠杆菌来源的酸性磷酸化酶AphA；
所述的重组微生物为大肠杆菌。
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