CN106591338B - 一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，将标签蛋白基因与目标蛋白基因构建到表达载体上，导入到大肠杆菌中构建得到重组菌，重组菌诱导表达，标签蛋白与目标蛋白进行融合表达，从而提高糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达；所述标签蛋白基因为3’‑磷酸腺苷‑5’磷酸酶基因、2‑氧代‑3‑脱氧‑6磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因或者抗终止作用因子基因中的至少一种，将标签蛋白基因构建在表达载体的Nde I和Hind III之间，将目标蛋白构建在Hind III和EcoR I之间，且标签蛋白和目标蛋白的之间添加一组肠激酶酶切位点，蛋白序列为DDDDK。融合表达与之前目标蛋白单独表达相比，蛋白的可溶性增加一倍，且酶活提高了80%。

Description

一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法。

背景技术

甜菊糖是一种从甜味菊茎叶中提取的天然甜味剂，其主要成分为甜菊糖甙，它是一种高甜度、低热值的非发酵性的天然甜味剂。甜度约为蔗糖的200～300倍，其中提纯的莱鲍迪甙A糖的甜度约为蔗糖的450倍，味感更佳。甜菊糖的热值仅为蔗糖的1/300，与蔗糖、葡萄糖等天然甜味剂，甜密素、阿斯巴甜等化学合成甜味剂相比，甜菊糖具有热量低、甜度高、味质好、耐高温、稳定性好等特点，摄入人体后不被吸收，不产生热量，是糖尿病和肥胖病患者适用的甜味剂。甜菊糖是继甘蔗甜菜糖之外第三种有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际誉为“世界第三蔗糖”。

甜菊叶中三种最主要的糖苷成分在叶片中的含量通常为：甜菊苷（Stevioside，St甙）占叶片干重9.1%，莱鲍迪苷A（Rebaudioside A,RA甙)占3.8%，莱鲍迪苷C占0.6%。其中RA甙与其它糖苷相比，其甜度高，且甜味纯正，口感也更接近蔗糖，甘苦味和甘草异味低，稳定性好，是一种理想的天然高倍甜味剂产品。因此，提高甜菊糖甙的含量，尤其是提高RA 甙的纯度，获得高品质的甜菊糖，成为甜菊糖产业升级和产品改进的重要目标和内容。

目前已发现的糖基转移酶UGT76G1可通过一步糖基化反应将St甙转化生成RA甙[1]。但是植物来源的糖基转移酶UGT76G1在大肠杆菌中表达会产生大量包涵体，实际可溶性表达很低。针对外源基因在异源表达时出现包涵体现象，目前研究人员提出了较多的解决方法，如：优化密码子[2]、降低诱导温度[3]、降低诱导物的浓度、添加分子伴侣[4-7]以及融合表达[8-12]等等。本发明即采用多种新型的低分子量的标签蛋白与糖基转移酶进行融合表达，最终提高糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达。

参考文献

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发明内容

本发明的目的是针对目前植物来源的糖基转移酶UGT76G1在大肠杆菌中表达会产生大量包涵体，实际可溶性表达很低的问题，提供一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法, 采用多种新型的低分子量的标签蛋白与糖基转移酶进行融合表达，最终提高糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，将标签蛋白基因与目标蛋白基因构建到表达载体上，导入到大肠杆菌中构建得到重组菌，重组菌诱导表达，标签蛋白与目标蛋白进行融合表达，从而提高糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达；所述标签蛋白基因为3’-磷酸腺苷-5’磷酸酶基因、2-氧代-3-脱氧-6磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因或者抗终止作用因子基因中的至少一种，所述目标蛋白基因为植物来源糖基转移酶基因。

将标签蛋白基因构建在表达载体的Nde I和Hind III之间，将目标蛋白构建在Hind III和EcoR I之间，且标签蛋白和目标蛋白的之间添加一组肠激酶酶切位点，蛋白序列为DDDDK。

所述目标蛋白基因为甜叶菊来源的糖基转移酶基因，为GenBank accession no:AAR06912，该序列命名为UGT，基因序列见SEQ.No.1所示，其编码的糖基转移酶氨基酸序列见SEQ.No.5所示。

所述的3’-磷酸腺苷-5’磷酸酶（3’-phosphoadenosine-5’-phosphatase）编码基因为GenBank accession no: BAE78215，该序列命名为CysQ，基因序列见SEQ.No.2所示，其编码的3’-磷酸腺苷-5’磷酸酶蛋白序列见SEQ.No.6所示；

2-氧代-3-脱氧-6磷酸葡萄糖酸醛缩酶（2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconatealdolase）编码基因为GenBank accession no:YP_006120211，该序列命名为EDA，基因序列见SEQ.No.3所示，其编码的2-氧代-3-脱氧-6磷酸葡萄糖酸醛缩酶蛋白序列见SEQ.No.7所示；

抗终止作用因子（Antitermination L factor）编码基因为GenBank accessionno: AAC76203，该序列命名为NusA，基因序列见SEQ.No.4所示，其编码的抗终止作用因子的蛋白序列如SEQ.No.8所示。

所述重组菌诱导表达条件为：将重组菌接种到LB培养基中，于20~37℃、250rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入LB培养基中，于200rpm， 20~37℃培养2h，待OD₆₀₀达到0.2左右时，添加诱导剂后转18~25℃诱导培养16~30h，离心收集菌体。

所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，用量为0.1~1.0mM。

有益效果：本发明对于植物来源糖基转移酶基因在大肠杆菌中的异源表达，经常会出现包涵体现象，通过使用标签蛋白融合表达的方式，尤其是选用新型的、分子量较小的标签蛋白，降低表达时包涵体的形成，融合表达大大提高了可溶性表达量。将标签蛋白与目标蛋白甜叶菊来源的糖基转移酶基因共同构建到pET-28a（+）质粒上，并转入到大肠杆菌宿主细胞中进行表达，融合表达结果与目标蛋白糖基转移酶单独表达相比，蛋白的可溶性增加一倍，且酶活提高了80%。

附图说明

图1 UGT以及UGT和CysQ/EDA/NusA融合表达的SDS-PAGE结果，M：Marker S：上清I：沉淀；

图2 CysQ与UGT不同诱导温度下融合表达的SDS-PAGE结果，M：Marker S：上清 I：沉淀；

图3 纯酶UGT和CysQ/EDA/NusA-UGT酶活检测实验HPLC图，其中A是标准品甜菊甙（St甙）， B是标准品莱胞迪甙A（RA甙），C、D1、D2、D3分别是纯酶UGT和NusA/CysQ/EDA-UGT酶活检测实验30min的样品。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1 重组大肠杆菌的构建

1）、标签蛋白基因的获得

根据CysQ、EDA、NusA基因序列设计引物，

CysQ上游引物为：

5’-gtg ccg cgc ggc agc cat atg tta gat caa gta tgc cag ctt g-3’

CysQ下游引物为：

5’-ctc gag tgc ggc cgc aag ctt gta aat aga cac tct gaa ccc c-3’

EDA上游引物为：

5’-gtg ccg cgc ggc agc cat atg aaa aac tgg aaa aca agt gca g-3’

EDA下游引物为：

5’-ctc gag tgc ggc cgc aag ctt cag ctt agc gcc ttc tac agc-3’

NusA上游引物为：

5’-gtg ccg cgc ggc agc cat atg aac aaa gaa att ttg gct gta g-3’

NusA下游引物为：

5’-ctc gag tgc ggc cgc aag ctt cgc ttc gtc acc gaa cca gc-3’

所有引物由南京金斯瑞公司合成。

以大肠杆菌BL21（DE3）基因组为模板，用各自的引物进行PCR扩增，将CysQ、EDA和NusA基因片段纯化产物分别和pET-28a（+）载体Nde I、Hind III双酶切胶回收产物，用CloneEZ试剂中DNA连接酶20℃进行连接，将10u1的连接产物pET-28a-CysQ，pET-28a-EDA、pET-28a-NusA分别热击转化至大肠杆菌DH5α感受态中。转化物涂布于含有含100ug/mlKana的平板上，37℃培养过夜，筛选阳性克隆。获得正确序列的克隆载体pET-28a-CysQ、pET-28a-EDA、pET-28a-NusA。

2）、目标蛋白糖基转移酶基因的获得

根据UGT基因序列分别设计引物，

UGT上游引物为：

5’-gtg ccg cgc ggc agc cat atg gaa aat aaa acc gaa acc acc gtc c-3’

UGT下游引物为：

5’-gtg gtg gtg gtg gtg ctc gag tta cag aga gct gat gta tga aac c-3’

UGT（CysQ）上游引物为：

5’-aga gtg tct att tac aag cttgat gac gat gac aag gaa aat aaa acc gaaacc-3’

UGT（CysQ）下游引物为：

5’-gtg gtg gtg gtg gtg ctc gag tta cag aga gct gat gta tga aac c-3’

UGT（EDA）上游引物为：

5’-gaa ggc gct aag ctg aag cttgat gac gat gac aag gaa aat aaa acc gaaacc-3’

UGT（EDA）下游引物为：

5’-gtg gtg gtg gtg gtg ctc gag tta cag aga gct gat gta tga aac c-3’

UGT（NusA）上游引物为：

5’-ttc ggt gac gaa gcg aag cttgat gac gat gac aag gaa aat aaa acc gaaacc-3’

UGT（NusA）下游引物为：

5’-gtg gtg gtg gtg gtg ctc gag tta cag aga gct gat gta tga aac c-3’

所有引物由南京金斯瑞公司合成，且上述斜体加粗的15个核苷酸序列即为标签蛋白和目标蛋白之间添加的一组肠激酶酶切位点，将15个氨基酸序列翻译成氨基酸序列后即为：DDDDK。

以实验室带有UGT基因的质粒PYes2-UGT（专利ZL 201210029158.2）作为模板，用各自的引物进行PCR扩增，将UGT基因片段纯化产物分别和pET-28a（+）以及上述的pET-28a-CysQ、pET-28a-EDA、pET-28a-NusA载体的Hind III、EcoR I双酶切胶回收产物，用CloneEZ试剂中DNA连接酶20℃进行连接，将10u1的连接产物pET-28a-CysQ/EDA/NusA-UGT热击转化至大肠杆菌DH5α感受态中。转化物涂布于含有含100ug/ml Kana的平板上，37℃培养过夜，筛选阳性克隆。获得正确序列的克隆载体pET-28a-UGT和pET-28a-CysQ-UGT、pET-28a-EDA-UGT以及pET-28a-NusA-UGT。

3）、重组大肠杆菌的获得

将上述得到的正确的克隆载体pET-28a-UGT和pET-28a-CysQ-UGT、pET-28a-EDA-UGT以及pET-28a-NusA-UGT热击转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态中，转化物涂布于含有含100ug/ml Kana的平板上，37℃培养过夜，获得重组大肠杆菌。

实施例2 重组菌的融合表达

将分别含有pET-28a-UGT和pET-28a-CysQ-UGT、pET-28a-EDA-UGT以及pET-28a-NusA-UGT的四株重组菌接种到含有0.05g/L卡纳霉素的5mL LB培养基（0.5g/L酵母粉，1g/L氯化钠，1g/L胰蛋白胨），于37℃、200rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入含有50mL LB培养基的500mL摇瓶中，于200rpm，37℃培养2h，待OD₆₀₀达到0.2左右时，添加0.5mMIPTG，后30℃诱导16h离心收集菌体。超声破菌，离心取上清液为粗酶液，取一部分用于SDS-PAGE的检测（结果见，图1），其他置于4℃冰箱待用。结果发现，融合蛋白CysQ-UGT的可溶性比例比UGT单独表达的要高出一倍；融合蛋白EDA-UGT和NusA-UGT的可溶性也比UGT单独表达的要高一些，但并没有融合蛋白CysQ-UGT可溶性提高地那么明显。融合蛋白CysQ-UGT效果最佳。

实施例3 温度对重组菌融合表达的影响

将分别含有pET-28a-UGT和pET-28a-CysQ-UGT的两株重组菌接种到含有0.05g/L卡纳霉素的5mL LB培养基（0.5g/L酵母粉，1g/L氯化钠，1g/L胰蛋白胨），于37℃、200rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入含有50mL LB培养基的500mL摇瓶中，于200rpm，37℃培养2h，待OD₆₀₀达到0.2左右时，添加0.5mM IPTG，后20、25、30℃分别诱导30h、22h、16h离心收集菌体。超声破菌，离心取上清液为粗酶液，取一部分用于SDS-PAGE的检测（结果见，图2），其他置于4℃冰箱待用。结果发现诱导温度在25℃，可溶性效果达到最好。

实施例4 融合表达蛋白粗酶液的活性检测

1）、催化反应体系

在3mL温度30℃，pH=7.2的50mM的磷酸钾缓冲溶液中，添加1mM甜菊甙（St甙），2mMUDPG，3mM MgCl₂，最后加入1mg粗酶液（含UGT或者UGT-CysQ）开始反应。在0min、15min、30min时分别取样500ul，置于95℃水浴锅内煮15min，后室温下12000rpm/min，离心1min，取上清300ul置于新的EP管中。样品后用等体积的水饱和正丁醇进行萃取两遍，后氮吹仪蒸干，最终加入300ul水饱和正丁醇重新溶解样品，待液相检测（结果见，表1）。结果发现，融合表达的酶没有损失活性，并且还增加了80%。可能是标签蛋白CysQ表面集群的疏水性氨基酸会促进分子伴侣与之绑定，提高了融合蛋白的可溶性表达，大大提高了融合蛋白在粗酶液中各种杂蛋白中所占的比例，因此与UGT单独表达时相比，粗酶液CysQ-UGT的酶活更高。

2）、HPLC检测方法

色谱柱:Lichrospher NH2柱(250mm X 4. 6mm, 5 u m)；流动相为乙睛：水20 ；V：V)；流速：1mL/min；柱温：40℃；检测波长：210nm。

3）、酶活力单位定义为：在上述反应条件下，30 °C，1 min催化形成1 μmol 产物莱鲍迪甙A所需要的酶量为1个活力单位(U)。

表1 UGT和CysQ-UGT粗酶液的酶活比较

Enzyme	Specific activity (mU/mg)
		UGT	11.28(±1.68)
CysQ-UGT	20.53(±1.02)

实施例5 融合表达蛋白纯酶的活性检测

1）、催化反应体系

在3mL温度30℃，pH=7.2的50mM的磷酸钾缓冲溶液中，添加1mM甜菊甙（St甙），2mMUDPG，3mM MgCl₂，最后加入1mg纯酶（含UGT、UGT-CysQ、UGT-EDA或者UGT-NusA）开始反应。在0min、15min、30min时分别取样500ul，置于95℃水浴锅内煮15min，后室温下12000rpm/min，离心1min，取上清300ul置于新的EP管中。样品后用等体积的水饱和正丁醇进行萃取两遍，后氮吹仪蒸干，最终加入300ul水饱和正丁醇重新溶解样品，待液相检测（结果见，表2以及图3）。结果发现，相比单独表达酶UGT，纯化后融合蛋白的酶活更高，并且融合蛋白CysQ-UGT的酶活最高，融合蛋白提高了蛋白结构的稳定性，酶活性也进而增强。并且新型的相对而言分子量较低的标签蛋白CysQ更为地适合。

2）、HPLC检测方法

色谱柱:Lichrospher NH2柱(250mm X 4. 6mm, 5 u m)；流动相为乙睛：水20 ；V：V)；流速：1mL/min；柱温：40℃；检测波长：210nm。

3）、酶活力单位定义为：在上述反应条件下，30 °C，1 min催化形成1 μmol 产物莱鲍迪甙A所需要的酶量为1个活力单位(U)。

表2 UGT和CysQ-UGT纯酶液的酶活比较

Enzyme	Specific activity (mU/mg)
		UGT76G1	0.69(±0.16)
CysQ-UGT	6.11(±0.72)
		EDA-UGT	3.01(±0.22)
NusA-UGT	1.49(±0.19)

SEQUENCE LISTING

<110> 南京工业大学

<120> 一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法

<130>

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggaaaata aaaccgaaac caccgtccgc cgtcgtcgcc gtatcattct gttcccggtc 60

ccgttccagg gccacatcaa cccgattctg caactggcga acgtgctgta ttcgaaaggt 120

ttcagcatca ccatcttcca tacgaacttc aacaagccga agaccagcaa ttacccgcac 180

tttacgttcc gttttattct ggataacgac ccgcaggatg aacgcatctc taatctgccg 240

acccacggcc cgctggcggg tatgcgtatt ccgattatca acgaacacgg cgcagatgaa 300

ctgcgtcgcg aactggaact gctgatgctg gccagcgaag aagatgaaga agtttcttgc 360

ctgatcaccg acgcactgtg gtattttgcc cagtctgttg cagatagtct gaacctgcgt 420

cgcctggtcc tgatgaccag cagcctgttc aattttcatg cccacgttag tctgccgcag 480

ttcgatgaac tgggttatct ggacccggat gacaaaaccc gcctggaaga acaggcgagc 540

ggctttccga tgctgaaagt caaggatatt aagtcagcgt actcgaactg gcagattctg 600

aaagaaatcc tgggtaaaat gattaagcaa accaaagcaa gttccggcgt catctggaat 660

agtttcaaag aactggaaga atccgaactg gaaacggtga ttcgtgaaat cccggctccg 720

agttttctga ttccgctgcc gaagcatctg accgcgagca gcagcagcct gctggatcac 780

gaccgcacgg tgtttcagtg gctggatcag caaccgccga gttccgtgct gtatgttagc 840

ttcggtagta cctcggaagt ggatgaaaag gactttctgg aaatcgctcg tggcctggtt 900

gatagcaaac aatctttcct gtgggtggtt cgcccgggtt ttgtgaaggg ctctacgtgg 960

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tcaacgctgg aatcggtttg tgaaggtgtc ccgatgattt tctcagattt tggcctggac 1140

cagccgctga atgcacgtta tatgtcggat gttctgaaag tcggtgtgta cctggaaaac 1200

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ggcggttcat cgtatgaaag tctggaatcc ctggtttcat acatcagctc tctgtaa 1377

<210> 2

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgttagatc aagtatgcca gcttgcacgg aatgcaggcg atgccattat gcaggtctac 60

gacgggacga aaccgatgga cgtcgtcagc aaagcggaca attctccggt aacggcagcg 120

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ctggtagacc cgctggatgg tactaaagag tttattaaac gtaatggcga attcaccgtt 300

aacattgcgc tcattgacca tggcaaaccg attttaggcg tggtgtatgc gccggtaatg 360

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<210> 3

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 4

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaacaaag aaattttggc tgtagttgaa gccgtatcca atgaaaaggc gctacctcgc 60

gagaagattt tcgaagcatt ggaaagcgcg ctggcgacag caacaaagaa aaaatatgaa 120

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gcggtgtcta ctgaactggg tggcgagcgt atcgatatcg tcctgtggga tgataacccg 840

gcgcagttcg tgattaacgc aatggcaccg gcagacgttg cttctatcgt ggtggatgaa 900

gataaacaca ccatggatat cgccgttgaa gccggtaacc tggcgcaggc gattggccgt 960

aacggtcaga acgtgcgtct ggcttcgcag ctgagcggtt gggaactcaa cgtgatgacc 1020

gttgacgacc tgcaggctaa gcatcaggcg gaagcgcacg cagcgatcga caccttcacc 1080

aaatatctcg acatcgacga agacttcgcg actgttctgg tagaagaagg cttctcgacg 1140

ctggaagaat tggcctatgt gccgatgaaa gagctgttgg aaatcgaagg ccttgatgag 1200

ccgaccgttg aagcactgcg cgagcgtgct aaaaatgcac tggccaccat tgcacaggcc 1260

caggaagaaa gcctcggtga taacaaaccg gctgacgatc tgctgaacct tgaaggggta 1320

gatcgtgatt tggcattcaa actggccgcc cgtggcgttt gtacgctgga agatctcgcc 1380

gaacagggca ttgatgatct ggctgatatc gaagggttga ccgacgaaaa agccggagca 1440

ctgattatgg ctgcccgtaa tatttgctgg ttcggtgacg aagcgtaa 1488

<210> 5

<211> 458

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile

1 5 10 15

Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu

20 25 30

Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr

35 40 45

Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg

50 55 60

Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro

65 70 75 80

Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His

85 90 95

Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser

100 105 110

Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr

115 120 125

Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu

130 135 140

Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln

145 150 155 160

Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu

165 170 175

Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser

180 185 190

Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile

195 200 205

Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu

210 215 220

Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro

225 230 235 240

Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser

245 250 255

Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro

260 265 270

Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp

275 280 285

Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln

290 295 300

Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp

305 310 315 320

Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val

325 330 335

Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala

340 345 350

Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu

355 360 365

Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn

370 375 380

Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn

385 390 395 400

Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val

405 410 415

Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln

420 425 430

Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu

435 440 445

Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu

450 455

<210> 6

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Leu Asp Gln Val Cys Gln Leu Ala Arg Asn Ala Gly Asp Ala Ile

1 5 10 15

Met Gln Val Tyr Asp Gly Thr Lys Pro Met Asp Val Val Ser Lys Ala

20 25 30

Asp Asn Ser Pro Val Thr Ala Ala Asp Ile Ala Ala His Thr Val Ile

35 40 45

Met Asp Gly Leu Arg Thr Leu Thr Pro Asp Val Pro Val Leu Ser Glu

50 55 60

Glu Asp Pro Pro Gly Trp Glu Val Arg Gln His Trp Gln Arg Tyr Trp

65 70 75 80

Leu Val Asp Pro Leu Asp Gly Thr Lys Glu Phe Ile Lys Arg Asn Gly

85 90 95

Glu Phe Thr Val Asn Ile Ala Leu Ile Asp His Gly Lys Pro Ile Leu

100 105 110

Gly Val Val Tyr Ala Pro Val Met Asn Val Met Tyr Ser Ala Ala Glu

115 120 125

Gly Lys Ala Trp Lys Glu Glu Cys Gly Val Arg Lys Gln Ile Gln Val

130 135 140

Arg Asp Ala Arg Pro Pro Leu Val Val Ile Ser Arg Ser His Ala Asp

145 150 155 160

Ala Glu Leu Lys Glu Tyr Leu Gln Gln Leu Gly Glu His Gln Thr Thr

165 170 175

Ser Ile Gly Ser Ser Leu Lys Phe Cys Leu Val Ala Glu Gly Gln Ala

180 185 190

Gln Leu Tyr Pro Arg Phe Gly Pro Thr Asn Ile Trp Asp Thr Ala Ala

195 200 205

Gly His Ala Val Ala Ala Ala Ala Gly Ala His Val His Asp Trp Gln

210 215 220

Gly Lys Pro Leu Asp Tyr Thr Pro Arg Glu Ser Phe Leu Asn Pro Gly

225 230 235 240

Phe Arg Val Ser Ile Tyr

245

<210> 7

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Lys Asn Trp Lys Thr Ser Ala Glu Ser Ile Leu Thr Thr Gly Pro

1 5 10 15

Val Val Pro Val Ile Val Val Lys Lys Leu Glu His Ala Val Pro Met

20 25 30

Ala Lys Ala Leu Val Ala Gly Gly Val Arg Val Leu Glu Val Thr Leu

35 40 45

Arg Thr Glu Cys Ala Val Asp Ala Ile Arg Ala Ile Ala Lys Glu Val

50 55 60

Pro Glu Ala Ile Val Gly Ala Gly Thr Val Leu Asn Pro Gln Gln Leu

65 70 75 80

Ala Glu Val Thr Glu Ala Gly Ala Gln Phe Ala Ile Ser Pro Gly Leu

85 90 95

Thr Glu Pro Leu Leu Lys Ala Ala Thr Glu Gly Thr Ile Pro Leu Ile

100 105 110

Pro Gly Ile Ser Thr Val Ser Glu Leu Met Leu Gly Met Asp Tyr Gly

115 120 125

Leu Lys Glu Phe Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Asn Gly Gly Val Lys

130 135 140

Ala Leu Gln Ala Ile Ala Gly Pro Phe Ser Gln Val Arg Phe Cys Pro

145 150 155 160

Thr Gly Gly Ile Ser Pro Ala Asn Tyr Arg Asp Tyr Leu Ala Leu Lys

165 170 175

Ser Val Leu Cys Ile Gly Gly Ser Trp Leu Val Pro Ala Asp Ala Leu

180 185 190

Glu Ala Gly Asp Tyr Asp Arg Ile Thr Lys Leu Ala Arg Glu Ala Val

195 200 205

Glu Gly Ala Lys Leu

210

<210> 8

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Asn Lys Glu Ile Leu Ala Val Val Glu Ala Val Ser Asn Glu Lys

1 5 10 15

Ala Leu Pro Arg Glu Lys Ile Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ala Leu Ala

20 25 30

Thr Ala Thr Lys Lys Lys Tyr Glu Gln Glu Ile Asp Val Arg Val Gln

35 40 45

Ile Asp Arg Lys Ser Gly Asp Phe Asp Thr Phe Arg Arg Trp Leu Val

50 55 60

Val Asp Glu Val Thr Gln Pro Thr Lys Glu Ile Thr Leu Glu Ala Ala

65 70 75 80

Arg Tyr Glu Asp Glu Ser Leu Asn Leu Gly Asp Tyr Val Glu Asp Gln

85 90 95

Ile Glu Ser Val Thr Phe Asp Arg Ile Thr Thr Gln Thr Ala Lys Gln

100 105 110

Val Ile Val Gln Lys Val Arg Glu Ala Glu Arg Ala Met Val Val Asp

115 120 125

Gln Phe Arg Glu His Glu Gly Glu Ile Ile Thr Gly Val Val Lys Lys

130 135 140

Val Asn Arg Asp Asn Ile Ser Leu Asp Leu Gly Asn Asn Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Ile Leu Arg Glu Asp Met Leu Pro Arg Glu Asn Phe Arg Pro Gly

165 170 175

Asp Arg Val Arg Gly Val Leu Tyr Ser Val Arg Pro Glu Ala Arg Gly

180 185 190

Ala Gln Leu Phe Val Thr Arg Ser Lys Pro Glu Met Leu Ile Glu Leu

195 200 205

Phe Arg Ile Glu Val Pro Glu Ile Gly Glu Glu Val Ile Glu Ile Lys

210 215 220

Ala Ala Ala Arg Asp Pro Gly Ser Arg Ala Lys Ile Ala Val Lys Thr

225 230 235 240

Asn Asp Lys Arg Ile Asp Pro Val Gly Ala Cys Val Gly Met Arg Gly

245 250 255

Ala Arg Val Gln Ala Val Ser Thr Glu Leu Gly Gly Glu Arg Ile Asp

260 265 270

Ile Val Leu Trp Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Val Ile Asn Ala Met

275 280 285

Ala Pro Ala Asp Val Ala Ser Ile Val Val Asp Glu Asp Lys His Thr

290 295 300

Met Asp Ile Ala Val Glu Ala Gly Asn Leu Ala Gln Ala Ile Gly Arg

305 310 315 320

Asn Gly Gln Asn Val Arg Leu Ala Ser Gln Leu Ser Gly Trp Glu Leu

325 330 335

Asn Val Met Thr Val Asp Asp Leu Gln Ala Lys His Gln Ala Glu Ala

340 345 350

His Ala Ala Ile Asp Thr Phe Thr Lys Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Asp

355 360 365

Phe Ala Thr Val Leu Val Glu Glu Gly Phe Ser Thr Leu Glu Glu Leu

370 375 380

Ala Tyr Val Pro Met Lys Glu Leu Leu Glu Ile Glu Gly Leu Asp Glu

385 390 395 400

Pro Thr Val Glu Ala Leu Arg Glu Arg Ala Lys Asn Ala Leu Ala Thr

405 410 415

Ile Ala Gln Ala Gln Glu Glu Ser Leu Gly Asp Asn Lys Pro Ala Asp

420 425 430

Asp Leu Leu Asn Leu Glu Gly Val Asp Arg Asp Leu Ala Phe Lys Leu

435 440 445

Ala Ala Arg Gly Val Cys Thr Leu Glu Asp Leu Ala Glu Gln Gly Ile

450 455 460

Asp Asp Leu Ala Asp Ile Glu Gly Leu Thr Asp Glu Lys Ala Gly Ala

465 470 475 480

Leu Ile Met Ala Ala Arg Asn Ile Cys Trp Phe Gly Asp Glu Ala

485 490 495

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtgccgcgcg gcagccatat gttagatcaa gtatgccagc ttg 43

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctcgagtgcg gccgcaagct tgtaaataga cactctgaac ccc 43

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtgccgcgcg gcagccatat gaaaaactgg aaaacaagtg cag 43

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctcgagtgcg gccgcaagct tcagcttagc gccttctaca gc 42

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtgccgcgcg gcagccatat gaacaaagaa attttggctg tag 43

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctcgagtgcg gccgcaagct tcgcttcgtc accgaaccag c 41

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtgccgcgcg gcagccatat ggaaaataaa accgaaacca ccgtcc 46

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtggtggtgg tggtgctcga gttacagaga gctgatgtat gaaacc 46

<210> 17

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agagtgtcta tttacaagct tgatgacgat gacaaggaaa ataaaaccga aacc 54

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gtggtggtgg tggtgctcga gttacagaga gctgatgtat gaaacc 46

<210> 19

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gaaggcgcta agctgaagct tgatgacgat gacaaggaaa ataaaaccga aacc 54

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gtggtggtgg tggtgctcga gttacagaga gctgatgtat gaaacc 46

<210> 21

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ttcggtgacg aagcgaagct tgatgacgat gacaaggaaa ataaaaccga aacc 54

<210> 22

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtggtggtgg tggtgctcga gttacagaga gctgatgtat gaaacc 46

Claims (4)

1.一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，其特征在于，将标签蛋白基因与目标蛋白基因构建到表达载体上，导入到大肠杆菌中构建得到重组菌，重组菌诱导表达，标签蛋白与目标蛋白进行融合表达，提高糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达；所述标签蛋白基因为3’-磷酸腺苷-5’磷酸酶基因、2-氧代-3-脱氧-6磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因或者抗终止作用因子基因中的一种，所述目标蛋白基因为植物来源糖基转移酶基因；将标签蛋白基因构建在表达载体的Nde I和Hind III之间，将目标蛋白构建在Hind III和EcoR I之间，且标签蛋白和目标蛋白的之间添加一组肠激酶酶切位点，蛋白序列为DDDDK；所述目标蛋白基因为甜叶菊来源的糖基转移酶基因，为GenBank accession no:AAR06912，基因序列见SEQ.No.1所示；所述3’-磷酸腺苷-5’磷酸酶基因为GenBankaccession no: BAE78215，基因序列见SEQ.No.2所示；2-氧代-3-脱氧-6磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因为GenBank accession no:YP_006120211，基因序列见SEQ.No.3所示；抗终止作用因子基因为GenBank accession no: AAC76203，基因序列见SEQ.No.4所示。

2.根据权利要求1所述的一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，其特征在于，所述重组菌诱导表达条件为：将重组菌接种到LB培养基中，于20~37℃、250rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入LB培养基中，于200rpm， 20~37℃培养2h，待OD₆₀₀达到0.2时，添加诱导剂后转18~25℃诱导培养16~30h，离心收集菌体。

3.根据权所述利要求2所述的一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，其特征在于，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，用量为0.1~1.0mM。

4.根据权利要求2所述的一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，其特征在于，所述诱导培养温度为25℃，诱导时间为22h。