CN106501514A

CN106501514A - 丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒

Info

Publication number: CN106501514A
Application number: CN201610895043.XA
Authority: CN
Inventors: 王贤俊; 张敏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-10-03
Filing date: 2016-10-03
Publication date: 2017-03-15

Abstract

本发明涉及丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒，属于临床体外诊断试剂技术领域。本发明的目的是能够提供有效消除内源性α‑酮戊二酸干扰且稳定性良好的丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，使测定丙氨酸氨基转移酶的结果更加准确可靠。本发明的试剂盒包括试剂1和试剂2：其中试剂1的组分包括：Tris‑HCl缓冲液、L‑丙氨酸、还原型辅酶(NADH)、乳酸脱氢酶(LDH)、酶保护剂、稳定剂、防腐剂；试剂2的组分包括：Tris‑HCl缓冲液、α‑酮戊二酸、稳定剂、防腐剂。本发明所提供的ALT检测试剂盒加入酶保护剂、稳定剂，提高了丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒的稳定性，适用于各类全自动生化分析仪，操作简单、安全，便于临床应用推广。

Description

丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒

技术领域：

本发明属于临床体外诊断试剂技术领域，涉及丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒。

背景技术：

丙氨酸氨基转移酶(ALT)是能够催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基转移酶，是一种参与人体蛋白质新陈代谢的酶，起着加快人体内蛋白质在体内转化的作用，该酶广泛存在于人体各种组织、器官、肌肉、骨骼中，以肝脏细胞的细胞浆中最多。一旦有肝细胞遭到损害、肝功能下降、肝细胞坏死，细胞内的ALT即可释放到细胞外，从而导致血清中ALT含量升高。ALT活性升高表示有肝细胞损伤，也可见于心肌及骨骼肌损伤。血清ALT活性是肝细胞损伤的敏感指标，尤其是病毒性肝炎的重要标志，目前ALT临床上主要用来检测肝功能。

体外检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)的方法主要有赖氏比色法、丙酮酸氧化酶法及连续监测法(速率法)。赖氏比色法的缺点是易受反应产物丙酮酸的反馈抑制影响，导致测定结果的准确度和精密度不高；丙酮酸氧化酶法虽然测定结果较好，但所用的4-氨基安替比林有毒、有致畸性，不满足绿色原则；连续监测法的优点是可以确定线性期并计算每分钟吸光度的变化(ΔA/min)，根据此值再准确地计算酶活性，可以利用全自动生化分析仪进行检测；酶和底物反应的特异性好，检测结果准确度高。以上三种方法相比较，采用连续监测法较佳。

本发明的试剂盒主要采用连续监测法进行检测，其检测原理为：ALT催化L-丙氨酸的氨基转移至α-酮戊二酸，生成丙酮酸和L-谷氨酸。乳酸脱氢酶(LDH)催化丙酮酸还原的同时将还原型辅酶(NADH)氧化成氧化型辅酶(NAD⁺)，由于NADH在340nm处有特征吸收，所以NADH的下降速率和ALT的活力成正比。反应式如下：

目前ALT检测试剂盒多采用丙酮酸氧化酶法，如CN 103320497 B(2015.09.09)、CN100595282 C(2010.03.24)、CN 1086205 C(2002.06.12)均采用此法；CN 104195220 A(2014.12.10)主要讲到缓冲液对ALT试剂的影响；CN 104404127 A(2015.03.11)所述ALT试剂盒采用单一试剂，无法消除内源性干扰。本发明涉及的丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒采用液体双试剂，可以有效消除内源性干扰，无需样本前处理，可直接利用全自动生化分析仪进行大批量样本检测，操作简单、准确度高、稳定性好，适合临床应用推广。

发明内容：

本发明的目的在于提供丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒供临床应用，主要解决现有ALT检测领域存在的准确度低、操作繁琐、污染环境、试剂不稳定等问题。

为了解决本发明内源性α-酮戊二酸对丙氨酸(ALT)测定的干扰，采用如下技术方案：采用两步法检测，血清与(缺少α-酮戊二酸)的底物溶液混合，37℃保温5min，使样品中所含内源性α-酮戊二酸引起的副反应进行完毕。然后加入α-酮戊二酸启动ALT的催化反应，在主波长340nm处连续监测吸光度下降速率，根据线性反应期吸光度下降速率(-ΔA/min)，计算出ALT活力。

本发明提供的试剂盒由试剂1和试剂2组成，其中试剂1的组成和成份如下：

Tris-HCl缓冲液 120mmol/L-180mmol/L，PH＝8.4

L-丙氨酸 650mmol/L-850mmol/L

还原型辅酶(NADH) 0.2mmol/L-0.4mmol/L

乳酸脱氢酶(LDH) 2000U/L-3000U/L

酶保护剂

稳定剂

防腐剂

试剂2的组成和成份如下：

Tris-HCl缓冲液 60mmol/L-100mmol/L，PH＝7.2

α-酮戊二酸 35mmol/L-55mmol/L

稳定剂

防腐剂

所述酶保护剂选自牛血清白蛋白(BSA)或甘油与糖类中的一种或多种组合物，其用量为BSA0.1％-2％，甘油5％-20％，优选为BSA 0.5％-1.5％，甘油10％-15％。

以上所述糖类可选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖中的一种或多种，其用量为1g/L-15g/L，优选为5g/L-10g/L。

所述试剂1和试剂2的稳定剂均选自KCl及表面活性剂组合物，其用量为KCl 1g/L-15g/L，优选为5g/L-10g/L。

以上所述表面活性剂可选自吐温-20(Tween-20)、吐温-80(Tween-80)、曲拉通X-100(Triton X-100)、聚乙二醇6000(PEG 6000)及聚乙二醇8000(PEG 8000)中的一种或多种，其用量为0.1％-2％，优选为0.5％-1.5％。

所述试剂1和试剂2的防腐剂均可选自NaN₃或Proclin-300，其用量为NaN₃ 0.1g/L-2g/L，Proclin-3000.1％-2％，优选为NaN₃ 0.6g/L-1g/L，Proclin-3000.5％-1％。

本发明丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒适用于各类全自动生化分析仪，现于全自动生化分析仪BS-420上的应用，其具体使用方法如下：

表1 样本检测操作程序

计算方法：样品中的ALT含量(U/L)＝ΔAT/min×F

ΔAT/min：测定管平均每分钟相对空白管吸光度变化

注：TV：试剂样品总体积，SV为样品体积；6.22：NADH在340nm处的毫摩尔分子吸光系数；

1.0：比色皿光径(cm)；1000：U/mL到U/L的转换系数。

本发明所使用的质控品为罗氏高、低值质控品；所测样品为不溶血血清。

有益效果：本发明丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒为液体双试剂，采用两步法，有效消除内源性α-酮戊二酸干扰，提高了ALT测定的准确度；本发明试剂盒中加入酶保护剂和稳定剂，提高了ALT试剂盒的稳定性，于37℃水浴可稳定至少一周，说明2-8℃保存可以至少稳定一年。

以下结合具体实施例进一步说明本发明，应理解，具体实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

附图说明：

图1是本发明实施例1-3及对比实施例2-8℃保存一周的空白吸光度变化对比试验结果图；

图2是本发明实施例1-3及对比实施例37℃水浴一周的空白吸光度变化对比试验结果图。

具体实施方式

实施例1

丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，具体成分及含量如下：

试剂1的组成：

Tris-HCl缓冲液 120mmol/L，PH＝8.4

L-丙氨酸 650mmol/L

NADH 0.2mmol/L

LDH 2000U/L

KCl 5g/L

曲拉通X-100 1％

甘油 15％

蔗糖 5g/L

NaN₃ 1g/L

试剂2的组成：

Tris-HCl缓冲液 100mmol/L，PH＝7.2

α-酮戊二酸 35mmol/L

KCl 6g/L

PEG 8000 1.5％

NaN₃ 0.6g/L

实施例2

试剂1的组成：

Tris-HCl缓冲液 150mmol/L，PH＝8.4

L-丙氨酸 750mmol/L

NADH 0.3mmol/L

LDH 2500U/L

KCl 8g/L

吐温-20 1％

BSA 1.5％

麦芽糖 10g/L

Proclin-300 0.8％

试剂2的组成：

Tris-HCl缓冲液 80mmol/L，PH＝7.2

α-酮戊二酸 45mmol/L

KCl 8g/L

PEG 6000 1％

Proclin-300 0.5％

实施例3

试剂1的组成：

Tris-HCl缓冲液 180mmol/L，PH＝8.4

L-丙氨酸 850mmol/L

NADH 0.4mmol/L

LDH 3000U/L

KCl 10g/L

吐温-80 1.5％

PEG 8000 0.5％

甘油 10％

果糖 6g/L

葡糖糖 8g/L

Proclin-300 1％

试剂2的组成：

Tris-HCl缓冲液 60mmol/L，PH＝7.2

α-酮戊二酸 55mmol/L

KCl 10g/L

曲拉通X-100 0.5％

PEG 6000 0.5％

Proclin-300 0.8％

对比实施例

不加稳定剂和酶保护剂的丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，具体成分及含量如下：

试剂1的组成：

Tris-HCl缓冲液 180mmol/L，PH＝8.4

L-丙氨酸 850mmol/L

NADH 0.4mmol/L

LDH 3000U/L

NaN₃ 1g/L

试剂2的组成：

Tris-HCl缓冲液 60mmol/L，PH＝7.2

α-酮戊二酸 55mmol/L

NaN₃ 0.6g/L

将本发明实施例1-3及对比实施例进行准确度验证试验。质控品选用罗氏高值质控(ALT靶值：118 U/L，靶值范围(±10％)：106.2U/L-129.8U/L)；罗氏低值质控(ALT靶值：37U/L，靶值范围(±10％)：33.3U/L-40.7U/L)。采用BS-420全自动生化分析仪进行检测，具体操作方法如表一所述，采用单点定标法定标后，ALT测定值及空白吸光度值可从仪器上直接读取，为了减少偶然误差，重复测定三次取均值。

实施例1-3及对比实施例准确度结果如下：

表2 实施例1-3及对比实施例准确度比较

将本发明实施例1-3及对比实施例进行稳定性验证试验。将以上四种试剂盒每种平均分成两份，一份至于2-8℃保存，另一份至于37℃水浴中保存，每隔一天测定一次，连续监测一周，观察空白吸光度变化及血清测定值(血清定值75.6U/L，允许误差范围(±10％)：68.04U/L-83.16U/L)，通过空白吸光度的变化和准确度的测定比较试剂稳定性。

表3 实施例1试剂盒稳定性数据

表4 实施例2试剂盒稳定性数据

表5 实施例3试剂盒稳定性数据

表6 对比实施例试剂盒稳定性数据

由表2可知实施例1-3制得的试剂盒准确度均在允许的误差范围(±10％)内，而对比实施例制得的试剂盒准确度超出了误差允许范围：由图1和图2可以看出，实施例1-3制得的试剂盒的稳定性明显强于对比实施例制得的试剂盒。实施例1-3制得的试剂盒虽然试剂空白有一定程度的下降，但是下降的幅度不大，在允许范围内，说明加入合适的稳定剂和酶保护剂可以减缓NADH的衰减、保护酶的活性，进而提高试剂盒的稳定性，延长试剂盒的保存期。

Claims

1.丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，其特征在于，

试剂1的组成和成份如下：

Tris-HCl缓冲液120mmol/L-180mmol/L，PH＝8.4

L-丙氨酸650mmol/L-850mmol/L

还原型辅酶(NADH)0.2mmol/L-0.4mmol/L

乳酸脱氢酶(LDH)2000U/L-3000U/L

酶保护剂

稳定剂

防腐剂

试剂2的组成和成份如下：

Tris-HCl缓冲液60mmol/L-100mmol/L，PH＝7.2

α-酮戊二酸35mmol/L-55mmol/L

稳定剂

防腐剂。

2.如权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，其特征在于，所述酶保护剂选自牛血清白蛋白(BSA)或甘油与糖类中的一种或多种组合物，其用量为BSA 0.5％-1.5％，甘油10％-15％。

3.如权利要求2所述的糖类，其特征在于，可选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖中的一种或多种，其用量为5g/L-10g/L。

4.如权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1和试剂2的稳定剂均选自KCl及表面活性剂组合物，其中KCl用量为5g/L-10g/L。

5.如权利要求4所述的表面活性剂，其特征在于，可选自吐温-20(Tween-20)、吐温-80(Tween-80)、曲拉通X-100(Triton X-100)、聚乙二醇6000(PEG 6000)及聚乙二醇8000(PEG8000)中的一种或多种，其用量为0.5％-1.5％。

6.如权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1和试剂2的防腐剂均可选自NaN₃或Proclin-300，其用量为NaN₃0.6g/L-1g/L，Proclin-300 0.5％-1％。