CN106661082A - 用于从微藻生物质提取可溶性蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，其特征在于它包括以下步骤：供给一种由发酵产生的微藻生物质，洗涤该生物质，以便消除可溶性间质化合物并且浓缩该生物质，在卧式球磨机类型系统中对经过洗涤并且浓缩的生物质进行机械研磨，以产生一种乳液，将由此产生的乳液变构，三相分离，以便从包含脂质和细胞碎片的部分中分离可溶性部分，回收由此产生的可溶性部分，以产生可溶性分离蛋白，然后将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。

Description

用于从微藻生物质提取可溶性蛋白的方法

本发明涉及一种用于从微藻生物质提取可溶性蛋白的方法。

本发明还涉及以此方式获得的微藻分离蛋白。

背景技术

所属领域技术人员熟知，小球藻是一种潜在的食物来源，因为它们富含蛋白质和其他必需营养素。

它们被描述为包含45％的蛋白质、20％的脂肪、20％的碳水化合物、5％的纤维素和10％的矿物质和维生素。

鉴于其丰度和氨基酸谱，微藻蛋白因此被认为是大豆蛋白或豌豆蛋白的替代性食物来源。

蛋白部分也可以被开发为化妆品行业、或甚至医药行业中的功能剂。

然而，由于在所述部分中存在不希望的化合物(例如叶绿素)而导致包含它们的食物组合物的颜色、味道和结构方面发生不希望的变化，所以在微藻蛋白的食品应用方面的发展尚不显著。

为了增加其在食品应用中的潜力，并且也为了增加其商业价值，必须在不影响它们的分子结构的前提下从微藻中提取这些蛋白。

“软”提取技术将因此需要分离具有高溶解度和良好技术和功能特性的蛋白质，但是微藻细胞壁的刚性，尤其绿色微藻的刚性，根本上与这一点矛盾，这是因为它破坏了细胞内蛋白质的提取和完整性。

因此，与其相反，常规地“硬”的物理或化学条件被用来破坏微藻细胞壁。

因此，许多研究提出了通过有机溶剂型或高压匀浆类型进行提取的技术。

然而，在这些技术选择中，蛋白质的变性未认为是麻烦的，这是因为大多数的这些方法开发，是出于分析的目的，或意在提供用于酶消化的底物，从而产生水解蛋白。

然而，保存细胞组分完整性的有效崩解方法不仅应最大化产率，而且应最大化提取的产物的质量。

换言之，用于优化崩解壁的方法必须例如避免：

-目标产物的化学污染，

-使用过高的破裂能；后者可能导致感兴趣的细胞内分子的不可逆变性或降解。

此外，对于大规模生产而言，对于选择的方法，重要的是可转换值这一规模。

最后，这一细胞崩解步骤的引入必须是容易的，并且必须对随后的方法/处理步骤不具有负面影响。

所有这些限制影响崩解方法的效率并且由于同样原因影响其能量消耗。

这就是为什么珠磨机技术是优选的，因为它被认为对于按其天然形式释放细胞内蛋白质是有效的。

在珠磨机中，将细胞与小球形颗粒一起以悬浮液状态搅动。细胞的破碎是由珠间剪切力、碾磨以及与珠的碰撞引起的。

例如，专利US 5 330 913中给出了一种适合的珠磨机的描述。这些珠使细胞破裂以从中释放细胞内容物。然后以“水包油”乳液形式获得粒径小于起源细胞的悬浮液。

通常雾化此乳液并且消除水，然而留下包含由细胞碎片、间质可溶性化合物和油组成的异质混合物的干燥粉末。

在使用这些细胞崩解技术时难以解决的是单独地分离细胞内内容物(以便排除膜碎片、糖、纤维和脂肪)，并且尤其是保存蛋白负载的质量。

在四爿藻属的微藻的情况下，安雅施文茨法伊尔(Anja Schwenzfeier)等人(生物资源技术(Bioresource Technology)，2011，102，9121-9127)提出了保证分离蛋白质的溶解度和氨基酸谱质量的方法，其中污染物(例如染色物质)被除去，该方法包括以下步骤：

-用珠磨机进行细胞崩解，

-将磨碎的微藻悬浮液离心，

-上清液的透析，

-穿过离子交换树脂，

-洗脱物的透析，

-脱色，然后

-洗涤和再悬浮。

然而，这种实验室方法(用于处理24g的生物质)不能放大到工业规模，其中而将珠磨机方法用于回收完整生物质。

此外，该方法不适合在其生物质中包含并非不显著脂质含量的微藻(例如在原壳小球藻中，脂质含量大于15％)。

的确，即使在细胞壁的这种“相对软的”破裂之后，磨碎的细胞材料呈相对稳定的络合物“水包油”乳液的形式。

因此，而在此阶段通常通过溶剂或机械地提取细胞组分，但是这有损害于其完整性。

现有技术提出了第一解决方案，并且此外由本申请人公司测试了该第一解决方案，该方案包括将机械研磨与蒸发偶联，以便尝试将该乳液去稳定化，然后包括通过离心分离脂肪部分。

然而，该分离步骤(碱性乳油化)的差的质量使得这种相分离方法的效率非常低。

即使在此阶段推荐添加乙醇(20％-30％/原始)改进了该乳液的去稳定化，然而它仅使能够实现50％的级别的脱脂，甚至在低产率的情况下。

此外，当该脂质部分与蛋白/多糖基质结合时，该机械途径是特别难以实施或甚至不可能实施的。

另一个解决方案提出使用中性溶剂。然而，它面临巨大的限制(质量、安全性、法规等)。

发明主题

其结果是，对于提取并稳定化感兴趣的微藻的细胞组分的技术(通过机械研磨释放所述细胞组分)存在未满足的需要。

本申请人公司已经发现，这一需要可以通过如下方式满足：通过提出从现有技术中已知的那些方法的替代方法，通过将用于机械研磨微藻细胞的方法与用于使通过选自由碱处理和酶处理组成的组中的处理产生的脂质部分变构的步骤，随后是离心的步骤组合。

然后通过微孔过滤将脱脂可溶性部分澄清，然后超滤，以获得该分离蛋白。

因此，本发明涉及一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

-提供一种由发酵产生的微藻生物质，

-洗涤该生物质，以便消除间质可溶性化合物，并且浓缩，

-在卧式珠磨机类型系统中实施对经过洗涤并且浓缩的生物质的机械研磨，以获得一种乳液，

-将以此方式获得的乳液变构，

-三相分离，以便从包含脂质和细胞碎片的部分中分离可溶性部分，

-尤其通过微孔过滤，回收以及任选的澄清以此方式获得的可溶性部分，以便从中除去残留不溶性物质，以便获得可溶性分离蛋白，

-在具有小于5kDa，优选在1kDa和5kDa之间的截止阈值的膜上对澄清的可溶性部分进行任选的超滤，以便获得一种可溶性分离蛋白，

-在pH 7下进行任选的中和，

-将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。

微藻生物质的选择

优选地，小球藻属微藻选自由普通小球藻、根腐小球藻和原壳小球藻组成的组，并且更具体地是原壳小球藻。

在一个具体实施例中，该菌株为原壳小球藻(菌株UTEX 250-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心(The Culture Collection of Algae at the Universityof Texas at Austin-USA))。

在另一个具体实施例中，该菌株为耐热性小球藻(菌株UTEX 1663-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心(The Culture Collection of Algae at theUniversity of Texas at Austin-USA))。

在异养条件下并且在不存在光的情况下进行培养通常导致产生具有按干细胞的重量计，45％至70％的蛋白含量(通过测量氮含量N×6.25进行评估)的小球藻生物质。

如将在下文示例，分两个步骤进行这一培养：

-在包含葡萄糖和酵母提取物的培养基中进行预培养，在28℃下，伴随搅动，持续72h，然后

-自身在葡萄糖和酵母提取物中持续多于36h，在28℃下，伴随搅动并且在用氨水调节的pH 6.5下，进行用于产生生物质的培养，

这生成具有按干细胞的重量计，52％的级别的蛋白含量(用N x 6.25进行评估)的大约80g/l的生物质。

然后通过固液分离，通过正面过滤或切向过滤、或通过另外为本领域普通技术人员已知的任一方式收集生物质。

有利地，本申请人公司然后推荐洗涤并浓缩生物质，以便通过生物质的一系列的浓缩(通过离心)/稀释来消除间质可溶性化合物。

在工业规模上，有利地选择通过分一个阶段或两个阶段的离心，来进行顺序稀释和离心。

出于本发明的目的，术语“间质可溶性化合物”旨在意指发酵培养基中的所有可溶性有机污染物，例如水溶性化合物，例如盐、残留葡萄糖、具有2或3的聚合度(或DP)的寡糖、或肽。

然后将其间质可溶性化合物的以此方式纯化的生物质优先调节至按重量计15％和30％之间的干物质，优选调节至20％和30％之间的干物质。

对于本发明的方法的剩余部分，以此方式获得的生物质可以被用作为，或被热透化(通过高温短时或HTST方法-同样由本申请人公司开发并且在其迄今仍未公开的申请之一中加以保护)，以便从中释放可溶性肽的内容物。

可以通过随后的以下步骤来提取此生物质的残留蛋白。

生物质研磨

本申请人公司推荐使用(卧式)珠磨机技术。

更具体地，有利地，可以根据由本申请人公司已经开发的并且在其迄今未审查的申请之一中加以保护的方法来实施该研磨，其中：

-硅酸锆珠的表观密度在2kg/l和3.5kg/l之间，并且

-研磨室的填充率大于或等于80％。

按连续模式，例如通过串联连续多遍来实施该研磨。

选择待研磨的微藻的密度在小于250g/l的水平。

在研磨结束时，获得一种乳液。

乳液的变构及其组分的分离

为了从中提取感兴趣的肽的和多肽部分，乳液的组分的分离需要将由细胞研磨得到的乳液(脂质、蛋白-肽和多肽-以及细胞碎片的复杂混合物)变构/去稳定化。

可以通过以下方式来促进该乳液的这种变构/去稳定化：

-通过酶预消化，尤其是通过特异性蛋白酶，通过用极性溶剂进行处理和/或通过靶向乳液蛋白部分的受控碱处理，

-抑或通过调节pH和温度，通过用极性溶剂进行处理和/或通过靶向与乳液脂质部分的界面的酶消化，尤其是纤维素酶类型的酶消化。

因此，在装有低剪切搅拌模块的搅拌式反应器中调节研磨的细胞材料，以便限制乳化，同时使得能够进行促进所选择的特定处理(设定pH，水解酶的作用等)的均匀混合。

例如，在目的在于经由酶途径(例如通过碱性蛋白酶)通过处理混合物中的蛋白部分来使乳液去稳定化的处理的情况下，将乳液的温度和pH调节至针对所述蛋白酶的反应条件：

-将温度调节至大于30℃的值，优选为60℃的级别，并且

-将pH调节至大于7的值，优选为8的级别，(或甚至任选地为10的级别，如果仅仅利用了pH的作用)。

反应的持续时间在2h和8h之间。

在裂解结束时，可以按大于5％(v/v)将乙醇作为针对乳液的去稳定剂添加至反应混合物中(在水包油乳液的情况下)。

可以通过三相分离(例如通过离心)使以此方式去稳定化的乳液(部分地)分裂。

因此，获得了3个相：

-上层脂质乳膏，

-水性/中间的(＝“原始”可溶性物质)可溶性化合物(和残留不溶性物质)相，以及

-集中细胞碎片的球粒。

可溶性部分基本上由主要的蛋白部分、可溶性糖、盐和残留脂质小球组成。

膜分离

为了释放肽和多肽，本发明的方法接下来导致优选通过膜分级来分离感兴趣的蛋白。

因此，本申请人公司推荐分三个步骤进行该方法：

-将以此方式获得的可溶性部分通过微孔过滤进行回收和澄清，以便从中除去残留不溶性物质，

-在具有小于5kDa，优选在1kDa和5kDa之间的截止阈值的膜上对澄清的可溶性部分进行超滤，并且

-在6和8之间，优选在7的pH值下，进行任选的中和。

利用这些通路使可能纯化其残留的盐和糖的可溶性肽和多肽。

在pI下的沉淀

可替代地，为了分离感兴趣的肽和多肽，可以做出选择来进行分三个步骤的方法：

-通过调节介质的pH至4和5之间的值，在其pI下沉淀蛋白质，

-离心或者微孔过滤，以便回收沉淀的蛋白，并且

-在6和8之间，优选7的pH下，溶解于水中。

应注意，尽管根据本发明的方法，后两个步骤使得可能获得具有按重量计大于80％，优选大于90％蛋白含量的分离蛋白，但是通过其实施方法，它们导致了本质上不同的组成。

获得呈粉末形式的分离物

以此方式获得的呈可溶形式的分离蛋白可以进行以下处理：

-通过蒸发进行浓缩，

-巴氏灭菌，并且最后

-雾化。

从以下实例将更清楚地理解本发明，所述实例旨在是说明性的，并且是非限制性的。

实例

实例1：通过分批补料发酵进行原壳小球藻的生产

使用的藻种是原壳小球藻UTEX 250。

预培养：

-在一个2l锥形瓶中的500ml的培养基；

-该培养基的组成(以g/l计)：

表1

孵育在以下条件下进行：持续时间：72h；温度：28℃；搅动：110rpm(伊孚森莫特顿(Infors Multitron)孵育器)。

然后将预培养物转移到30l赛多利斯(Sartorius)型发酵罐中。

用于生物质生产的培养：

该培养基如下：

表2

在接种后将发酵罐的初始体积(Vi)调节至17l。达到大约20l-25l的最终体积。

用于进行发酵的参数如下：

表3

温度	28℃
		pH	5.0-5.2，使用28％w/w NH3
pO2	20％±5％(通过摇动来维持)
		摇动	最小300rpm
气流速率	15l/min

当残留葡萄糖浓度下降至低于10g/l时，则引入处于在大约800g/l的浓缩溶液形式的葡萄糖，以维持发酵罐中的葡萄糖含量在0与20g/l之间。

结果

在40h时获得包含52％的蛋白的80g/l的生物质。

实例2.研磨原壳小球藻生物质并且回收可溶性部分-通过处理肽和多肽部分，将 乳液变构

将根据实例1获得的生物质洗涤并且通过离心浓缩，以便达到220g/l的干物质含量并且达到多于90％的纯度(用生物质的干物质与总干物质的比率定义纯度)。

然后通过用硅酸锆珠(0.6mm直径，表观密度2.4)的珠磨(卧式珠磨机)来将其研磨。

然后在装有海洋推进器和挡板的反应器中搅动研磨的生物质。温度被调节为60℃，并且pH被氢氧化钾调节到8。添加结合纤维素酶的碱性蛋白酶，其中这些反应条件被维持持续6h。

然后在使可能获得3个相的三相离心机上将乳液离心，这三个相是：上层脂质乳膏，水性/中间的(＝“原始”可溶性物质)可溶性化合物(和残留不溶性物质)相，以及集中细胞碎片的球粒。

通过微孔过滤来使原始可溶性物质的部分澄清。微孔过滤渗透物“P1”具有55％和70％之间的滴度的肽和蛋白(表示为总氨基酸)，并且然后在具有<5kDa截止阈值的膜上进行超滤。

以此方式获得的超滤渗余物“R2”包含80％以上具有大于或等于5kDa的分子量的肽。

渗透物“P2”包含具有小于5kDa的分子量的肽和寡糖以及残留的盐。

然后尤其可以在反渗透膜(具有93％的NaCl排斥程度)上过滤这一渗透物“P2”，以获得：

ο渗余物“R3”，包含具有小于5kDa的分子量的肽和DP 2的寡糖，例如蔗糖；以及

ο渗透物“R3”，包含DP 1的寡糖、盐、游离氨基酸和有机酸。

然后将分离蛋白“R2”：

-用氢氧化钾中和至pH 7，

-通过蒸发浓缩至35％干物质(DM)，

-巴氏灭菌，然后

-雾化。

实例3.研磨原壳小球藻生物质并且回收可溶性部分-通过处理脂质部分，将乳液 变构

根据如实例2中所述的相同顺序，在装有海洋推进器和挡板的反应器中搅动研磨的生物质。温度被调节至50℃，而不调节pH(自然地在5和6之间)。

添加在此pH和温度范围中具有最佳活性的纤维素酶，其中将这些反应条件维持6h的持续时间。

在反应结束时，pH被调节至8，之后分离为3个相。

操作的剩余部分如在实例2中所述。

Claims (7)

1.一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，其特征在于它包括以下步骤：

-提供一种由发酵产生的微藻生物质，

-洗涤该生物质，以便消除间质可溶性化合物并且浓缩，

-在卧式珠磨机类型系统中实施对经过洗涤并且浓缩的生物质的机械研磨，以获得一种乳液，

-将以此方式获得的乳液变构，

-三相分离，以便从包含脂质和细胞碎片的部分中分离可溶性部分，

-回收以此方式获得的可溶性部分，以获得可溶性分离蛋白，然后

-将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于这些小球藻属微藻选自由普通小球藻、根腐小球藻和原壳小球藻组成的组，并且更具体地是原壳小球藻。

3.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于通过酶预消化、通过用极性溶剂进行处理和/或通过靶向该乳液的蛋白部分的受控碱处理，来使该乳液变构。

4.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于通过调节pH和温度、通过用极性溶剂进行处理和/或通过靶向与该乳液的脂质部分的界面的酶消化，来使该乳液变构。

5.如权利要求1到4中任一项所述的方法，其特征在于经过变构的乳液的三相分离是通过离心进行的。

6.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于通过以下方式从该可溶性部分获得该可溶性分离蛋白：

-通过微孔过滤将所述可溶性部分澄清，以便从中除去残留不溶性物质，

-在具有小于5kDa的截止阈值的膜上对澄清的可溶性部分进行超滤，并且

-任选地，在6和8之间，优选在7的pH值下，进行中和。

7.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于通过以下方式从该可溶性部分获得该可溶性分离蛋白：

-通过将介质的pH调节至4和5之间的值，在其pI下沉淀蛋白，

-离心或者微孔过滤，以回收沉淀的蛋白，并且

-在6和8之间，优选7的pH下，溶解于水中。