CN106701610B - 一种多粘类芽孢杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)及其培养方法和应用。所述多粘类芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No.10062，培养物名称是BD3736。本发明多粘类芽孢杆菌能够产生一种具有广谱、高抑菌效果的抑菌物质，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有明显的抑制作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)及其培养方法和应用。
背景技术
类芽孢杆菌属的很多微生物对植物具有防病作用和促生作用，因此在农业生产中具有很好的应用潜力。类芽孢杆菌可产生多种生物活性物质，如酶、抗菌物质、植物激素以及絮凝剂等，这些活性物质大多为蛋白质、多糖、多肽等。
多粘类芽孢杆菌由于其具植物防病和植物促生作用，对人畜安全和无污染等优点而受到重视，美国环保署(EPA)将其列为可在商业上应用的微生物之一。多粘类芽孢杆菌代谢产物中含有多种可利用的生物活性物质。这些活性物质按其结构分为多糖、多肽和蛋白质等，此外还有糖蛋白、核苷类似物、吡嗪类、醇醛酸等。按其功能划分，主要是抗生素、酶类、植物激素和絮凝剂等，另外还产生具有抗氧化、刺激免疫等功能的物质。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少能够产生高效抑菌物质的多粘类芽孢杆菌这一问题，提供了一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)及其培养方法和应用。本发明多粘类芽孢杆菌能够产生具有广谱、高抑菌效果的抑菌物质，并且对酸碱和温度不敏感，且在碱性条件下抑菌活性大于酸性，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有明显的抑制作用。
本发明技术方案之一：一种多粘类芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC No.10062。
本发明中，所述多粘类芽孢杆菌已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10062，培养物名称是BD3736，分类命名是Paenibacilluspolymyxa。
本发明技术方案之二：一种培养多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062的方法，其包括下述步骤：将多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062接种于培养基中培养。
本发明中，所述培养可以是各种微生物的培养方式，包括液体培养、固体培养、半固体培养等，可以是振荡培养，也可以是发酵罐深层发酵，较佳地为振荡培养。所述振荡培养的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为180转/分钟。
本发明中，所述培养的温度可以为本领域常规的温度，较佳地为25-35℃，更佳地为30℃。
本发明中，所述培养的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为1-7天，更佳地为4-6天，最佳地为5天。
本发明中，所述培养基可以为本领域培养类芽孢杆菌的常规的培养基，包括液体培养基和固体培养基，较佳地为选自PDA培养基、TYC培养基、LB培养基和牛乳中的一种，更佳地为LB培养基。所述牛乳可以为本领域常规的牛乳，较佳地为全脂牛乳和/或脱脂牛乳，更佳地为脱脂牛乳。所述牛乳的固形物含量可以为本领域常规的含量，较佳地为2-15％，更佳地为10-15％，最佳地为10％，所述百分比为所述固形物的质量占所述牛乳体积的质量体积百分比。
本发明技术方案之三：多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062在制备抑菌物质中的应用。
本发明中，所述抑菌物质可以抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。所述革兰氏阴性菌较佳地包括大肠杆菌(Escherichia coli)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)及肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)；所述革兰氏阳性菌较佳地包括单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、藤黄小球菌(Micrococcus luteus)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)及其培养方法和应用。通过培养本发明多粘类芽孢杆菌，能够获得一种具有广谱、高抑菌效果的抑菌物质，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有明显的抑制作用。
生物材料保藏信息
本发明的多粘类芽孢杆菌BD3736，已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10062，培养物名称是BD3736，分类命名是Paenibacilluspolymyxa。
附图说明
图1为本发明述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对指示菌的抑制作用。
图2为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物经Sephadex G-15柱层析后不同收集管在280nm处的紫外吸收结果。
图3为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物经Sephadex G-15柱层析后不同收集管洗脱液对沙门氏菌的抑菌活性。
图4为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物经Sephadex G-15柱层析后不同收集管洗脱液蛋白含量。
图5为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物经Sephadex G-15柱层析后不同收集管洗脱液经硫酸铵沉淀后，SDS-PAGE电泳结果。其中，M：蛋白Marker；23-26代表Sephedx G-15柱层析的收集管号。
图6为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物经SDS-PAGE电泳后各条带对肠炎沙门氏菌的抑菌效果。
图7为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对不同温度处理的稳定性。
图8为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物不同酸碱度处理的稳定性。图中竖坐标为R2-r2(R为样品加入不同pH缓冲液所产生的抑菌圈半径，r为不同pH缓冲液所产生的抑菌圈半径)。
图9为本发明所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对不同酶处理的稳定性。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择
本发明所用到的培养基成分如下：
TYC培养基：胰胨(或酪朊水解物)1.5g；酵母膏0.5g；L-胱氨酸0.02g；乙酸钠2.0g；Na2SO40.01g；NaCl 0.1g；蔗糖5.0g；蒸馏水100m L；115℃，杀菌15min。
TYC固体培养基：上述TYC培养基另加入1.8g琼脂。
LB培养基：胰胨(或酪朊水解物)1g；酵母膏0.5g；NaCl 0.5g，水100mL，115℃，杀菌15min。
LB固体培养基：上述LB培养基加入1.8g琼脂。
PDA培养基：马铃薯浸粉，0.5g；葡萄糖，2.0g；氯霉素，0.1g；蒸馏水100m L，115℃，杀菌15min。
PDA固体培养基：上述PDA培养基加入1.8g琼脂。
BHI培养基：胰胨(或酪朊水解物)1g；酵母膏0.5g；NaCl 0.5g，水100mL，115℃，杀菌15min。
糖发酵肉汤基础培养基购买自北京陆桥技术有限责任公司。
本发明中所用到的菌种：
大肠杆菌(Escherichia coli)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、藤黄小球菌(Micrococcus luteus)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
本发明中所用到的试剂：
基因组DNA提取试剂盒；购自天根生化科技有限公司。KOD plus与KOD plus 10×缓冲液(不含氯化镁)购自东洋纺(Toyobo)公司。
引物由上海生工生物工程有限公司合成。
PCR产物由上海生工生物工程有限公司进行测序。
本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
以下实施例中，所述各种牛乳的固形物含量百分比为所述牛乳中的固形物质量占所述牛乳体积的质量体积百分比。
实施例1 BD3736菌株的分离
取上海的农家腌制泡菜，以无菌方式取1g，放入10mL无菌生理盐水捣碎，用无菌生理盐水系列稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于固体TYC培养基上，30℃培养24-48小时。选取粘鼻涕状、具有良好拉丝性的单菌落多个，分别转接到新的固体TYC培养基上，得到纯化的菌落，其中之一即为BD3736菌株。
实施例2 BD3736菌株的鉴定
1、形态学鉴定
将实施例1分离得到的BD3736菌株接种到LB固体培养基、含有0.001％溶菌酶的LB固体培养基、含有3％NaCl的LB固体培养基和PDA固体培养基上，所述百分比为占所述LB固体培养基或所述PDA固体培养基质量的质量百分比。大气条件下培养箱中30℃培养18h至对数生长期且菌落大小稳定时，进行菌落形态观察，主要包括氧利用、菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。
结果显示，所述BD3736菌株兼性好氧，在0.001％的溶菌酶或者3％NaCl中不生长，在LB固体培养基上呈薄层、似变形虫的移动扩散状；在PDA固体培养基上为大型粘液状，乳白至浅黄色，表面光滑，中央常有小突起。
进一步对处于对数生长期的BD3736菌株经涂片后进行美蓝染色、芽孢染色和革兰氏染色，光镜下观察菌体和芽孢形态及革兰氏染色特性。结果表明，菌体杆状，芽孢膨大，呈椭圆形，位于菌体的中间，革兰氏染色阳性。
2、生理生化特征分析
采用常规方法对BD3736菌株进行生理生化特性分析，试验项目及其结果见表1。
表1 BD3736菌株的理化实验结果
1)取180mm×16mm的试管，每试管中加糖发酵肉汤基础培养基，高压灭菌，分别加入0.22μm的膜过滤的糖，使其终浓度为50mM；
2)挑取LB平板培养的的多粘类芽孢杆菌BD3736菌株2-3环接入30mLLB培养基中，置于30℃下，180r/min振荡培养18h。无菌条件下12000rpm离心10min收集菌体。用生理盐水0.9％(w/v)NaCl洗涤2次，重悬于1mL糖发酵肉汤基础培养基；
3)往步骤1)试管中接种10μL步骤2)重悬于1mL糖发酵肉汤基础培养基的BD3736菌株，30℃培养24h，48h观察菌株的生长状况并检测菌株的糖发酵结果。结果见表2所示。
表2菌株糖发酵鉴定结果
“+”表示利用糖产酸，“-”表示不产酸。
结果显示，上述BD3736菌株的生理生化特征跟Paenibacillus polymyxa的模式菌株一致，认为其属于Paenibacillus polymyxa。
3、16s rDNA序列同源性分析
挑取如上所述LB固体培养基上培养的BD3736菌株2-3环接入30mL LB培养基中，置于30℃下，180r/min振荡培养18h。取5mL菌液12000rpm离心10min收集菌体。按基因组DNA提取试剂盒说明书上的方法提取BD3736菌株的基因组DNA作为基因扩增模板，以细菌16srDNA通用引物，27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’进行PCR反应。反应体系：KOD plus10×缓冲液(不含氯化镁)2.5μL、MgSO41.5μL，KOD plus0.5μL，2mM dNTP 2.5μL、ddH2O 16μL、10μM引物27f 1μL、10μM引物1492r 1μL、模板DNA 1μL。反应程序为：94℃预变性5min；30个循环(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸8min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目标条带测序，测序结果如序列表SEQ ID NO.1所示。所得序列通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线Blast比对。结果显示，本发明BD3736菌株16s rDNA序列与多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CF05最接近，相似性为99％，故认为BD3736菌株属于Paenibacillus polymyxa。
4、pheS基因序列同源性分析
以上述步骤中提取的BD3736基因组DNA作为基因扩增模板，以细菌pheS引物，pheS-f：5’-atgagcgaaaccatccaaatg-3’，pheS-r：5’-ttattgacgcgcaaactgctt-3’进行PCR反应。反应体系：KOD plus10×缓冲液(不含氯化镁)2.5μL、MgSO41.5μL，KOD plus 0.5μL，2mM dNTP 2.5μL、ddH2O 16μL、10μM引物pheS-f 1μL、10μM引物pheS-r 1μL、模板DNA 1μL。反应程序为：94℃预变性5min；30个循环(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min)；72℃延伸8min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目标条带送测序，测序结果如序列表SEQ ID NO.2所示。所得序列通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线Blast比对。结果显示，上述BD3736菌株的pheS基因序列与Paenibacillus polymyxa strain CF05相似性最高，但相似性仅为98％，故两者属于不同菌株。
实施例3 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736来源的抗菌物质的提取
1、BD3736菌株的培养
取20％甘油保存的BD3736菌株，接种到LB固体培养基上，在大气条件下30℃恒温箱中48h。然后，刮取一环单菌落于15mL固形物含量为10％灭菌脱脂牛乳中，30℃、180r/min恒温振荡培养24h，制得BD3736菌株种子发酵液。
在500mL三角瓶中装入130mL固形物含量为10％灭菌脱脂牛乳，将上述BD3736菌株种子发酵液按照4％(v/v)的接种量接种，30℃、180r/min恒温振荡5天，得BD3736菌株发酵液。
2、BD3736菌株发酵液提取物的制备
将如上所述BD3736菌株发酵液在60℃下水浴10min，冷却至室温，9000r/min，离心25min，收集上清液。在磁力搅拌的作用下，缓慢加入硫酸铵粉末，使盐离子终饱和度达到80％，所述百分比为所述盐的质量占所述上清液和盐的总体积的质量体积百分比，过夜沉淀。然后9000r/min离心25min，收集沉淀物。将上述沉淀物重悬入去离子水中，即得BD3736菌株发酵液提取物粗品。
实施例4 BD3736菌株发酵液提取物的纯化
(1)将实施例3所述BD3736菌株发酵液提取物粗品利用截留值分别为3500Da和1000Da的透析袋，4℃过夜透析，收集袋内的样品。将透析液冷冻干燥，得冻干粉。
(2)将步骤(1)得到的冻干粉用超纯水溶解到质量浓度200mg/mL，上样量10mL，过Sephadex G-15(柱体积约800mL)凝胶柱层析分离。洗脱液为pH 7.0的超纯水，流速为3mL/min。每4min收集一管，每管约12mL。用蛋白紫外检测仪在280nm处检测。实验结果见图2。
将上述收集到的样品蒸干水相。测定对沙门氏菌的抑菌圈直径，实验结果见图3。结果显示，14-16、23-30两段收集管(分别用A、B表示)表现出明显的抑菌活性，且两段收集管的洗脱时间比较接近，A为64min，B为96min，说明它们的分子量比较接近。
(3)利用蛋白定量试剂盒，将步骤(2)得到的不同收集管，分别检测蛋白含量。结果见图4。
实施例5 BD3736菌株发酵液提取物的相对分子质量的分析
(1)SDS-PAGE电泳。
取实施例4中编号为23-26号的收集管中收集的样品点样跑SDS-PAGE胶，实验结果见图5。结果显示，样品经电泳后出现两条明显的色带，分子量分别37kD～25kD和10kDa以下。
(2)将步骤(1)得到的两个条带，用无菌蒸馏水反复浸洗后，测试不同分离条带的抑菌作用。实验结果见图6，结果显示，低于10kD区域出现的条带具有抑菌活性。
实施例6 BD3736菌株发酵液提取物的对温度的稳定性
将实施例3所制得的BD3736菌株发酵液提取物粗品分别在60℃、80℃和100℃中水浴30min和121℃温度下处理15min，未经热处理的样品CK作为对照。利用如实施例2所述制得的指示菌(肠炎沙门氏菌)平板，在牛津杯分别加100μL上述样品测其抑菌圈直径。实验结果见图7，结果显示，BD3736菌株所产抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物粗品在60℃、80℃、100℃温度下处理30min后，抑菌活性均没有发生明显变化；甚至经121℃处理15min后，活性也没有丧失。可见BD3736菌株的抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物具有较好的热稳定性。
实施例7 BD3736菌株发酵液提取物对酸碱度的稳定性
用不同pH范围的缓冲液将如实施例3所制得的BD3736菌株发酵液提取物粗品pH分别调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，室温放置2h，以对应pH值的缓冲液为对照，利用如实施例2所述制得的指示菌(肠炎沙门氏菌)平板，在牛津杯分别加100μL上述样品测其抑菌圈直径。
实验结果见图8，结果显示，本发明所述BD3736菌株发酵液提取物能耐受较宽范围的酸碱度，且在碱性条件下抑菌活性大于酸性。
实施例8 BD3736菌株发酵液提取物的酶的稳定性
分别配制5mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、脂肪酶(pH分别为1.5、7.5、7.5和6.5)，各取100μL于离心管中，加入实施例3所制得的BD3736菌株发酵液提取物粗品400μL，使酶的终浓度为1mg/mL。在各蛋白酶的最适温度下(胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶分别为40℃、37℃、55℃和26℃)恒温水浴酶解4h，置100℃沸水水浴5min使酶失活。再将pH值调回6.0，用20mmol/mL PBS缓冲液将体积补至同一体积，以100μL超纯水加400μL细菌素为对照。利用如实施例2所述制得的指示菌(肠炎沙门氏菌)平板，在牛津杯分别加100μL上述样品测其抑菌圈直径。实验结果见图9，结果显示，本发明所述BD3736菌株发酵液提取物对胃蛋白酶、蛋白酶K部分敏感，对脂肪酶、胰蛋白酶不敏感。依据此推测该BD3736菌株发酵液提取物为蛋白类物质。
实施例9 BD3736菌株发酵液的抑菌谱
1、指示菌平板的制备
将20％甘油保存的病原菌，分别转接到BHI固体培养基，30℃培养48h。然后刮取一环单菌落转接到液体BHI中，30℃培养24h。12000rpm离心5min收集菌体，用无菌水稀释，制成菌悬液。利用血球计数板计数，控制终始菌浓为106cfu/mL。
待BHI固体培养基冷却至55℃，与制备好的所述指示菌菌悬液混匀倒平板，每个培养皿内倒入20mL左右培养基。凝固并充分晾干后即得指示菌平板。
2、BD3736菌株发酵所产生抑菌物质的抑菌谱
以大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)为革兰氏阴性菌代表，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄小球菌(Micrococcus luteus)为革兰氏阳性菌代表。在指示菌平板上放置牛津杯，然后加100μL实施例3所获得的BD3736菌株发酵液提取物粗品，检测对其是否有抑制作用。
实验结果见图1，结果显示，本发明所述BD3736菌株发酵液提取物对大肠杆菌、志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、藤黄小球菌及枯草芽孢杆菌均有比较明显的抑制作用，而对金黄色葡萄球菌没有抑制作用。因此BD3736菌株发酵液提取物具有抑菌活性，并具有广谱、高效抑菌效果。
实施例10 BD3736菌株发酵液提取物的发酵时间的优化
将如实施例3所述装入500ml三角瓶中的130ml固形物含量10％灭菌脱脂牛乳的发酵液连续发酵，每隔1天取样一次。
在实施例9所述的指示菌平板上等间隔放置无菌牛津杯，取100μL上述发酵液加入牛津杯中，每个样品2个重复，将加好样的培养皿，30℃恒温培养36h后，测量抑菌圈的直径(mm)。结果如表3所示。
表3 BD3736菌株不同时间的发酵上清液对沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺氏菌的抑菌效果
注：抑菌圈试验结果判定标准：抑菌圈直径(mm)＞20：极敏感；抑菌圈直径(mm)在15～20：高敏感；抑菌圈直径(mm)在10～14：中敏感；抑菌圈直径(mm)＜10：低敏感；抑菌圈直径(mm)为0：不敏感。
从表3可知，BD3736菌株第5天的发酵上清液抑菌活性明显最强，抑菌圈平均直径约为13.08mm，且该抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对肠炎沙门氏菌抑菌作用最强，因此本发明以肠炎沙门氏菌作为指示菌代表。
实施例11多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736来源的抗菌物质的提取
1、BD3736菌株的培养
取20％甘油保存的BD3736菌株，接种到LB固体培养基上，在大气条件下30℃恒温箱中48h。然后，刮取一环单菌落于15mL固形物含量为10％灭菌脱脂牛乳中，30℃、180r/min恒温振荡培养24h，制得BD3736菌株种子发酵液。
在500mL三角瓶中装入130mL灭菌生鲜牛乳，将上述BD3736菌株种子发酵液按照4％(v/v)的接种量接种25℃、180r/min恒温振荡5天，得BD3736菌株发酵液。所述灭菌生鲜牛乳的固形物含量为11％。
2、BD3736菌株发酵液提取物的制备
将如上所述BD3736菌株发酵液在50℃下水浴15min，冷却至室温，9000r/min，离心25min，收集上清液。在磁力搅拌的作用下，缓慢加入硫酸铵粉末，使盐离子终饱和度达到80％，所述百分比为所述盐的质量占所述上清液和盐的总体积的质量体积百分比。过夜沉淀。然后9000r/min离心25min，收集沉淀物。将上述沉淀物重悬入去离子水中，即得BD3736菌株发酵液提取物粗品。
测定如上所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对指示菌平板(沙门氏菌)的抑菌圈直径。结果显示，抑菌圈直径为14.5mm。
实施例12多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736来源的抗菌物质的提取
1、BD3736菌株的培养
取20％甘油保存的BD3736菌株，接种到LB固体培养基上，在大气条件下30℃恒温箱中48h。然后，刮取一环单菌落于15mL固形物含量10％灭菌脱脂牛乳，30℃、180r/min恒温振荡培养24h，制得BD3736菌株种子发酵液。
在500mL三角瓶中装入130mL灭菌脱脂牛乳，将上述BD3736菌株种子发酵液按照4％(v/v)的接种量接种25℃、180r/min恒温振荡5天，得BD3736菌株发酵液。所述灭菌脱脂牛乳的固形物含量为2％。
2、BD3736菌株发酵液提取物的制备
将如上所述BD3736菌株发酵液在50℃下水浴15min，冷却至室温，9000r/min，离心25min，收集上清液。在磁力搅拌的作用下，缓慢加入硫酸铵粉末，使盐离子终饱和度达到80％，所述百分比为所述盐的质量占所述上清液和盐的总体积的质量体积百分比。过夜沉淀。然后9000r/min离心25min，收集沉淀物。将上述沉淀物重悬入去离子水中，即得BD3736菌株发酵液提取物粗品。
测定如上所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对指示菌平板(沙门氏菌)的抑菌圈直径。结果显示，抑菌圈直径为13mm。
实施例13多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736来源的抗菌物质的提取
1、BD3736菌株的培养
取20％甘油保存的BD3736菌株，接种到LB固体培养基上，在大气条件下30℃恒温箱中48h。然后，刮取一环单菌落于15mL固形物含量为10％灭菌脱脂牛乳中，30℃、180r/min恒温振荡培养24h，制得BD3736菌株种子发酵液。
在500mL三角瓶中装入130mL灭菌脱脂牛乳，将上述BD3736菌株种子发酵液按照4％(v/v)的接种量接种35℃、180r/min恒温振荡5天，得BD3736菌株发酵液。所述灭菌脱脂牛乳的固形物含量为15％。
2、BD3736菌株发酵液提取物的制备
将如上所述BD3736菌株发酵液在80℃下水浴5min，冷却至室温，9000r/min，离心25min，收集上清液。在磁力搅拌的作用下，缓慢加入硫酸铵粉末，使盐离子终饱和度达到80％，所述百分比为所述盐的质量占所述上清液和盐的总体积的质量体积百分比。过夜沉淀。然后9000r/min离心25min，收集沉淀物。将上述沉淀物重悬入去离子水中，即得BD3736菌株发酵液提取物粗品。
测定如上所述抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物对指示菌平板(沙门氏菌)的抑菌圈直径。结果显示，抑菌圈直径为14mm。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明的相关条件作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.10062。
2.一种培养如权利要求1所述多粘类芽孢杆菌的方法，其特征在于，其包括下述步骤：将多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062接种于培养基中培养。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述培养的温度为25-35℃。
4.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述培养为振荡培养。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述振荡培养的转速为180转/分钟。
6.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述培养的时间为1-7天。
7.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述培养基为选自PDA培养基、TYC培养基、LB培养基和牛乳中的一种。
8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述牛乳为全脂牛乳和/或脱脂牛乳；和/或，所述牛乳的固形物含量为2–15％，所述百分比为所述固形物的质量占所述牛乳体积的质量体积百分比。
9.如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌在制备抑菌物质中的应用。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述抑菌物质抑制大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)和藤黄小球菌(Micrococcus luteus)。
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