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CN106659165B - 含水流动状组合物及其制造方法、以及溶菌酶加工品和/或其盐、及其制造方法 - Google Patents

含水流动状组合物及其制造方法、以及溶菌酶加工品和/或其盐、及其制造方法 Download PDF

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CN106659165B CN201580041459.9A CN201580041459A CN106659165B CN 106659165 B CN106659165 B CN 106659165B CN 201580041459 A CN201580041459 A CN 201580041459A CN 106659165 B CN106659165 B CN 106659165B
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Abstract

含水流动状组合物是包含溶菌酶加工品和/或其盐的含水流动状组合物，前述含水流动状组合物的下述规定的荧光强度为5000以上，前述含水流动状组合物中，前述溶菌酶加工品和/或其盐在接触极性有机溶剂的状态下溶解于该含水流动状组合物，前述含水流动状组合物中的前述极性有机溶剂的含量为55质量％以上且90质量％以下。荧光强度：按照溶菌酶加工品和/或其盐的浓度以固体成分换算达到0.05质量％且磷酸盐的浓度达到0.2M的方式，用磷酸缓冲液(pH7.0)稀释前述含水流动状组合物，向所得稀释液5mL中添加8mM的1,8‑苯胺基萘磺酸的甲醇溶液25μL，针对使所得溶液在室温下反应30分钟后的该溶液，在激发波长390nm(激发带宽为10nm)和荧光波长470nm(荧光带宽为10nm)的条件下测得的荧光强度。

Description

含水流动状组合物及其制造方法、以及溶菌酶加工品和/或其 盐、及其制造方法
技术领域
本发明涉及含水流动状组合物及其制造方法、以及溶菌酶加工品和/或其盐、及其制造方法。
背景技术
溶菌酶是蛋、动物的组织、体液、植物等生物界中广泛存在的酶。工业上从蛋清分离出的溶菌酶被应用于食品和药品(专利文献1)。例如，溶菌酶由于具有抗菌作用而被广泛用作消毒剂的成分。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平5-221875号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明人等发现：将溶菌酶在特定的条件下改性而得到的溶菌酶加工品具有诺如病毒失活作用，以及，将该溶菌酶加工品在极性有机溶剂的存在下保存时能够抑制诺如病毒失活作用的降低，从而想到了本发明。
本发明提供能够抑制诺如病毒失活作用降低的含水流动状组合物及其制造方法、以及溶菌酶加工品和/或其盐、及其制造方法。
用于解决问题的方案
1.本发明的一个方式所述的含水流动状组合物是包含溶菌酶加工品和/或其盐的含水流动状组合物，前述含水流动状组合物的下述规定的荧光强度为5000以上，前述含水流动状组合物中，前述溶菌酶加工品和/或其盐在接触极性有机溶剂的状态下溶解于该含水流动状组合物，前述含水流动状组合物中的前述极性有机溶剂的含量为55质量％以上且90质量％以下。
荧光强度：按照溶菌酶加工品和/或其盐的浓度以固体成分换算达到0.05质量％且磷酸盐的浓度达到0.2M的方式，用磷酸缓冲液(pH7.0)稀释前述含水流动状组合物，向所得稀释液5mL中添加8mM的1,8-苯胺基萘磺酸的甲醇溶液25μL，针对使所得溶液在室温下反应30分钟后的该溶液，在激发波长390nm(激发带宽10nm)和荧光波长470nm(荧光带宽10nm)的条件下测得的荧光强度。
2.根据上述1所述的含水流动状组合物，其中，下述规定的抗诺如病毒活性能够为3.0以上。抗诺如病毒活性：将对于诺如病毒液0.1质量份混合前述含水流动状组合物1质量份而得到的诺如病毒混合液在室温下放置1分钟时的、从放置前的传染性滴度的对数减去放置后的传染性滴度的对数而得到的值。
3.根据上述1或2所述的含水流动状组合物，其中，前述荧光强度能够为6000以上。
4.根据上述1～3中任一项所述的含水流动状组合物，其中，前述极性有机溶剂包含乙醇，前述乙醇的浓度能够为55质量％以上且90质量％以下。
5.根据上述1～4中任一项所述含水流动状组合物，其中，前述溶菌酶加工品和/或其盐的浓度以固体成分换算能够为0.1质量％以上且10质量％以下。
6.根据上述1～5中任一项所述的含水流动状组合物，其还能够含有除乙醇之外的水溶性醇。
7.根据上述1～6中任一项所述的含水流动状组合物，其中，前述溶菌酶加工品和/或其盐能够源自蛋清溶菌酶。
8.根据上述1～7中任一项所述的含水流动状组合物能够填充至喷雾式容器中。
9.根据上述1～7中任一项所述的含水流动状组合物能够填充至泵式容器中。
10.根据上述1～7中任一项所述的含水流动状组合物能够浸渗至无纺布中。
11.本发明的一个方式所述的细菌和/或病毒的失活方法包括使上述1～7中任一项所述的含水流动状组合物接触对象物的工序。
12.本发明的一个方式所述的溶菌酶加工品和/或其盐的通过下述定义规定的荧光强度为4000以上：
荧光强度：按照前述溶菌酶加工品和/或其盐的浓度以固体成分换算达到0.05质量％且磷酸盐的浓度达到0.2M的方式用磷酸缓冲液(pH7.0)进行稀释，向所得稀释液5mL中添加8mM的1,8-苯胺基萘磺酸的甲醇溶液25μL，针对使所得溶液在室温下反应30分钟后的该溶液，在激发波长390nm(激发带宽10nm)和荧光波长470nm(荧光带宽10nm)的条件下测得的荧光强度。
13.根据上述12所述的溶菌酶加工品和/或其盐能够是下述规定的抗诺如病毒活性为2.0以上的溶菌酶加工品和/或其盐。
抗诺如病毒活性：将使诺如病毒液与溶菌酶加工品和/或其盐的2质量％水溶液等量混合而得到的诺如病毒混合液在室温下放置1分钟时的、从放置前的传染性滴度的对数减去放置后的传染性滴度的对数而得到的值。
14.本发明的一个方式所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法是制造上述12或13所述的溶菌酶加工品和/或其盐的方法，包括下述工序：将波长660nm下的光透射率超过70％、pH为5.0以上且7.0以下、并且溶菌酶和/或其盐的浓度以固体成分换算为0.5质量％以上且7质量％以下的溶菌酶和/或其盐的水溶液加热至该水溶液的波长660nm下的光透射率达到70％为止的第一加热工序；在前述第一加热工序之后，加热至前述水溶液的波长660nm下的光透射率达到低于70％的极小值，然后将该水溶液加热至光透射率达到70％为止的第二加热工序；以及，在前述第二加热工序之后，在前述水溶液的波长660nm下的光透射率超过70％的状态下进一步加热该水溶液的第三加热工序。
15.根据上述14所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法，其中，前述第三加热工序的加热条件能够是加热至将该第三加热工序中得到的水溶液用0.45μm的膜滤器进行过滤而得到的物质与乙醇按照质量比计为1:1的比例混合时波长660nm下的光透射率达到85％以上为止的条件。
16.根据上述14或15所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法，其中，在前述第三加热工序之后，还包括对前述水溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥而得到粉末状的溶菌酶加工品和/或其盐的工序。
17.本发明的一个方式所述的含水流动状组合物的制造方法包括：将极性有机溶剂与通过上述14～16中任一项所述的制造方法得到的溶菌酶加工品和/或其盐进行混合，从而得到前述极性有机溶剂的浓度为55质量％以上且90质量％以下的含水流动状组合物的工序。
18.本发明的一个方式所述的含水流动状组合物的制造方法包括：将极性有机溶剂与上述12或13所述的溶菌酶加工品和/或其盐进行混合，从而得到前述极性有机溶剂的浓度为55质量％以上且90质量％以下的含水流动状组合物的工序。
19.根据上述17或18所述的含水流动状组合物的制造方法，其中，在获得前述含水流动状组合物的工序中，能够按照该含水流动状组合物中的溶菌酶加工品和/或其盐的浓度以固体成分换算达到0.1质量％以上且10质量％以下的方式，将前述极性有机溶剂与前述溶菌酶加工品和/或其盐进行混合。
发明的效果
根据上述1～10中任一项所述的含水流动状组合物，通过包含溶菌酶加工品和/或其盐，前述含水流动状组合物的下述规定的荧光强度为5000以上，在前述含水流动状组合物中，前述溶菌酶加工品和/或其盐以接触极性有机溶剂的状态溶解于该含水流动状组合物，前述含水流动状组合物中的前述极性有机溶剂的含量为55质量％以上且90质量％以下，从而在具有诺如病毒失活作用的基础上，能够长期维持(例如以40℃维持2星期以上、通常为24星期以下)诺如病毒的失活作用。
上述含水流动状组合物能够用于例如药品、医药外用品、化妆品、食品的清洗用途、或者卫生用途。此时，作为去除诺如病毒的用途，可以使用上述含水流动状组合物。更具体而言，上述含水流动状组合物例如以容纳于容器(例如附带喷嘴或喷雾器等的容器、或者未附带喷嘴或喷雾器等的容器)的形态或者浸渗至无纺布的形态来使用。
此外，关于上述12或13所述的溶菌酶加工品和/或其盐，通过使上述定义规定的荧光强度为4000以上而具有诺如病毒的失活作用，并且，通过使该溶菌酶加工品和/或其盐接触极性有机溶剂，能够长期维持诺如病毒的失活作用。
此外，根据上述14～16所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法，通过前述第一加热工序、前述第二加热工序和第三加热工序，可以获得具有诺如病毒的失活作用、且通过与极性有机溶剂接触而能够长期维持诺如病毒失活作用的溶菌酶加工品和/或其盐。
此外，根据上述17和19所述的含水流动状组合物的制造方法，通过包括将极性有机溶剂与利用上述14～16中任一项所述的制造方法得到的溶菌酶加工品和/或其盐进行混合从而得到前述极性有机溶剂的浓度为55质量％以上且90质量％以下的含水流动状组合物的工序，可以获得具有诺如病毒的失活作用、且能够长期维持诺如病毒失活作用的含水流动状组合物。
此外，根据上述18和19中任一项所述的含水流动状组合物的制造方法，通过包括将极性有机溶剂与上述12或13所述的溶菌酶加工品和/或其盐进行混合从而得到前述极性有机溶剂的浓度为55质量％以上且90质量％以下的含水流动状组合物的工序，可以获得具有诺如病毒的失活作用、且能够长期维持诺如病毒失活作用的含水流动状组合物。
附图说明
图1是示意性地表示本发明的一个实施方式所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法中，第一加热工序、第二加热工序和第三加热工序中的加热时间与透射率之间的关系的图。
图2是示出通过本发明的一个实施例得到的溶菌酶加工品和/或其盐的电泳(SDS-PAGE)结果的照片。
具体实施方式
以下详细说明本发明。应予说明，本发明中，在没有特别说明的情况下，“份”表示“质量份”，“％”表示“质量％”。
<含水流动状组合物>
本发明的一个实施方式所述的含水流动状组合物是包含溶菌酶加工品和/或其盐的含水流动状组合物，前述含水流动状组合物的下述规定的荧光强度为5000以上，前述含水流动状组合物中，前述溶菌酶加工品和/或其盐在接触极性有机溶剂的状态下溶解于该含水流动状组合物，前述含水流动状组合物中的前述极性有机溶剂的含量为55质量％以上且90质量％以下。
荧光强度：按照溶菌酶加工品和/或其盐的浓度以固体成分换算达到0.05质量％且磷酸盐的浓度达到0.2M的方式，用磷酸缓冲液(pH7.0)稀释前述含水流动状组合物，向所得稀释液5mL中添加8mM的1,8-苯胺基萘磺酸的甲醇溶液25μL，针对使所得溶液在室温下反应30分钟后的该溶液，在激发波长390nm(激发带宽10nm)和荧光波长470nm(荧光带宽10nm)的条件下测得的荧光强度。
本发明中，“含水流动状组合物”是指含有水且具有可变形程度的粘度(例如为1～100000mPa·s)的组合物，是包括粘度低至能够喷雾的程度的液状组合物、以及凝胶状组合物的概念。溶剂只要是溶菌酶加工品和/或其盐会均匀溶解或分散的溶剂就没有特别限定，例如可以使用水、醇。此外，本发明中，“室温”是指20℃以上且25℃以下。
[荧光强度和诺如病毒的失活作用]
从表面疏水性更高的观点出发，本实施方式所述的含水流动状组合物的荧光强度优选为通过上述定义而规定的6000以上、更优选为6500以上、进一步优选为7000以上，通常为10000以下。本发明中规定的含水流动状组合物的荧光强度是含水流动状组合物中包含的蛋白质的表面疏水性的指标。即可以说：本发明中规定的含水流动状组合物的荧光强度越高，则含水流动状组合物中包含的蛋白质的表面疏水性越高，该含水流动状组合物的表面疏水性越高，则诺如病毒的失活作用越高。
因此，本实施方式所述的含水流动状组合物的荧光强度主要起因于该含水流动状组合物中包含的溶菌酶加工品和/或其盐的表面疏水性。通常，若提高蛋白质的表面疏水性，则蛋白质的疏水性部分彼此牵扯、聚集。本发明人等发现：存在溶菌酶加工品和/或其盐的表面疏水性越高则诺如病毒的失活作用越高的倾向。即，本实施方式所述的溶菌酶加工品和/或其盐具有诺如病毒的失活作用优异这一特征。
本实施方式所述的含水流动状组合物中包含的溶菌酶加工品和/或其盐具有优异的诺如病毒失活作用的原因尚未明确，推测如下：第一，具有表面疏水性的溶菌酶加工品和/或其盐容易结合于诺如病毒的疏水性部位；第二，溶菌酶加工品和/或其盐是溶菌酶的改性物，通过改性而使溶菌酶加工品包含由溶菌酶所具有的S-S键的至少一部分开裂而得到的硫醇基(-SH)，该硫醇基与诺如病毒的表面存在的S-S键进行结合；第三，溶菌酶加工品和/或其盐具有容易结合于诺如病毒的立体结构。
此外，本实施方式所述的含水流动状组合物能够抑制诺如病毒的失活作用降低的原因尚未明确，推测如下：通过使溶菌酶加工品和/或其盐溶解于本实施方式所述的含水流动状组合物，该含水流动状组合物中包含的极性有机溶剂与溶菌酶加工品和/或其盐呈现相接触的状态，因此，溶菌酶加工品和/或其盐能够维持可表现出诺如病毒失活作用的立体结构。
即，溶菌酶加工品和/或其盐由于表面疏水性高而与极性有机溶剂(尤其是乙醇)的亲和性高，因此，溶菌酶加工品在该含水流动状组合物中在接触极性有机溶剂的状态下，能够维持使溶菌酶加工品和/或其盐能够表现出诺如病毒失活作用的立体结构，其结果可推测：能够维持诺如病毒的失活作用。
本发明中，含水流动状组合物和后述溶菌酶加工品和/或其盐的荧光强度是通过Canadian Institute of Food Science and Technology 1985Vol.18No.4p.290-295记载的方法而测得的值。应予说明，本发明的溶菌酶加工品和/或其盐的荧光强度的测定中使用的磷酸缓冲液是利用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠制备的。此外，本发明中的溶菌酶加工品和/或其盐的荧光强度是将0.2M磷酸缓冲液(pH为7.0、作为磷酸盐而含有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)的荧光强度作为空白值而另行测定，并减去该空白值而得到的值。
本实施方式所述的含水流动状组合物和后述实施方式所述的溶菌酶加工品和/或其盐的荧光强度是指：使用日本分光株式会社制造的型号FP-8500荧光分光光度计，在激发波长为390nm、激发带宽为10nm、荧光波长为470nm、荧光带宽为10nm、灵敏度为0.5秒、灵敏度低(约为270±10V)(电源频率为(50/60Hz))、使用ペリスタシッパSHP-820型的条件下测定时的值。应予说明，也可以使用其它荧光分光光度计进行测定，此时，需要使灵敏度等测定条件符合本申请中规定的条件。
本实施方式所述的含水流动状组合物中，前述溶菌酶加工品和/或其盐在接触前述极性有机溶剂的状态下保存在该含水流动状组合物中。即，本实施方式所述的含水流动状组合物中，前述溶菌酶加工品和/或其盐由于溶解于前述含水流动状组合物，因此能够在接触前述极性有机溶剂的状态下存在于该含水流动状组合物中。
本发明人等获得了如下的惊人发现：特定的溶菌酶加工品和/或其盐具有诺如病毒的失活作用，以及，在本实施方式所述的含水流动状组合物中，通过使前述溶菌酶加工品和/或其盐在接触前述极性有机溶剂(尤其是乙醇等水溶性醇)的状态下溶解在该含水流动状组合物中，由此能够抑制诺如病毒的失活作用降低，从而创造出本实施方式所述的含水流动状组合物。
[溶菌酶加工品和/或其盐]
本发明中，“溶菌酶”是指：具有将N-乙酰基葡糖胺与N-乙酰基胞壁酸的β-1,4键水解的性质的蛋白质。此外，本发明中，“溶菌酶加工品”是指溶菌酶的改性物，其具有与溶菌酶和/或其盐不同的立体结构。
溶菌酶广泛存在于蛋、动物的组织、体液、植物等生物界中，根据底物特异性和结构而大致分类为以下的5个种属。
1.溶菌酶(细菌型)
2.溶菌酶(鸡型)
3.溶菌酶(鹅型)
4.溶菌酶(噬菌体型；V类)
5.溶菌酶(CH型)
本实施方式所述的含水流动状组合物中，作为溶菌酶加工品和/或其盐的原料，上述5个种属的溶菌酶均可以使用。这些溶菌酶之中，作为原料溶菌酶，优选为蛋清溶菌酶、人溶菌酶等溶菌酶(鸡型)。本实施方式所述的含水流动状组合物中，从诺如病毒的失活作用更优异、成本低且容易获取的观点出发，作为溶菌酶加工品和/或其盐的原料溶菌酶，更优选为源自蛋清溶菌酶的溶菌酶。
此外，作为溶菌酶加工品的盐，可列举出食品添加物或药学上可允许的盐，可列举出盐酸、碳酸、磷酸、硼酸、六偏磷酸、硝酸、硫酸等无机酸的盐；柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、醋酸、谷氨酸、甘油磷酸、葡糖酸等有机酸的盐。溶菌酶的盐之中，优选为无机酸盐，从广泛用作消炎剂、安全性已经确定的观点出发，更优选为盐酸盐。
本实施方式所述的含水流动状组合物可以含有选自溶菌酶加工品和/或其盐中的至少1种。此外，本实施方式所述的含水流动状组合物中含有多种溶菌酶加工品和/或其盐时，溶菌酶加工品和/或其盐的浓度(固体成分换算)是指溶菌酶加工品和/或其盐的合计量的浓度(固体成分换算)。
(荧光强度)
本发明中规定的溶菌酶加工品和/或其盐的荧光强度是溶菌酶加工品和/或其盐的表面疏水性的指标。即可以说，本发明中规定的溶菌酶加工品和/或其盐的荧光强度越高，则溶菌酶加工品和/或其盐的表面疏水性越高，溶菌酶加工品和/或其盐的表面疏水性越高。
从表面疏水性更高、诺如病毒的失活作用更优异的观点出发，通过下述定义规定的溶菌酶加工品和/或其盐的荧光强度优选为4000以上、更优选为5000以上，通常为10000以下。
前述荧光强度是指：按照前述溶菌酶加工品和/或其盐的浓度以固体成分换算达到0.05质量％且磷酸盐的浓度达到0.2M的方式用磷酸缓冲液(pH7.0)进行稀释，向所得稀释液5mL中添加8mM的1,8-苯胺基萘磺酸的甲醇溶液25μL，针对使所得溶液在室温下反应30分钟后的该溶液，在激发波长390nm(激发带宽10nm)和荧光波长470nm(荧光带宽10nm)的条件下测得的荧光强度值。应予说明，按照溶菌酶加工品和/或其盐的浓度以固体成分换算达到0.05质量％且磷酸盐的浓度达到0.2M的方式用磷酸缓冲液进行稀释具体是指：例如在测定以固体成分换算含有1质量％溶菌酶加工品和/或其盐的水溶液的荧光强度时，通过将前述水溶液5g与0.25M的磷酸缓冲液80mL投入至100mL的容量瓶中，然后用纯化水定容至100mL来制备。
(浓度)
本实施方式所述的含水流动状组合物中，从能够更可靠地抑制诺如病毒的失活作用降低这一点出发，溶菌酶加工品和/或其盐的浓度以固体成分换算优选为0.1质量％以上且10质量％以下、更优选为0.2质量％以上，进一步优选超过0.5质量％、例如为0.6质量％以上，最优选为0.7质量％以上，另一方面，优选为5质量％以下、更优选为4质量％以下、进一步优选为2质量％以下。
(溶菌酶加工品和/或其盐的抗诺如病毒活性)
本实施方式所述的溶菌酶加工品和/或其盐具有诺如病毒的失活作用。更具体而言，本实施方式所述的溶菌酶加工品和/或其盐的下述规定的抗诺如病毒活性优选达到2.0以上。
溶菌酶加工品和/或其盐的抗诺如病毒活性：将使诺如病毒液与溶菌酶加工品和/或其盐的2质量％水溶液等量混合而得到的诺如病毒混合液在室温下放置1分钟时的、从放置前的传染性滴度的对数减去放置后的传染性滴度的对数而得到的值。
(二聚体和三聚体)
前述溶菌酶加工品或其盐可以包含约29KDa(KDa＝103Da)的蛋白质和/或约36.5KDa的蛋白质。即，本实施方式所述的含水流动状组合物可以包含约29KDa的蛋白质和/或约36.5KDa的蛋白质。本实施方式所述的含水流动状组合物以及前述溶菌酶加工品或其盐中包含约29KDa的蛋白质和/或约36.5KDa的蛋白质可通过后述实施例中示出的电泳来确认。应予说明，电泳可以使用市售的电泳试剂盒来进行。
推测约29KDa的蛋白质是溶菌酶加工品的二聚体，推测约36.5KDa的蛋白质是溶菌酶加工品的三聚体。
可推测：本实施方式所述的含水流动状组合物中，通过包含约29KDa的蛋白质和/或约36.5KDa的蛋白质，溶菌酶加工品和/或其盐以表面疏水性高的状态存在于该含水流动状组合物中。
(制造方法)
溶菌酶加工品和/或其盐可通过后述实施方式所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法一项中记载的第一加热工序、第二加热工序和第三加热工序来制造。
[极性有机溶剂]
本实施方式所述的含水流动状组合物含有极性有机溶剂。本发明中，“极性有机溶剂”是指对于水具有亲和性的有机溶剂，更具体而言，是指与水混合的有机溶剂。作为极性有机溶剂，可列举出例如包括乙醇、甲醇、1-丙醇、2-丙醇、正丁醇等碳原子数为1以上且4以下(优选为3以下)的一元醇、甘油、乙二醇、二乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、丁二醇、二丙二醇、山梨糖醇等多元醇等多元醇的水溶性醇(醇系溶剂)；丙酮、甲乙酮等酮系溶剂；二噁烷、四氢呋喃、乙腈、N-甲基吡咯烷酮，可以单独使用这些之中的1种或者组合使用2种以上。其中，从对生物体的负担少的观点出发，极性有机溶剂优选含有醇系溶剂，更优选含有乙醇。
本实施方式所述的含水流动状组合物中，从溶菌酶加工品和/或其盐的溶解性优异且能够更可靠地抑制诺如病毒的失活作用降低的观点出发，本实施方式所述的含水流动状组合物中的极性有机溶剂的浓度为55质量％以上且90质量％以下、优选为60质量％以上、更优选为65质量％以上。另一方面，优选为85质量％以下、更优选为80质量％以下。
本实施方式所述的含水流动状组合物含有乙醇作为极性有机溶剂时，从能够更可靠地抑制诺如病毒的失活作用降低的观点出发，本实施方式所述的含水流动状组合物中的乙醇浓度可以为55质量％以上且90质量％以下，优选为60质量％以上、更优选为65质量％以上，另一方面，优选为85质量％以下、更优选为80质量％以下。
[诺如病毒失活作用]
本发明中，诺如病毒失活作用可通过使用了后述实施例所述的方法(即感染了诺如病毒的小鼠细胞)的体系来进行评价。
更具体而言，本实施方式所述的含水流动状组合物具有诺如病毒失活作用。更具体而言，本实施方式所述的含水流动状组合物的下述规定的抗诺如病毒活性能够达到3.0以上。应予说明，本发明中的含水流动状组合物的抗诺如病毒活性优选为分别针对溶菌酶加工品的浓度(固体成分换算)为0.1质量％以上且10质量％以下的含水流动状组合物而测定的值。此时，本实施方式所述的含水流动状组合物可以包含含有约29KDa和/或约36.5KDa的蛋白质的溶菌酶加工品或其盐。
含水流动状组合物的抗诺如病毒活性：将对于诺如病毒液0.1质量份混合前述含水流动状组合物1质量份而得到的诺如病毒混合液在室温下放置1分钟时的、从放置前的传染性滴度的对数减去放置后的传染性滴度的对数而得到的值。
[诺如病毒失活作用的维持]
此外，本实施方式所述的含水流动状组合物即使在长期保存后也能够维持诺如病毒失活作用。更具体而言，本实施方式所述的含水流动状组合物在40℃×75％RH下保存4星期后的抗诺如病毒活性相对于保存前的抗诺如病毒活性可以为50％以上(优选为70％以上、通常为100％以下)。
[除乙醇之外的水溶性醇]
本实施方式所述的含水流动状组合物可以进一步含有除乙醇之外的水溶性醇。作为除乙醇之外的水溶性醇，可列举出上述水溶性醇。除乙醇之外的水溶性醇可作为极性有机溶剂而发挥功能。使用除乙醇之外的水溶性醇时，除乙醇之外的水溶性醇可以单独使用或者组合使用2种以上。
溶菌酶加工品和/或其盐在水溶性和极性有机溶剂(尤其是乙醇)中的溶解性优异，因此，通过使本实施方式所述的含水流动状组合物进一步含有选自除乙醇之外的水溶性醇中的至少1种，能够进一步提高溶菌酶加工品和/或其盐对于该极性有机溶剂(尤其是乙醇)的溶解性，其结果，在该含水流动状组合物中能够确保极性有机溶剂与溶菌酶加工品和/或其盐的接触。
其中，从对生物体的负担少的观点出发，本实施方式所述的含水流动状组合物优选在包含乙醇的基础上，还包含水和除乙醇之外的水溶性醇、或者含有其中的任一者。
本实施方式所述的含水流动状组合物包含除乙醇之外的水溶性醇时，其含量通常为0.1质量％以上且20质量％以下、优选为0.5质量％以上，另一方面，优选为10质量％以下。此时，从能够进一步提高该含水流动状组合物中的溶菌酶加工品和/或其盐的溶解性的观点出发，本实施方式所述的含水流动状组合物包含乙醇和除乙醇之外的水溶性醇时，水溶性醇的含量相对于乙醇的含量优选为1/700以上且1/5以下。
本实施方式所述的含水流动状组合物包含水时，本实施方式所述的含水流动状组合物中的水含量通常为10质量％以上且50质量％以下、优选为15质量％以上、更优选为20质量％以上，另一方面，优选为40质量％以下、更优选为30质量％以下。此时，从能够进一步提高溶菌酶加工品和/或其盐的溶解性的观点出发，本实施方式所述的含水流动状组合物包含乙醇时，水的含量相对于乙醇的含量优选为1/3以上且1/1以下。
[其它原材料]
本实施方式所述的含水流动状组合物中，除了含有溶菌酶加工品、极性有机溶剂和水之外，还可以含有其它的配混原材料。
作为其它的原材料，可以适当组合使用例如甘氨酸、有机酸、苯甲酸钠、山梨酸钠、丙酸钠、脱氢乙酸钠、对羟基苯甲酸酯、亚硫酸钠、EDTA、苯扎氯铵、苄索氯铵、葡糖酸洗必泰、氯烷基二氨基乙基甘氨酸、碘酊、聚乙烯吡咯烷酮碘、棕榈酸化苯甲烃铵、三氯生、氯化二甲苯酚、异丙基甲基苯酚、ε-聚赖氨酸、乳铁蛋白、乳链菌肽、细菌素、土当归提取物、苏合香提取物、菌陈蒿提取物、酶分解薏苡提取物、鱼精蛋白提取物、苧侧素、果胶分解物等抑菌剂。
本实施方式所述的含水流动状组合物根据需要还可以含有柠檬酸、柠檬酸钠、氢氧化钠、三乙醇胺等pH调节剂、生育酚醋酸酯等抗氧化剂、聚羧乙烯、羟乙基纤维素等增稠剂等添加剂、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等表面活性剂。
<剂型>
本实施方式所述的含水流动状组合物的粘度可以根据使用方法来适当确定。例如，通过制成能够喷雾的粘度的液体制剂并填充至手扣式喷雾器、泵容器、挤压容器、气溶胶容器等容器，将包含本实施方式所述的含水流动状组合物的液滴喷雾至手指、食品、烹饪器具、家居环境、呕吐物、排泄物等，从而能够轻松地进行病毒的失活。即，上述容器包含本实施方式所述的含水流动状组合物。
此外，通过在本实施方式所述的含水流动状组合物中浸渍失活对象物(例如手指、食品、医疗仪器、医疗器具、烹饪器具、家居环境)，能够轻松地进行病毒的失活。
此外，本实施方式所述的含水流动状组合物能够以将其浸渗至无纺布中而得到的片材形态来使用。即，上述无纺布浸渗有本实施方式所述的含水流动状组合物。此时，作为无纺布的材质，可列举出例如纸、纤维。通过使将本实施方式所述的含水流动状组合物浸渗至无纺布而得到的片材片材接触对象物的表面，能够轻松地进行病毒的失活。
进而，通过将本实施方式所述的含水流动状组合物制成涂剂，能够用作属于化妆品或者药品或医药外用品的皮肤外用剂。
[一例]
本实施方式所述的含水流动状组合物例如是包含溶菌酶加工品和/或其盐的含水流动状组合物，前述极性有机溶剂的含量为55质量％以上且90质量％以下，前述溶菌酶加工品和/或其盐的浓度为0.1质量％以上且10质量％以下。此时，在前述含水流动状组合物中，前述溶菌酶加工品和/或其盐以接触前述极性有机溶剂的状态溶解于该含水流动状组合物。
此时，前述极性有机溶剂包含乙醇，前述乙醇的含量能够为55质量％以上且90质量％以下。
此外，此时，该含水流动状组合物可以包含约29KDa的蛋白质和/或约36.5KDa的蛋白质。
进而，此时，该含水流动状组合物的下述规定的抗诺如病毒活性能够达到3.0以上。含水流动状组合物的抗诺如病毒活性：将对于诺如病毒液0.1质量份混合前述含水流动状组合物1质量份而得到的诺如病毒混合液在室温下放置1分钟时的、从放置前的传染性滴度的对数减去放置后的传染性滴度的对数而得到的值。
此外，该含水流动状组合物在40℃×75％RH下保存4星期后的抗病毒活性相对于保存前的抗病毒活性能够为50％以上(优选为70％以上、通常为100％以下)。
<溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法>
本发明的一个实施方式所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法是制造上述定义中规定的荧光强度为4000以上的溶菌酶加工品和/或其盐的方法，其包括下述工序：将波长660nm下的光透射率超过70％、pH为5.0以上且7.0以下、并且溶菌酶和/或其盐的浓度以固体成分换算为0.5质量％以上且7质量％以下的溶菌酶的水溶液加热至该水溶液的波长660nm下的光透射率达到70％为止的第一加热工序(以下也简称为“第一加热工序”)；在前述第一加热工序之后，加热至该水溶液的波长660nm下的光透射率达到低于70％的极小值为止，然后将该水溶液加热至光透射率达到70％为止的第二加热工序(以下也简称为“第二加热工序”)；以及，在前述第二加热工序之后，在前述水溶液的波长660nm下的光透射率超过70％的状态下进一步加热该水溶液的第三加热工序(以下也简称为“第三加热工序”)。
根据本实施方式所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法，通过前述第一加热工序、第二加热工序和第三加热工序，能够得到上述定义中规定的荧光强度为4000以上的溶菌酶加工品和/或其盐，并且，通过将极性有机溶剂与利用上述溶菌酶的制造方法得到的溶菌酶加工品和/或其盐进行混合，能够得到包含该溶菌酶加工品和/或其盐且具有诺如病毒的失活作用、并且抑制诺如病毒的失活作用降低的含水流动状组合物。
[加热的机理]
图1是示意性地表示本实施方式所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法中，第一加热工序、第二加热工序和第三加热工序中的加热时间与透射率之间的关系的图。本发明人等发现：将包含溶菌酶的水溶液加热时，波长660nm下的光透射率根据加热时间而如图1所示那样地变化。推测该透射率的变化主要是所得溶菌酶加工品的表面疏水性的变化和水溶性的变化(水溶性的降低和紧随其后的水溶性的增加)引起的。
如图1所示那样，通过第一加热工序，波长660nm下的光透射率超过70％的水溶液的该光透射率降低而成为70％。更具体而言，通过第一加热工序，水溶液的透明度降低。
此外，通过第二加热工序，因第一加热工序而成为70％的前述水溶液的波长660nm下的光透射率进一步降低，然后再次上升而能够制成70％。更具体而言，如图1所示那样，通过第二加热工序，该水溶液的波长660nm下的光透射率降低而降低至低于70％的极小值后，上升至70％为止。即，此时，通过目视而确认到水溶液的白浊和/或沉淀后(换言之，该水溶液的透射率(透明性)降低后)，该白浊和/或沉淀可以陆续消失(换言之，该水溶液的透射率(透明性)上升)。
进而，通过第三加热工序，在因第二加热工序而成为70％的前述水溶液的波长660nm下的光透射率超过70％的状态下进一步加热该水溶液。更具体而言，在第三加热工序中，该水溶液中优选不产生白浊和/或沉淀(换言之，该水溶液的透射率(透明性)得以维持)。
[第一加热工序]
第一加热工序的加热对象是波长660nm下的光透射率超过70％(优选为80％以上、更优选为90％以上、通常为100％以下)、pH为5.0以上且7.0以下、并且溶菌酶和/或其盐的浓度以固体成分换算为0.5质量％以上且7质量％以下的溶菌酶和/或其盐的水溶液。
通过第一加热工序，波长660nm下的光透射率超过70％的水溶液中的该光透射率达到70％表示该水溶液的透射率降低，例如可以通过目视来确认该水溶液的白浊。
即可推测：在第一加热工序中，前述水溶液中的溶菌酶的立体结构和/或溶菌酶表面的表面疏水性上升、疏水性部分互相牵扯而聚集、前述水溶液中的溶菌酶的溶解性降低，作为其结果，该水溶液的波长660nm下的光透射率从超过70％降低至70％。
(原料)
第一加热工序中，在水溶液中使用的作为原料的溶菌酶和/或其盐可以使用上述含水流动状组合物一项中例示出的溶菌酶和/或其盐。从成本低且容易获取的观点出发，作为原料的溶菌酶和/或其盐优选为蛋清溶菌酶。
(原料的浓度)
从能够可靠地改变溶菌酶的立体结构且能够防止溶菌酶聚集、提高诺如病毒的失活作用的观点出发，在第一加热工序中，水溶液中的溶菌酶的浓度优选为0.5质量％以上、更优选为1质量％以上，另一方面，优选为7质量％以下、更优选为5质量％以下。
(溶菌酶和/或其盐的水溶液)
构成溶菌酶和/或其盐的水溶液的溶剂是水，在不影响溶菌酶和/或其盐在水中的溶解性的范围内，也可以使用与水混合的有机溶剂。构成溶菌酶和/或其盐的水溶液的溶剂中的水的比例通常为80质量％以上且100质量％以下。此外，构成溶菌酶和/或其盐的水溶液的溶剂包含与水混和的有机溶剂时，构成溶菌酶和/或其盐的水溶液的溶剂中的该有机溶剂的比例通常为1质量％以上且20质量％以下。
作为前述有机溶剂，只要是与水混合的有机溶剂即可，可列举出例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、乙二醇、丙二醇、甘油等醇系溶剂；丙酮、甲乙酮等酮系溶剂；乙腈、四氢呋喃、1,4-二噁烷等，它们可以单独使用或者组合使用2种以上。
(pH)
从能够防止溶菌酶的聚集且能够提高所得溶菌酶加工品和/或其盐的表面疏水性的观点出发，在第一加热工序、第二加热工序和第三加热工序中，前述水溶液的pH优选为5.0以上、更优选超过5.0、进一步优选为5.5以上，另一方面，优选为7.0以下、更优选为6.5以下。
此外，根据需要，也可以使用酸(例如盐酸、硫酸、硝酸等无机酸；柠檬酸、醋酸、磷酸等有机酸)、碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾等无机碱)或缓冲液(例如醋酸缓冲液)，将前述水溶液调整成上述范围的pH。
例如，溶菌酶为溶菌酶的盐(例如氯化溶菌酶)时，优选的是，在使用酸、碱或缓冲液将水溶液的pH调整成上述范围的pH的基础上，进行第一加热工序。
[第二加热工序]
第二加热工序中，以通过第一加热工序得到的水溶液的波长660nm下的光透射率从70％达到低于70％的极小值并进一步达到70％的方式进行加热是指：通过第一加热工序得到的水溶液的透射率进一步降低后，转为增加，通过目视能够确认其逐渐变得透明。
即可推测：第二加热工序中，随着前述水溶液中的溶菌酶的立体结构的进一步变化、溶菌酶的表面疏水性的进一步提高，溶菌酶的水溶性暂时降低后再次提高，其结果，水溶液的波长660nm下的光透射率达到70％。
针对在第二加热工序中随着溶菌酶的表面疏水性的进一步提高，溶菌酶的水溶性暂时降低后再次提高的机理尚未明确，推测是因为：通过第二加热工序，在第一加热工序中产生的溶菌酶的聚集进一步加剧，接着，所聚集的溶菌酶彼此结合而变成线状的聚集体，该聚集体溶解于前述水溶液，从而导致前述水溶液中的溶菌酶的溶解性上升。
如图1所示那样，通过第二加热工序，该水溶液的波长660nm下的光透射率从70％降低至低于70％的极小值后，上升至70％为止。从能够更可靠地改变前述水溶液中的溶菌酶的立体结构的观点出发，基于第二加热工序的该水溶液的波长660nm下的光透射率的极小值优选低于60％、更优选低于50％(通常为0％以上)。
第二加热工序可以在第一加热工序之后接着进行。即，第二加热工序可以与第一加热工序连续进行。
[第三加热工序]
第三加热工序中，在前述第二加热工序之后，在前述水溶液的波长660nm下的光透射率超过70％的状态下进一步加热该水溶液。通过第一加热工序、第二加热工序和第三加热工序，能够得到溶菌酶加工品。
即可推测：第三加热工序中，前述水溶液中的溶菌酶的立体结构进一步变化，在维持了溶菌酶的水溶性的状态下，溶菌酶的表面疏水性进一步提高，其结果，水溶液的波长660nm下的光透射率能够维持超过70％的值。
从能够更可靠地改变前述水溶液中的溶菌酶的立体结构的观点出发，第三加热工序更优选加热至该水溶液的波长660nm下的光透射率达到75％以上为止，更优选加热至光透射率达到80％以上(通常为100％以下)。
进而，关于第三加热工序，优选加热至将通过第三加热工序得到的水溶液用0.45μm的膜滤器进行过滤而得到的物质与乙醇以质量比计为1:1的比例进行混合时波长660nm下的光透射率达到85％以上为止，更优选加热至达到90％以上(通常为100％以下)。
将通过第三加热工序得到的水溶液用0.45μm的膜滤器进行过滤而得到的物质与乙醇以质量比计为1:1的比例进行混合时的波长660nm下的光透射率达到85％以上可以作为得到了上述定义中规定的荧光强度为4000以上的溶菌酶加工品和/或其盐的指标。
第三加热工序可以在第二加热工序之后接着进行。即，第三加热工序可以与第一加热工序和第二加热工序连续进行。
第三加热工序中，在前述透射率超过70％的状态下被加热而变得透明的水溶液即使恢复至室温(例如25℃)也能够维持该透射率(换言之，能够维持透明性)。作为其原因，推测是因为：该水溶液中包含的溶菌酶等的形态即线状的聚集体的立体结构即使在室温下也得以维持。
(加热温度和加热时间)
本实施方式所述的含水流动状组合物的制造方法中，从溶菌酶加工品和/或其盐的制造能够实现高收率且能够将该水溶液调整成第一加热工序、第二加热工序和第三加热工序中分别规定的透射率的观点出发，优选以第一加热工序、第二加热工序和第三加热工序中的该水溶液的中心品温达到70℃以上的方式进行加热，从因加热时间短而能够缩短制造时间的观点出发，更优选为80℃以上、进一步优选为90℃以上、通常可以为130℃，进而可以约为100℃以下。应予说明，第一加热工序、第二加热工序和第三加热工序中的加热时间可以根据加热温度和处理量以满足各工序中规定的透射率的方式来适当确定。
更具体而言，第一加热工序与第二加热工序在相同的加热温度下连续进行时，关于第一加热工序中的加热时间和第二加热工序中的加热时间的合计，在中心品温为70℃以上且75℃以下时优选为5分钟以上且120分钟以下，在中心品温超过75℃且为80℃以下时优选为5分钟以上且75分钟以下，在中心品温超过80℃且为85℃以下时优选为5分钟以上且65分钟以下，在中心品温超过85℃且为90℃以下时优选为5分钟以上且45分钟以下，在中心品温超过90℃且为95℃以下时优选为5分钟以上且35分钟以下，在中心品温超过95℃且为100℃以下时优选为5分钟以上且20分钟以下。
关于第三加热工序中的加热时间，在中心品温为70℃以上且75℃以下时优选为5分钟以上且600分钟以下，在中心品温超过75℃且为80℃以下时优选为5分钟以上且360分钟以下，在中心品温超过80℃且为85℃以下时优选为5分钟以上且240分钟以下，在中心品温超过85℃且为90℃以下时优选为5分钟以上且195分钟以下，在中心品温超过90℃且为95℃以下时优选为5分钟以上且150分钟以下，在中心品温超过95℃且为100℃以下时优选为5分钟以上且100分钟以下。
第一加热工序、第二加热工序和第三加热工序在相同的加热温度下连续进行时，关于第一加热工序中的加热时间和第二加热工序中的加热时间和第三加热工序中的加热时间的合计，在中心品温为70℃以上且75℃以下时优选为125分钟以上且720分钟以下，在中心品温超过75℃且为80℃以下时优选为80分钟以上且435分钟以下，在中心品温超过80℃且为85℃以下时优选为70分钟以上且305分钟以下，在中心品温超过85℃且为90℃以下时优选为50分钟以上且240分钟以下，在中心品温超过90℃且为95℃以下时优选为40分钟以上且185分钟以下，在中心品温超过95℃且为100℃以下时优选为25分钟以上且120分钟以下。
(喷雾干燥/冷冻干燥)
应予说明，本实施方式所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法中，在前述第三加热工序之后，可以进一步包括使前述水溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥而得到粉末状的溶菌酶加工品和/或其盐的工序。
喷雾干燥和冷冻干燥按照常规方法进行即可。
<含水流动状组合物的制造方法>
本发明的一个实施方式所述的含水流动状组合物的制造方法包括：将上述溶菌酶加工品和/或其盐(更具体而言，是通过上述溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法得到的溶菌酶加工品和/或其盐)与极性有机溶剂进行混合，从而得到前述极性有机溶剂的浓度为55质量％以上且90质量％以下的含水流动状组合物的工序。即，上述实施方式所述的含水流动状组合物可通过上述制造方法来获得。
本实施方式所述的制造方法中，从能够更可靠地抑制诺如病毒的失活作用降低的观点出发，在获得含水流动状组合物的工序中，优选的是，按照该含水流动状组合物中的溶菌酶加工品和/或其盐的浓度以固体成分换算优选为0.1质量％以上且10质量％以下(更优选为0.2质量％以上、进一步优选超过0.5质量％、例如为0.6质量％以上、进一步优选为0.7质量％以上，另一方面，更优选为4质量％以下、进一步优选为2质量％以下)的方式，将前述极性有机溶剂与前述溶菌酶加工品和/或其盐进行混合。此时，可以进一步混合上述实施方式所述的含水流动状组合物一项中例示出的其它成分。
此外，本实施方式所述的制造方法中，从能够更可靠地抑制诺如病毒的失活效果降低的观点出发，在获得前述含水流动状组合物的工序中，优选的是，例如按照极性有机溶剂包含乙醇、该含水流动状组合物中的乙醇浓度优选为55质量％以上且90质量％以下(更优选为60质量％以上、进一步优选为65质量％以上，此外，更优选为85质量％以下、进一步优选为80质量％以下)的方式，将前述极性有机溶剂与前述溶菌酶加工品和/或其盐进行混合。
<含水流动状组合物的使用方法(病毒的失活方法)>
可以采用将本实施方式所述的含水流动状组合物喷雾或涂布至要使病毒(诺如病毒)失活的对象区域、或者与要使病毒失活的对象物进行混合、或者摄取等方法(使病毒失活的方法)。
<作用效果>
本实施方式所述的含水流动状组合物因含有溶菌酶加工品和/或其盐而具有病毒的失活作用。尤其是，本实施方式所述的含水流动状组合物通过含有溶菌酶加工品和/或其盐而具有诺如病毒的失活作用，并且，该溶菌酶加工品和/或其盐通过在接触极性有机溶剂的状态下溶解于该含水流动状组合物，能够抑制诺如病毒的失活作用降低，因此可长期维持诺如病毒的失活作用。
实施例
[实施例1]
向清水980g中添加溶菌酶(以鸡蛋蛋清作为原料的蛋清溶菌酶)20g并混合，从而制备该溶菌酶的2质量％水溶液。其后，将前述水溶液在80℃的中心品温下加热10分钟，其结果，该水溶液的波长660nm下的光透射率降低至70％(第一加热工序)。接着，加热至前述水溶液的波长660nm下的光透射率达到低于70％的极小值(20％)后，进一步将该水溶液以80℃进行60分钟的加热处理(第二加热工序)。接着，前述水溶液的波长660nm下的光透射率上升，在超过70％的状态下将该水溶液以80℃的中心品温加热110分钟(第三加热工序)。由此，得到含有2质量％溶菌酶加工品的水溶液。
应予说明，第3加热工序后的水溶液的透射率为96％，用0.45μm的膜滤器进行过滤而得到的该水溶液与乙醇以质量比计为1:1进行混合时的透射率为97％。
将所得溶菌酶加工品的2质量％水溶液用0.45μm的膜滤器进行过滤后，将所得滤液25g与极性有机溶剂(乙醇60g、甘油1g)、水13g和甘油脂肪酸酯1g进行混合，从而得到试验编号为1的含水流动状组合物。
变更表1所示的条件，制备试验编号为2～22的溶菌酶加工品。接着，按照表1的组成，制备包含各溶菌酶加工品的含水流动状组合物(粘度：3mPa·s)。
[表1]
Figure BDA0001219395500000261
应予说明，试验编号为1～22的各例中的含水流动状组合物和水溶液的波长660nm下的光透射率通过吸光光度计(型号“UV-2450”、株式会社岛津制作所制)进行测定。表1中示出试验编号为1～22的各例中的第一加热工序之前的水溶液的波长660nm下的光透射率(％)、第二加热工序中的波长660nm下的光透射率的极小值(％)、以及加热结束时的水溶液的波长660nm下的光透射率(即，第三加热工序后的水溶液的波长660nm下的光透射率)(％)。应予说明，试验编号1～22连续进行第一加热工序、第二加热工序和第三加热工序，表1的加热时间是第一加热工序、第二加热工序和第三加热工序中的加热时间的合计。
试验编号1～16中，将加热前的水溶液的波长660nm下的光透射率超过70％、pH为5.0以上且7.0以下、并且溶菌酶和/或其盐的浓度以固体成分换算为0.5质量％以上且7质量％以下的溶菌酶和/或其盐的水溶液通过第一加热工序将该水溶液加热至水溶液的波长660nm下的光透射率达到70％为止，接着，通过第二加热工序，将该水溶液加热至前述水溶液暂时白浊后，白浊逐渐消失而透明性变高(波长660nm下的光透射率达到70％)为止，接着，通过第三加热工序，一边维持该水溶液的透明性(更具体而言，一边维持前述水溶液的波长660nm下的光透射率超过70％的状态)，一边加热该水溶液，从而得到溶菌酶加工品。
此外，在用于获得试验编号为2～16的溶菌酶加工品的制造工序中，将通过第三加热工序得到的水溶液用0.45μm的膜滤器进行过滤而得到的物质与乙醇以质量比计为1:1的比例混合时的波长660nm下的光透射率均为85％以上。
应予说明，试验编号18和19中，水溶液的前述光透射率降低至低于70％(20％)后，没有再次上升至70％以上。此外，试验编号21中，水溶液的前述光透射率降低至低于70％(15％)后，虽然上升至40％，但没有上升至70％以上。
[试验例1]
本试验例中，针对试验编号为1～21的含水流动状组合物，确认诺如病毒的失活作用和该失活作用的经时变化。
<抗诺如病毒活性的评价>
通过噬菌斑测定法，如下那样地评价试验编号为1～21的含水流动状组合物的抗诺如病毒活性。应予说明，试验编号为1～21的含水流动状组合物的抗诺如病毒活性是分别针对溶菌酶加工品的浓度(固体成分换算)为表1所示数值的含水流动状组合物测得的值。
(巨噬细胞的培养)
(1)在6孔板中，将小鼠巨噬细胞确立细胞株(RAW264.7细胞)培养至铺满(confluent)的60～80％为止。
(诺如病毒液的制备)
(2)另一方面，如下那样地制备诺如病毒的传染性滴度(PFU/mL)为106～107PFU/mL左右的诺如病毒液。
首先，将小鼠巨噬细胞确立细胞株(RAW264.7细胞)培养至铺满为止，向铺满的细胞接种诺如病毒原液1mL，在37℃、5％CO2条件下培养2天。此时，作为诺如病毒原液，使用了Murine norovirus strain 1(MNV-1)(Effect of Food Residues on NorovirusSurvival on Stainless Steel Surfaces)。
MNV-1由华盛顿大学(Washington University)的Herbert W.Virgin博士供给。
培养后，目视确认细胞已经剥离，重复进行4次冻融而破坏细胞，释放出细胞中的病毒。其后，分取注入至50mL离心沉淀管中，进行离心分离(8000g、20分钟)，得到传染性滴度(PFU/mL)为106～107PFU/mL左右的诺如病毒液。将该诺如病毒液在-80℃下保存，进行解冻来使用。针对该诺如病毒液，按照下述方法来测定传染性滴度。
(诺如病毒混合液的制备)
(3)为了测定含水流动状组合物的诺如病毒传染性滴度，对于试验编号为1～21的含水流动状组合物1质量份，添加通过(2)得到的诺如病毒液0.1质量份后，在室温下放置1分钟，从而得到各含水流动状组合物与诺如病毒的混合液(诺如病毒混合液)。
(传染性滴度的测定)
接着，通过下述方法算出通过上述(2)制备的诺如病毒液的传染性滴度和放置1分钟后的混合液的传染性滴度。
将前述诺如病毒混合液(或诺如病毒液)稀释10x倍，作为稀释样品。此处，x为整数，采用后述(8)中通过目视而能够数出噬菌斑数量的数值。即，通过(8)来调整稀释倍率，使得噬菌斑数量达到10以上且100以下左右。应予说明，细胞因该混合液中的残留醇的影响而发生变性，因此诺如病毒混合液(或诺如病毒液)未进行10倍稀释。
(4)在(1)的板中，将撤掉全部培养液并放置特定时间后进行了稀释的稀释样品以500μL/孔各接种2个孔。
(5)一边以小鼠巨噬细胞确立细胞株(RAW264.7细胞)不会干燥的方式进行振荡，一边在室温下孵育1个小时，从而使小鼠巨噬细胞确立细胞株感染诺如病毒。
(6)将板上的500μL/孔的接种液全部去除，并以2ml/孔叠加1.5％Sea PlaqueAgarose-DMEM(37℃)，待其固化后，在37℃、5％CO2的条件下培养2天。
(7)向培养2天后的板中以2mL/孔叠加作为染色液的0.03％中性红溶液，在37℃、5％CO2的条件下孵育1小时。
(8)在(7)的孵育后撤掉全部的0.03％中性红溶液，通过目视来数出噬菌斑数量。根据所得噬菌斑数量和稀释倍率来算出前述放置1分钟后的诺如病毒混合液(或诺如病毒液)的传染性滴度(PFU/mL)。应予说明，放置1分钟前的诺如病毒混合液的传染性滴度使用了前述诺如病毒液的传染性滴度乘以诺如病毒混合液中的诺如病毒液与含水流动状组合物的混合比率(0.1/1.1)而得到的值。
(9)通过下式来算出试验编号为1～21的含水流动状组合物的抗诺如病毒活性。抗诺如病毒活性＝Log10(放置1分钟前的诺如病毒混合液的传染性滴度)-Log10(放置1分钟后的诺如病毒混合液的传染性滴度)
试验编号为1～9的含水流动状组合物在放置1分钟后的传染性滴度为104以下，如表1所示那样，根据上述式子算出的抗诺如病毒活性为3以上。即可确认：试验编号为1～9的含水流动状组合物通过包含溶菌酶加工品和/或其盐，且上述规定的荧光强度为5000以上，从而在刚制造后具有诺如病毒失活作用。
此外可确认：试验编号为1～9的含水流动状组合物中，通过使前述溶菌酶加工品和/或其盐在接触极性有机溶剂的状态下溶解于该含水流动状组合物，并且该含水流动状组合物中的该极性有机溶剂的含量为55质量％以上且90质量％以下，即使在40℃×75％RH下保存2星期、4星期和8星期后也具有诺如病毒失活作用，诺如病毒失活作用的降低受到抑制。
更具体而言，可确认：试验编号1～9的含水流动状组合物在40℃×75％RH下保存4星期后的抗诺如病毒活性相对于保存前(刚制造后)的抗诺如病毒活性为50％以上(70％以上)。
与此相对，可确认：试验编号为10～15的含水流动状组合物由于极性有机溶剂的含量低于55质量％(为50质量％)，因此在40℃×75％RH下保存2星期、4星期、8星期后，诺如病毒的失活作用降低。更具体而言，可确认：试验编号为10～15的含水流动状组合物在40℃×75％RH下保存4星期后的抗诺如病毒活性相对于保存前(刚制造后)的抗诺如病毒活性降低至低于50％。
此外可确认：试验编号为16的含水流动状组合物由于极性有机溶剂的含量低于20质量％(为0质量％)，因此，在40℃×75％RH下保存4星期后的抗诺如病毒活性相对于保存前(刚制造后)的抗诺如病毒活性大幅降低。
进而可确认：通过试验编号17～21制备的溶菌酶加工品的荧光强度低于4000，抗诺如病毒活性低。
此外，向通过试验编号17～21制备的溶菌酶加工品中混合极性有机溶剂时发生白浊，因此，无法测定含有该溶菌酶加工品的含水流动状组合物的荧光强度和抗诺如病毒活性。
应予说明，试验编号22中，制备了溶菌酶加工品的浓度为10质量％的水溶液，结果在室温(25℃)的水溶液中产生沉淀，因此无法测定荧光强度和抗诺如病毒活性。
[试验例2]
针对本试验例中得到的溶菌酶加工品进行电泳。本试验例中，变更试验编号1中的加热条件(加热温度、加热时间和蛋清溶菌酶的浓度)来制备溶菌酶加工品。
更具体而言，向将蛋清溶菌酶的2质量％水溶液以80℃的加热温度进行了加热时间为0分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟的加热时采集的该水溶液50μL中添加样品缓冲液950μL，以100℃加热10分钟后，进行冰冷，将10μL(以溶菌酶加工品计为10μg)填充至电泳凝胶。应予说明，作为样品缓冲液，使用了未添加2-巯基乙醇的缓冲液(非还原)。电泳的凝胶使用SDS-PAGEmini(TEFCO公司制、凝胶浓度为4-10％、凝胶厚度为1mm)，以20mA的恒定电流进行泳动。染色液使用了考马斯蓝R250。
图2是示出电泳结果的照片。如图2所示那样，在加热时间为60分钟、90分钟和120分钟的时刻，明显检测出表示约29KDa的蛋白质(推测为二聚体)和/或约36.5KDa的蛋白质(推测为三聚体)的带。此外可确认：加热时间越长，则表示这些蛋白质的带越浓(即，生成的前述蛋白质的量增加)。此外可推测：在相同加热温度下，加热时间越长，则该蛋白质的表面疏水性越会增加，能够得到诺如病毒失活作用高的蛋白质。
[实施例2]
使用实施例1的试验编号2中得到的溶菌酶加工品，将该溶菌酶加工品的浓度设为0.3质量％、0.6质量％和2质量％，除此之外，利用与试验编号2相同的方法，得到试验编号为23～26的含水流动状组合物。针对试验编号为23～26的含水流动状组合物，测定通过上述方法测得的荧光强度和抗诺如病毒活性时，该荧光强度均为5000以上，此外，刚制造后以及在40℃×75％RH下保存8星期后的抗诺如病毒活性均为3.0以上。
[配混例1]
按照下述的配混比，使通过试验编号9得到的含水流动状组合物与下述成分进行混合，从而制备凝胶状的消毒剂(含水流动状组合物)。
含水流动状组合物(试验编号为9) 98质量％
甘油 1质量％
聚羧乙烯 1质量％
[配混例2]
按照下述的配混比，使通过试验编号9得到的含水流动状组合物与下述成分的混合物浸渗至无纺布中，制备成湿巾。
含水流动状组合物(试验编号5) 99质量％
PEG-40氢化蓖麻油 1质量％
产业上的可利用性
本发明的含水流动状组合物例如作为对手指、身躯、医疗器械、学校、医院、福利设施等设施、工厂、住宅等进行消毒的消毒剂、食品添加物、病毒(诺如病毒)的去除剂是有用的。
本发明的实施方式的说明如上所述。本发明包括与实施方式中说明的技术方案实质上相同的技术方案，例如功能、方法和结果相同的技术方案或者目的和结果相同的技术方案。此外，本发明包括将实施方式中说明的技术方案的非本质部分进行替换而得到的技术方案。此外，本发明包括与实施方式中说明的技术方案起到相同作用效果的技术方案或者能够实现同一目的的技术方案。此外，本发明包括对实施方式中说明的技术方案附加公知技术而得到的技术方案。

Claims (6)

1.一种溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法，其是制造溶菌酶加工品和/或其盐的方法，包括下述工序：
将波长660nm下的光透射率超过70％、pH为5.0以上且7.0以下、并且溶菌酶和/或其盐的浓度以固体成分换算为0.5质量％以上且7质量％以下的溶菌酶和/或其盐的水溶液加热至该水溶液的波长660nm下的光透射率达到70％为止的第一加热工序；
在所述第一加热工序之后，加热至所述水溶液的波长660nm下的光透射率达到低于70％的极小值为止，然后将该水溶液加热至光透射率达到70％为止的第二加热工序；以及
在所述第二加热工序之后，在所述水溶液的波长660nm下的光透射率超过70％的状态下进一步加热该水溶液的第三加热工序，
所述第一加热工序、所述第二加热工序以及所述第三加热工序在相同的加热温度下连续进行时，第一加热工序中的加热时间和第二加热工序中的加热时间和第三加热工序中的加热时间的合计为：所述水溶液的中心品温超过80℃且为85℃以下时为70分钟以上且305分钟以下，所述水溶液的中心品温超过85℃且为90℃以下时为50分钟以上且240分钟以下，或者所述水溶液的中心品温超过90℃且为95℃以下时为40分钟以上且185分钟以下，
所述溶菌酶加工品和/或其盐通过下述定义规定的荧光强度为4000以上：
荧光强度：按照所述溶菌酶加工品和/或其盐的浓度以固体成分换算达到0.05质量％且磷酸盐的浓度达到0.2M的方式用pH为7.0的磷酸缓冲液进行稀释，向所得稀释液5mL中添加8mM的1,8-苯胺基萘磺酸的甲醇溶液25μL，针对使所得溶液在室温下反应30分钟后的该溶液，在激发波长390nm和荧光波长470nm的条件下测得的荧光强度，所述激发波长390nm的激发带宽为10nm、所述荧光波长470nm的荧光带宽为10nm。
2.根据权利要求1所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法，所述溶菌酶加工品和/或其盐的下述规定的抗诺如病毒活性为2.0以上，
抗诺如病毒活性：将使诺如病毒液与溶菌酶加工品和/或其盐的2质量％水溶液等量混合而得到的诺如病毒混合液在室温下放置1分钟时的、从放置前的传染性滴度的对数减去放置后的传染性滴度的对数而得到的值。
3.根据权利要求1所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法，其中，所述第三加热工序的加热条件是加热至将该第三加热工序中得到的水溶液用0.45μm的膜滤器进行过滤而得到的物质与乙醇按照质量比计以1:1的比例混合时波长660nm下的光透射率达到85％以上为止的条件。
4.根据权利要求1所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法，其中，在所述第三加热工序之后，还包括对所述水溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥而得到粉末状的溶菌酶加工品和/或其盐的工序。
5.根据权利要求3所述的溶菌酶加工品和/或其盐的制造方法，其中，在所述第三加热工序之后，还包括对所述水溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥而得到粉末状的溶菌酶加工品和/或其盐的工序。
6.一种含水流动状组合物的制造方法，其包括：将极性有机溶剂与通过权利要求1～5中任一项所述的制造方法得到的溶菌酶加工品和/或其盐进行混合，从而得到所述极性有机溶剂的浓度为55质量％以上且90质量％以下、并且所述溶菌酶加工品和/或其盐的浓度以固体成分换算为0.1质量％以上且10质量％以下的含水流动状组合物的工序。
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