CN105203472A - 一种稳定的游离脂肪酸测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种稳定的酶法游离脂肪酸的试剂盒，该试剂盒由分别放置的试剂1和试剂2两种独立液体试剂组成，具有良好的稳定性和抗干扰性。酶法测定游离脂肪酸，方法简便、易于操作。本发明试剂中选用了新型色原，配方中同时加入了抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾等抗扰剂，使试剂具有灵敏度高、抗干扰性强的特点；同时采用液体稳定技术，加入了一系列特殊的稳定剂、螯合剂和酶保护剂，使试剂具有优良的稳定性，可广泛应用于绝大多数半/全自动生化分析仪，监测人体脂肪代谢情况和血脂水平等，便于临床推广。

Description

一种稳定的游离脂肪酸测定试剂盒

技术领域

本发明属医学检验技术领域，具体涉及一种稳定的游离脂肪酸测定试剂盒。

背景技术

游离脂肪酸，即非酯化脂肪酸(non-estesterfiedfattyacid，NEFA)，是人体内脂肪代谢的中间产物，也是细胞膜脂质结构的底物和前列腺素等细胞内信号分子的供体。当肌肉活动所需能源——肝糖耗尽时，脂肪组织会分解中性脂肪成为游离脂肪酸来充当能源使用。虽然游离脂肪酸只占身体脂肪很少的一部分，但却满足了能量需求的很大部分，故而是监控人体脂代谢、糖代谢的重要指标。游离脂肪酸不仅能够反映人体脂肪代谢情况及血脂水平、评价血糖及辅助诊断糖尿病，还能反映人体内多种其他病理、生理情况，如胰岛素抵抗、肥胖、恶性疾病、代谢综合征和心血管疾病等。

血清中高游离脂肪酸浓度多见于肥胖、糖尿病、心肌梗塞、重症肝障碍、甲状腺功能亢进、肢端肥大症和饥饿等；游离脂肪酸含量低见于甲状腺机能减退、脑垂体功能不全、阿狄森氏病等，餐后亦可引起游离脂肪酸生理性降低。

随着糖尿病、高血压、高血脂等现代病的日益多发，对糖类和脂类的异常代谢监控，也成为临床上诊治和检测病情的重要事项。目前测定血清中游离脂肪酸的方法较多，如酶法、滴定法、比色法、原子分光光度法、高压液相层析法、气相色谱法等。由于传统方法操作繁琐且精密度差，而酶法检测血清游离脂肪酸试剂盒具有特异性高、精密度好、操作简单等优点，因此在临床大批量样本的自动快速检测中，酶法应用的最为广泛。

市售酶法测定游离脂肪酸试剂盒的主要反应原理大都基于Trinder反应模式，具体反应过程如下：

即游离脂肪酸在ATP、辅酶A的存在下，经脂酰辅酶A合成酶(AcylCoASynthetase，ACS)作用，生成脂酰辅酶A；脂酰辅酶A被脂酰辅酶A氧化酶(AcylCoAOxidase，ACOD)氧化，生成反式-烯酰辅酶A(2,3-trans-Enoyl-CoA)和过氧化氢；而生成的过氧化氢在过氧化物酶(peroxidase，POD)存在下，与Trinder色原及4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，4-APP)生成红色醌亚胺物(purpledye)，该物质的生成量与样本中的游离脂肪酸含量呈正比，通过测定其吸光度即可得到样品中游离脂肪酸的浓度。

目前市售酶法测定游离脂肪酸的试剂盒主要存在下述问题：

1.酶法测定游离脂肪酸试剂盒最初从国外进口，进口试剂具有良好的稳定性和优秀的分析性能，但价格昂贵，检测成本较高，不适合大规模应用。现今，游离脂肪酸的生化检测在国内市场上方兴未艾，仅有少数的一些厂家能够实现游离脂肪酸试剂盒的自产，但其所采用的色原反应物质活性低，显色稳定性差、抗干扰性弱，从而导致整个试剂盒稳定性差，检测结果不准确，灵敏度低。

2.由于催化Trinder反应的过氧化物酶对底物专一性较差，反应易受到内源性物质的干扰，如抗坏血酸、胆红素、溶血等。抗坏血酸等还原性物质还会与H₂O₂竞争过氧化物酶(POD)或与色原性物质竞争H₂O₂，从而使氧化过程中产生的H₂O₂被消耗，生成的红色醌亚胺化合物减少，导致测定结果不准确。

3.目前市售酶法游离脂肪酸试剂盒均选用单一的稳定剂，由于游离脂肪酸试剂盒成分比较复杂含有多种酶，其试剂盒稳定性直接与酶活性相关，而酶的活性易受各种因素的干扰，比如pH、温度、紫外线、重金属盐、抑制剂、激活剂等，导致试剂盒缺乏稳定性，保存时间短，影响临床使用。单一的稳定剂已越来越不能满足对试剂盒稳定性的要求，因此，组合选用两种或多种配制简单、成本低廉、对酶种类较多的游离脂肪酸测定试剂盒有良好稳定效果的稳定剂，是非常必要的。

发明内容

本发明为克服上述现有技术缺陷，提供了一种高稳定性的酶法游离脂肪酸测定试剂盒，能够消除人血清中抗坏血酸、胆红素等多种物质的干扰、灵敏度高、成本低，不仅能够适应大规模人群普查的需求，也能满足日常临床快速、大量检查的要求，适合产业化，便于临床推广。

为了解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案为：一种基于Trinder反应原理的酶法测定血清中游离脂肪酸的试剂盒，其组成包括试剂1和试剂2两种独立液态试剂，其中试剂1、试剂2中的各组分及浓度范围为：

试剂1：

试剂2：

所述试剂1和试剂2的容积比为4:1。

由于酶法反应需要合适的pH范围和适宜离子强度的缓冲环境，离子强度过高，电解质干扰酶与底物结合，酶活性将逐渐下降，但离子强度过低也可能无法激活酶的活性，因此，一般选择与生理环境的体液比较接近的离子强度。作为优选，本发明所述试剂缓冲液选自对酶化学反应等无抑制作用，不干扰生物化学反应过程的GOOD’S缓冲液，如2-吗啉代乙磺酸(MES)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基甲磺酸(TES)、3-[4-(2-羟甲基)-1-哌嗪]丙磺酸((H)EPPS)中的一种，优选MOPS缓冲液，pH优选范围为6.0～8.5。根据酶催化反应最适条件的要求，在酶测定体系中还需要加入一定量的离子激活剂，激活剂可以是酶的活性中心，也可以通过其他机制激活酶的活性。优选的，本发明所述试剂盒中所述离子激活剂为MgCl₂·6H₂O，同时加入一定浓度的KCL调节离子强度。

本发明所述防腐剂为咪唑烷基脲，较市售常用的proclin系列防腐剂不仅具有良好的防腐作用，且无还原性，对酶活性无抑制，不影响反应。

本发明所述稳定剂并不特指某一个，而是由两种或两种以上试剂共同发挥了稳定剂的作用，对保持酶活性、维持试剂的长期稳定发挥重要作用，是本发明的一个关键所在。所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖、β-环糊精、甘露醇中的一种或多种，不仅能够发挥稳定试剂的作用，还可以用于维持试剂中多种酶的活性。为了减少各试剂之间的交叉影响，更好提高试剂的稳定性，所述稳定剂同时添加白蛋白，特别选用利用基因工程学上的方法制造的无脂肪酸白蛋白，经专门的去脂纯化处理，脂肪酸含量低于0.002％(w/w)，较市售产品选用来自牛、马、羊、人的白蛋白，消除了其所含高浓度脂肪酸对检测结果的影响，减少了检测背景干扰。

本发明所述试剂2中酶保护剂为脂酰辅酶A氧化酶稳定剂，用于维持试剂2中的脂酰辅酶A氧化酶的高活性，有助于提高试剂的稳定性。

本发明所述色原物质的选择对试剂的稳定性、灵敏度以及准确性十分重要，为本发明的另一个关键因素。本发明通过综合比较国内外常用色原，最终选用了一种胺类新色原3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺(TODP)，作为酶法测定游离脂肪酸显色剂，其优点在于色原合成容易，性能稳定，分子共轭结构特性使得灵敏度大大提高(反应灵敏度可达到0.01mmol/L)，相应可减少样本使用量，最终有效地降低干扰物的量；所述色原的灵敏度、稳定性优于TOPS、TOOS、ADPS等显色剂，与4-AAP氧化缩合显色迅速，呈色稳定，可有效改善对反应体系中酶类稳定性的影响；其显色反应生成的胺类色原素最大吸收峰在540nm以上，可有效避开黄疸、溶血干扰。

本发明所述各组分组合所发挥的去干扰作用，是本发明酶法准确测定血清NEFA浓度再一个关键因素。

本发明所述表面活性剂选自Brij35、Brij98、Tween20。表面活性剂是反应的促进剂，可去除其他脂类杂质的影响，提高检测的灵敏度。为了提高试剂的抗干扰的能力，所述试剂1中加入了亚铁氰化钾和抗坏血酸氧化酶，亚铁氰化钾与表面活性剂的组合可有效消除样本中高胆红素对测值的影响，抗坏血酸氧化酶可有效消除样本中高抗坏血酸对测定样本的干扰，从而保证了临床检测结果的准确性。

本发明所述试剂1选用EGTA螯合剂(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，可有效防止除Mg²⁺外的其他二价金属离子干扰第一步反应。所述试剂2特别选用了氨羧螯合剂DTPA螯合剂(二乙烯三胺五乙酸)，较常用的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)、二羟乙基甘氨酸(DHG)等螯合剂性能更优，可迅速与钙、镁、铁、铅、铜等离子生成水溶性螯合物，有效络合后续反应中过多的镁离子及抑制乙酰辅酶A氧化酶活性的金属离子，提高测定结果的准确性；同时还可以防止反应中各种金属阳离子对H₂O₂的分解作用，作为H₂O₂稳定剂，具有明显的增效和稳定作用。

本发明所述4-氨基安替比林(4-AAP)选自高纯度制品，其作用并不在第一次酶反应中发挥，而是留待在过氧化物酶催化的酶反应中参与呈色反应。

本发明所述试剂2中添加黄素腺嘌呤二核苷酸钠盐(FAD)为脂酰辅酶A氧化酶的辅酶，在反应中起到递氢体的作用，有助于提高反应的灵活性，使氧化反应更完全，保证了反应高效、稳定的进行。

本发明所述脂酰辅酶A合成酶和脂酰辅酶A氧化酶均选自由基因工程重组产品提取的高纯度制品；所述过氧化物酶(POD)选自由辣根提取的高稳定性制品。

本发明中所述的百分比浓度如未进行特别说明，均为质量体积百分比浓度，即100ml溶液中所含溶质的克数。

本文中使用的术语“高纯度”是指产品的纯度大于95％。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益结果：

本发明试剂盒与进口试剂盒相关性好，检测结果具有高度的一致性(相关系数r≥0.990)，线性拟合相关系数优于进口试剂，检测数据准确可靠，在临床可以替代进口试剂盒使用，大幅降低了检测成本。

本发明试剂盒选用液体双试剂检测法，合理分配各反应物质在整个反应体系中的浓度，避免自发反应的出现，保持存在于其中的各种酶的空间结构完整，同时添加了酶保护剂，保证了酶的长期高活性，有效的提高了试剂性能。

本发明试剂盒选用新型色原物质，性能更优，呈色稳定，同时添加了抗干扰剂，较常规的游离脂肪酸测定试剂盒抗干扰性能强，能有效避免样本中溶血、坏血酸、胆红素和黄疸对检测结果的干扰，提高了试剂盒的分析灵敏度。

本发明试剂盒选用复合稳定剂，有效的延长了试剂盒的保存时间，保证了试剂中多种反应酶的性能稳定，在保存期内各反应酶不会因为环境温度等变化而产生变异，提高了试剂盒的稳定性。本发明试剂盒在2-8℃温度条件下贮存，至少稳定20个月；试剂开瓶后2-8℃可稳定保存至少1个月且准确度无明显变化，而市售试剂盒有效期一般为12个月，开瓶后一般只能保存10-15天，久置后准确度明显降低。

本发明用于临床检测血清游离脂肪酸含量，操作简单快捷，对医疗设施要求不高，适用范围广，不仅可以在大中型医院广泛使用，而且可直接应用于各种全自动、半自动生化分析仪，仅需几分钟便可完成检测。

附图说明

附图1所示的是根据本发明实施例1所述的酶法游离脂肪酸测定试剂盒与进口试剂盒检测40例临床样本的相关性比对图。

附图2所示的是根据本发明实施例1所述的酶法游离脂肪酸测定试剂盒与进口试剂盒线性对比图。

附图3所示的是根据本发明实施例2所述的酶法游离脂肪酸测定试剂盒与进口试剂盒检测40例临床样本的相关性比对图。

附图4所示的是根据本发明实施例2所述的酶法游离脂肪酸测定试剂盒与进口试剂盒线性对比图。

附图5所示的是根据本发明实施例3所述的酶法游离脂肪酸测定试剂盒与进口试剂盒检测40例临床样本的相关性比对图。

附图6所示的是根据本发明实施例3所述的酶法游离脂肪酸测定试剂盒与进口试剂盒线性对比图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的描述，但是，本申请不限于这些实施例，这些实施例也不能解释为对本申请的限制。

下述试剂的配制方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。

实施例1

一、一种稳定的酶法游离脂肪酸测定试剂盒，该试剂盒由按照下述成分和比例配制的液体双试剂组成，其中：

试剂1：

试剂2：

所述试剂1和试剂2的容积比为4:1。

二、操作方法

本实施例描述的游离脂肪酸测定试剂盒，采用自动生化分析仪，以日立7080为例，具体操作如下：

表1本发明试剂盒检测方法

测试条件：37℃，比色杯光径为1.0cm，检测主波长546nm，副波长660nm。按以下公式计算游离脂肪酸含量。

三、本发明试剂盒与进口酶法试剂盒的相关性

使用本实施例所述试剂盒与进口试剂盒(德赛)，同时对40例人血清样本中游离脂肪酸的检测结果进行相关性分析。进口试剂盒按照其说明书进行操作，测定结果如下表2所示。下表中进口试剂盒参考范围是0.10-0.60mmol/L，本发明试剂盒的参考范围是0.13-0.77mmol/L。

表2本发明试剂盒与进口试剂盒对游离脂肪酸的测定结果比较

相关系数R表示两组数值的相关程度，R越接近1表明两组数据的相关性越好。通常认为R大于0.990时的相关性为良好。

所述相关系数的计算方法如下：

$r=\frac{\mathrm{\Σ}(x_i-\stackrel{\‾}{x})(y_i-\stackrel{\‾}{y})}{\sqrt{\mathrm{\Σ}{(x_i-\stackrel{\‾}{x})}^2\mathrm{\Σ}{(y_i-\stackrel{\‾}{y})}^2}}$

其中，X为本发明试剂盒测得的NEFA含量浓度值，为上述测得的X值的平均数；Y为使用进口试剂盒测得的NEFA含量浓度值，为上述测得的Y值的平均数。

由上表统计结果可以看出，在这40例新鲜人血清样本中，共出现29例阴性结果和11例阳性结果，本发明试剂盒和进口酶法试剂盒在结果判断上是一一对应的，二者相关性良好(R＝0.9990)，临床意义显著。

以上的试验是采用日立公司制造的7080型号全自动生化分析仪进行的，但本发明试剂盒的应用不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪，并且本领域技术人员可以根据情况对测定参数做适当调整。

四、线性评估

取某一高值样本，分别用本发明试剂盒和进口试剂盒(德赛)测定高值样本5次倍比稀释后的线性，以此从实际样本中评估各试剂盒的线性，结果列于表3中。

表3本发明试剂盒与进口试剂盒线性对比

稀释倍数	本发明试剂盒	进口试剂盒
			0	0.000	0.000
0.0313	0.061	0.064
			0.0625	0.186	0.143
0.125	0.362	0.354
			0.25	0.741	0.652
0.5	1.582	1.443
			1	3.211	2.881

结果表明本发明试剂盒线性良好，拟合相关系数优于进口试剂盒。

五、稳定性研究

使用本实施例所述试剂盒，对高、低两个水平的游离脂肪酸样本进行测定，每个水平样本重复测定10次，并分别与2-8℃放置20个月的试剂测定结果进行对比，验证测定结果的准确性，按正规统计学要求，计算每个水平样品测定结果的平均值和标准差，然后按公式：

变异系数(CV)＝标准差/平均值×100％；

其中，X为测得的游离脂肪酸含量浓度值，为测得的X值的平均数，n为重复测定次数；

计算变异系数CV，结果列于下表4中；

按公式 $B\%=(\stackrel{\‾}{X}-T)/T\×100\%$

其中T为初始测定值均值，为2-8℃放置20个月的测定值均值。

计算2-8℃放置20个月测定值与初始测定值均值的相对偏差(B％)，结果列于表4中。

表4本发明试剂盒2-8℃长期放置20个月检测结果

由表4可以看出本实施例所述试剂盒在2-8℃放置20个月，测定结果重复性CV均小于10％，且与初始测定值的偏差均小于10％，符合《体外诊断试剂通用要求》，表明本发明试剂盒重复性良好，具有较好的准确性和良好的稳定性。

六、酶活性的影响

加入0.5％脂酰辅酶A氧化酶稳定剂对脂酰辅酶A氧化酶的保护作用。

表5酶保护剂对试剂中酶活性的影响

时间	未加酶保护剂残存酶活	加入0.5％脂酰辅酶A氧化酶稳定剂残存酶活
			0月	100％	100％
1个月	96％	98％
			3个月	84％	94％
6个月	73％	88％
			12个月	42％	78％

18个月	26％	66％
			20个月	17％	62％

本发明试剂盒对试剂中的酶有很强的保护作用，随着时间的推移，对酶的保护作用会更明显，20个月后加酶稳定剂的试剂与未加酶稳定剂的试剂相比，残存酶活率升高45％。

实施例2

一、一种稳定的酶法游离脂肪酸测定试剂盒，该试剂盒由按照下述成分和比例配制的液体双试剂组成，其中：

试剂1：

试剂2：

所述试剂1和试剂2的容积比为4:1。

二、本发明试剂盒与进口试剂盒的相关性

使用本实施例所述试剂盒，按实施例1所述方法，同时与市售进口试剂盒(德赛)对40例人血清样本中的游离脂肪酸含量进行测定，进口试剂盒按照其说明书进行操作，测定结果如下表6所示。下表中进口试剂盒参考范围是0.10-0.60mmol/L，本发明试剂盒的参考范围是0.13-0.77mmol/L。

表6本发明试剂盒与进口试剂盒对NEFA的测定结果

由上表统计结果可以看出，在这40例新鲜人血清样本中，共出现30例阴性结果和10例阳性结果，本发明试剂盒和进口酶法试剂盒在结果判断上是一一对应的，计算本发明试剂盒与进口试剂盒测定结果的相关系数r＝0.9989，二者相关性良好，临床意义显著。

以上的试验是采用日立公司制造的7080型号全自动生化分析仪进行的，但本发明试剂盒的应用不限于上述仪器，还适用于其它全自动或半自动生化分析仪，并且本领域技术人员可以根据情况对测定参数做适当调整。

三、线性评估

取某一高值样本，分别用本发明试剂盒和进口试剂盒(德赛)测定高值样本5次倍比稀释后的线性，以此从实际样本中评估各试剂盒的线性，结果列于表7中。

表7本发明试剂盒与进口试剂盒线性对比

稀释倍数	本发明试剂盒	进口试剂盒
			0	0.000	0.000
0.0313	0.131	0.143
			0.0625	0.272	0.252
0.125	0.553	0.499
			0.25	1.122	0.973
0.5	2.275	1.876
			1	4.616	3.591

结果表明本发明试剂盒线性良好，拟合相关系数优于进口试剂盒。

四、稳定性研究

使用本实施例所述试剂盒，测定高、低两个水平的游离脂肪酸样品，每个水平样本重复测定10次，对2-8℃放置20个月的试剂测定结果进行对比，验证测定结果的准确性，按正规统计学要求，计算每个水平样品测定结果的平均值和标准差，然后按公式：

变异系数(CV)＝标准差/平均值×100％

其中，X为测得的NEFA含量浓度值，为测得的X值的平均数，n为重复测定次数；

计算变异系数CV，结果列于下表8中；

按公式 $B\%=(\stackrel{\‾}{X}-T)/T\×100\%$

其中T为初始测定值均值，为2-8℃放置20个月的测定值均值。

计算2-8℃放置20个月测定值与初始测定值均值的相对偏差(B％)，结果列于表8中。

表8本发明试剂盒2-8℃长期放置20月检测结果

由表8可以看出本实施例所述试剂盒在2-8℃放置20个月，测定结果重复性CV均小于10％，且与初始测定值的偏差均小于10％，符合《体外诊断试剂通用要求》，表明本发明试剂盒重复性良好，具有较好的准确性和良好的稳定性。

六、酶活性的影响

加入2.0％脂酰辅酶A氧化酶稳定剂对脂酰辅酶A氧化酶的保护作用。

表9酶保护剂对试剂中酶活性的影响

时间	未加酶保护剂残存酶活	加入2.0％脂酰辅酶A氧化酶稳定剂残存酶活
			0月	100％	100％
1个月	96％	99％
			3个月	87％	94％
6个月	70％	85％
			12个月	41％	79％
18个月	24％	67％
			20个月	11％	60％

本发明试剂盒对试剂中的酶有很强的保护作用，随着时间的推移，对酶的保护作用会更明显，20个月后加酶稳定剂的试剂与未加酶稳定剂的试剂相比，残存酶活率升高49％。

实施例3

一、一种稳定的酶法游离脂肪酸测定试剂盒，该试剂盒由按照下述成分和比例配制的液体双试剂组成，其中：

试剂1：

试剂2：

所述试剂1和试剂2的容积比为4:1。

二、本发明试剂盒与进口试剂盒的相关性

使用本实施例所述试剂盒，按实施例1所述方法，同时使用市售进口试剂盒(德赛)对40例人血清样本中的游离脂肪酸含量进行测定，进口试剂盒按照其说明书进行操作，测定结果如下表10所示。下表中进口试剂盒参考范围是0.10-0.60mmol/L，本发明试剂盒的参考范围是0.13-0.77mmol/L。

表10本发明试剂盒与进口试剂盒对NEFA的测定结果

由上表统计结果可以看出，在这40例新鲜人血清样本中，共出现28例阴性结果和12例阳性结果，本发明试剂盒和进口酶法试剂盒在结果判断上是一一对应的，按实施例1所述方法，计算本发明试剂盒与进口试剂盒测定结果的相关系数r＝0.9992，二者相关性良好，临床意义显著。

以上的试验是采用日立公司制造的7080型号全自动生化分析仪进行的，但本发明试剂盒的应用不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪，并且本领域技术人员可以根据情况对测定参数做适当调整。

三、线性评估

取某一高值样本，分别用本发明试剂盒和进口试剂盒(德赛)测定高值样本的5次倍比稀释后的线性，以此从实际样本中评估各试剂盒的线性，结果列于表11中。

表11本发明试剂盒与进口试剂盒线性对比

稀释倍数	本发明试剂盒	进口试剂盒
			0	0	0
0.0313	0.091	0.082

0.0625	0.233	0.216
			0.125	0.488	0.441
0.25	0.962	0.917
			0.5	2.031	1.933
1	4.119	3.676

结果表明本发明试剂盒线性良好，拟合相关系数优于进口试剂盒。

四、稳定性研究

使用本实施例所述试剂盒，测定高、低两个水平的游离脂肪酸样本，每个水平重复测定10次，对2-8℃放置20个月的试剂测定结果进行对比，验证测定结果的准确性，按正规统计学要求，计算每个水平样本测定结果的平均值和标准差，然后按公式：

变异系数(CV)＝标准差/平均值×100％

其中，X为测得的NEFA含量浓度值，为测得的X值的平均数，n为重复测定次数；

计算变异系数CV，结果列于下表12中；

按公式 $B\%=(\stackrel{\‾}{X}-T)/T\×100\%$

其中T为初始测定值均值，为2-8℃放置20个月的测定值均值。

计算2-8℃放置20个月测定值与初始测定值均值的相对偏差(B％)，结果列于表12中。

表12本发明试剂盒2-8℃长期放置20个月

由以上结果可以看出本实施例所述试剂盒在2-8℃放置20个月，测定结果重复性CV均小于10％，且与初始测定值的偏差均小于10％，符合《体外诊断试剂通用要求》，表明本发明酶法游离脂肪酸检测试剂盒具有较高的准确性和良好的稳定性。

五、酶活性的影响

加入1％脂酰辅酶A氧化酶稳定剂对脂酰辅酶A氧化酶的保护作用。

表13酶保护剂对试剂中酶活性的影响

时间	未加酶保护剂残存酶活	加入1％脂酰辅酶A氧化酶稳定剂残存酶活
			0月	100％	100％
1个月	94％	98％
			3个月	80％	95％
6个月	71％	89％
			12个月	40％	81％
18个月	25％	72％
			20个月	15％	66％

本发明试剂盒对试剂中的酶有很强的保护作用，随着时间的推移，对酶的保护作用会更明显，20个月后加酶稳定剂的试剂与未加酶稳定剂的试剂相比，残存酶活率升高51％。

Claims (4)

1.一种稳定的游离脂肪酸测定试剂盒，其特征在于：包括试剂1和试剂2两种分别放置的液体试剂，其各组分及浓度范围为：

试剂1：

缓冲液20~200mmol/L

MgCl₂·6H₂O1~100mmol/L

KCL5~50mmol/L

ATP2~20mmol/L

辅酶A0.1~2.0mmol/L

脂酰辅酶A合成酶0.4~5KU/L

4-氨基安替比林0.2~2g/L

稳定剂1~10g/L

防腐剂0.05~0.5%

表面活性剂0.5~5g/L

EGTA0.5~3mmol/L

抗坏血酸氧化酶0.5~10KU/L

亚铁氰化钾0.01~0.1mmol/L

试剂2：

缓冲液20~200mmol/L

脂酰辅酶A氧化酶10~100KU/L

黄素腺嘌呤二核苷酸钠盐0.01-0.05g/L

色原1~10mmol/L

DTPA螯合剂0.5~3mmol/L

表面活性剂0.5~5g/L

防腐剂0.05~0.5%

酶保护剂0.5~2%

过氧化物酶（POD）50~150KU/L

所述试剂1和试剂2的容积比为4:1；

所述缓冲液选自2-吗啉代乙磺酸（MES）、3-吗啉代丙磺酸（MOPS）、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基甲磺酸（TES）、3-[4-(2-羟甲基)-1-哌嗪]丙磺酸（(H)EPPS）中的一种，优选MOPS缓冲液，pH优选范围为6.0~8.5；

所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖、β-环糊精、甘露醇中一种或多种的组合，同时添加无脂肪酸白蛋白；

所述防腐剂为咪唑烷基脲；

所述表面活性剂选自Brij35、Brij98、Tween20；

所述酶保护剂为乙酰辅酶A氧化酶稳定剂；

所述色原为胺类新色原3-甲基-N,N-二丙磺酸钠苯胺。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述白蛋白为利用基因工程学上方法制造的无脂肪酸白蛋白，纯度大于98%，脂肪酸含量低于0.002%（w/w）。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述脂酰辅酶A合成酶和脂酰辅酶A氧化酶均选自由基因工程重组产品提取的纯度大于95%的高纯度制品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述过氧化物酶为辣根提取的高稳定性制品。