[go: up one dir, main page]

CN106498012A - 一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法 - Google Patents

一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106498012A
CN106498012A CN201611022781.XA CN201611022781A CN106498012A CN 106498012 A CN106498012 A CN 106498012A CN 201611022781 A CN201611022781 A CN 201611022781A CN 106498012 A CN106498012 A CN 106498012A
Authority
CN
China
Prior art keywords
temperature
protein
volume
liquid
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611022781.XA
Other languages
English (en)
Inventor
胡永红
杨文革
丁志雯
马小平
钱永根
章泳
沈飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Tech University
Original Assignee
Nanjing Tech University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Tech University filed Critical Nanjing Tech University
Priority to CN201611022781.XA priority Critical patent/CN106498012A/zh
Publication of CN106498012A publication Critical patent/CN106498012A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，依次包括补料分批发酵、低温离心、硫酸铵分级沉淀、低温离心、取沉淀溶解，再进行透析、冷冻干燥。本发明从凝结芽孢杆菌发酵液中提取蛋白质的方法，建立了一种简单的操作流程，得到不同分子量的蛋白质和多肽。通过对提取出的蛋白质进行抑菌作用测定，发现部分组分蛋白质具有一定的抑制病原菌作用。此方法不仅工艺简单、提取率高，而且提高了不同分子量蛋白质的得率，为新型微生态制剂的生产提供模板。

Description

一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，具体是将凝结芽孢杆菌进行分批补料培养后得到的发酵液，经过低温离心、硫酸铵分级沉淀、低温离心、取沉淀，用缓冲溶液溶解，再进行透析、冷冻干燥，提取出凝结芽孢杆菌发酵液中的蛋白质，属于发酵工程技术领域。
技术背景
凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)，是革兰染色阳性菌，菌体呈杆形，单个或成短链，有运动性。其主要特征与普通乳酸菌十分相似，因抑菌效果突出而迅速发展成为国际市场上新一代益生菌保健产品。凝结芽胞杆菌是极温和的益生菌，并未有不良反应报道，是经美国FDA批准的一种“普遍认为安全”的乳酸菌(1992年美国FDA公布了5种芽胞杆菌为可以用作饲料的安全菌株，凝结芽胞杆菌名列第一位)。用于微生态制剂的枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌虽名为减毒或无毒菌株，但安全性仍不如凝结芽胞杆菌。凝结芽胞杆菌不但本身可以被制作成微生物菌剂和微生物肥料，其产生的生理活性物质也是种类丰富，如细菌素、酶类、激素等。因此，凝结芽胞杆菌是目前最具市场潜力的一种芽胞杆菌，国内外多把凝结芽胞杆菌作为重要的微农用微生态制剂出发菌，广泛应用于食品、医药、农业等领域。
代谢产物是靠菌种来完成的。菌种越多，并且处于最佳生产状态，产量就会越大。菌体发酵液中成分复杂，在如此复杂的体系中，抑菌物质的分离纯化要根据研究工作的类型而定。常规的蛋白质分离技术对于抗菌蛋白的提取是可行的，但是作为性质特异的物质如脂类等，结构性质差异大，分子量一般较小，某些常规的蛋白层析、电泳技术并不适合需要进一步改进，因此给抗菌蛋白的分离纯化工作带来极大阻碍。
与陶黎明等人用有机溶剂沉淀分离提取蛋白质的方法相比较，本发明中利用硫酸铵分级沉淀的方法分离出蛋白质，显著降低有机溶剂对蛋白质结构破坏，避免抑菌蛋白质失活，不需要低温下提取，简化操作流程。
发明内容
本发明针对当前凝结芽孢杆菌制剂普遍存在货架期期短的难题，提供了一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，此方法不仅工艺简单、提取率高，而且提高了不同分子量蛋白质的得率，为新型微生态制剂的生产提供模板。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，其具体步骤如下：
(1)补料分批发酵：将凝结芽孢杆菌菌株接种在营养琼脂培养基后培养，选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，锥形瓶装液量为锥形瓶体积的18～22％，温度控制在35～42℃，摇床转速140～200r/min，培养32～48h后，得到种子液。再移取发酵培养基体积分数比为4～8％的种子液接入发酵罐中发酵培养，其中发酵罐装液量为发酵罐体积的25～45％，控制温度在36～42℃，通入无菌空气，通气量保持在3～6L/(L·min)，搅拌速率140～200r/min，pH值为6.5～7.5，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在80～100g/L，培养32～48h后即为发酵液；
(2)低温离心：将步骤(1)中的发酵液装入离心管中，置于3～9℃低温离心机中离心得到上清液和沉淀，取上清液；
(3)硫酸铵分级沉淀：将步骤(2)中的得到的上清液置于搅拌仪上，在20～24℃温度下加入固体硫酸铵，使其饱和度达相应温度下的20～26％，磁力充分搅拌3～4h后，低温离心收集第一级沉淀物和第一级上清液；将得到的第一级上清液转入烧杯中，并以硫酸铵饱和度15～21％为梯度，继续加入固体硫酸铵充分搅拌，即离心收集到蛋白组分的第二级沉淀物；重复上述步骤，收集第三组分的沉淀物；
(4)透析：将步骤(3)中得到的第一、二和三级沉淀物装好并悬于含20～30％体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到5～15mg/mL；将悬液移至透析袋中，排出空气并密封，透析袋中悬液的装液量为透析袋体积的35～45％，在温度为5～10℃条件下，用蒸馏水透析6～10h，期间换液2～4次；再转至缓冲液中，相同温度条件下继续透析28～32h，得蛋白提取液；将提取液冷冻干燥即得到蛋白质。
其中凝结芽胞杆菌菌种的拉丁学名是：Bacillus coagulans，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.6681。
优选步骤(1)中种子液培养基的组分为：葡萄糖35～70g/L，酵母膏3～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl4～8g/L，pH为6.5～7.5。
优选步骤(1)中发酵培养基的组分为：葡萄糖35～70g/L，酵母膏3～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl 4～8g/L，CaCO310～15g/L,K2HPO4 0.8～1.5g/L，MgSO4·7H2O0.1～0.6g/L，ZnSO4·7H2O 0.005～0.015g/L，MnCl2·4H2O 0.001～0.005g/L，pH为6.5～7.5。
优选步骤(2)中低温离心转速在8000～10000r/min，离心5～9min。
优选步骤(3)低温离心温度在3～9℃，转速为10000～12000r/min，离心15～19min。
优选步骤(4)缓冲液成分：7～9mmol/L Tris-HCl、0.1～0.25mol/L NaCl、0.8～1.2mmol/L乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸。
抑菌活性的检测：采取上述方法提取的第一、二、三级蛋白质沉淀物透析冷冻干燥后的物质，各称取4～8μg溶于无菌蒸馏水中，制备出浓度4～8μg/mL的溶液。中心接有棉花黄萎病病菌菌碟的PDA平板培养48～52h后，于上下左右距离培养皿边缘2～3cm处用打孔器(d＝6mm)各打一个孔，在其中三个孔注入10～8μL溶解后的第一、二、三级蛋白质沉淀物，另一个空孔以无菌蒸馏水为对照。温度在26～32℃培养48～52h，观察发现第二、三级蛋白质组分具有显著的抑菌效果。
CGMCC No.6681菌株具有下述性质：
1、形态与培养特征：
该菌为革兰氏染色阳性菌，菌体呈杆形，(0.8～1)μm×(3～4)μm，单个或成短链。产生卵圆形芽孢，大多偏菌体一端菌，有的孢子囊膨胀，有运动性。对外界环境抵抗力很强，90℃处理10min，100℃处理5min不会失活，pH值为4.0～9.0时也能生长。在营养琼脂培养基上边缘不整齐，呈扁平圆形白色菌落，2～3mm大小。兼性厌氧菌，生长温度为20～55℃，最适生长温度为35～45℃。
2、生理生化特性
凝结芽孢杆菌CGMCC No.6681菌株的主要生理生化特征见表1：
表1菌株的生理生化特征
注：+：阳性或生长；－：阴性或不生长
有益效果：
本发明提供了一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法。该方法制得菌悬液在植物的体表定殖能力增强，集促生、抑菌和杀虫于一体，其多种功效决定了其推广具有非常大的前景，符合现代农业的要求。
保藏信息
上述凝结芽孢杆菌其分类命名为Bacillus coagulans，参据的微生物(株)为：NJYHHWG 877005，该菌株是本课题组自主筛选并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所)。其简称为CGMCC，保藏日期是2012年10月18日，登记入册的编号是CGMCC No.6681。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。以下例子所述凝结芽胞杆菌菌株，菌种的拉丁学名是：Bacillus coagulans，参据的菌株：NJYHHWG 877005，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登记入册编号是CGMCCNo.6681。
实施例1
(1)将凝结芽孢杆菌菌株接种在营养琼脂培养基后培养，选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，其中，种子液培养基为葡萄糖35g/L，酵母膏3g/L，蛋白胨8g/L，NaCl4g/L，pH为6.5。锥形瓶装液量为锥形瓶体积的18％，温度控制在36℃，摇床转速140r/min，培养32h后，得到种子液。再移取发酵培养基体积分数比为4％的种子液接入发酵罐中发酵培养，其中发酵培养基的组分为：葡萄糖35g/L，酵母膏3g/L，蛋白胨8g/L，NaCl 4g/L，CaCO3 10g/L,K2HPO4 0.8g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，ZnSO4·7H2O0.005g/L，MnCl2·4H2O 0.001g/L，pH为6.5。发酵罐装液量为发酵罐体积的25％，控制温度在36℃，通入无菌空气，通气量保持在3L/(L·min)，搅拌速率140r/min，pH值为6.5，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在80/L，培养32h后即为发酵液。
(2)低温离心：将步骤(1)中的发酵液装入离心管中，置于3℃低温离心机中低温离心，转速为8000r/min，离心5min，取上清液；
(3)硫酸铵分级沉淀：首先将步骤(2)中的得到的上清液置于搅拌仪上，在20℃温度下加入固体硫酸铵，使其饱和度达相应温度下的20％，磁力充分搅拌3h后，在3℃下低温离心，转速为10000r/min，离心15min，收集第一级沉淀物和第一级上清液；将得到的第一级上清液转入烧杯中，加入固体硫酸铵充分搅拌，使硫酸铵饱和度为35％，同样条件下离心收集到蛋白组分的第二级沉淀物。取第二级上清液加固体硫酸铵，是硫酸铵饱和度达50％，同样条件下离心收集即可收集第三组分的沉淀物。
(4)透析：将步骤(3)中得到的第一、二、三级沉淀物装好并悬于含20％体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到5mg/mL；将悬液移至透析袋中，排出空气并密封，透析袋中悬液的装液量为透析袋体积的35％，在温度为5℃条件下，用蒸馏水透析6h，期间换液2次。再转至缓冲液中，其中缓冲液成分为：7mmol/L Tris-HCl、0.1mol/L NaCl、0.8mmol/L乙二醇-
双-(2-氨基乙醚)四乙酸，相同温度条件下继续透析28h，得蛋白提取液。
将提取液冷冻干燥即可得到蛋白质。
抑菌活性的检测：采取上述方法提取的第一、二、三级蛋白质沉淀物透析冷冻干燥后的物质，各称取4μg溶于无菌蒸馏水中，制备出浓度4μg/mL的溶液。中心接有棉花黄萎病病菌菌碟的PDA平板培养48h后，于上下左右距离培养皿边缘2cm处用打孔器(d＝6mm)各打一个孔，在其中三个孔注入10μL溶解后的第一、二、三级蛋白质沉淀物，另一个空孔以无菌蒸馏水为对照。温度在26℃培养48h，观察发现第二、三级蛋白质组分具有显著的抑菌效果，抑菌直径分别达15.69mm和14.21mm。
实施例2
(1)将凝结芽孢杆菌菌株接种在营养琼脂培养基后培养，选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，其中种子液培养基的组分为：葡萄糖55g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨11g/L，NaCl6g/L，pH为7，锥形瓶装液量为锥形瓶体积的20％，温度控制在39℃，摇床转速170r/min，培养40h后，得到种子液。再移取发酵培养基体积分数比为6％的种子液接入发酵罐中发酵培养，其中发酵培养基的组分为：葡萄糖55g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨11g/L，NaCl 6g/L，CaCO3 13g/L,K2HPO4 1.2g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，ZnSO4·7H2O0.011g/L，MnCl2·4H2O 0.003g/L，pH为7，发酵罐装液量为发酵罐体积的35％，控制温度在39℃，通入无菌空气，通气量保持在5L/(L·min)，搅拌速率170r/min，pH值为7，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在90g/L，培养40h后即为发酵液。
(2)将步骤(1)中的发酵液装入离心管中，置于6℃低温离心机中离心，转速为9000r/min，
离心7min，取上清液；
(3)首先将步骤(2)中的得到的上清液置于搅拌仪上，在22℃温度下加入固体硫酸铵，使其饱和度达相应温度下的23％，磁力充分搅拌3.5h后，在6℃低温离心温度，转速为11000r/min，离心17min。收集第一级沉淀物和第一级上清液；将得到的第一级上清液转入烧杯中，继续加入固体硫酸铵充分搅拌，使硫酸铵饱和度达到41％，相同条件下离心收集到蛋白组分的第二级沉淀物。将第二级上清液放于另一烧杯中加入固体硫酸铵，使其饱和度达59％，相同条件下即可收集第三组分的沉淀物。
(4)将步骤(3)中得到的第一、二、三级沉淀物装好并悬于含25％体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到10mg/mL；将悬液移至透析袋中，排出空气并密封，透析袋中悬液的装液量为透析袋体积的40％，在温度为8℃条件下，用蒸馏水透析8h，期间换液3次。再转至缓冲液中，其中缓冲液成分：8mmol/L Tris-HCl、0.2mol/L NaCl、1.0mmol/L乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸，相同温度条件下继续透析30h，得蛋白提取液。
将提取液冷冻干燥即可得到蛋白质。
抑菌活性的检测：采取上述方法提取的第一、二、三级蛋白质沉淀物透析冷冻干燥后的物质，各称取6μg溶于无菌蒸馏水中，制备出浓度6μg/mL的溶液。中心接有棉花黄萎病病菌菌碟的PDA平板培养50h后，于上下左右距离培养皿边缘2.5cm处用打孔器(d＝6mm)各打一个孔，在其中三个孔注入9μL溶解后的第一、二、三级蛋白质沉淀物，另一个空孔以无菌蒸馏水为对照。温度在29℃培养50h，观察发现第二、三级蛋白质组分具有显著的抑菌效果，抑菌直径分别达17.09mm和15.82mm。
实施例3
(1)菌高密分批补料培养：将凝结芽孢杆菌菌株接种在营养琼脂培养基后培养，选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，其中种子液培养基的组分为：葡萄糖70g/L，酵母膏8g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 8g/L，pH为7.5。锥形瓶装液量为锥形瓶体积的22％，温度控制在42℃，摇床转速200r/min，培养48h后，得到种子液。再移取发酵培养基体积分数比为8％的种子液接入发酵罐中发酵培养，其中发酵培养基的组分为：葡萄糖70g/L，酵母膏8g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 8g/L，CaCO3 15g/L,K2HPO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O0.6g/L，ZnSO4·7H2O 0.015g/L，MnCl2·4H2O 0.005g/L，pH为7.5，发酵罐装液量为发酵罐体积的45％，控制温度在42℃，通入无菌空气，通气量保持在6L/(L·min)，搅拌速率200r/min，pH值为7.5，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在100g/L，培养48h后即为发酵液。
(2)将步骤(1)中的发酵液装入离心管中，置于9℃低温离心机中，离心转速为10000r/min，离心9min，取上清液；
(3)首先将步骤(2)中的得到的上清液置于搅拌仪上，在24℃温度下加入固体硫酸铵，使其饱和度达相应温度下的26％，磁力充分搅拌4h后，在9℃下低温离心，转速为12000r/min，离心19min。收集第一级沉淀物和第一级上清液；将得到的第一级上清液转入烧杯中，继续加入固体硫酸铵充分搅拌，使硫酸铵饱和度达47％，相同条件下离心收集到蛋白组分的第二级沉淀物。将第二级上清液置于另一烧杯中，添加硫酸铵固体充分搅拌，使其饱和度达68％，相同条件下离心收集第三组分的沉淀物。
(4)将步骤(3)中得到的第一、二、三级沉淀物装好并悬于含30％体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到15mg/mL；将悬液移至透析袋中，排出空气并密封，透析袋中悬液的装液量为透析袋体积的45％，在温度为10℃条件下，用蒸馏水透析10h，期间换液4次。再转至缓冲液中，其中缓冲液成分：9mmol/L Tris-HCl、0.25mol/L NaCl、1.2mmol/L乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸，相同温度条件下继续透析32h，得蛋白提取液。将提取液冷冻干燥即可得到蛋白质。
抑菌活性的检测：采取上述方法提取的第一、二、三级蛋白质沉淀物透析冷冻干燥后的物质，各称取8μg溶于无菌蒸馏水中，制备出浓度8μg/mL的溶液。中心接有棉花黄萎病病菌菌碟的PDA平板培养52h后，于上下左右距离培养皿边缘3cm处用打孔器(d＝6mm)各打一个孔，在其中三个孔注入8μL溶解后的第一、二、三级蛋白质沉淀物，另一个空孔以无菌蒸馏水为对照。温度在32℃培养52h，观察发现第二、三级蛋白质组分具有显著的抑菌效果，抑菌直径分别达18.13mm和16.22mm。

Claims (6)

1.一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，其具体步骤如下：
(1)补料分批发酵：将凝结芽孢杆菌菌株接种在营养琼脂培养基后培养，选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，锥形瓶装液量为锥形瓶体积的18～22％，温度控制在35～42℃，摇床转速140～200r/min，培养32～48h后，得到种子液；再移取发酵培养基体积分数比为4～8％的种子液接入发酵罐中发酵培养，其中发酵罐装液量为发酵罐体积的25～45％，控制温度在36～42℃，通入无菌空气，通气量保持在3～6L/(L·min)，搅拌速率140～200r/min，pH值为6.5～7.5，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在80～100g/L，培养32～48h后即为发酵液；
(2)低温离心：将步骤(1)中的发酵液装入离心管中，置于3～9℃低温离心机中离心得到上清液和沉淀，取上清液；
(3)硫酸铵分级沉淀：将步骤(2)中的得到的上清液置于搅拌仪上，在20～24℃温度下加入固体硫酸铵，使其饱和度达相应温度下的20～26％，磁力充分搅拌3～4h后，低温离心收集第一级沉淀物和第一级上清液；将得到的第一级上清液转入烧杯中，并以硫酸铵饱和度15～21％为梯度，继续加入固体硫酸铵充分搅拌，即离心收集到蛋白组分的第二级沉淀物；重复上述步骤，收集第三级沉淀物；
(4)透析：将步骤(3)中得到的第一、二和三级沉淀物装好并悬于含20～30％体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到5～15mg/mL；将悬液移至透析袋中，排出空气并密封，透析袋中悬液的装液量为透析袋体积的35～45％，在温度为5～10℃条件下，用蒸馏水透析6～10h，期间换液2～4次；再转至缓冲液中，相同温度条件下继续透析28～32h，得蛋白提取液；将提取液冷冻干燥即得到蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中种子液培养基的组分为：葡萄糖35～70g/L，酵母膏3～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl4～8g/L，pH为6.5～7.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中发酵培养基的组分为：葡萄糖35～70g/L，酵母膏3～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl 4～8g/L，CaCO3 10～15g/L,K2HPO4 0.8～1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1～0.6g/L，ZnSO4·7H2O 0.005～0.015g/L，MnCl2·4H2O 0.001～0.005g/L，pH为6.5～7.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中低温离心转速在8000～10000r/min，离心5～9min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中的离心温度在3～9℃，转速为10000～12000r/min，离心15～19min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)缓冲液成分：7～9mmol/L Tris-HCl、0.1～0.25mol/L NaCl、0.8～1.2mmol/L乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸。
CN201611022781.XA 2016-11-18 2016-11-18 一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法 Pending CN106498012A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611022781.XA CN106498012A (zh) 2016-11-18 2016-11-18 一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611022781.XA CN106498012A (zh) 2016-11-18 2016-11-18 一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106498012A true CN106498012A (zh) 2017-03-15

Family

ID=58327283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611022781.XA Pending CN106498012A (zh) 2016-11-18 2016-11-18 一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106498012A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703550A (zh) * 2012-03-06 2012-10-03 南京工业大学 一种从蜡样芽孢杆菌高密度发酵液中提取蛋白质的方法
CN102943057A (zh) * 2012-11-16 2013-02-27 南京工业大学 一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵的工艺
CN107568211A (zh) * 2017-08-31 2018-01-12 南京工业大学 一种制备凝结芽孢杆菌预混剂的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703550A (zh) * 2012-03-06 2012-10-03 南京工业大学 一种从蜡样芽孢杆菌高密度发酵液中提取蛋白质的方法
CN102943057A (zh) * 2012-11-16 2013-02-27 南京工业大学 一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵的工艺
CN107568211A (zh) * 2017-08-31 2018-01-12 南京工业大学 一种制备凝结芽孢杆菌预混剂的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘馨磊等: "补料分批法高密度培养凝结芽孢杆菌", 《生物技术》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113564081B (zh) 一种产呕吐毒素降解酶的德沃斯氏菌scs-3及其应用
CN114657097B (zh) 一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用
CN101285046A (zh) 一种诱变菌株白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法
CN109022324B (zh) 一种荧光假单胞菌及其应用
CN101245362B (zh) 发酵法生产多肽类抗生素安来霉素的方法
WO2016155567A1 (zh) 一种链霉菌及其生产米尔贝霉素a4的方法
JP6550144B2 (ja) ストレプトマイセスおよびそれを用いてミルベマイシンａ３を製造する方法
CN110387339A (zh) 一株中间苍白杆菌b522及其应用
CN107338202B (zh) 具有广谱抑制病原菌功能的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN102174448B (zh) 一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用
CN103897995B (zh) 一种短乳杆菌及其应用
CN102703550B (zh) 一种从蜡样芽孢杆菌高密度发酵液中提取蛋白质的方法
CN113214999B (zh) 一株地霉tn42及其在污水处理中的应用
CN102618464A (zh) 一种能促进vbnc细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基及其制备方法和应用
CN102943056A (zh) 一种地衣芽孢杆菌及多阶段发酵的方法
CN114045248A (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌、组合物及其应用与解淀粉芽孢杆菌的发酵培养方法
CN110903994B (zh) 产高温蛋白酶地衣芽孢杆菌及其应用
CN108546663A (zh) 一种猪源卷曲乳杆菌及其应用
CN104894026B (zh) 纳豆芽孢杆菌的培养方法及其应用
CN104830728B (zh) 一种雷氏普罗威登斯菌
CN108913618B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌jspb14及其应用
CN104974957B (zh) 芽孢杆菌（Bacillus sp.）ZY菌株及其应用
CN110616177B (zh) 一株具有高发酵密度的芽孢杆菌及其发酵生产方法
CN106498012A (zh) 一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法
CN107760639A (zh) 菌株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170315

RJ01 Rejection of invention patent application after publication