CN119344151B - 一种利用微生物菌肥防治青钱柳病害的栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用微生物菌肥防治青钱柳病害的栽培方法，属于农林病害防治领域。所述栽培方法包括利用微生物菌肥处理青钱柳的步骤；微生物菌肥包括：短小芽胞杆菌菌粉30份、芽孢杆菌菌粉50份以及金针菇菌渣生物炭30‑75份；所述短小芽胞杆菌为短小芽胞杆菌CICC 22096，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌ACCC 64091。本发明将短小芽胞杆菌CICC 22096和芽孢杆菌ACCC 64091复配后，以金针菇菌渣生物炭作为载体，可为菌株生长繁殖以及代谢产物的负载提供优越条件，促使优势菌群快速形成，并将代谢产物中的抗性成分更集中的供应给植物，促使植物快速吸收利用，为提高植物抗病性奠定基础。

Description

一种利用微生物菌肥防治青钱柳病害的栽培方法

技术领域

本发明涉及农林病害防治领域，特别是涉及一种利用微生物菌肥防治青钱柳病害的栽培方法。

背景技术

青钱柳，胡桃科青钱柳属的落叶乔木植物，其果实像一串串的铜钱，颇具观赏性，可作为园林绿化观赏树种和用材树种；嫩叶具降血压、降血糖、降血脂、增强人体免疫力、抗氧化、抗衰老等药用价值；木材也是优质的家具良材。基于青钱柳在多个领域颇具应用价值，市场需求量也随之增加，因此，若想保证青钱柳持续的市场供应，就需要保证青钱柳质量的基础上每年不会减产。

但是，青钱柳苗期极易发生病害，尤其是立枯病和叶黑枯病，其中，立枯病常见于苗圃中，叶黑枯病常见于从苗圃移栽后的移栽苗，两种病害都直接影响青钱柳的产量和质量。目前用于防治立枯病和叶黑枯病的方法，主要有良种培育、化学药物防治等。良种培育可以从根本上改善易出现立枯病的情况，但是培育周期长，投入成本高；化学防治，一般是将苗圃播种前消毒，结合出现立枯病害或者叶黑枯病后使用化学药剂比如甲基托布津、百菌清、多菌灵等药物进行防治，化学防治虽然效果明显，但是长期使用造成环境污染以及病原微生物产生抗性。因此，寻找新的防治青钱柳的方法非常重要。

微生物菌肥是以活性微生物的生命活动导致作物得到所需养分的一种新型肥料生物制品，是农业生产中肥料的一种（也称第三代肥料）。微生物菌肥已经应用到农业病害防治中，并且效果显著。而目前有采用单一菌剂防治青钱柳病害相关的报告，但是单一菌剂防效一般在60%-70%，并且难以还原微生态结构，不是所有菌株都有生防效果，不同的菌株与植物的协同作用差异较大，而随着市场对于青钱柳的数量和质量需求均在提高的基础上，寻求更好生防效果的单一菌剂或者复合菌剂对于青钱柳病害防治不佳的问题解决至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用微生物菌肥防治青钱柳病害的栽培方法，以解决上述现有技术存在的问题，将短小芽胞杆菌CICC 22096和芽孢杆菌ACCC 64091复配后，以金针菇菌渣生物炭作为载体，可为菌株生长繁殖以及代谢产物的负载提供优越条件，促使优势菌群快速形成，并将代谢产物中的抗性成分更集中的供应给植物，促使植物快速吸收利用，为提高植物抗病性奠定基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种利用微生物菌肥防治青钱柳病害的栽培方法，包括利用微生物菌肥处理青钱柳的步骤；其中，所述微生物菌肥包括以下重量份的组分：短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)菌粉30份、芽孢杆菌（Bacillus sp.）菌粉50份以及金针菇菌渣生物炭30-75份；所述短小芽胞杆菌为短小芽胞杆菌CICC 22096，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌ACCC64091。

可选的是，利用微生物菌肥处理青钱柳的方式包括：将所述微生物菌肥根施苗圃期青钱柳根部或者将所述微生物菌肥喷施青钱柳移栽苗叶片上。

可选的是，每亩青钱柳苗使用所述微生物菌肥5-7kg。该用量主要是针对苗圃期或者从苗圃移栽的青钱柳苗的使用量，如果是针对成年树叶黑枯病的防治，可以根据需求适当调整用量。

本发明还提供一种微生物菌肥，包括以下重量份的组分：短小芽胞杆菌菌粉30份、芽孢杆菌菌粉50份以及金针菇菌渣生物炭30-75份；

所述短小芽胞杆菌为短小芽胞杆菌CICC 22096，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌ACCC64091。

本发明还提供一种所述的微生物菌肥的制备方法，其特征在于，包括按照配方中各组分用量混合均匀即得。

可选的是，所述短小芽孢杆菌菌粉是将短小芽孢杆菌CICC 22096活化后，利用营养肉汤培养基35-37℃发酵培养3天后，收集发酵液，冷冻干燥得到；

所述芽孢杆菌菌粉是将芽孢杆菌ACCC 64091活化后，利用营养肉汤培养基35-37℃发酵培养3天后，收集发酵液，冷冻干燥得到。

可选的是，所述金针菇菌渣生物炭的制备步骤包括：将金针菇菌渣在300-400℃高温热解30min，之后降至100-200℃高温热解1h，制得蘑菇菌渣基生物炭。

本发明还提供所述的微生物菌肥在防治青钱柳病害中的应用。

可选的是，所述青钱柳病害包括青钱柳立枯病和叶黑枯病。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过将短小芽胞杆菌CICC 22096和芽孢杆菌ACCC 64091复合，并通过金针菇菌渣通过特定温度处理后形成的生物炭负载，可以为两株菌的生存繁殖以及所需要的营养物质提供良好的负载载体和微环境条件，通过生物炭大孔隙和小空隙共存的网状结构能够更近距离的将营养物质和菌株富集在该结构中，为菌株的快速生长繁殖为优势菌种提供了便利条件，进而在施用到土壤后，可以更高效的为植物提供丰富的营养物质，便于植物快速吸收利用，从而通过菌株代谢产物中抗性组分的吸收利用为提高植物抗病性奠定基础。

本发明通过对菌种复配条件的筛选，以及微生物菌肥组成和工艺条件的优化，制备了一种能够显著提高青钱柳抗立枯病和叶黑枯病的能力的微生物菌肥。本发明为市场提供高抗病的青钱柳提供了新的方法和方向。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明所涉及的微生物菌肥最本质、最显著的特征在于它是一种活的、有生命的肥料。微生物菌肥是由一种或数种有益微生物、经工业化培养发酵而成的生物性肥料。通常把微生物菌肥分为两类：一类是通过其中所含微生物的生命活动，增加了植物营养元素的供应量，导致植物营养状况的改善，进而增加产量，其代表品种是菌肥；另一类是广义的微生物菌肥，虽然也是通过其所含的微生物生命活动作用使作物增产，但它不仅仅限于提高植物营养元素的供应水平，还包括了它们所产生的次生代谢物质，如激素类物质对植物的刺激作用。微生物菌肥的主要功能有：促进植物对营养元素的吸收利用，或者能够抵抗某些病原微生物的致病作用，减轻病虫害，从而提高农作物产量和品质。

本发明涉及的生物炭（英语：Biochar）是一种作为土壤改良剂的木炭，能帮助植物生长，可应用于农业用途以及碳收集及储存使用，有别于一般用于燃料之传统木炭。金针菇菌渣指在金针菇采摘后剩余的部分，包括菌丝和不可食用部分。这些废弃物虽然不再作为食材使用，但其内含丰富的营养物质，具有很高的利用价值。金针菇渣的有机成分主要包括碳水化合物、蛋白质、脂肪、矿物质和维生素等。本发明将金针菇菌渣炭化后制备的生物炭，可以作为负载菌株或者菌株代谢的一样组分的载体，为菌株生长繁殖提供优越的条件。

现有技术中已经公开了多种单一菌株作为青钱柳抗病的生防菌株，更具体的可实施方式如：现有技术公开了一种链霉菌生防菌株，其分类命名为Streptomyces sp. QJK-26，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018434，保藏日期为2018年7月2日。还公开了所述的链霉菌生防菌株在防治青钱柳叶黑枯病中的应用，所述青钱柳叶黑枯病由杜仲拟茎点霉引起。又如：现有技术公开了一种芽孢杆菌生防菌株，其分类命名为Bacillus sp .QJK-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2019377，保藏日期为2019年5月20日。还公开了所述的芽孢杆菌生防菌株在防治青钱柳叶黑枯病中的应用，所述青钱柳叶黑枯病由杜仲拟茎点霉引起。

但是现有技术中都是采用特定菌株用于青钱柳叶黑枯病的防治中，复合菌株或者其他单一菌株在防治青钱柳叶黑枯病中的应用鲜有报道，尤其是针对青钱柳苗圃期立枯病和从苗圃移栽后叶黑枯病同时进行防治的单一菌株或者复合菌株未见报道，而生防菌株的发现具有随机性。因此，为了满足市场对于青钱柳数量和质量的大量需求，从现有技术中现存的菌株挖掘具有抗青钱柳立枯病和叶黑枯病的复合菌剂非常必要。

本发明涉及的菌株：

短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)，保藏编号为CICC 22096，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；

芽孢杆菌（Bacillus sp.），保藏编号为ACCC 64091，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。

公众可从上述平台获取相应菌株。

两菌株拮抗实验验证：

将短小芽孢杆菌用营养琼脂培养基活化后，接种营养肉汤培养基，然后在37℃、200rpm条件下震荡培养3d，收集发酵液，冷冻干燥得到短小芽孢杆菌菌粉。

在营养琼脂培养基中接种上述制备的短小芽孢杆菌菌粉，37℃静置培养3天，无菌去除营养琼脂培养基上的短小芽孢杆菌，再接种芽孢杆菌ACCC 64091，继续培养48h；接种芽孢杆菌ACCC 64091的同时，向新的营养琼脂培养基中接种等量的芽孢杆菌ACCC 64091，培养48h，观察培养结果。结果显示芽孢杆菌ACCC 64091在两种培养基中均生长良好，说明这两种菌不存在拮抗，可以在同一培养环境中共存。

实施例1 优化短小芽孢杆菌和芽孢杆菌的复配比

通过以下表1所示的比例进行复配，采用平板菌落计数法测定活菌数（培养条件为：营养琼脂培养基上，37℃培养3天）。

表1 优化菌株的复配条件和结果

从表1的实验数据可以看出，在短小芽孢杆菌菌粉和芽孢杆菌菌粉按照质量比3:5复配时，活菌数最高，因此，后续采用该比例进行实验。

实施例2

一种微生物菌肥，包括以下重量份的组分：短小芽孢杆菌菌粉30份、芽孢杆菌菌粉50份和金针菇菌渣生物炭50份。将上述组分直接混合均匀得到微生物菌肥。

短小芽孢杆菌菌粉的制备见上述“两菌株拮抗实验验证”中相关方法。

芽孢杆菌菌粉的制备方法同短小芽孢杆菌菌粉的制备方法。

金针菇菌渣生物炭的制备方法：选用无污染、无霉菌的金针菇菌渣，在太阳下曝晒，让残余杂菌死亡，之后将金针菇菌渣在300-400℃（此实验选择400℃）高温热解30min，之后降至100-200℃（此实验选择200℃）高温热解1h，制得蘑菇菌渣基生物炭。

实施例3

与实施例2相比，区别仅在于：金针菇菌渣生物炭添加量为30份。其他方法步骤均相同。

实施例4

与实施例2相比，区别仅在于：金针菇菌渣生物炭添加量为75份。其他方法步骤均相同。

对比例1

与实施例2相比，区别仅在于：不包含短小芽孢杆菌菌粉。其他方法步骤均相同。

对比例2

与实施例2相比，区别仅在于：不包含芽孢杆菌菌粉。其他方法步骤均相同。

对比例3

与实施例2相比，区别仅在于：不包含短小芽孢杆菌菌粉和芽孢杆菌菌粉。其他方法步骤均相同。

对比例4

与实施例2相比，区别仅在于：短小芽孢杆菌菌粉30份、芽孢杆菌菌粉40份和金针菇菌渣生物炭50份。其他方法步骤均相同。

对比例5

与实施例2相比，区别仅在于：短小芽孢杆菌菌粉10份、芽孢杆菌菌粉20份和金针菇菌渣生物炭50份。其他方法步骤均相同。

对比例6

与实施例2相比，区别仅在于：短小芽孢杆菌菌粉20份、芽孢杆菌菌粉50份和金针菇菌渣生物炭50份。其他方法步骤均相同。

对比例7

与实施例2相比，区别仅在于：金针菇菌渣生物炭的制备方法不同，即选用无污染、无霉菌的金针菇菌渣，在太阳下曝晒，让残余杂菌死亡，之后将金针菇在400℃高温热解90min，制得蘑菇菌渣基生物炭。其他方法步骤均相同。

对比例8

与实施例2相比，区别仅在于：金针菇菌渣生物炭的制备方法不同，即选用无污染、无霉菌的金针菇菌渣，在太阳下曝晒，让残余杂菌死亡，之后将金针菇在200℃高温热解90min，制得蘑菇菌渣基生物炭。其他方法步骤均相同。

对比例9

与实施例2相比，区别仅在于：金针菇菌渣生物炭为20份。其他方法步骤均相同。

对比例10

与实施例2相比，区别仅在于：金针菇菌渣生物炭为85份。其他方法步骤均相同。

应用例 一种利用微生物菌肥防治青钱柳病害的栽培方法

上述栽培方法主要是利用实施例2-4以及对比例1-10制备的微生物菌肥处理青钱柳，具体如下：

选用张家界四都坪乡的青钱柳种植基地某苗圃，对上述实施例2-4以及对比例1-10制备的微生物菌肥进行效果验证。

将苗圃随机划分为14组，每组的青钱柳的种植条件、生长状态、管理水平以及栽培数量等均一致。其中，1组为空白对照组，即不使用本发明实施例以及对比例的微生物菌肥；2-4组为实验组，即分别使用本发明实施例2-4制备的微生物菌肥，5-14组为对照组，即分别施用本发明对比例1-10制备的微生物菌肥。在青钱柳长出2-3片叶子时开始根施微生物菌肥（用水溶解后根施），空白对照使用等量的水，按照每亩使用6kg微生物菌肥，持续观察一直到移栽青钱柳前，统计该观察期间立枯病的发病率。结果如表2所示。

表2 苗圃中青钱柳立枯病发病率统计结果

立枯病发病率（%）=每组发生立枯病的植株数/每组的总植株数×100，每组的总植株数为100。

上述结果发现，经过本发明实施例2-4制备的微生物菌肥的使用，使得青钱柳苗圃期立枯病几乎无发生，而该效果的实现主要是依赖于短小芽孢杆菌和芽孢杆菌以及金针菇菌渣生物炭间的协同作用，如果改变菌种的组成（比如对比例1-3）或者改变菌株菌粉用量比（比如对比例4-6）都会影响其协同作用的发挥；另外，金针菇菌渣生物炭的生成条件以及用量也直接影响其复合菌种使用效果（比如对比例7-10），金针菇菌渣通过先高温快速处理后形成大孔隙的网状结构，然后调低温度持续炭化，可以保证大孔隙网状结构大量存在，且机械强度和稳定性也较好的同时，还能形成一些空隙较小的结构，如此大小空隙交错，在为两种菌株提供重组的氧气条件的同时，还能使得两株菌降解的大分子物质比如蛋白分子，能够也附着在孔隙上，更近源的为两株菌提供可吸收的营养物质，利于菌株在限定的空间内快速形成优势菌群，进而在施用到土壤时，充分利用优势菌群和营养物质聚集的有利条件，为植物快速吸收利用营养物质奠定条件，通过营养物质中的抗性成分的吸收利用，显著抑制苗圃期间青钱柳立枯病的产生。

在上述苗圃移栽青钱柳1年后，长出嫩叶开始计2个月内，统计叶黑枯病的发病率，结果如下表3所示。

表3 青钱柳移栽苗叶黑枯病发病率统计结果

叶黑枯病发病率（%）=每组发生叶黑枯病的植株数/每组总移栽植株数×100，每组总移栽植株数为60株。

为了进一步直接验证本发明制备的微生物菌肥的生防效果，通过病原菌接菌实验进行生防效果验证。

将叶黑枯病病原菌接种PDA培养基，室温培养，收集分生孢子，制备成1×10⁶cfu/mL的孢子悬浮液。选用某青钱柳苗圃地，取土，晾晒3天，粉碎后，过筛，然后均匀喷洒叶黑枯病病原菌孢子悬浮液，充分混合均匀后，制成带菌土。然后，将带菌土分装到相同的栽培盆中，装土量为栽培盆总容积的2/3，每盆移栽1株一年生健康的青钱柳苗，温室培养。栽培盆的青钱柳随机分为14组，每组5盆，移栽15天后，按照如下方法进行处理：1组为空白对照组，即不使用本发明实施例以及对比例的微生物菌肥，用等量无菌水进行处理；2-4组为实验组，即分别使用本发明实施例2-4制备的微生物菌肥处理进行处理（用水溶解实验组微生物菌肥），5-14组为对照组，即分别施用本发明对比例1-10制备的微生物菌肥进行处理（用水溶解对照组微生物菌肥）。每株青钱柳采用1g微生物菌肥，用水溶解100mL，用喷壶均匀喷洒在青钱柳叶片表面，处理30d后，调查病情。

病级标准：0级，无叶黑枯症状；1级，1-25%的叶出现叶黑枯症状；2级，26-50%的叶出现叶黑枯症状；3级，51-75%的叶出现叶黑枯症状；76%以上的叶出现叶黑枯症状。病情指数＝Σ[各级病叶数×各级相对病级值]/[调查总叶数]×最高病级值。防效(%)＝(对照病情指数―处理病情指数)/对照病情指数×100。

表4 温室盆栽青钱柳叶黑枯病病情调查结果

上述结果可以看出，本发明实施例2-4制备的微生物菌肥具有显著提高抗叶黑枯病的功能，防效均可达90%以上，相比现有技术60-70%生物防效明显提高。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种利用微生物菌肥防治青钱柳病害的栽培方法，其特征在于，包括利用微生物菌肥处理青钱柳的步骤；其中，所述微生物菌肥包括以下重量份的组分：短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)菌粉30份、芽孢杆菌（Bacillus sp.）菌粉50份以及金针菇菌渣生物炭30-75份；所述短小芽胞杆菌为短小芽胞杆菌CICC 22096，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌ACCC64091；

所述金针菇菌渣生物炭的制备步骤包括：将金针菇菌渣在300-400℃高温热解30min，之后降至100-200℃高温热解1h，制得蘑菇菌渣基生物炭。

2.如权利要求1所述的栽培方法，其特征在于，利用微生物菌肥处理青钱柳的方式包括：将所述微生物菌肥根施苗圃期青钱柳根部或者将所述微生物菌肥喷施青钱柳移栽苗叶片上。

3.如权利要求1所述的栽培方法，其特征在于，每亩青钱柳苗使用所述微生物菌肥5-7kg。

4.一种用于防治青钱柳病害的微生物菌肥，其特征在于，包括以下重量份的组分：短小芽胞杆菌菌粉30份、芽孢杆菌菌粉50份以及金针菇菌渣生物炭30-75份；

所述短小芽胞杆菌为短小芽胞杆菌CICC 22096，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌ACCC64091。

5.如权利要求4所述的微生物菌肥在防治青钱柳病害中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述青钱柳病害包括青钱柳立枯病和叶黑枯病。