CN106577049A - 一种利用生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法，其中，包括方法一，配置添加了生物质炭培养基的抑制法，方法二，将添加了生物质炭培养基的pH调节回培养基原始pH的抑制法，方法三，配置菌土抑制法。本发明方法简单，使用方便，对黑胫病菌抑制效果好，本发明在燕麦培养基中分别或共同加入不同比例的两种生物质炭，通过对相关指标进行测定，确定生物质炭对烟草黑胫病菌的影响，并从生物质炭自身性质出发，设计相关实验进行机理验证；选用棕壤土，在盆栽条件下加入不用比例稻壳炭，验证生物质炭对烟草黑胫病的防治效果，以期为生物质炭的合理化应用和烟草黑胫病的相关研究及综合治理提供理论依据。

Description

一种利用生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法

技术领域：

本发明涉及烟草致病菌的抑制方法技术领域，具体的涉及一种利用生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法。

背景技术：

烟草黑胫病是烟草生产上的一种毁灭性病害，严重制约我国各烟区烟叶的生产。据不完全统计，我国平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失达1亿元以上。烟草黑胫病菌在无烟草存在的土壤中可存活5年或者更长，在风干土中可存活18个月，侵染烟草植株后，会严重影响烟叶产质量的提高。针对黑胫病菌的抑制或防治，通常采用化学药物，化学药物对环境污染大，时间长久不利于农业生产和环境发展，因此，需要选取一种新的方法来抑制黑胫病菌。

生物质炭是生物质在高温下热解生成，是一种含碳丰富的固体物质（SOHI S Pet.al，2010；杨平平，2012），它具有较好的孔隙结构和比表面积，营养元素丰富，能改善农田环境，在农业方面应用广泛。我国是烟草种植大国，种植面积居世界首位，每年都会产生大量的烟草废弃物（主要为烟草秸秆），目前来说主要的处理方式是焚烧和直接还田，焚烧会造成元素损失和环境污染，而秸秆还田则容易导致严重的土传病害。因此，将烟草秸秆炭化后进行应用可以充分发挥其优点，减少秸秆焚烧造成的区域环境污染。现有技术中的记载，生物质炭的利用，多数集中在炭基肥的利用上，例如中国专利申请CN104292044A公开了一种酸性土壤改良并防治烟草根茎病害的生物质炭基肥。（其通过生物质炭基肥来改良土壤结构，增加水肥利用率，提高土壤肥力，提高烟株抗性，丰富土壤微生态，促进作物生长发育进而达到防治烟草根茎病，但是并无实验数据以证明其对根茎病的影响，效果未知）

其他记载中：在多孔的无土介质中施加生物质炭能减少辣椒和番茄叶部真菌病害的侵入（Ellen R.Graber et.al，2010）。施用椰子生物炭后，芦笋的镰刀菌感染率明显降低（Lehmann J，2011）。与对照相比，施用木炭的某些处理中，青枯菌对番茄的侵染明显降低（Lehmann J，2011）。到目前为止，已经在6个不同的致病体系中发现在土壤中施加生物质炭能影响土传病害的发生程度（Graber ER et.al，2014）。通过现有文献记载，已经报道的关于生物质炭对植物病害的影响主要集中在辣椒、番茄、芦笋、大豆等作物上（EllenR.Graber et.al，2010；Lehmann J，2011；Jaiswal AK，2013），而对烟草及烟草黑胫病的研究尚未见报道，而烟草又是我国重要的经济作物之一，烟草黑胫病是影响其产质量的主要病害，所以研究生物质炭对烟草黑胫病影响是十分必要的。鉴于上述现有技术，本发明旨在提供一种方法简单，使用方便，对黑胫病菌抑制效果好的一种利用生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种方法简单，使用方便，对黑胫病菌抑制效果好的一种利用生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种利用生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法，其中，包括

方法一，配置添加了生物质炭培养基的抑制法，

方法二，将添加了生物质炭培养基的pH调节回培养基原始pH的抑制法，

方法三，配置菌土抑制法。

方法一包括如下步骤：

配置燕麦培养基：燕麦片33g，琼脂粉18g，去离子水1000ml，

在燕麦培养基的配置过程中加入不同比例的稻壳炭和/或烟草秸秆炭并测定相应的pH值；

接种黑胫病菌株并采用十字交叉法测定菌落直径，以培养2d的菌落直径变化计算黑胫病菌菌丝的生长速率及抑制率。

方法二包括如下步骤：

配置燕麦培养基：燕麦片33g，琼脂粉18g，去离子水1000ml，

在燕麦培养基的配置过程中加入不同比例的稻壳炭和/或烟草秸秆炭并测定相应的pH值；接着用0.1mol的HCl或NaOH溶液将变化的pH值调回到初始值，初始值为不加生物质炭的培养基所对应的pH值，

灭菌后进行接菌实验，培养结束后，挑取菌丝置于载玻片上，在显微镜下观察黑胫病菌菌丝形态的变化。

方法三包括如下步骤：

菌谷准备：将谷子加水煮开至半数谷粒呈开花状，装入500ml三角瓶中，121℃高压灭菌20 min；在无菌条件下，取1cm×1cm的烟草黑胫病菌菌块转接到盛有菌谷的三角瓶中，28℃培养14d备用；

菌土准备：将灭菌的土壤与生物质炭（稻壳炭和/或烟草秸秆炭）按不同比例（0，1%，2%，4%，10%，20%）混合，装入直径9cm、高7cm的花盆中，先装3/4的混合土，均匀加入菌谷0.5g/盆，将剩余1/4的混合土填满，浇透水，置于人工气候室内一个月，保持高温高湿；

移栽：将苗龄60天左右的烟苗移栽到花盆中，每盆一株。每个处理10盆，重复3次，置于人工气候室培养，白天30℃/黑夜28℃，光照12h/黑暗12h，相对湿度95%，移栽后于第5、7、9天调查烟苗的发病级数，并进行记录，计算病情指数和防治效果。病情指数=∑（各级病株数×级数）/（最高病级数×调查总株数）×100，防治效果=（对照组病指-处理组病指）/对照组病指×100%。

生物质炭为稻壳炭和/或烟草秸秆炭，

稻壳炭：烟草秸秆炭为0-20g/L:20-0g/L。

本发明的优点为：方法简单，使用方便，对黑胫病菌抑制效果好，具体为：

本发明通过室内培养试观察生物质炭对烟草黑胫病菌的影响，从生物质炭自身性质分析可能的作用机理，并进行盆栽验证。在燕麦培养基中分别或共同加入不同比例的两种生物质炭，通过对相关指标进行测定，确定生物质炭对烟草黑胫病菌的影响，并从生物质炭自身性质出发，设计相关实验进行机理验证；选用棕壤土，在盆栽条件下加入不用比例稻壳炭，验证生物质炭对烟草黑胫病的防治效果，以期为生物质炭的合理化应用和烟草黑胫病的相关研究及综合治理提供理论依据。生物质炭随着比例的增加病菌生长抑制率逐渐升高，抑制效果显著。黑胫病菌菌落直径随着pH的升高呈逐渐减小的趋势，生物质炭的吸附性及毒性物质（A&T）显著减小了黑胫病菌菌落直径，且随着比例的增加呈显著降低。综上，本发明生物质炭对烟草黑胫病菌具有显著的抑制效果。

附图说明：

图1 生物质炭对黑胫病菌菌丝生长速率的影响（A.烟草秸秆炭；B.稻壳炭）

图2 pH和炭的吸附性&毒性物质（A&T)对黑胫病菌菌丝生长速率的影响（A、B、C、D依次是烟草秸秆炭对应的pH、烟草秸秆炭的A&T、稻壳炭对应的pH、稻壳炭的A&T对菌丝生长速率的影响）

图3 黑胫病菌菌丝形态（10×40倍）（1.正常菌丝形态；2.菌丝变形；3.菌丝分支；4.原生质泄露）

具体实施方式：

本发明提供了一种利用生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法，其中，包括

方法一，配置添加了生物质炭培养基的抑制法，

方法二，将添加了生物质炭培养基的pH调节回培养基原始pH的抑制法，

方法三，配置菌土抑制法。

方法一包括如下步骤：

配置燕麦培养基：燕麦片33g，琼脂粉18g，去离子水1000ml，

在燕麦培养基的配置过程中加入不同比例的稻壳炭和/或烟草秸秆炭并测定相应的pH值；

接种黑胫病菌株并采用十字交叉法测定菌落直径，以培养2d的菌落直径变化计算黑胫病菌菌丝的生长速率及抑制率。

方法二包括如下步骤：

配置燕麦培养基：燕麦片33g，琼脂粉18g，去离子水1000ml，

在燕麦培养基的配置过程中加入不同比例的稻壳炭和/或烟草秸秆炭并测定相应的pH值；接着用0.1mol的HCl或NaOH溶液将变化的pH值调回到初始值，初始值为不加生物质炭的培养基所对应的pH值，

灭菌后进行接菌实验，培养结束后，挑取菌丝置于载玻片上，在显微镜下观察黑胫病菌菌丝形态的变化。

方法三包括如下步骤：

菌谷准备：将谷子加水煮开至半数谷粒呈开花状，装入500ml三角瓶中，121℃高压灭菌20 min；在无菌条件下，取1cm×1cm的烟草黑胫病菌菌块转接到盛有菌谷的三角瓶中，28℃培养14d备用；

菌土准备：将灭菌的土壤与生物质炭（稻壳炭和/或烟草秸秆炭）按不同比例（0，1%，2%，4%，10%，20%）混合，装入直径9cm、高7cm的花盆中，先装3/4的混合土，均匀加入菌谷0.5g/盆，将剩余1/4的混合土填满，浇透水，置于人工气候室内一个月，保持高温高湿；

移栽：将苗龄60天左右的烟苗移栽到花盆中，每盆一株。每个处理10盆，重复3次，置于人工气候室培养，白天30℃/黑夜28℃，光照12h/黑暗12h，相对湿度95%，移栽后于第5、7、9天调查烟苗的发病级数，并进行记录，计算病情指数和防治效果。病情指数=∑（各级病株数×级数）/（最高病级数×调查总株数）×100，防治效果=（对照组病指-处理组病指）/对照组病指×100%。

生物质炭为稻壳炭和/或烟草秸秆炭，

稻壳炭：烟草秸秆炭为0-20g/L:20-0g/L。

下面结合附图，对本发明进行说明。如图1-3所示，图1 生物质炭对黑胫病菌菌丝生长速率的影响（A.烟草秸秆炭；B.稻壳炭）。图2 pH和炭的吸附性&毒性物质（A&T)对黑胫病菌菌丝生长速率的影响（A、B、C、D依次是烟草秸秆炭对应的pH、烟草秸秆炭的A&T、稻壳炭对应的pH、稻壳炭的A&T对菌丝生长速率的影响）。图3 黑胫病菌菌丝形态（10×40倍）（1.正常菌丝形态；2.菌丝变形；3.菌丝分支；4.原生质泄露）

具体举例：

1.1 材料

供试烟草、菌株及生物质炭：烟草品种是小黄金1025，来自国家烟草中期库。烟草黑胫病菌Phytophthora parasitica var. Nicotianae（普通黑胫病菌）。稻壳炭（S）是从市场购买，烟草秸秆炭（C），【生物质炭（稻壳炭或烟草秸秆炭）是生物有机材料（生物质）在缺氧或绝氧环境中，经高温热裂解后生成的含碳丰富的固态产物。方法是在500℃到600℃的高温和缺氧状态下下，将有机物质高温分解。】，基本理化性质见表1，试验前生物质炭研磨过0.5mm筛。

试剂：盐酸、氢氧化钠、琼脂粉均为国药分析纯，购于青岛赛尚科贸有限公司；燕麦片为超市购买的常规即食燕麦片。

仪器：NIKON Eclipse E100双目显微镜，上海普赫光电科技有限公司；超净工作台（Clean bench），无锡一净净化设备有限公司；Panasonic高压蒸汽灭菌锅（MLS-3751L-PC），松下健康医疗器械株式会社；BINDER生化培养箱，德国Binder有限公司；酸度计（pH计），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 培养基配制

燕麦培养基：燕麦片33g，琼脂粉18g，去离子水1000ml。

1.3 方法

1.3.1 生物质炭对黑胫病菌菌丝生长的影响

在燕麦培养基配置的过程中加入不同比例的炭：0，2.5，5.0，10.0，20.0g/L，并测定相应的pH（见表2）。配制完成后，经121 ℃高压灭菌20 min，倒入无菌培养皿（直径9 cm）中，将事先在燕麦培养基上活化且生长较好的菌株的菌落用直径为5 mm的灭菌打孔器打孔取边缘菌饼，用接种铲接种于平板培养基中央，置于28 ℃恒温黑暗条件下培养，每个处理设5次重复。每天观察测量1次，采用十字交叉法测定菌落直径并做好记录，直到菌丝长满培养皿为止。以培养2d的菌落直径变化计算黑胫病菌菌丝的生长速率（马国胜等，2007）及抑制率（汪琨等，2009）。生长速率(cm d-1)=1/2×(菌落直径-菌饼直径)/培养时间，抑制率%=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100。

1.3.2 pH和炭的吸附性及毒性物质对黑胫病菌菌丝生长的影响

pH对黑胫病菌菌丝生长的影响：在配置燕麦培养基的过程中，用0.1mol的HCl或NaOH溶液按照表2调节培养基的酸碱度，灭菌后进行接菌实验，同1.2.1。

炭的吸附性及毒性物质（Absorption and Toxins，A&T）对黑胫病菌菌丝生长的影响：在配置燕麦培养基的过程中加入不同比例的炭：0，2.5，5.0，10.0，20.0g/L，用0.1mol的HCl或NaOH溶液将变化的pH值调回到初始值（不加炭的培养基所对应的pH值）。灭菌后进行接菌实验，同1.2.1。

1.3.3 生物质炭对黑胫病菌菌丝形态的影响

培养结束后，挑取菌丝置于载玻片上，在显微镜下观察黑胫病菌菌丝形态的变化，并拍照记录。

1.3.4 生物质炭对黑胫病防治效果的盆栽试验

菌谷准备：将谷子加水煮开至半数谷粒呈开花状，装入500ml三角瓶中，121℃高压灭菌20 min。在无菌条件下，取1cm×1cm的烟草黑胫病菌菌块转接到盛有菌谷的三角瓶中，28℃培养14d备用。

菌土准备：将灭菌的土壤与生物质炭（稻壳炭和/或烟草秸秆炭）按不同比例（0，1%，2%，4%，10%，20%）混合，装入直径9cm、高7cm的花盆中，先装3/4的混合土，均匀加入菌谷0.5g/盆（于海芹等，2007），将剩余1/4的混合土填满，浇透水，置于人工气候室内一个月，保持高温高湿。

移栽：将苗龄60天左右的烟苗移栽到花盆中，每盆一株。每个处理10盆，重复3次，置于人工气候室培养，白天30℃/黑夜28℃，光照12h/黑暗12h，相对湿度95%，移栽后于第5、7、9天调查烟苗的发病级数，并进行记录，计算病情指数和防治效果。病情指数=∑（各级病株数×级数）/（最高病级数×调查总株数）×100，防治效果=（对照组病指-处理组病指）/对照组病指×100%。

1.4 数据分析

试验数据采用Excel及SAS 9.2统计软件进行数据统计与分析，α=0.05水平下进行Duncan’s 多重比较。

2结果与分析

2.1 生物质炭对烟草黑胫病菌菌丝生长的影响

2.1.1 对黑胫病菌菌落直径的影响

在燕麦培养基中加入生物质炭后，黑胫病菌菌落直径减小。随着加炭比例由2.5 gL-1l增加到20.0 gL-1，菌落直径迅速下降（表3）。

与CK相比，第一、二、三天加不同比例烟草秸秆炭处理的黑胫病菌菌落直径分别减少0.57-0.82cm、0.81-1.54cm、0.35-1.63cm，加入不同比例稻壳炭处理的菌落直径分别减少0.59-0.76cm、0.37-1.35cm、0.29-0.99cm，两种生物质炭对黑胫病菌菌落直径的降低作用显著。

2.1.2 对黑胫病菌菌丝生长速率和抑制率的影响

烟草秸秆炭对黑胫病菌菌丝生长速率的影响见图1，A。与CK相比,加炭处理的菌丝生长速率均有不同程度的下降，随加炭比例由2.5g L^-1增至20 g L^-1，菌丝生长速率降低幅度为15.56%-28.89%。在燕麦培养基中加入稻壳炭降低了菌丝的生长速率（图1，B，注：不同字母表示经Duncan's 多重比较法验证在P<0.05水平上差异显著。下同。Different lettersindicate significant difference at P<0.05 level by Duncan's Multiple RangeTest. The same below.）。与CK相比，菌丝生长速率随加炭比例的增加呈逐渐降低的趋势，降低幅度为11.85%-25.19%，差异显著。因此，生物质炭能降低黑胫病菌菌丝生长速率，且随加炭比例增加降低效果显著。

由表4可知，在培养基中加入不同比例的烟草秸秆炭对黑胫病菌菌丝生长有一定的抑制作用，随加炭比例的增加抑制效果明显。烟草秸秆炭对黑胫病菌生长的抑制率由加炭比例5g/L的15.06%变化至加炭比例20g/L的28.62%，处理间差异显著。同样的，随着稻壳炭比例的增加病菌生长抑制率由11.34%变化至25.09%，抑制效果显著。

在培养基中加入生物质炭后，通过对黑胫病菌菌落直径、菌丝生长速率、病菌生长抑制率的分析，可以得知生物质炭对黑胫病菌菌丝的生长有抑制作用，且这种作用随着施炭量的增加更为显著。

和炭的吸附性及毒性物质（A&T)对黑胫病菌菌丝生长的影响

2.2.1 对黑胫病菌菌落直径的影响

2.2.1.1 pH对黑胫病菌菌落直径的影响

在培养初期，不同比例的烟草秸秆炭对应pH对菌落直径的影响呈先减小后增加的趋势，调节pH处理的菌落直径均小于CK处理；培养第三天pH对黑茎病菌菌落直径的影响不大，差异不显著。除了加炭比例为10g/L对应的pH对菌落直径有抑制外，其他处理的菌落直径均高于CK的菌落直径。因此，调节培养基的pH在初期对菌丝的生长有一定的抑制作用，但随着培养时间的变化，这种抑制效果不明显，可能与培养基的空间有限，后期菌丝与培养基接触较少有关（表5）。

由表5可知，调节培养基的pH（稻壳炭对应的pH）对黑胫病菌菌落直径有显著的抑制作用。培养前两天，黑胫病菌菌落直径随着pH的升高呈逐渐减小的趋势，与对照相比，分别降低了0.39cm、0.29cm、0.33cm、0.37cm和0.44cm、0.52cm、0.57cm、0.60cm。在第三天，除了加炭比例为2.5 g L^-1和20 g L^-1L对应的pH对菌落直径有显著抑制外，其他处理和对照处理的菌落直径无显著差异，平均值为7.60cm。

2.2.1.2 炭的吸附性及毒性物质（A&T)对黑胫病菌菌落直径的影响

培养前两天，与CK相比，烟草秸秆炭的吸附性及毒性物质（A&T）显著的降低了黑胫病菌菌落直径，降低幅度分别为0.28cm、0.21cm、0.32cm、0.56cm和0.59cm、0.63cm、0.94cm、1.37cm。培养第三天，与CK相比，除加入2.5g/L和5g/L的烟草秸秆炭的处理外，其他处理均显著降低菌落直径。同样的，稻壳炭的吸附性及毒性物质（A&T）显著减小了黑胫病菌菌落直径，且随着比例的增加呈显著降低的趋势。与CK相比，培养前两天稻壳炭A&T处理的菌落直径分别减少了0.37cm、0.67cm、0.27cm、0.49cm和0.66cm、0.92cm、0.49cm、0.71cm。加炭比例为2.5g/L的菌落直径减小幅度大于加炭比例为20g/L的处理，其原因可能是与外界操作不当或者取菌饼时菌丝活力很弱有关。培养第三天，相比于CK，加炭比例为2.5g/L和20g/L的黑胫病菌菌落直径显著减小，分别减少了为0.73cm、0.50cm（表5）。

2.2.2 对黑胫病菌菌丝生长速率的影响

2.2.2.1 pH对黑胫病菌菌丝生长速率的影响

调节培养基的pH对黑胫病菌菌丝生长速率的影响见图2A和C。与CK相比，菌丝的生长速率随着pH的升高而降低，降低幅度分别为3.7%、5.93%、8.89%、3.7%和8.15%、9.63%、11.1%、11.1%，平均值为5.56%和10.00%，说明调节培养基的pH对黑胫病菌菌丝的生长有一定的抑制作用。不同比例的烟草秸秆炭对应的pH高于稻壳炭对应的pH，但是调节烟草秸秆炭对应的pH对菌丝生长速率降低幅度小于稻壳炭对应pH的变化，说明黑胫病菌可能更适合于在碱性环境下生长。

2.2.2.2 炭的吸附性及毒性物质（A&T)对黑胫病菌菌丝生长速率的影响

由图2B可知，烟草秸秆炭的A&T降低了黑胫病菌菌丝的生长速率，与CK相比，不同加炭比例处理的菌丝生长速率降低了11.11%-25.93%，差异显著。同样的，由图2D可知，与CK相比，不同比例的稻壳炭的A&T降低了菌丝的生长速率，降低幅度分别为17.04%、12.04%、9.63%、13.33%，降低效果显著。

2.2.3 对黑胫病菌生长抑制率的影响

2.2.3.1 pH对黑胫病菌生长抑制率的影响

在培养基中调节烟草秸秆炭和稻壳炭对应的pH对黑胫病菌菌丝的生长产生一定的抑制作用。随着培养基pH的升高，抑制率的变化幅度分别为：3.16%-8.74%和8.18%-11.15%，平均值为5.25%和9.90%。从总体来看，虽然抑制率波动不大，仍随着培养基pH的升高呈增加趋势（表6）。

2.2.3.2炭的吸附性及毒性物质（A&T）对黑胫病菌生长抑制率的影响

由表6可知，烟草秸秆炭和稻壳炭的吸附性及毒性物质（A&T）对黑胫病菌菌丝的生长产生了抑制作用。在烟草秸秆炭的A&T试验中，抑制率变化幅度为10.97%-25.46%，平均值为16.40%。病菌生长抑制率随加炭比例的增加呈现增加的趋势，这与正常的添加生物质炭的试验规律一致。

在稻壳炭A&T试验中，随着加炭比例的增加，抑制率分别为17.10%、12.27%、9.11%、13.20%，平均值12.29%。加稻壳炭2.5g/L处理对黑胫病菌的抑制率（17.10%）高于正常加稻壳炭2.5g/L处理的抑制率（11.34%），原因可能与外界操作不当或者选取菌饼的活力有关。

综上所述，从黑胫病菌菌落直径、菌丝生长速率及病菌生长抑制率的变化可以看出，pH和炭的吸附性及毒性物质（A&T)均对黑胫病菌菌丝的生长有一定的抑制作用。从总体来看，这种抑制作用随着pH升高或者加炭比例的升高越来越显著，因此，生物质炭对黑胫病菌菌丝生长的抑制作用主要源于两个方面——pH和炭的吸附性及毒性物质（A&T)。

镜检

培养过程中，与对照相比，处理后的烟草黑胫病菌菌丝生长比较缓慢。在10×40倍的显微镜下观察发现与正常的菌丝相比，高加炭比例的处理（10g/L和20g/L）菌丝出现畸形，菌丝膨大体明显增多，且菌丝分支很多，但大多短小，部分出现断裂，原生质外泄的现象（图3）。

2.4 生物质炭对烟草黑胫病的盆栽防治效果

移栽后5天调查烟苗的发病情况，不施炭处理的烟苗出现明显的发病症状，随着施炭量的增加，烟苗发病程度依次显著降低，降低幅度为5.96%~24.65%。同样的，与对照相比，移栽后第7天和第9天调查烟苗的病指随施炭量的增加呈降低趋势，降低幅度分别为4.59%~32.38%和3.15%~33.75%，减轻病害发生程度效果显著。在调查期间，生物质炭对烟草黑胫病的防治效果随着施炭比例的增加呈增加趋势。在第5、7、9天，不同比例的生物质炭处理对烟草黑胫病的防治效果分别为14.71%~60.89%、7.75%~54.73%、4.35%~45.66%。表明施加一定量的生物质炭对烟草黑胫病有较好的防治效果，能有效的减轻烟草黑胫病的发生程度。

综上，许多研究表明在培养介质中施加生物质炭会降低植物真菌病害的侵染率。（Ellen R.Graber et.al，2010）（Lehmann J，2011）。（Lehmann J，2011）。本研究通过平板培养和盆栽防效试验设计初步探讨了生物质炭对烟草黑胫病菌的影响及作用机理。在燕麦培养基中加入生物质炭能显著抑制黑胫病菌菌丝的生长，而且这种抑制作用会随加炭量的增多越来越显著。从生物质炭自身的性质来看，我们认为生物质炭对黑胫病菌抑制作用的机理主要包括两部分：一方面生物质炭呈碱性。在试验中我们所用的生物质炭均为碱性（表1），加入燕麦培养基中提高了培养基的pH，改变了病菌的生长环境，进而影响病菌的生长。在pH对黑胫病菌菌丝生长影响的试验中，调节燕麦培养基的pH减小了菌落直径，降低了菌丝的生长速率，对黑胫病菌菌丝的生长产生一定的抑制作用。另一方面是生物质炭的吸附性及毒性物质。因为这两者难以分开，我们将其作为一个因素考虑。有研究表明生物质炭的吸附性比普通的土壤胶体粒子高出几个数量级（Graber E. R. et.al，2014）,这种吸附性可能会吸附病菌，抑制菌丝的生长。生物质炭本身含有正链烷酸（n-alkanoic acids）、羟基（hydroxy）、乙酰氧基酸（acetoxy acids）、苯甲酸（benzoic acids）、二醇和三醇类化合物（diols and triols）及酚类化合物（phenols）（Ellen R. Graber，2010），这些有机化合物在低浓度时一方面可能刺激植物生长，诱导系统抗病性，另一方面可能会抑制病菌的生长，从而减轻病害的发生程度。在炭的吸附性及毒性物质试验中，黑胫病菌菌落直径、菌丝生长速率随加炭比例的增加呈现显著降低的趋势，病菌生长抑制率随加炭比例的增加呈显著增加的趋势，表明炭的吸附性及毒性物质对黑胫病菌菌丝的生长有抑制作用。但是当加炭比例过高时，生物质炭不仅会影响土壤质量（章明奎，2012）而且会影响大田烟株的生长，因此要根据用地养地的情况选择合适的生物质炭的施用量，减轻病害发生程度，提高烟叶的产质量。

通过比较正常加生物质炭、调节培养基pH及炭的吸附性及毒性物质试验的抑制率可以看出（表4和表6），在我们所讨论的两种作用机制中，pH和炭的吸附性及毒性物质均对菌丝的生长有一定抑制作用，但在以烟草秸秆炭为基础设计的试验中，炭的吸附性及毒性物质起主导作用，稻壳炭则是pH和炭的吸附性及毒性物质的作用效果所占比重差不多。这种现象的原因可能与生物质炭粒级分布有关。购买的商品稻壳炭其粒级组成主要集中在0.25-0.5mm之间，约占80%，而烟草秸秆炭经研磨过筛后，其粒级组成小于0.25mm的生物炭粒子约占77%。粒级越小，其比表面就越大，吸附性也会随之而改变。

盆栽试验结果显示生物质炭对烟草黑胫病有一定的防治效果，能有效的减轻烟草黑胫病的发生程度。在移栽后9d，高施炭量的处理（20 g L-1）防治效果达到46.55%，效果显著。通过镜检发现高炭处理（10 gL-1和20 gL-1）会引起黑胫病菌菌丝形态的变化，这些变化是否会影响黑胫病菌对烟株的侵染力还有待于进一步研究。生物质炭施入土壤后，会对土壤的物理化学性质产生一定的影响，而且自然环境复杂，加之土壤-炭-植物三者之间的相互作用共同对烟草黑胫病的发生和蔓延产生影响。因此，除我们在文中探讨的两方面外，有关生物质炭对真菌病害的作用机理还需进一步的探究。

生物质炭能显著减小菌落直径，降低菌丝的生长速率，抑制黑胫病菌菌丝的生长，这种抑制作用随生物质炭比例的增加越来越显著。从生物质炭自身性质分析，产生这种影响的机理主要包括两部分：pH和炭的吸附性及毒性物质(A&T)。通过镜检发现，高比例生物质炭处理的菌丝形态畸形，菌丝膨大体明显增多，分支很多，部分出现断裂，原生质外泄。盆栽条件下，与对照相比，施加不同比例的生物质炭在9d后对烟草黑胫病的盆栽防治效果为4.35%~46.55%，差异显著。表明施加一定量的生物质炭对烟草黑胫病有较好的防治效果，能有效的减轻烟草黑胫病的发病程度。

Claims (5)

1.一种利用生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法，其特征在于，包括

方法一，配置添加了生物质炭培养基的抑制法，

方法二，将添加了生物质炭培养基的pH调节回培养基原始pH的抑制法，

方法三，配置菌土抑制法。

2.根据权利要求1所述利用生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法，其特征在于，方法一包括如下步骤：

配置燕麦培养基：燕麦片33g，琼脂粉18g，去离子水1000ml，

在燕麦培养基的配置过程中加入不同比例的稻壳炭和/或烟草秸秆炭并测定相应的pH值；

接种黑胫病菌株并采用十字交叉法测定菌落直径，以培养2d的菌落直径变化计算黑胫病菌菌丝的生长速率及抑制率。

3.根据权利要求1所述生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法，其特征在于，方法二包括如下步骤：

配置燕麦培养基：燕麦片33g，琼脂粉18g，去离子水1000ml，

在燕麦培养基的配置过程中加入不同比例的稻壳炭和/或烟草秸秆炭并测定相应的pH值；接着用0.1mol的HCl或NaOH溶液将变化的pH值调回到初始值，初始值为不加生物质炭的培养基所对应的pH值，

灭菌后进行接菌实验，培养结束后，挑取菌丝置于载玻片上，在显微镜下观察黑胫病菌菌丝形态的变化。

4.根据权利要求1所述生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法，其特征在于，方法三包括如下步骤：

菌谷准备：将谷子加水煮开至半数谷粒呈开花状，装入500ml三角瓶中，121℃高压灭菌20 min；在无菌条件下，取1cm×1cm的烟草黑胫病菌菌块转接到盛有菌谷的三角瓶中，28℃培养14d备用；

菌土准备：将灭菌的土壤与生物质炭（稻壳炭和/或烟草秸秆炭）按不同比例（0，1%，2%，4%，10%，20%）混合，装入直径9cm、高7cm的花盆中，先装3/4的混合土，均匀加入菌谷0.5g/盆，将剩余1/4的混合土填满，浇透水，置于人工气候室内一个月，保持高温高湿；

移栽：将苗龄60天左右的烟苗移栽到花盆中，每盆一株；

每个处理10盆，重复3次，置于人工气候室培养，白天30℃/黑夜28℃，光照12h/黑暗12h，相对湿度95%，移栽后于第5、7、9天调查烟苗的发病级数，并进行记录，计算病情指数和防治效果；

病情指数=∑（各级病株数×级数）/（最高病级数×调查总株数）×100，防治效果=（对照组病指-处理组病指）/对照组病指×100%。

5.根据权利要求1所述利用生物质炭抑制烟草黑胫病菌的方法，其特征在于，生物质炭为稻壳炭和/或烟草秸秆炭，

稻壳炭：烟草秸秆炭为0-20g/L:20-0g/L。