CN106488767A - 调节雌激素受体突变体的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本申请描述了用于通过给予雌激素受体调节剂来治疗特征在于ESR1基因中突变的ER相关疾病或病症的方法和组合物。本申请还描述了用于通过给予雌激素受体调节剂来治疗特征在于ESR1基因中突变的激素抗性‑雌激素受体(ER)阳性乳腺癌的方法。

Description

调节雌激素受体突变体的方法和组合物

序列表

本申请含有序列表，其已经作为呈ASCII格式的计算机可读文本文件经由EFS-Web提交，并通过引用的方式整体并入本申请。该文本文件，创建于2014年3月13日，命名为45202-739-101seqlist.txt且大小为8KB。

技术领域

本申请描述了通过给予雌激素受体调节剂来治疗妇女中特征在于一个或多个肿瘤细胞中ER基因突变的激素抗性-雌激素受体(ER)阳性乳腺癌的方法。

背景技术

乳腺癌是最常见的癌症形式并且是全世界妇女中癌症死亡的首要原因。所有乳腺癌中约80％表达并且依赖于用于肿瘤生长和进展的雌激素受体(ER)。雌激素受体(“ER”)是一种通过其与内源性雌激素的相互作用而介导诱导多种生物效应的配体活化的转录调节蛋白。内源性雌激素包括17β-雌二醇和雌酮。已发现ER具有两种亚型，ER-α和ER-β。雌激素和雌激素受体牵涉许多疾病或病症，诸如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、子宫癌，以及其它疾病或病症。

大多数乳腺癌患者用药物治疗，该药物阻断雌激素合成(例如，芳香酶抑制剂；AIS)或通过竞争性ER结合拮抗雌二醇的作用(例如，他莫昔芬)(Puhalla S,et al MolOncol 2012；6(2):222-236)。尽管在疾病的不同阶段，这些药物具有充分记载的治疗效用，但是许多ER+乳腺癌复发且患者最终死亡。最近，下一代全基因组和靶标测序在高达20％的来自已经对内分泌疗法(主要是芳香酶抑制剂)进展的具有晚期乳腺癌的患者的肿瘤中已鉴定出ESR1(雌激素受体α基因)(Li S,et al.Cell Rep(2013)；4(6):1116-1130；Merenbakh-Lamin K,et al.Cancer Res(2013)；73(23):6856-6864；Robinson DR,etal.Nat Genet(2013)；45(12):1446-1451；Toy W,et al.Nat Genet(2013)；45(12):1439-1445；Jeselsohn R,et al.Clin Cancer Res(2014)；20:1757-1767)。这些配体结合域(LBD)突变赋予apo受体高基底活性，这使得它们不依赖于配体且由此在低雌二醇环境(setting)中具有活性。在AI或他莫昔芬治疗后进行性疾病的环境(包括具有ESR1突变肿瘤的患者的亚组)中，对于靶向具有强效活性的ER信号传导的疗法存在巨大的需求。

ARN-810(GDC-0810,Seragon Pharmaceuticals,Genentech Inc.)是一种拮抗雌激素作用且经蛋白酶体诱导ER降解的强效的小分子、非类固醇、选择性ER调节剂。在临床试验中，ARN-810作为口服递送的疗法以治疗晚期转移性ER-α阳性(ER+)乳腺癌。

已经描述了非类固醇、选择性雌激素受体降解剂(SERD)(WO 2011/156518；US8703810；WO 2012/037411；WO 2012/037410；US 8299112；US 8455534；WO 2013/090829；WO2013/142266；WO 2014/151899；WO 2013/090836；WO 2014/025138；WO 2014/205136)。

发明内容

在某些实施方案中，本申请描述了用于治疗特征在于具有ESR1基因突变的患者中激素抗性-雌激素受体(ER)阳性乳腺癌的方法，所述方法包括给予雌激素受体调节剂(ERM)。在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为选择性雌激素受体降解剂(SERD)。在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为选择性雌激素受体调节剂(SERM)。在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为具有式(A)、(B)、(C)或(D)结构的化合物。在一些实施方案中，具有式(A)结构的化合物为具有式(A-1)结构的化合物。在一些实施方案中，具有式(C)结构的化合物为具有式(C-1)结构的化合物。在一些实施方案中，具有式(D)结构的化合物为具有式(D-1)、(D-2)、(D-3)、(D-4)、(D-5)或(D-6)结构的化合物。在一些实施方案中，ESR1基因中的突变导致形成在选自以下的位置具有氨基酸替换的ER多肽：SEQ ID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555。在一些实施方案中，所述突变导致形成具有选自以下的氨基酸替换的ER多肽：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些实施方案中，所述患者具有两个或更多个ESR1基因中的突变。

在某些实施方案中，本申请描述了用于治疗ER相关疾病或病症的方法，其包括向具有ESR1基因突变的患者给予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂(ERM)化合物。

式(A)化合物或其药用盐或溶剂化物，所述化合物具有以下结构：

其中，

R^a为-CO₂H或选自以下的5元杂环：

R^b为C₁-C₆烷基或C₃-C₆环烷基；

R^c为H或F；

每个R^d独立地选自H、卤素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每个R^e独立地选自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

每个R^f独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

X为CH或N；且

n为0、1或2。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为式(A-1)化合物或其药用盐或溶剂化物，所述化合物具有以下结构：

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂选自化合物1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11和1-12。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为化合物1-3。

式(B)化合物具有以下结构：

其中，

R^a为-CO₂H或选自以下的5元杂环：

环C为

环D为苯基或噻吩基；

每个R^d独立地选自H、卤素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每个R^e独立地选自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

每个R^f独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

n为0、1或2，

或其药用盐或溶剂化物。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂选自化合物2-1、2-2、2-3、2-4和2-5。

式(C)化合物具有以下结构：

其中，

R^a为-CO₂H或选自以下的5元杂环：

R^b为C₁-C₆烷基或C₃-C₆环烷基；

每个R^d独立地选自H、卤素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每个R^e独立地选自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

每个R^f独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；且

n为0、1或2，

或其药用盐或溶剂化物。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为式(C-1)化合物或其药用盐或溶剂化物，所述化合物具有以下结构：

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为化合物3-1、3-2、3-3、3-4。

式(D)化合物或其药用盐或溶剂化物，所述化合物具有以下结构：

其中，

R¹为H、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

R²为H、F、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

R³为H、卤素、-CN、-OR⁶、-NHR⁶、-NR⁶R⁷、-SR⁶、-S(＝O)R⁷、-S(＝O)₂R⁷、C₁-C₄烷基或C₁-C₄氟烷基；

每个R⁴独立地选自H、卤素、-CN、-OH、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₄烷基、氟C₁-C₄烷氧基和C₁-C₄烷氧基；每个R⁵为H、F、Cl、-OH、-CH₃、-CF₃或-OCH₃；

每个R⁶独立地选自H、-C(＝O)R⁷、-C(＝O)OR⁷、-C(＝O)NHR⁷、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；每个R⁷独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、经取代的或未经取代的C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

n为0、1或2；且t为1或2。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为具有以下结构的式(D-1)化合物：

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为具有以下结构的式(D-2)化合物：

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为具有以下结构的式(D-3)化合物：

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为具有以下结构的式(D-4)化合物：

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂选自化合物4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11、4-12、4-13、4-14、4-15、4-16、4-17、4-18、4-19、4-20、4-21、4-22、4-23、4-24、4-25、4-26、4-27、4-28、4-29、4-30、4-31、4-32、4-33、4-34、4-35、4-36、4-37、4-38、4-39、4-40、4-41、4-42、4-43、4-44和4-45。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为化合物4-23。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为化合物1-3或4-23。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或(S)-2-(4-(2-(3-(氟甲基)氮杂环丁-1-基)乙氧基)苯基)-3-(3-羟基苯基)-4-甲基-2H-色烯-6-醇。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为(S)-2-(4-(2-(3-(氟甲基)氮杂环丁-1-基)乙氧基)苯基)-3-(3-羟基苯基)-4-甲基-2H-色烯-6-醇。

在一些实施方案中，所述ER相关的疾病或病症为癌症。在一些实施方案中，所述癌症为乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌为转移性乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌为激素抗性乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌为雌激素受体阳性乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌为HER2阳性乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌为HER2阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌对用芳香酶抑制剂的治疗具有抗性。在一些实施方案中，ESR1基因中的突变为体细胞突变。在一些实施方案中，所述患者表达野生型ER和突变型ER。在一些实施方案中，所述患者表达两种突变型ER-α多肽的同二聚体。在一些实施方案中，所述患者表达一种野生型ER-α多肽和一种突变型ER-α多肽的异二聚体，或一种野生型ER-β多肽和一种突变型ER-α多肽的异二聚体。在一些实施方案中，所述患者具有肿瘤。在一些实施方案中，多数肿瘤细胞表达突变型ER。在一些实施方案中，所述患者处于绝经前或绝经后。在一些实施方案中，所述患者已经历一种或多种抗癌疗法失败。在一些实施方案中，所述患者已接受化学治疗剂、生物疗法、癌症疫苗、血管生成抑制剂、激素疗法、放射疗法、外科手术或它们的任意组合。在一些实施方案中，所述生物疗法是肽、细胞因子、抗体、治疗性病毒、治疗性细菌、基因疗法、siRNA、过继性T细胞转移或它们的任意组合。在一些实施方案中，所述患者已接受芳香酶抑制剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、选择性雌激素降解剂(SERD)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR途径抑制剂、CDK4/6抑制剂、HER-2抑制剂、EGFR抑制剂、PD-1抑制剂、聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、HSP90抑制剂、VEGFR抑制剂、AKT抑制剂、化学疗法或它们的任意组合。在一些实施方案中，所述患者已接受氟维司群(fulvestrant)、他莫昔芬(tamoxifen)、阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、GDC0032、戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprolide)、雷洛昔芬(raloxifene)、托瑞米芬(toremifene)、乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)、巴多昔芬(bazedoxifene)或它们的任意组合。在一些实施方案中，所述患者已接受蒽环类抗生素(anthracycline)、紫杉烷(taxane)、铂剂、埃坡霉素(epothilone)或核苷类似物。在一些实施方案中，所述患者已接受顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、卡培他滨(capecitabine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、艾日布林(eribulin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、伊沙匹隆(ixabepilone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸(pamidronate)、长春瑞滨(vinorelbine)或它们的任意组合。在一些实施方案中，所述患者已接受帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥单抗(trastuzumab)、拉帕替尼(lapatinib)、依维莫司(everolimus)、贝伐单抗(bevacizumab)、坦西莫司(temsirolimus)或它们的任意组合。在一些实施方案中，所述ESR1突变导致替换、插入或缺失一个或多个ER多肽中的氨基酸。在一些实施方案中，所述ESR1突变导致雌激素受体的N末端结构域、DNA结合域、铰链区或配体结合域中的氨基酸替换。在一些实施方案中，所述ESR1突变导致雌激素受体的配体结合域中的氨基酸替换。在一些实施方案中，所述氨基酸替换位于SEQ ID NO:2的6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555位氨基酸。在一些实施方案中，所述氨基酸替换选自H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些实施方案中，所述氨基酸替换选自Y537N、Y537C、Y537S和D538G。在一些实施方案中，所述方法还包括给予一种或多种用于治疗ER相关疾病或病症的治疗剂。在一些实施方案中，所述方法还包括给予额外的抗癌剂。在一些实施方案中，所述方法还包括给予芳香酶抑制剂。

在某些实施方案中，本申请所述的是针对用式(A)、(B)、(C)或(D)化合物调节剂化合物的治疗选择患有ER相关疾病或病症的患者的方法：其包括1)在包含来自患者的核酸的样品中检测ESR1基因中的突变；和2)若患者具有ESR1突变，则针对用所述化合物的治疗选择患者。

在一些实施方案中，所述核酸为RNA或DNA。在一些实施方案中，所述DNA为基因组DNA。在一些实施方案中，所述方法还包括从核酸样品中分离mRNA。在一些实施方案中，所述方法还包括从核酸样品中扩增包含所述突变的核酸分子。在一些实施方案中，通过聚合物酶链式反应(PCR)或数字PCR进行扩增。在一些实施方案中，PCR扩增包括使用一对侧翼具有包含所述突变的区域的寡核苷酸引物。在一些实施方案中，所述方法包括使核酸与序列特异性核酸探针接触，其中所述序列特异性核酸探针与具有所述突变的核酸结合且不与野生型核酸结合。在一些实施方案中，所述样品包含来自一个或多个肿瘤细胞的核酸。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞取自肿瘤活检样品、血液样品、血清样品、淋巴样品或骨髓穿刺液。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞是循环肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述样品包含循环肿瘤DNA(ctDNA)。

在某些实施方案中，本申请所述的是试剂盒，其包含一种或多种用于检测ESR1突变的试剂以及式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种引物或用于检测ESR1中的突变的探针。在一些实施方案中，所述ESR1突变导致替换、插入或缺失一个或多个ER多肽中的氨基酸。在一些实施方案中，所述ESR1突变导致雌激素受体的N末端结构域、DNA结合域、铰链区或配体结合域中的氨基酸替换。在一些实施方案中，所述ESR1突变导致雌激素受体的配体结合域中的氨基酸替换。在一些实施方案中，所述氨基酸替换位于SEQ ID NO:2的6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555位氨基酸。在一些实施方案中，所述氨基酸替换选自H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些实施方案中，所述氨基酸替换选自Y537N、Y537C、Y537S和D538G。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受体调节剂口服给予患者。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受体调节剂每天给予。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受体调节剂以连续每日给药方案给予。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受体调节剂以约5mg/天至约1000mg/天给予。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受体调节剂的治疗有效量为约10mg/天至约100mg/天。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受体调节剂每日一次或每日多次给予。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受体调节剂每日一次、每日两次、每日三次或每日四次给予。

本申请所述的方法、用途和组合物的其它目的、特征和优点将从以下详细描述中变得显而易见。然而，应当理解的是，详细描述和具体实施例，虽然指示具体实施方案，但仅以说明的方式给出，这是因为从该详细描述中本公开的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

具体实施方式

乳腺癌是最常见的癌症形式并且是全世界妇女中癌症死亡的首要原因。所有乳腺癌中约80％表达并依赖于肿瘤生长和进展的雌激素受体(ER)。其它癌症也被认为依赖于用于生长和存活的ER-α信号传导，诸如卵巢癌和子宫内膜癌。

雌激素受体α(ER-α)和雌激素受体β(ER-β)是类固醇激素受体，其为大的核受体超家族成员。核受体共享共同的模块结构，其最低限度包括DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)。类固醇激素受体是作为配体调节的转录因子的可溶性细胞内蛋白质。脊椎动物含有五个密切相关的类固醇激素受体(雌激素受体、雄激素受体、孕激素受体、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体)，其调节广谱的生殖、代谢和发育活动。ER的活性受内源性雌激素，包括17β-雌二醇和雌酮的结合控制。

ER-α基因位于6q25.1且编码595AA蛋白。ER-β基因位于染色体14q23.3上且产生530AA蛋白质。然而，由于选择性剪接和翻译起始位点，这些基因中的每一个可产生多种同工型。除了DNA结合域(称为C结构域)和配体结合域(E结构域)之外，这些受体还包含N-末端(A/B)结构域，连接C和E结构域的铰链(D)结构域，和C-末端延伸(F结构域)(Gronemeyerand Laudet；Protein Profile 2:1173-1308,1995)。虽然ER-α和ER-β的C和E结构域是相当保守的(分别为95％和55％氨基酸同一性)，但是A/B、D和F结构域的保守性差(低于30％的氨基酸同一性)。两种受体都参与雌性生殖道的调节和发育，但在中枢神经系统、心血管系统和骨代谢中也发挥多种作用。

类固醇激素受体的配体结合口袋深深地埋在配体结合域内。结合后，配体变成该结构域的疏水核心的一部分。因此，大多数类固醇激素受体在不存在激素的情况下是不稳定的，并且需要来自伴侣蛋白诸如Hsp90的辅助，以便维持激素结合能力(competency)。与Hsp90的相互作用也控制这些受体的核易位。配体结合稳定受体并启动释放伴侣蛋白的序列构象变化，改变各种受体结构域之间的相互作用并重塑蛋白相互作用表面，其允许这些受体易位至细胞核中，结合DNA并参与与染色质重塑复合物和转录器的相互作用。虽然ER可与Hsp90相互作用，但是这种相互作用不是激素结合所必需的，并且取决于细胞环境，apo-ER既可以是胞质的也可以是核的。生物物理研究表明有助于受体的稳定性的是DNA结合而不是配体结合(Greenfield et al.,Biochemistry 40:6646-6652,2001)。

ER可通过结合称为雌激素响应元件(ERE)的特异性DNA序列基序(经典途径)直接与DNA相互作用，或通过蛋白质-蛋白质相互作用(非经典途径)间接与DNA相互作用(Welboren et al.,Endocrine-Related Cancer 16:1073-1089,2009)。在非经典途径中，ER已显示与其它转录因子包括SP-1、AP-1和NF-κB相连。这些相互作用似乎在ER调节细胞增殖和分化的能力中发挥关键作用。

两种类型的ER DNA相互作用可导致依赖于由相应的ER-ERE复合物募集的转录辅助调节因子的基因激活或抑制(Klinge,Steroid 65:227-251,2000)。辅助调节因子的募集主要由两个蛋白质相互作用表面AF2和AF1介导。AF2位于ER E结构域中并且其构象由配体直接调节(Brzozowski et al.,Nature 389:753-758,1997)。完全激动剂似乎促进辅助激活因子的募集，而弱激动剂和拮抗剂则有助于辅助抑制因子的结合。对用AF1调节蛋白质了解较少，但其可通过丝氨酸磷酸化来控制(Ward and Weigel,Biofactors 35:528-536,2009)。所涉及的磷酸化位点(S118)之一似乎在存在拮抗剂诸如他莫昔芬的情况下控制ER的转录活性，所述拮抗剂在乳腺癌的治疗中发挥重要作用。尽管完全激动剂似乎以某些构象阻止ER，但弱激动剂倾向于使ER保持在不同构象之间的平衡中，这允许辅助调节因子所有组分中的细胞依赖性差异以细胞依赖性方式调节ER的活性(Tamrazi et al.,Mol.Endocrinol.17:2593-2602,2003)。ER与DNA的相互作用是动态的，并且通过包括但不限于通过蛋白酶体降解ER的方法来调节(Reid et al.,Mol Cell 11:695-707,2003)。用配体降解ER为对可用的抗激素治疗具有雌激素敏感性和/或抗性的疾病或病症提供有吸引力的治疗策略。

ER信号传导对于女性生殖器官(包括乳房)的发育和维持、排卵和子宫内膜的增厚是至关重要的。ER信号传导还在骨量、脂质代谢、癌症等中发挥作用。

雌激素活性和/或合成的调节是具有ER阳性(ER+)乳腺癌的女性的治疗方法的主要内容。ER-α拮抗剂他莫昔芬已用于治疗绝经前和绝经后妇女的早期和晚期ER-α阳性乳腺癌。氟维司群(FASLODEX^TM,Astra Zeneca)，即一种基于类固醇的ER拮抗剂，用于治疗虽用他莫昔芬治疗但仍有进展的妇女的乳腺癌。类固醇和非类固醇芳香酶抑制剂也用于治疗人类的癌症。在一些实施方案中，类固醇和非类固醇芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑和依西美坦)阻断绝经后妇女中由雄烯二酮和睾酮产生雌激素，从而阻断癌症中的ER依赖性生长。除了这些抗激素剂之外，在一些情况下用多种其它化疗剂诸如蒽环类、铂类、紫杉烷类治疗进行性ER阳性乳腺癌。在一些情况下，用单克隆抗体曲妥单抗(HERCEPTIN^TM,GenentechInc.)或小分子pan-ERB-B抑制剂拉帕替尼治疗携带ERB-B/HER2酪氨酸激酶受体的基因扩增的ER阳性乳腺癌。尽管具有一系列抗激素、化学治疗和小分子以及基于抗体的靶向疗法，许多具有ER-α阳性乳腺癌的妇女发展进展性转移性疾病，并需要新的疗法。重要的是，在现有抗激素以及其它疗法上进展的大多数ER阳性肿瘤被认为仍然依赖于用于生长和存活的ER-α。因此，需要在转移性疾病和获得性耐药的情况下具有活性的新型ER-α靶向剂。

尽管对于芳香酶抑制剂或他莫昔芬而言变得具有难治性，抗性肿瘤细胞的生长和存活仍然依赖于ER信号传导；因此，具有ER+乳腺癌患者在先前激素疗法进展后仍然可进行第二/三线激素治疗。在一些实施方案中，在内分泌耐药状态下，ER可以配体非依赖性方式发出信号。在一些实施方案中，具有双重作用机制(诸如ER拮抗作用+降解)的药物具有靶向配体依赖性和非依赖性ER信号传导两者的潜力，并因此改善晚期ER+乳腺癌的治疗结果。

来自激素抗性乳腺癌患者的肿瘤样品的基因组分析揭示了雌激素受体α基因ESR1中的突变，其有助于ER+乳腺癌中的激素抗性。在某些情况下，这种突变导致雌激素受体的配体非依赖性激活。如本申请所述，特定的ER调节剂化合物在ER突变体环境中有效抑制ER信号传导。因此，这种ER调节剂化合物可用于治疗具有突变型ER的ER+乳腺癌患者。

在某些情况下，所述ER突变为ESR1基因中的体细胞突变。在一些实施方案中，所述体细胞突变在癌症治疗过程中发生于癌细胞(例如，乳腺癌细胞)中。在一些实施方案中，所述患者具有野生型ESR1基因和突变的ESR1基因两者(即，杂合子)。在一些实施方案中，癌细胞经历体细胞突变以产生突变的ESR1基因。在一些实施方案中，所述突变的癌细胞复制产生许多突变的癌细胞(例如，归因于体细胞突变的具有突变的ESR1基因的扩大种群的癌细胞)。在一些实施方案中，所述患者表达野生型ER-α和突变型ER-α(即，异源表达)。在一些实施方案中，所述突变型ER-α包含两种突变型ER-α多肽(即，同二聚体)。在一些实施方案中，所述突变型ER-α包含野生型ER-α多肽和突变型ER-α(即，异二聚体)。在一些实施方案中，所述体细胞突变赋予癌细胞对癌症治疗的抗性。在一些实施方案中，许多癌细胞中的体细胞突变赋予患者对癌症治疗的抗性。在一些实施方案中，对于癌症(例如，乳腺癌)的治疗，所述突变赋予基于激素的疗法的抗性。在一些实施方案中，所述癌症为ER+乳腺癌。

在一些实施方案中，所述ER突变为遗传的ESR1基因中的种系突变。在一些实施方案中，所述突变增加发展乳腺癌的风险。在一些实施方案中，所述种系突变赋予癌细胞对癌症治疗的抗性。在一些实施方案中，许多癌细胞(例如，乳腺癌细胞)中的种系突变赋予患者对癌症治疗的抗性。在一些实施方案中，对于癌症(例如，乳腺癌)的治疗，所述种系突变赋予基于激素的疗法的抗性。在一些实施方案中，所述癌症为ER+乳腺癌。

在一个方面，本申请描述用于治疗具有一个或多个ESR1基因中的突变的患者的雌激素受体调节剂的化合物。在一些实施方案中，所述患者在一个或多个癌细胞，或多数癌细胞中具有一个或多个ESR1基因中的突变。在一些实施方案中，所述ER调节剂化合物为选择性雌激素受体降解剂(SERD)，其靶向用于降解的ER-α。在一些实施方案中，所述ER调节剂化合物为具有组织特异性ER性质的选择性雌激素受体调节剂(SERM)。

在一些实施方案中，在基于细胞的测定中，本申请所述的化合物导致稳态ER-α水平的降低(例如，ER降解)，并且可用于治疗雌激素敏感性疾病或病症和/或已经对抗激素疗法发展出抗性的疾病或病症。在一些实施方案中，本申请所公开的ER调节剂化合物使核中雌激素受体的水平最小化。在一些实施方案中，所述ER调节剂化合物与雌激素竞争结合至雌激素受体。在一些实施方案中，所述ER调节剂化合物为与雌激素竞争结合至雌激素受体的非类固醇ERα拮抗剂。在一些实施方案中，所述ER调节剂化合物完全拮抗野生型ER-α对雌激素的响应。在一些实施方案中，所述ER调节剂化合物完全拮抗突变型ER-α对雌激素的响应。在一些实施方案中，与野生型ER-α相比，所述突变型ER-α展现出增加的基底活性。在一些实施方案中，所述突变型ER-α展现出配体非依赖性活性(例如，组成性活性)。在一些实施方案中，所述突变型ER-α在不存在雌二醇的情况下展现出组成性活性。在一些实施方案中，所述ER调节剂抑制突变型ER-α的配体非依赖性活性(例如，组成性活性)。在一些实施方案中，所述ER调节剂诱导突变型ER-α中的构象改变。在一些实施方案中，所述ER调节剂诱导抑制突变型ER-α的活性的突变型ER-α中的构象改变。在一些实施方案中，所述ER调节剂诱导乳腺癌细胞中野生型ER-α的蛋白酶体降解。在一些实施方案中，所述ER调节剂诱导乳腺癌细胞中突变型ER-α的蛋白酶体降解。在一些实施方案中，所述ER调节剂不依赖蛋白酶体降解而抑制细乳腺癌胞中突变型ER-α。在一些实施方案中，所述ER调节剂化合物完全拮抗ER-α对雌激素的响应并诱导乳腺癌细胞中野生型ER-α的蛋白酶体降解。在一些实施方案中，所述ER调节剂化合物完全拮抗突变型ER-α对雌激素的响应并诱导乳腺癌细胞中突变型ER-α的蛋白酶体降解。在一些实施方案中，所述ER调节剂化合物完全拮抗突变型ER-α对雌激素的响应而不诱导乳腺癌细胞中突变型ER-α的蛋白酶体降解。在一些实施方案中，所述ER调节剂化合物抑制表达突变型ER-α的乳腺癌细胞的增殖。在一些实施方案中，所述ER调节剂化合物展现出良好的口服生物利用度。

本申请公开的ER调节剂化合物可单独或与调节乳腺癌中其它关键途径的其它药物组合用于治疗特征在于ESR1基因中的一个或多个突变的激素抗性ER阳性乳腺癌，所述其它途径包括但不限于抑制IGF1R、EGFR、Erb-B2、Erb-B3、PI3K/AKT/mTOR途径、HSP90、PARP、细胞周期蛋白依赖性激酶(即CDK4/6)、VEGF受体或组蛋白脱乙酰酶的那些途径。在一些实施方案中，本申请公开的ER调节剂化合物可单独或与用于治疗乳腺癌的其它药物组合用于治疗特征在于ESR1基因中的一个或多个突变的激素抗性ER阳性乳腺癌，所述其它药物包括但不限于，芳香酶抑制剂、蒽环类抗生素、铂类、氮芥、烷化剂、紫杉烷、核苷类似物、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR途径抑制剂、CDK 4/6抑制剂、HER-2抑制剂、EGFR抑制剂、聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、HSP90抑制剂、VEGFR抑制剂、AKT抑制剂和化学疗法。用于治疗乳腺癌的示例性药物包括但不限于，氟维司群、他莫昔芬、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、GDC-0032、GDC-0068、戈舍瑞林、亮丙瑞林、雷洛昔芬、托瑞米芬、乙酸甲地孕酮、巴多昔芬、顺铂、卡铂、卡培他滨、环磷酰胺、多西他赛、多柔比星、表柔比星、艾日布林、非格司亭、氟尿嘧啶、吉西他滨、伊沙匹隆、LEE011、LY2835219、米托蒽醌、甲氨蝶呤、紫杉醇、帕米膦酸、长春瑞滨、非格司亭(pegfilgrastim)、帕妥珠单抗、曲妥单抗、拉帕替尼、依维莫司、贝伐单抗、坦西莫司及它们的组合，以及本申请所述的其它药物。用于治疗乳腺癌的其它非限制性示例性药物在本申请他处提供。

在一些实施方案中，本发明涉及本申请所述的雌激素受体调节剂化合物，其用于治疗本申请所述的ER相关疾病或病症。

在一些实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含用于治疗本申请所述的ER相关疾病或病症的本申请所述的雌激素受体调节剂化合物和一种或多种药用赋形剂。

在一些实施方案中，本发明涉及本申请所述的雌激素受体调节剂化合物在制备用于治疗本申请所述的ER相关疾病或病症的药物中的用途。

在一些实施方案中，本发明涉及本申请所述的雌激素受体调节剂化合物用于治疗本申请所述的ER相关疾病或病症的用途。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗患者的ER相关疾病或病症的方法，其包括给予本申请所述的雌激素受体调节剂化合物。

附图说明

图1和2示出不存在E2(炔雌醇)的情况下在诱导表达野生型(WT)和突变型ERα的MCF7中的ERα降解测定。在含有100ng/ml Dox(多柔比星)的缺乏雌激素(estrogen-depleted)的培养基中将细胞用增加剂量的氟维司群(图1)处理24小时。用来自表1的雌激素受体调节剂(ERM)1-3(图1)和ERM 4-23(图2)而非他莫昔芬(图2)，观察到突变的ERa降解。由PR和细胞周期蛋白D1水平证明功能输出。

图3示出一组7只携带MCF-7EF1:Y537S ESR1-突变体(Y537S)的免疫受损小鼠中历时28天的拟合肿瘤体积变化：每日一次PO(口服)给予媒介物，以高剂量200mg/kg给予氟维司群；AUC约20-30x临床暴露以上，以及100mg/kg/天来自表1的雌激素受体调节剂(ERM)1-3和100mg/kg/天来自表4的ERM 4-23。

图4示出一组5只携带包含ESR1L536P突变体的HCI-005乳腺肿瘤(NOD.SCID OVX中的BC PDX模型)异种移植物(ER+,PR+,HER2+)的免疫受损小鼠中历时40天的拟合肿瘤体积变化：每日一次PO(口服)给予媒介物(+)、媒介物(-)，以60mg/kg/天给予他莫昔芬，以200mg/kg(QD 3x/wk)给予氟维司群，以100mg/kg/天给予ERM 1-3，以及以100mg/kg/天给予ERM4-23。媒介物(+)为含有炔雌醇(0.1mg/kg)的溶剂/缓冲液。媒介物(-)为不含有炔雌醇的溶剂/缓冲液。

图5示出一组7只携带包含ESR1L536P突变体的HCI-005乳腺肿瘤(NOD.SCID OVX中的BC PDX模型)异种移植物(ER+,PR+,HER2+)的免疫受损小鼠中具有Fold Over Start的历时56天的拟合肿瘤体积变化：每日一次PO(口服)给予媒介物(+E2)、媒介物(-E2)，以60mg/kg/天给予他莫昔芬，以200mg/kg(QD 3x/wk)给予氟维司群，以100mg/kg/天给予ERM 1-3，以及以100mg/kg/天给予ERM 4-23。媒介物(+E2)为含有炔雌醇(0.1mg/kg)的溶剂/缓冲液。媒介物(-E2)为不含有炔雌醇的溶剂/缓冲液。

图6示出一组7-8只携带WHIM 20Y537S ESR1-突变体(Y537S)、PIK3CA突变体(E542K)乳腺肿瘤(NOD.SCID OVX中的BC PDX模型)异种移植物的免疫受损小鼠中历时35天的拟合肿瘤体积变化：每日一次PO(口服)给予媒介物(+E2)、媒介物(-E2)，以60mg/kg/天给予枸橼酸他莫昔芬，以50mg/kg给予氟维司群，以100mg/kg/天给予ERM 1-3，以及以100mg/kg/天给予ERM 4-23。

图7示出一组7只携带WHIM 20Y537S ESR1-突变体(Y537S)、PIK3CA突变体(E542K)乳腺肿瘤(NSG OVX中的BC PDX模型)异种移植物的免疫受损小鼠中历时28天的拟合肿瘤体积变化：每日一次PO(口服)给予媒介物(+E2)、媒介物(-E2)，以200mg/kg每周三次皮下给予氟维司群，以100mg/kg/天给予ERM 1-3，以及以10和100mg/kg/天给予ERM 4-23。

图8和9示出携带WHIM 20Y537S ESR1-突变体(Y537S)、PIK3CA突变体(E542K)乳腺肿瘤、患者衍生的(BC PDX模型)异种移植物模型的免疫受损小鼠中ERα(alpha)与肌动蛋白水平的比率(图8)以及PR-A与肌动蛋白水平的比率(图9)的条形图：所述模型历时4天每日一次PO(口服)给予100微升(μl)媒介物，以200mg/kg给予氟维司群，以100mg/kg给予ERM 1-3，以及以100mg/kg给予ERM 4-23。

图10示出乳腺癌患者在基线、治疗前(左侧)和以600mg/天连续每日口服给予ERM1-3(ARN-810)一个月后(右侧)的[¹⁸F]FES-PET图像，其中在给予后23小时采集图像。确认患者具有含ESR1D538G突变的软组织损害。

定义

除非另有定义，否则本申请使用的所有技术和科学术语具有与所要求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。除非另有说明，否则在本申请的整个公开内容中提及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GENBANK序列、网站和其它公开的材料通过引用整体并入。在本申请中存在术语的多个定义的情况下，以本部分中的定义为准。在参考URL或其它这样的标识符或地址时，应当理解，这样的标识符可以改变，并且互联网上的特定信息可为不定的，但是等效信息是已知的并且可容易地访问，诸如通过搜索互联网和/或适当的数据库。有关参考文献证明这种信息的可用性和公开传播。通常，细胞培养、细胞感染、抗体生产和分子生物学方法的操作是本领域常用的方法。这样的标准技术可在例如参考手册诸如Sambrook et al.(2000)和Ausubel et al.(1994)中找到。

除非上下文另有明确指示，否则本申请使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。在本申请中，除非另有特别说明，单数的使用包括复数。如本申请所用，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其它形式(例如，“包含”、“含有”和“涵盖”)的使用是非限制性的。

本申请使用的范围和量可表示为“约”特定值或范围。约还包括确切量。因此，“约5μg”意指“约5μg”也指“5μg”。通常，术语“约”包括预期在实验误差内的量。

本申请使用的“雌激素受体多肽”或“ER多肽”是指任何雌激素受体蛋白或多肽，包括但不限于，重组产生的蛋白、合成产生的蛋白、天然雌激素受体蛋白质和从细胞或组织提取的雌激素受体蛋白。ER多肽包括来自不同物种的相关多肽，包括但不限于人源和非人源的动物。非人源的ER多肽包括但不限于，非人灵长类动物(例如黑猩猩和猿)、鼠科动物(例如，小鼠和大鼠)、犬科动物(狗)、猫科动物(猫)、兔属动物(兔)、禽类(鸟)、牛科动物(牛)、绵羊类(绵羊)、猪类(猪)、马科动物(马)、鱼类(鱼)、蛙科动物(蛙)和其它哺乳动物或非哺乳动物ER多肽。示例性ER多肽包括例如SEQ ID NO:2。ER多肽包括野生型ER、等位基因变体同工型、体细胞突变(包括在肿瘤中发现的那些)、来自核酸的合成分子、从人组织和细胞分离的蛋白质以及它们的经修饰形式。本申请提供的ER多肽可通过缺失、添加或取代一个或多个氨基酸来修饰一级氨基酸序列，从而得到进一步修饰。本申请使用的ER蛋白包括ER多肽的单体和二聚体形式，包括ER-α和ER-β多肽的二聚体形式(例如，ER-α(αα)或ER-β(ββ)同二聚体或ERαβ(αβ)异二聚体)。

本申请使用的“突变的雌激素受体”或“突变型ER”是指与野生型ER相比通过缺失、添加或取代一个或多个氨基酸来修饰一级氨基酸序列从而得到修饰的任何雌激素受体蛋白或多肽。在一些实施方案中，突变型ER包括突变型ER多肽和野生型多肽的异二聚体。在一些实施方案中，突变雌激素受体(ER)包含两种突变型ER多肽的同二聚体。

本申请使用的术语“调节”意指直接或间接与靶标相互作用从而改变靶标的活性，包括(仅举例来说)增强靶标的活性、抑制靶标的活性、限制靶标的活性或者扩展靶标的活性。

本申请使用的术语“调节剂”是指直接或间接与靶标相互作用的分子。所述相互作用包括但不限于，激动剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂、降解剂或它们的组合的相互作用。在一些实施方案中，调节剂是拮抗剂。本申请使用的雌激素受体(ER)调节剂是与雌激素受体(例如，ER-α)相互作用的分子。在一些实施方案中，调节剂是降解剂。

本申请使用的“选择性雌激素受体调节剂”或“SERM”是指差异性调节不同组织中的雌激素受体活性的分子。例如，在一些实施方案中，SERM在一些组织中展现ER拮抗剂活性，且在其它组织中展现ER激动剂活性。在一些实施方案中，SERM在一些组织中展现ER拮抗剂活性，在其它组织中展现最小ER激动剂活性或无该活性。在一些实施方案中，SERM在乳腺组织、卵巢组织、子宫内膜组织和/或子宫颈组织中展现ER拮抗剂活性，但在子宫组织中展现最小ER激动剂活性或无该活性。在一些实施方案中，SERM展现ER降解性质。在一些实施方案中，SERM在一些组织中展现ER降解性质，而在其它组织中没有ER降解性质。在一些实施方案中，SERM展现ER降解和ER拮抗剂性质。在一些实施方案中，SERM在一些组织中展现ER降解和ER拮抗剂性质，但在其它组织中展现ER降解性质而无ER激动剂活性。在一些实施方案中，SERM在一些组织中展现ER降解和ER拮抗剂性质，但在其它组织中展现ER拮抗剂性质而无ER降解性质。在一些实施方案中，SERM在乳腺组织、卵巢组织、子宫内膜组织和/或子宫颈组织中展现ER降解和ER拮抗剂性质，但在子宫组织中展现最小或没有ER降解和/或ER拮抗剂性质。

本申请使用的术语“拮抗剂”是指结合核激素受体并随后降低激动剂诱导的核激素受体转录活性的小分子药物。

本申请使用的术语“激动剂”是指不存在已知激动剂的情况下结合核激素受体并随后提高核激素受体转录活性的小分子药物。

本申请使用的术语“反相激动剂”是指不存在已知激动剂的情况下结合核激素受体并随后降低核激素受体转录活性的基础水平的小分子药物。

本申请使用的术语“降解剂”是指结合核激素受体并随后降低所述受体的稳态蛋白水平的小分子药物。在一些实施方案中，本申请所述的降解剂降低稳态雌激素受体水平至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。

本申请使用的术语“选择性雌激素受体降解剂”或“SERD”是指优先结合雌激素受体而非其它受体并随后降低稳态雌激素受体水平的小分子药物。

本申请使用的术语“ER依赖性”是指不存在雌激素受体的情况下不会发生或不会以相同程度发生的疾病或病症。

本申请使用的术语“ER介导的”是指不存在雌激素受体的情况下不会发生但可在存在雌激素受体时发生的疾病或病症。

本申请使用的术语“ER敏感性”是指不存在雌激素的情况下不会发生或不会以相同程度发生的疾病或病症。

本申请使用的术语“癌症”是指倾向于以不受控制的方式增殖的细胞的异常生长，并且在一些情况下是指转移(扩散)。癌症的类型包括但不限于，处于有或无转移的疾病的任何阶段的实体瘤，诸如膀胱肿瘤、肠肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、子宫内膜肿瘤、心脏肿瘤、肾肿瘤、肺肿瘤、子宫肿瘤、淋巴组织肿瘤(淋巴瘤)、卵巢肿瘤、胰腺或其它内分泌器官肿瘤(甲状腺肿瘤)、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤(黑色素瘤或基底细胞癌)或血液肿瘤(诸如白血病和淋巴瘤)。在一些实施方案中，所述癌症是癌(例如，腺癌)或肉瘤。

癌症的其它非限制性实例包括急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌(骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑干胶质瘤、脑肿瘤、脑和脊髓肿瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、胚胎肿瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤家族肿瘤、眼癌、成视网膜细胞瘤、胆囊癌、胃部(胃)癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、胃肠道间质细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞肿瘤(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、伯基特淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、间皮瘤、口腔癌(mouth cancer)、慢性骨髓性白血病、骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌(oral cancer)、口咽癌、骨肉瘤、骨的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、乳头状瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、中间分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumor)、垂体瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、成胸膜肺细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌症、肉瘤、尤文肉瘤家族肿瘤、肉瘤、卡波西肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃部(胃)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌(throat cancer)、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、维尔姆斯瘤。

本申请使用的术语“乳腺癌”是指组织学或细胞学证实的乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌为癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌为腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌为肉瘤。

术语“局部晚期乳腺癌”是指已经从在乳房开始的地方扩散到附近组织或淋巴结，而不是扩散到身体的其它部分的癌症。

术语“转移性乳腺癌”是指已经从乳房扩散到身体的其它部分的癌症，诸如骨、肝、肺或脑。转移性乳腺癌也称为IV期乳腺癌。

本申请使用的术语“共同给予”等意在涵盖向单个患者给予所选择的治疗剂，并且旨在包括其中通过相同或不同的给予途径或在相同或不同的时间给予所述药物的治疗方案。

本申请使用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指待给予的药物或化合物的足够量，其将在一定程度上缓解待治疗的疾病或病症的一种或多种症状。所述结果包括减少和/或减轻疾病的体征、症状或原因，或生物系统的任何其它期望的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是包含本申请公开的化合物的组合物的量，其需要提供疾病症状的临床显著降低。在任何个别情况下，任选地使用技术诸如剂量递增研究来确定合适的“有效”量。

本申请使用的术语“治疗”(“treat”、“treating”或“treatment”)包括缓解、减轻或改善疾病或病症的至少一种症状，预防另外的症状，抑制疾病或病症，例如预防性和/或治疗性地阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、延迟病症的进展、缓解由疾病或病症引起的病症或停止疾病或病症的症状。在一些实施方案中，治疗包括延长无进展存活期。在一些实施方案中，治疗包括与其它治疗选择相比降低疾病进展的相对风险。在一些实施方案中，其它治疗选择包括但不限于激素治疗(例如，抗雌激素疗法，诸如他莫昔芬和/或氟维司群或芳香酶疗法)。

术语“无进展存活”是在疾病(诸如癌症)的治疗期间和之后患者带病生活但其并未恶化的时间的量。在临床试验中，测量无进展存活期是一种查看治疗产生效果好坏的方式。

术语“无转移存活”或“MFS”是指研究中在没有癌症扩散持续确定的时间段或死亡的情况下存活的受试者的百分比。MFS通常以研究中由治疗开始的时间报告。对于个体或研究群体报道MFS。在一些实施方案中，无转移存活的增加为约1个月、约2个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约10个月、约11个月、约12个月、约13个月、约14个月、约15个月、约16个月、约17个月、约18个月、约19个月、约20个月或多于20个月。

本申请使用的术语“药物组合”意指由多于一种活性成分混合或组合产生的产品且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”意指活性成分，例如式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物和共药物(co-agent)，以单一实体或剂量的形式同时给予于患者。术语“非固定组合”意指活性成分，例如式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物和共药物，作为单独的实体同时、共同或先后给予患者，而没有特定的中间时间限制，其中所述给予在患者体内提供有效水平的两种化合物。后者也适用于混合疗法(cocktail therapy)，例如三种或更多种活性成分的给予。

本申请公开的化合物的“代谢物”是当化合物被代谢时形成的该化合物的衍生物。术语“活性代谢物”是指化合物代谢时形成的化合物的生物活性衍生物。本申请使用的术语“代谢”是指特定物质被生物体改变的过程(包括但不限于水解反应和酶催化的反应)的总和。因此，酶可对化合物产生特定的结构改变。例如，细胞色素P450催化多种氧化和还原反应，而二磷酸尿苷葡糖醛酸转移酶催化经活化的葡糖醛酸分子转移至芳族醇、脂族醇、羧酸、胺和游离巯基。任选地通过以下方式鉴定本申请公开的化合物的代谢物：向宿主给予化合物并分析来自宿主的组织样品，或使化合物与肝细胞在体外孵育并分析所得化合物。

本申请使用的术语“药用的”是指不消除本申请所述的ER抑制剂化合物的生物活性或性质的物质(例如，载体或稀释剂)，并且相对无毒(即，将所述物质给予个体而不引起不期望的生物效应或以有害方式与包含它的组合物的任何组分相互作用)。

本申请使用的“对照”是指与测试样品基本相同的样品，除了其不用测试参数处理，或者如果其为血浆样品，则其可来自未受所研究的病症侵袭的正常志愿者。对照也可为内部对照。

本申请使用的术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用。上述术语均不被解释为需要医疗专业人员(例如，医生、护士、医生助理、护理员、临终关怀工作者(hospiceworker))的监督。本申请使用的受试者可为任何动物，包括哺乳动物(例如，人或非人动物，例如，黑猩猩、猿、猴、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、犬、猫、大鼠、小鼠、豚鼠等)和非哺乳动物。在本申请提供的方法和组合物的一个实施方案中，所述哺乳动物是人。

术语“连续每日给药方案”是指没有任何休药期的每天给予雌激素受体调节剂或其药用盐。在一些实施方案中，连续每日给药方案包括在每天大致相同的时间每天给予雌激素受体调节剂或其药用盐。

“烷基”是指脂族烃基。烷基部分可为支链或直链。“烷基”基团可具有1至6个碳原子(每当在本申请出现时，数值范围诸如“1至6”是指给定范围内的每个整数；例如，“1至6个碳原子”意指烷基可由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至并包括6个碳原子组成，但是本定义也涵盖没有指定数值范围的术语“烷基”的出现)。在一个方面，烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基等。在一些实施方案中，烷基的1个或更多个氢原子被1个或多个氘原子替代。

“烷氧基”是指(烷基)O-基团，其中烷基如本申请所定义。

术语“芳族”是指具有包含4n+2个π电子的离域π电子系统的平面环，其中n为整数。芳族为任选取代的。术语“芳族的”包括碳环芳基(“芳基”，例如，苯基)和杂环芳基(或“杂芳基”或“杂芳族”)基团(例如吡啶)。该术语包括单环或稠环多环(即，共享相邻碳原子对的环)基团。

术语“碳环”是指其中形成环骨架的原子均为碳原子的环或环系。因此，该术语使碳环区别于其中环骨架含有至少一个不同于碳的原子的杂环。

本申请使用的术语“芳基”是指芳族环，其中形成环的每个原子为碳原子。在一个方面，芳基为苯基或萘基。在一个方面，芳基为苯基。在一个方面，芳基为C₆-C₁₀芳基。在一些实施方案中，芳基的1个或多个氢原子被1个或多个氘原子替代。

术语“环烷基”是指环状脂族烃基。环烷基包括具有3至10个环原子的基团。在一些实施方案中，环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。在一个方面，环烷基是C₃-C₆环烷基。

术语“卤代”或“卤素”或“卤化物”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。在一些实施方案中，卤素是F或Cl。在一些实施方案中，卤素为F。

术语“氟烷基”是指其中一个或多个氢原子被氟原子替代的烷基。在一些实施方案中，氟烷基为氟C₁-C₆烷基。在一些实施方案中，氟烷基为单氟烷基，其中烷基的一个氢原子被氟原子替代。在一些实施方案中，氟烷基为二氟烷基，其中烷基的两个氢原子被氟原子替代。在一些实施方案中，氟烷基为三氟烷基，其中烷基的三个氢原子被氟原子替代。在一些实施方案中，氟烷基为单氟烷基，二氟烷基或三氟烷基。在一些实施方案中，单氟烷基为-CH₂F、-CHF₂、-CF₃、-CHFCH₃、-CH₂CH₂F、-CH₂CHF₂、-CH₂CF₃、-CH₂CH₂CF₃、-CH₂CH₂CH₂CF₃、-CHCH₃CF₃、-CH(CF₃)₂或-CF(CH₃)₂。

术语“杂环”或“杂环的”是指在一个或多个环中含有一至四个杂原子的杂芳族环(也称为杂芳基)和杂环烷基环(也称为杂脂环基)，其中在所述环中的每个杂原子选自O、S和N，其中在其环系中的每个杂环基团具有3至10个原子，并且条件是任何环不含有两个相邻的O或S原子。非芳族杂环基团(也称为杂环烷基)包括在其环系中仅具有3个原子的基团，但芳族杂环基团在其环系中必须具有至少5个原子。杂环基团包括苯并稠合环系。3元杂环基团的实例是氮杂环丙基。4元杂环基团的实例是氮杂环丁基。5元杂环基团的实例是噻唑基。6元杂环基的实例是吡啶基，且10元杂环基的实例是喹啉基。非芳族杂环基团的实例为吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、噁唑烷酮基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫吗啉基、噻噁烷基、哌嗪基、氮杂环丙基、氮杂环丁基、氧杂环丁基、硫杂环丁基、高哌啶基、氧杂环庚基、硫杂环庚基、氧氮杂基、二氮杂基、硫氮杂基、1,2,3,6-四氢吡啶基、吡咯啉-2-基、吡咯啉-3-基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧杂环戊基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫杂环戊基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂二环[3.1.0]己基、3-氮杂二环[4.1.0]庚基、3H-吲哚基和喹嗪基。芳族杂环基团的实例为吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、二氮杂萘基和呋喃并吡啶基。当可能时，前述基团可为C-附接的(或C-连接的)或N-附接的。例如，衍生自吡咯的基团可为吡咯-1-基(N-附接的)或吡咯-3-基(C-连接的)。此外，衍生自咪唑的基团可为咪唑-1-基或咪唑-3-基(均为N-附接的)或咪唑-2-基、咪唑-4-基或咪唑-5-基(均为C-附接的)。杂环基团包括苯并稠合环系。

术语“杂芳基”是指包括一个或多个选自氮、氧和硫的环杂原子的芳基。单环杂芳基包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基和呋咱基。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有0-3个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有1-3个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有0-3个N原子、0-1个O原子，和0-1个S原子。在一些实施方案中，单环杂芳基为5元或6元杂芳基。

“杂环烷基”或“杂脂环基”是指其中环烷基的至少一个碳原子被氮(未经取代或经取代的，例如，-NH-、-NR^e-)、氧(-O-)或硫(例如-S-、-S(＝O)-或-S(＝O)₂-)取代的环烷基。所述基团可与芳基或杂芳基稠合。在一些实施方案中，所述杂环烷基选自噁唑烷酮基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫吗啉基、哌嗪基和二氢吲哚基。术语杂脂环还包括碳水化合物的所有环形式，包括但不限于单糖、二糖和寡糖。在一个方面，杂环烷基为C₂-C₁₀杂环烷基。在另一方面，杂环烷基为C₄-C₁₀杂环烷基。在一些实施方案中，杂环烷基在环中含有0-2个N原子。在一些实施方案中，杂环烷基在环中含有0-2个N原子、0-2个O原子和0-1个S原子。

术语“任选取代的”或“经取代的”意指所述基团可取代有一个或多个单独和独立地选自以下的额外基团：烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳基氧基、烷基硫基、芳基硫基、烷基亚砜、芳基亚砜、烷基砜、芳基砜、氰基、卤素、硝基、卤代烷基、氟烷基、氟烷氧基和氨基(包括单取代和二取代的氨基)及其经保护的衍生物。在一些实施方案中，任选的取代基独立地选自卤素、-CN、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-OH、-CO₂H、-CO₂烷基、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-S(＝O)₂NH₂、-S(＝O)₂NH(烷基)、-S(＝O)₂N(烷基)₂烷基、环烷基、氟烷基、杂烷基、烷氧基、氟烷氧基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳基氧基、烷基硫基、芳基硫基、烷基亚砜、芳基亚砜、烷基砜和芳基砜。在一些实施方案中，任选的取代基独立地选自卤素、-CN、-NH₂、-OH、-NH(CH₃)、-N(CH₃)₂、-CH₃、-CH₂CH₃、-CF₃、-OCH₃和-OCF₃。在一些实施方案中，取代基取代有一个或两个前述基团。在一些实施方案中，脂族碳原子(非环状或环状、饱和或不饱和的碳原子，不包括芳族碳原子)上的任选取代基包括氧代(＝O)。

用于诊断和治疗的示例性雌激素受体突变体

在一些实施方案中，本申请提供的诊断方法包括检测ESR1基因中的一个或多个突变。在一些实施方案中，本申请提供的方法包括治疗具有ESR1基因中的一个或多个突变的患者。用于诊断和治疗的示例性ESR1突变包括，但不限于核苷酸插入、缺失或取代。在一些实施方案中，所述突变为导致编码的ER多肽中氨基酸的取代的核苷酸取代(即，错义突变)。在一些实施方案中，所述突变为导致编码的ER多肽中氨基酸的插入和/或一个或多个氨基酸的取代的核苷酸插入。在一些实施方案中，所述突变为导致编码的ER中的氨基酸缺失和/或一个或多个氨基酸的取代的核苷酸缺失。在一些实施方案中，所述突变为导致杂合ER多肽的基因组易位，其中ER多肽的一个或多个结构域与另一蛋白或其部分融合。在一些实施方案中，所述突变为导致截短的ER多肽(即，无义突变)的核苷酸插入、缺失或取代。在一些实施方案中，ESR1突变导致编码的突变ER-α多肽的活性增加。在一些实施方案中，所述突变赋予编码的突变ER-α多肽的配体非依赖性激活。在一些实施方案中，所述突变导致组成性激活的突变ER-α多肽。在一些实施方案中，所述突变型ER-α在不存在雌二醇的情况下展现组成性活性。在一些实施方案中，所述ESR1突变增加了ESR1基因产物的表达(即，增加野生型ER-α多肽的表达)。

在一些实施方案中，所述突变导致在选自以下的位置具有氨基酸替换的ER多肽：SEQ ID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555。在一些实施方案中，所述突变导致在选自以下的位置具有氨基酸替换的ER多肽：SEQ ID NO:2的氨基酸位置380、463、534、535、536、537和538。在一些实施方案中，所述突变导致具有选自以下的氨基酸替换的ER多肽：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些实施方案中，所述患者具有两个或更多个ESR1基因中的突变。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的6位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为H6Y取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的编码H6的密码子中的C16T取代(例如，CAC至TAC)。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的118位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为S118P取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的编码S118的密码子中的T352C取代(例如，TCG至CCG)。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的269位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为R269C取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的编码R269的密码子中的C805T取代(例如，CGC至TGC)。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的311位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为T311M取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的C932T取代。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的341位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为S341L取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的C1022T取代。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起在SEQ ID NO:2的氨基酸G344和L345之间的氨基酸插入的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸插入为C氨基酸。在一些实施方案中，所述错义突变为SEQ ID NO:l的核苷酸1032和1033之间核苷酸GCT的插入。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的350位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为A350E取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的C1049A取代。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的380位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为E380Q取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的编码E380的密码子中的G1138C取代(例如，GAA至CAA)。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的392位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为V392I取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的编码V392的密码子中的G1174A取代(例如，GTC至ATC)。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的394位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为R394H取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的G1181A取代。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起在SEQ ID NO:2的413位结束的截短蛋白的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸截短为Q414*突变，归因于引入终止密码子的核苷酸序列中的突变。在一些实施方案中，所述突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的C1240T取代。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的433位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为S433P取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的T1297C取代。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的463位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为S463P取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的编码S463的密码子中的T1387C取代(例如，TCC至CCC)。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的503位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为R503W取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的C1507T取代。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的534位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为V534E取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的编码V534的密码子中的T1601A取代(例如，GTG至GAG)。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的535位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为P535H取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的编码P535的密码子中的C1604A取代(例如，CCC至CAC)。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的536位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为L536R取代。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为L536P取代。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为L536Q取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的编码L536的密码子中的T1607A取代和C1608A取代(例如，CTC至CAA)。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的537位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为Y537N取代。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为Y537C取代。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为Y537S取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的T1609A取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的A1610G取代。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的538位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为D538G取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的A1613G取代。

在一些实施方案中，所述ESR1突变包括引起SEQ ID NO:2的555位氨基酸替换的ESRl基因中的错义突变。在一些实施方案中，所述氨基酸替换为R555C取代。在一些实施方案中，所述错义突变为根据SEQ ID NO:l的核苷酸序列的编码R555的密码子中的C1663T取代(例如，CGT至TGT)。

在一些实施方案中，所述ESRl突变为ESRl基因的配体结合域中的缺失。在一些实施方案中，所述ESRl突变为3个或更多个核苷酸的框内缺失(in frame deletion)。在一些实施方案中，所述突变为一个或多个ESR1外显子中3个或更多个核苷酸的框内缺失。在一些实施方案中，所述突变为ESR1基因的外显子8、9、10、11或12中3个或更多个核苷酸的框内缺失。在一些实施方案中，所述ESRl突变为根据SEQ ID NO:1的1046-1051核苷酸(TGGCAG)的6个核苷酸缺失，其导致349-351位氨基酸(LAD)的缺失和在SEQ ID NO:2的ER多肽的349位氨基酸处插入H。

在一些实施方案中，ESR1基因中的错义突变导致SEQ ID NO:2的选自以下的一个或多个氨基酸替换：在6位组氨酸至酪氨酸取代(H6Y)；在118位丝氨酸至脯氨酸取代(S118P)；在269位精氨酸至半胱氨酸取代(R269C)；在311位苏氨酸至甲硫氨酸取代(T311M)；在341位丝氨酸至亮氨酸取代(S341L)；在350位丙氨酸至谷氨酰胺取代(A350E)；在380位谷氨酸至谷氨酰胺取代(E380Q)；在392位缬氨酸至异亮氨酸取代(V392I)；在394位精氨酸至组氨酸取代(R394H)；在414位谷氨酰胺取代，例如，插入至终止密码子(Q414*)；在433位丝氨酸至脯氨酸取代(S433P)；在463位丝氨酸至脯氨酸取代(S463P)；在503位精氨酸至色氨酸取代(R503W)；在534位缬氨酸至谷氨酸取代(V534E)；在535位脯氨酸至组氨酸取代(P535H)；在536位亮氨酸至精氨酸取代536(L536R)；在536位亮氨酸至脯氨酸取代(L536P)；在536位亮氨酸至谷氨酰胺取代(L536Q)；在537位酪氨酸至天冬酰胺取代(Y537N)；在537位酪氨酸至半胱氨酸取代(Y537C)；在537位酪氨酸至丝氨酸取代(Y537S)；在538位天冬氨酸至甘氨酸取代(D538G)；在555位精氨酸至半胱氨酸取代(R555C)。

在一些实施方案中，所述ESRl突变为导致ER-YAP1融合蛋白的ESR1基因与Yes激活蛋白1(YAP1)基因之间的基因组易位。

在一些实施方案中，所述ESRl基因包含两个或更多个突变。在一些实施方案中，所述ESRl基因包含在铰链结构域和/或配体结合域中的两个或更多个突变。

雌激素受体调节剂化合物

本申请提供了用于治疗具有ESR1基因突变的受试者的雌激素受体调节剂(ERM)化合物。在一些实施方案中，雌激素受体调节剂化合物为式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物，其包括它们的药用盐、溶剂化物、N-氧化物、代谢物和前药。

在一个方面，用于本申请所述方法和组合物的雌激素受体调节剂化合物为式(A)化合物或其药用盐或溶剂化物：

其中，

R^a为-CO₂H或选自以下的5元杂环：

R^b为C₁-C₆烷基或C₃-C₆环烷基；

R^c为H或F；

每个R^d独立地选自H、卤素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每个R^e独立地选自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

每个R^f独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

X为CH或N；

n为0、1或2。

在一些实施方案中，R^a为-CO₂H。在一些实施方案中，R^a为选自以下的5元杂环：

在一些实施方案中，R^c为H。在一些实施方案中，R^c为F。

在一些实施方案中，R^b为-CH₃、-CH₂CH₃、环丙基或环丁基。在一些实施方案中，R^b为-CH₂CH₃。在一些实施方案中，R^b为环丁基。

在一些实施方案中，X为CH。在一些实施方案中，X为N。

在一些实施方案中，n为1或2。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，n为0。

在一些实施方案中，每个R^d独立地选自H、F、Cl、-CN、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-S(＝O)₂CH₃、-CH₃、-CH₂H₃和-CF₃。在一些实施方案中，每个R^d独立地选自H、F、Cl、-CN、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-CH₃、-CH₂H₃和-CF₃。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为式(A)化合物或其药用盐或溶剂化物，其中R^a为-CO₂H，R^b为C₁-C₆烷基，R^c为H，每个R^d独立地选自卤素，X为CH；且n为2。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为式(A)化合物或其药用盐或溶剂化物，其中R^a为-CO₂H，R^b为乙基，R^c为H，每个R^d独立地选自F和Cl，X为CH；且n为2。

在一些实施方案中，式(A)的雌激素受体调节剂化合物或其药用盐或溶剂化物具有以下式(A-1)的结构：

在一些实施方案中，式(A)的雌激素受体调节剂化合物或其药用盐或溶剂化物为表1所述的化合物：

表1.

在另一方面，用于本申请所述方法和组合物的雌激素受体调节剂化合物为式(B)化合物或其药用盐或溶剂化物：

其中，

R^a为-CO₂H或选自以下的5元杂环：

环C为

环D为苯基或噻吩基；

每个R^d独立地选自H、卤素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每个R^e独立地选自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

每个R^f独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

n为0、1或2。

在一些实施方案中，环C为

在一些实施方案中，环C为

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，R^a为-CO₂H。

在一些实施方案中，n为1或2。

在一些实施方案中，n为1。

在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，n为0。

在一些实施方案中，每个R^d独立地选自H、F、Cl、-CN、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-S(＝O)₂CH₃、-CH₃、-CH₂H₃和-CF₃。

在一些实施方案中，每个R^d独立地选自H、F、Cl、-CN、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-CH₃、-CH₂H₃和-CF₃。

在一些实施方案中，式(B)的雌激素受体调节剂化合物或其药用盐或溶剂化物为表2所述的化合物：

表2.

在再一个方面，用于本申请所述方法和组合物的雌激素受体调节剂化合物为式(C)化合物或其药用盐或溶剂化物：

其中，

R^a为-CO₂H或选自以下的5元杂环：

R^b为C₁-C₆烷基或C₃-C₆环烷基；

每个R^d独立地选自H、卤素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每个R^e独立地选自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

每个R^f独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

n为0、1或2。

在一些实施方案中，R^a为-CO₂H。

在一些实施方案中，R^b为-CH₃、-CH₂CH₃、环丙基或环丁基。

在一些实施方案中，R^b为-CH₂CH₃。

在一些实施方案中，R^b为环丁基。

在一些实施方案中，n为1或2。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，n为0。

在一些实施方案中，每个R^d独立地选自H、F、Cl、-CN、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-S(＝O)₂CH₃、-CH₃、-CH₂H₃和-CF₃。

在一些实施方案中，每个R^d独立地选自H、F、Cl、-CN、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-CH₃、-CH₂H₃和-CF₃。

在一些实施方案中，式(C)的雌激素受体调节剂化合物或其药用盐或溶剂化物具有式(C-1)的结构：

在一些实施方案中，式(C)的雌激素受体调节剂化合物或其药用盐或溶剂化物为表3所述的化合物：

表3.

在另一方面，用于本申请所述方法和组合物的雌激素受体调节剂化合物为式(D)化合物或其药用盐或溶剂化物：

其中，

R¹为H、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

R²为H、F、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

R³为H、卤素、-CN、-OR⁶、-NHR⁶、-NR⁶R⁷、-SR⁶、-S(＝O)R⁷、-S(＝O)₂R⁷、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

每个R⁴独立地选自H、卤素、-CN、-OH、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₄烷基、氟C₁-C₄烷氧基和C₁-C₄烷氧基；

每个R⁵为H、F、Cl、-OH、-CH₃、-CF₃或-OCH₃；

每个R⁶独立地选自H、-C(＝O)R⁷、-C(＝O)OR⁷、-C(＝O)NHR⁷、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

每个R⁷独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、经取代的或未经取代的C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

n为0、1或2；且

t为1或2。

在一些实施方案中，R¹为H、-CH₃、-CH₂F、-CHF₂或-CF₃。

在一些实施方案中，每个R²独立地为F、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂F、-CHF₂、-CF₃、-CHFCH₃、-CH₂CH₂F、-CH₂CHF₂、-CH₂CF₃、-CH₂CH₂CF₃、-CH₂CH₂CH₂CF₃、-CHCH₃CF₃、-CH(CF₃)₂或-CF(CH₃)₂。在一些实施方案中，每个R²独立地为F、-CH₃、-CH₂F、-CHF₂或-CF₃。在一些实施方案中，每个R²独立地为-CH₃、-CH₂F、-CHF₂或-CF₃。在一些实施方案中，每个R²独立地为-CH₂F。在一些实施方案中，每个R²独立地为-CH₃。

在一些实施方案中，t为1。在一些实施方案中，t为2。

在一些实施方案中，R³为-OR⁶。在一些实施方案中，R³为-OH。

在一些实施方案中，每个R⁴独立地选自H、F、Cl、-OH、-CH₃、-CF₃或-OCH₃。

在一些实施方案中，每个R⁵独立地选自H和F。

在一些实施方案中，每个R⁶独立地选自H、-C(＝O)R⁷、-C(＝O)OR⁷、-C(＝O)NHR⁷、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基和经取代的或未经取代的苯基。在一些实施方案中，每个R⁶为H。

在一些实施方案中，每个R⁷独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基和经取代的或未经取代的苯基。

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，为 或

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，式(D)的雌激素受体调节剂化合物或其药用盐或溶剂化物具有以下式(D-1)的结构：

在一些实施方案中，式(D)的雌激素受体调节剂化合物或其药用盐或溶剂化物具有以下式(D-2)的结构：

在一些实施方案中，式(D)的雌激素受体调节剂化合物或其药用盐或溶剂化物具有以下式(D-3)的结构：

在一些实施方案中，式(D)的雌激素受体调节剂化合物或其药用盐或溶剂化物具有以下式(D-4)的结构：

在一些实施方案中，式(D)的雌激素受体调节剂化合物或其药用盐或溶剂化物具有以下式(D-5)的结构：

在一些实施方案中，式(D)的雌激素受体调节剂化合物或其药用盐或溶剂化物具有以下式(D-6)的结构：

在一些实施方案中，为

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为式(D)化合物、式(D-1)化合物或式(D-3)化合物或其药用盐或溶剂化物，其中R¹为H，R²为氟C₁-C₄烷基，R³为H，R⁴为-OH，R⁵为H，R⁶为H，n为1，t为1。

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为式(D)化合物、式(D-1)化合物或式(D-3)化合物或其药用盐或溶剂化物，其中R¹为H，R²为-CH₂F，R³为H，R⁴为-OH，R⁵为H，R⁶为H，n为1，t为1。

在一些实施方案中，式(D)的雌激素受体调节剂化合物或其药用盐或溶剂化物为表4所述的化合物：

表4.

雌激素受体调节剂化合物的其它形式

在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂化合物用作药用盐。药用盐的类型包括但不限于：(1)酸加成盐，其通过使化合物的游离碱形式与药用无机酸反应形成盐，诸如，例如，盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、偏磷酸盐等；或与药用有机酸反应形成盐，诸如，例如乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、环戊烷丙酸盐、乙醇酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸盐、肉桂酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、1,2-乙二磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、2-萘磺酸盐、4-甲基二环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸盐、葡庚糖酸盐、4,4'-亚甲基二-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)盐、3-苯基丙酸盐、三甲基乙酸盐、叔丁基乙酸盐、月桂基硫酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、羟基萘甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、粘康酸盐、丁酸盐、苯乙酸盐、苯丁酸盐、丙戊酸盐等；(2)当存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替时形成的盐，所述金属离子例如，碱金属离子(例如锂盐、钠盐或钾盐)，碱土金属离子(例如镁盐或钙盐)或铝离子(例如铝盐)。在一些情况下，本申请所述的化合物可与有机碱配位形成盐，诸如但不限于乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、氨基丁三醇盐、N-甲基葡糖胺盐、二环己胺盐或三(羟基甲基)甲胺盐。在其它情况下，本申请所述的化合物可与氨基酸形成盐，诸如但不限于精氨酸盐、赖氨酸盐等。用于与包含酸性质子的化合物形成盐的可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。

应当理解的是，提及药用盐包括溶剂加成形式。溶剂化物含有化学计量或非化学计量量的溶剂，并且可在与药用溶剂诸如水、乙醇等的结晶过程中形成。当溶剂是水时形成水合物，或当溶剂是醇时形成醇化物。本申请所述的化合物的溶剂化物可方便地在本申请所述的操作中制备或形成。此外，本申请提供的化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在。

在一些实施方案中，本申请所述的雌激素受体调节剂化合物可包含一个或多个立体中心。应当理解的是，当存在立体中心时，所述立体中心可以R构型或S构型画出。除非画出立体中心的具体构型，否则本申请所述的化合物意在包括所有这些可能的立体化学构型(即外消旋形式，R构型、S构型)。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低突变型ER的活性。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低野生型ER的活性。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低突变型ER-α的活性，所述突变型ER-α具有一种野生型ER-α多肽和一种突变型ER-α多肽(即，异二聚体)。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低突变型ER-α的活性，所述突变型ER-α具有两种突变型ER-α多肽(即，同二聚体)。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低细胞中突变型ER-α的活性，所述细胞表达野生型和突变型ER-α两者(即，异源表达)。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低细胞中野生型ER-α的活性，所述细胞表达野生型和突变型ER两者。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低细胞中突变型ER-α的活性，所述细胞仅表达突变型ER-α(即，同源表达)。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低ER的活性，所述ER在选自以下的位置具有氨基酸替换：SEQ ID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555位。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低ER的活性，所述ER具有选自以下的氨基酸替换：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物拮抗突变型ER。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物拮抗野生型ER。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物拮抗突变型ER-α，所述突变型ER-α具有一种野生型ER-α多肽和一种突变型ER-α多肽(即，异二聚体)。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物拮抗突变型ER-α，所述突变型ER-α具有两种突变型ER-α多肽(即，同二聚体。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物拮抗细胞中突变型ER-α，所述细胞表达野生型和突变型ER-α两者(即，异源表达)。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物拮抗细胞中的野生型ER-α，所述细胞表达野生型和突变型ER。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物拮抗细胞中突变型ER-α，所述细胞仅表达突变型ER-α(即，同源表达)。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物拮抗ER，所述ER在选自以下的位置具有氨基酸替换：SEQ IDNO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物拮抗ER，所述ER具有选自以下的氨基酸替换：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低突变型ER的细胞浓度。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低野生型ER的细胞浓度。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低突变型ER-α的细胞浓度，所述突变型ER-α具有一种野生型ER-α多肽和一种突变型ER-α多肽(即，异二聚体)。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低突变型ER-α的细胞浓度，所述突变型ER-α具有两种突变型ER-α多肽(即，同二聚体)。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低细胞中突变型ER-α的细胞浓度，所述细胞表达野生型和突变型ER-α两者(即，异源表达)。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低细胞中野生型ER-α的细胞浓度，所述细胞表达野生型和突变型ER两者。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低细胞中突变型ER-α的细胞浓度，所述细胞仅表达突变型ER-α(即，同源表达)。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低ER的细胞浓度，所述ER在选自以下的位置具有氨基酸替换：SEQID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐或N-氧化物降低的细胞浓度ER，所述ER具有选自以下的氨基酸替换：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。

式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物、其药用盐或N-氧化物用作治疗或预防疾病或病症的药物，其中雌激素和/或雌激素受体的作用涉及疾病或病症的病因或病理学或有助于疾病或病症的至少一种症状，并且其中雌激素和/或雌激素受体的这种作用是不期望的。在一些实施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物为雌激素受体拮抗剂。在一些实施方案中，本申请公开的化合物为选择性雌激素受体降解剂化合物(SERD)。在一些实施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物为雌激素受体拮抗剂以及雌激素受体降解剂。在一些实施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物展现最小的雌激素受体激动剂活性或没有该活性。在一些实施方案中，在治疗癌症的背景下，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物提供改善的治疗活性，其特征在于完全或持续较长时间的肿瘤消退、较低的发生率或对治疗发展抗性的发生率和/或肿瘤侵袭力的减少。在一些实施方案中，本申请公开的化合物为雌激素受体降解剂，其展现完全的雌激素受体拮抗剂活性且具有可忽略的或最小的雌激素受体激动剂活性。在一些实施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物为具有组织特异性ER性质的选择性雌激素受体调节剂(SERM)。

诊断性和治疗性方法

在某些实施方案中，本申请描述的是针对使用雌激素受体调节剂的疗法选择患者的方法。在一些实施方案中，所述雌激素受体调节剂为式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物。在一些实施方案中，所述方法包括确定患者是否具有ESR1基因中的突变。在一些实施方案中，所述患者具有ER介导的疾病或病症。在一些实施方案中，所述患者具有癌症。在一些实施方案中，所述患者具有乳腺癌。在一些实施方案中，所述患者具有ER+乳腺癌。在一些实施方案中，所述患者具有激素抗性乳腺癌。在一些实施方案中，所述患者具有激素抗性ER+乳腺癌。在一些实施方案中，所述患者在激素疗法后展现疾病进展。在一些实施方案中，所述患者在抗雌激素疗法后展现疾病进展。在一些实施方案中，所述乳腺癌不适合具有治愈意图的切除或放射疗法。在一些实施方案中，所述乳腺癌在针对雌激素受体阳性乳腺癌的至少6个月激素疗法后进展。在一些实施方案中，所述乳腺癌先前在使用氟维司群的疗法存在的情况下进展。在一些实施方案中，所述乳腺癌先前在使用芳香酶抑制剂的疗法存在的情况下进展。在一些实施方案中，所述乳腺癌先前在使用阿那曲唑、来曲唑或依西美坦的疗法存在的情况下进展。

在一些实施方案中，针对使用式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂的疗法选择具有激素抗性雌激素受体(ER)阳性乳腺癌的患者的方法包括：a)确定所述患者是否具有ESR1基因中的突；和b)若所述患者具有突变，则针对疗法选择患者。在一些实施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂为选择性雌激素受体降解剂(SERD)。在一些实施方案中，所述突变导致具有选自以下位置的氨基酸替换的ER多肽：SEQ ID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555。在一些实施方案中，所述突变导致具有选自以下的氨基酸替换的ER多肽：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些实施方案中，所述患者具有ESR1基因中的两种或更多种突变。在一些实施方案中，所述突变为导致ER-YAP1融合多肽的易位。

在一些实施方案中，所述患者在激素疗法后展现疾病进展。在一些实施方案中，所述患者在抗雌激素疗法后展现疾病进展。在一些实施方案中，所述乳腺癌不适合具有治愈意图的切除或放射疗法。在一些实施方案中，所述乳腺癌在针对雌激素受体阳性乳腺癌的至少6个月激素疗法后进展。在一些实施方案中，所述乳腺癌先前在使用氟维司群的疗法存在的情况下进展。在一些实施方案中，所述乳腺癌先前在使用芳香酶抑制剂的疗法存在的情况下进展。在一些实施方案中，所述乳腺癌先前在使用阿那曲唑、来曲唑或依西美坦的疗法存在的情况下进展。

在一些实施方案中，确定所述患者是否具有ESR1基因中的突变的方法包括测试含有一种或多种肿瘤细胞的样品。在一些实施方案中，所述样品是肿瘤活检样品或流体样品(例如血液或淋巴样品)。在一些实施方案中，所述样品包含一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)。因此，在一些实施方案中，在含有一种或多种肿瘤细胞的样品中评估ESR1的突变状态。在一些实施方案中，在含有一种或多种CTC的样品中评估ESR1基因的突变状态。在一些实施方案中，含有一种或多种循环肿瘤细胞的样品由患者分离。在一些实施方案中，所述患者具有乳腺癌。在一些实施方案中，所述患者具有ER阳性乳腺癌。在一些实施方案中，所述患者具有转移性乳腺癌。在一些实施方案中，所述患者先前已用一种或多种抗癌剂治疗。在一些实施方案中，所述患者先前已用一种或多种激素疗法治疗。在一些实施方案中，针对存在或不存在一种或多种ESR1突变测定所述CTC。在一些实施方案中，所述ESR1突变赋予编码的ER多肽的配体非依赖性活性。在一些实施方案中，确定了导致在选自以下位置具有氨基酸替换的ER多肽的ESR1突变：SEQ ID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555。在一些实施方案中，确定了导致具有选自以下的氨基酸替换的ER多肽的ESR1突变：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些实施方案中，确定了作为导致ER-YAP1融合多肽的易位的突变。

在一些实施方案中，测定含有一种或多种肿瘤细胞的样品存在或不存在一种或多种额外的基因突变。在一些实施方案中，测定含有一种或多种肿瘤细胞的样品存在或不存在一种或多种选自以下基因中的突变的额外基因突变：BRCA1、BRCA2、CDH1、STK11、TP53、PIK3CA、PTEN、EGFR(ERBB1)、HER2(ERBB2)、AR、ATM、BARD1、BRIP1、CHEK2、DIRAS3、ERBB2、NBN、PALB2、RAD50和RAD51。

在一些实施方案中，编码ER的核酸分离自含有一种或多种肿瘤细胞的样品。在一些实施方案中，编码ER的核酸分离自循环肿瘤细胞。

在一些实施方案中，确定样品中具有一种或多种ESR1基因中突变的肿瘤细胞的百分比。在一些实施方案中，基于具有一种或多种ESR1基因中突变的肿瘤细胞的百分比确定治疗性诊断。

在一些实施方案中，确定样品中具有一种或多种ESR1基因中突变的CTC的百分比。在一些实施方案中，基于具有一种或多种ESR1基因中突变的CTC的百分比确定治疗性诊断。

在一些实施方案中，从患者中分离后，将含有一种或多种肿瘤细胞的样品体外培养。在一些实施方案中，在测定存在或不存在一种或多种ESR1突变之前，将含有一种或多种肿瘤细胞的样品体外培养。

在一些实施方案中，从患者中分离后，将含有一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)的样品体外培养。在一些实施方案中，在测定存在或不存在一种或多种ESR1突变之前，将循环肿瘤细胞(CTC)体外培养。

在一些实施方案中，随时间推移监测患者的ESR1突变状态。在一些实施方案中，在癌症治疗的过程中监测患者的ESR1突变状态。在一些实施方案中，在癌症治疗的过程中一次或多次评估患者的ESR1突变状态。在一些实施方案中，每周、每两周、每三周、每四周、每月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月、每年、每两年、每三年、每四年、每五年或更长时间周期评估患者的ESR1突变状态。

本申请提供的化合物的活性可使用本领域公知的标准方法测定，包括但不限于体外测定诸如报道分子测定、结合测定和细胞存活力测定，或体内测定包括异种移植物肿瘤动物模型。

在一些实施方案中，肿瘤样品来自生物体的任何组织或流体。样品包括但不限于全血、抽离的骨髓、骨髓穿刺液、胸膜液、腹膜液、中枢脊液、腹腔液、胰液、脑脊液、脑液、腹水、心包液、尿液、唾液、支气管灌洗液、汗液、眼泪、耳流、痰、脑积液、精液、经液(vaginalflow)、乳、羊水以及呼吸道、肠道或泌尿生殖道的分泌物。在具体实施方案中，所述样品为肿瘤活检样品。在具体实施方案中，所述样品来自作为淋巴系统或循环系统的一部分或与淋巴系统或循环系统相关联的流体或组织。在一些实施方案中，所述样品为血液样品，其为静脉、动脉、周围组织或脐带血样品。在具体实施方案中，所述样品为血清样品。在一些实施方案中，所述样品含有一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)。在一些实施方案中，所述样品含有一种或多种播散性肿瘤细胞(DTC，例如在一个实施方案中为骨髓穿刺液样品)。

分离来自包含在组织和流体样品中的细胞的核酸和蛋白质的方法是本领域公知的。在具体实施方案中，从受试者获得的核酸样品分离自包含在来自受试者的肿瘤活检中的细胞。在具体实施方案中，从受试者获得的核酸样品分离自骨髓穿刺液中的细胞。在具体实施方案中，从受试者获得的核酸样品分离自包含在血液样品中的细胞。在具体实施方案中，从受试者获得的核酸样品分离自包含在淋巴液样品中的细胞。在一些实施方案中，所述细胞为循环肿瘤细胞(CTC)。

在一些实施方案中，通过使用公知和常规临床方法获得样品的任何合适方法从受试者获得样品。用于从受试者获得流体样品的操作是公知的。例如，用于抽取和处理全血和淋巴的操作是公知的，并且可用于获得在所提供的方法中使用的样品。通常，为了收集血液样品，向样品中添加抗凝血剂(例如EDTA或柠檬酸盐和肝素或CPD(柠檬酸盐、磷酸盐、葡萄糖)或类似物质)以防止血液凝结。在一些实例中，将血液样品收集在含有一定量EDTA的收集管中，以防止血液样品的凝结。

在一些实施方案中，所述样品为组织活检并且例如通过针吸活检、CT引导的针吸活检、穿刺活检、内窥镜活检、支气管镜活检、支气管灌洗、切口活检、切除活检、钻取活检、剃刮活检、皮肤活检、骨髓活检和电套圈外科切除操作(Loop Electrosurgical ExcisionProcedure,LEEP)获得。通常，获得非坏死、无菌活检或样本，其大于100mg，但可更小，诸如小于100mg、50mg或更小，10mg或更小或5mg或更小；或更大，诸如大于100mg、200mg或更大，或500mg或更大，1g或更大，2g或更大，3g或更大，4g或更大或5g或更大。待提取用于测定的样品大小取决于许多因素，包括但不限于待进行的测定数目、组织样品的健康状况、癌症的类型和患者的状况。在一些实施方案中，将组织置于无菌容器(诸如无菌管或培养板)中，并任选地浸没在适当介质中。通常，通过本领域公知的机械方法和/或酶处理将细胞解离成细胞悬浮液。通常，收集细胞，然后进行标准操作以分离用于测定的核酸。

在一些实施方案中，在规律的间隔获得样品，诸如一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、四周、一个月，两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、每天、每周、每月、每季、每年两次或每年。在一些实施方案中，样品的收集在相对于用一种或多种抗癌剂治疗的预定时间或规律的间隔进行。在一些实施方案中，样品的收集在相对于用激素疗法治疗的预定时间或规律的间隔进行。例如，在治疗之前、期间或之后或在连续治疗之间以预定时间或以规律的间隔收集样品。在具体的实例中，在给予抗癌疗法之前从受试者获得样品，然后在实施治疗之后在规律的间隔再次获得样品。在具体的实例中，在给予激素治疗之前从受试者获得样品，然后在实施治疗之后在规律的间隔再次获得样品。

流体样品的体积可为适于在所提供的方法中检测ER突变体的任何体积。在一些实例中，流体样品的体积取决于所使用的特定测定方法。例如，特定的测定方法可需要更大或更小的流体样品体积，这取决于以下因素，诸如但不限于所使用的装置或方法的容量和测定方法的通量水平。在一些实例中，在应用测定方法之前，将流体样品在适当的培养基中稀释。在一些实例中，从受试者获得流体样品，并且在测定方法中使用样品的一部分或等分试样。在应用测定方法之前，可将所述部分或等分试样在适当的培养基中稀释。

在一些实施方案中，样品获自受试者，其为哺乳动物。示例性哺乳动物受试者包括但不限于灵长类动物，诸如人、猿和猴；啮齿类动物，诸如小鼠、大鼠、兔和雪貂；反刍动物，诸如山羊、牛、鹿和绵羊；马、猪、狗、猫和其它动物。在一些实施方案中，所述样品获自患者。在一些实施例中，所述患者为人类患者。

在一些实施方案中，获自受试者的核酸样品为基因组核酸样品。在一些实施方案中，获自受试者的核酸样品为RNA样品。在一些实施方案中，mRNA分离自RNA样品中的全RNA。在一些实施方案中，所述RNA样品逆转录至cDNA。在一些实施方案中，所述基因组核酸样品通过核酸扩增方法扩增。在一些实施方案中，所述核酸扩增方法为聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施方案中，所述基因组核酸样品使用一组对ER基因具有特异性的核苷酸引物扩增。在一些实施方案中，该组核苷酸引物侧面具有编码ER多肽的突变的氨基酸位置的核酸序列。在一些实施方案中，所述扩增产物为编码ER多肽的突变的氨基酸位置的核酸。在一些实施方案中，序列特异性引物与可检测分子，诸如荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记、可检测底物或结合第二可检测分子的肽或分子缀合。

在一些实施方案中，所述样品为含有循环肿瘤DNA(ctDNA)、RNA(ctRNA)或微RNA的血浆或血清样品(参见例如Chan et al.(2007)Br J Cancer 96(5):681-5)。在一些实施方案中，所述核酸在检测之前由样品分离。

检测方法

在一些实施方案中，测定包括测序所述核酸样品。在一些实施方案中，核酸样品中编码ER的核酸首先通过诸如聚合物酶链式反应(PCR)的方法使用序列特异性引物扩增，然后测序扩增后的PCR片段。用于本申请提供的方法的示例性测序方法是本领域公知的，并且包括但不限于双脱氧或链终止方法、Maxam-Gilbert测序、大规模平行签名测序(或MPSS)、Polony测序、焦磷酸测序、Illumina染料测序、SOLiD(或通过连接测序)测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、Heliscope测序和单分子实时(SMRT)测序。

在一些实施方案中，编码突变型ER-α的DNA通过BEAMing(珠子、扩增、乳液、磁性)PCR测序方法评估(参见，例如Li et al.(2006)Nat Methods 3(2):95-7；Li et al.(2006)Nat Methods 3(7):551-9；和Diehl et al.(2008)Nat Med.14(9):985–990)。BEAMing是这样的技术，其中单个DNA分子附着至油包水型乳剂中的磁珠，然后进行区室化PCR扩增。然后通过与突变型或野生型ER的荧光等位基因特异性探针杂交来确定与珠子结合的DNA的突变状态。然后使用流式细胞术来定量存在于血浆或血清中的突变型DNA的水平(参见例如Higgins et al.(2012)Clin Cancer Res 18:3462-3469)。

在一些实施方案中，编码突变型ER-α的DNA通过核酸样品的克隆扩增评估。在一些实施方案中，编码突变型ER-α的DNA通过数字聚合酶链式反应评估。在一些实施方案中，编码突变型ER-α的DNA通过液滴数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chainreaction)评估。

在一些实施方案中，对用于检测存在编码突变型ER-α的DNA的样品进行测定，其包括用序列特异性寡核苷酸探针检测突变，所述序列特异性寡核苷酸探针对编码突变型ER-α而非野生型ER的核酸具有特异性。在一些实施方案中，测定包括(a)使样品与突变型ER-α核酸序列特异性寡核苷酸探针接触，其中若样品中存在突变性核酸序列，则形成探针-DNA复合物，和(b)检测探针-DNA复合物。在一些实施方案中，将序列特异性探针与可检测分子缀合，诸如荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记、可检测底物或结合第二可检测分子的肽或分子。

在一些实施方案中，单核苷酸变化可通过以下方式检测：使用基于PCR的切割扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS)标记物进行PCR，其在突变序列中产生限制性位点(Michaels et al(1998)Plant J.14(3):381-5)或附接至可检测部分的序列特异性发卡探针，所述可检测部分诸如但不限于荧光团(Mhlanga andMalmberg(2001)Methods 25:463-471)。在一些实施方案中，将序列特异性探针与可检测分子缀合，诸如荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记、可检测底物或结合第二可检测分子的肽或分子。

在一些实施方案中，对用于检测存在编码突变型ER-α的DNA的样品进行测定，其使用寡核苷酸阵列进行(参见例如Hastia et al.(1999)J Med Genet.36(10):730-6)。在一些实施方案中，含有来自受试者的核酸的样品直接杂交至芯片。在一些实施方案中，含有来自受试者的核酸的样品使用扩增方法扩增，所述扩增方法诸如但不限于聚合酶链式反应(PCR)，并且扩增后的核酸杂交至芯片。在一些实施方案中，所述寡核苷酸阵列包含在微芯片上。在一些实施方案中，单核苷酸变化可使用微芯片检测。

在一些实施方案中，测定样品包括用针对突变型ER-α多肽具有特异性的抗体检测突变。在一些实施方案中，检测突变型ER-α多肽的方法包括从受试者获得样品，其中所述样品包含ER多肽，以及通过使样品与抗体接触来测试样品是否存在突变型ER-α多肽，所述抗体对结合突变型ER-α多肽具有特异性，而不结合野生型ER-α多肽或以降低的亲和力结合野生型ER-α多肽，其中突变型ER-α多肽的存在产生抗体-突变型ER-α多肽复合物。在一些实施方案中，所述方法还包括检测抗体-突变型ER-α多肽复合物。在一些实施方案中，所述方法还包括用检测试剂检测抗体-突变型ER-α多肽复合物。在一些实施方案中，所述突变型ER-α特异性抗体与可检测分子缀合，诸如荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记、可检测底物或结合第二可检测分子的肽或分子(例如二级抗体)。在一些实施方案中，通过测定可检测分子来检测突变型ER-α特异性抗体的结合。在一些实施方案中，通过使用二级抗体(例如抗-IgG)检测突变型ER-α特异性抗体的结合。在一些实施方案中，所述样品是肿瘤活检样品、骨髓穿刺液、血液样品、血清样品或淋巴样品。

雌激素受体调节剂体外活性

雌激素受体调节剂(ERM)化合物(其包括但不限于表1-4中的那些)的组合的细胞毒性和抑制细胞活性通过以下方式测量：在细胞培养基中建立增殖的哺乳动物肿瘤细胞系，添加测试化合物，将所述细胞培养约6小时至约5天的时间；并测量细胞存活力(实施例7)。使用基于细胞的体外测定法测量存活力，即增殖(IC₅₀)、细胞毒性(EC₅₀)和诱导凋亡(半胱天冬酶激活)。

ERM化合物的体外效力通过实施例7的细胞增殖测定(可从Promega Corp.,Madison,WI商购获得的发光细胞存活力测定)来测量。该均相测定方法基于鞘翅目(Coleoptera)荧光素酶的重组表达(US 5583024；US 5674713；US 5700670)，并基于存在的ATP(代谢活性细胞的指示剂)的定量来确定培养物中存活细胞的数量(Crouch etal(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；US 6602677)。以96或384孔格式进行测定，使其适合于自动化高通量筛选(HTS)(Cree et al(1995)AntiCancerDrugs 6:398-404)。均相测定操作包括将单一试剂(试剂)直接添加到在补充有血清的培养基中培养的细胞中。不需要细胞清洗、去除培养基和多次移液步骤。在添加试剂和混合后的10分钟内，系统在384孔格式中检测到少至15个细胞/孔。

通过针对肿瘤细胞系的测定(实施例7)测量ERM化合物的组合的抗增殖作用。建立测试化合物和组合的EC₅₀值。体外细胞效能活性的范围可为约100nM至约10μM。

雌激素受体调节剂体内肿瘤异种移植物活性

通过在啮齿类动物中植入癌细胞的同种异体移植物或异种移植物并用药物和对照(媒介物)制剂处理荷瘤动物，体内测量ERM化合物和各种化学治疗剂的功效。结果取决于细胞系、肿瘤细胞中存在或不存在某些突变、ERM化合物和化疗剂的给予顺序、给予方案和其它因素。用药物或对照(媒介物)处理受试小鼠，并监测数周或更长时间以测量肿瘤倍增时间、细胞杀灭对数值(log cell kill)和肿瘤抑制(实施例8)。图1-13显示根据实施例8的方案在对用ERM化合物和各种化疗剂处理的荷瘤小鼠处理后，肿瘤体积随时间变化的图。

图1和2示出不存在E2的情况下在诱导表达WT和突变型ERα的MCF7中的ERα降解测定。在含有100ng/ml Dox的缺乏雌激素的培养基中将细胞用增加剂量的氟维司群(图1)处理24小时。用来自表1的雌激素受体调节剂(ERM)1-3(图1)和ERM 4-23(图2)而非他莫昔芬(图2)，观察到突变的ERa降解。由PR和细胞周期蛋白D1水平证明功能输出。

图3示出一组7只携带MCF-7EF1:Y537S ESR1-突变体(Y537S)的免疫受损小鼠中历时28天的拟合肿瘤体积变化：每日一次PO(口服)给予媒介物，以高剂量200mg/kg给予氟维司群；AUC约20-30x临床暴露以上，以及100mg/kg/天来自表1的雌激素受体调节剂(ERM)1-3和100mg/kg/天来自表4的ERM 4-23。工程化MCF7突变型细胞表达相对于内源性野生型(WT)MCF7细胞而言4-5x以上的蛋白。氟维司群未显示强效的体内效能，甚至在30x临床暴露以上且不存在E2的情况下。

图4示出一组5只携带包含ESR1L536P突变体的HCI-005乳腺肿瘤(NOD.SCID OVX中的BC PDX模型)异种移植物(ER+,PR+,HER2+)的免疫受损小鼠中历时40天的拟合肿瘤体积变化：每日一次PO(口服)给予媒介物(+)、媒介物(-)，以60mg/kg/天给予他莫昔芬，以200mg/kg(QD 3x/wk)给予氟维司群，以100mg/kg/天给予ERM 1-3，以及以100mg/kg/天给予ERM 4-23。在该ESR1L536P突变体模型中，ERM 4-23比ERM 1-3具有更大效能。

图5示出一组7只携带包含ESR1L536P突变体的HCI-005乳腺肿瘤(NOD.SCID OVX中的BC PDX模型)异种移植物(ER+,PR+,HER2+)的免疫受损小鼠中具有Fold Over Start的历时56天的拟合肿瘤体积变化：每日一次PO(口服)给予媒介物(+E2)、媒介物(-E2)，以60mg/kg/天给予他莫昔芬，以200mg/kg(QD 3x/wk)给予氟维司群，以100mg/kg/天给予ERM 1-3，以及以100mg/kg/天给予ERM 4-23。

图6示出一组7-8只携带WHIM 20Y537S ESR1-突变体(Y537S)、PIK3CA突变体(E542K)乳腺肿瘤(NOD.SCID OVX中的BC PDX模型)异种移植物的免疫受损小鼠中历时35天的拟合肿瘤体积变化：每日一次PO(口服)给予媒介物(+E2)、媒介物(-E2)，以60mg/kg/天给予枸橼酸他莫昔芬，以50mg/kg给予氟维司群，以100mg/kg/天给予ERM 1-3，以及以100mg/kg/天给予ERM 4-23。

图7示出一组7只携带WHIM 20Y537S ESR1-突变体(Y537S)、PIK3CA突变体(E542K)乳腺肿瘤(NSG OVX中的BC PDX模型)异种移植物的免疫受损小鼠中历时28天的拟合肿瘤体积变化：每日一次PO(口服)给予媒介物(+E2)、媒介物(-E2)，以200mg/kg每周三次皮下给予氟维司群，以100mg/kg/天给予ERM 1-3，以及以10和100mg/kg/天给予ERM 4-23。

图8和9示出携带WHIM 20Y537S ESR1-突变体(Y537S)、PIK3CA突变体(E542K)乳腺肿瘤、患者衍生的(BC PDX模型)异种移植物模型的免疫受损小鼠中ERα(alpha)与肌动蛋白水平的比率(图8)以及PR-A与肌动蛋白水平的比率(图9)的条形图：所述模型历时4天每日一次PO(口服)给予100微升(μl)媒介物，以200mg/kg给予氟维司群，以100mg/kg给予ERM 1-3，以及以100mg/kg给予ERM 4-23。

图10示出乳腺癌患者在基线、治疗前(左侧)和以600mg/天连续每日口服给予ERM1-3(ARN-810)一个月后(右侧)的[¹⁸F]FES-PET图像，其中在给予后23小时采集图像。确认患者具有含ESR1D538G突变的软组织损害。

ERM 1-3和ERM 4-23证明在ER突变型乳腺癌异种移植模型中肿瘤退化至肿瘤生长延迟的抗肿瘤活性的范围。此外，ERM 1-3和ERM 4-23在其中来自患者的原发性或转移性肿瘤植入免疫受损小鼠的模型(也称为患者衍生的异种移植物模型)中是有效的。在患者衍生的异种移植物模型中观察到ERM 1-3和ERM 4-23的药效学活性，其基于降低的ER蛋白水平和孕酮受体水平的降低：ER靶基因。此外，在一个模型中，ERM 1-3和ERM 4-23比护理药物标准物(氟维司群或他莫昔芬)更有效，并且在其它模型中观察到改善的功效的趋势。

ER相关疾病或病症的治疗

在一些实施方案中，本申请提供了治疗具有一种或多种ESR1基因中的突变的患者的方法。在一些实施方案中，治疗包括对具有一种或多种ESR1基因中的突变的患者给予式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物。在一些实施方案中，所述突变导致具有选自以下的氨基酸替换的ER多肽：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些实施方案中，所述患者具有两种或更多种ESR1基因中的突变。在一些实施方案中，所述突变为导致ER-YAP1融合多肽的易位。在一些实施方案中，所述患者具有癌症。在一些实施方案中，所述患者具有实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、肺癌或膀胱癌。在一些实施方案中，所述癌症为乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症为雌激素阳性乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症为HER2阳性乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症为HER2阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症转移性癌症。在一些实施方案中，所述癌症为转移性乳腺癌。

在一些实施方案中，所述癌症为激素依赖性癌症。在一些实施方案中，所述癌症为雌激素受体依赖性癌症。在一些实施方案中，所述癌症为雌激素受体阳性癌症。在一些实施方案中，所述癌症为雌激素敏感性癌症。在一些实施方案中，所述癌症对抗激素治疗具有抗性。在一些实施方案中，所述癌症为对抗激素治疗具有抗性的雌激素敏感性癌症或雌激素受体依赖性癌症。在一些实施方案中，抗激素治疗包括用至少一种选自以下的药物治疗：他莫昔芬、氟维司群、类固醇芳香酶抑制剂和非类固醇芳香酶抑制剂。在一些实施方案中，抗激素治疗包括用阿那曲唑、来曲唑或依西美坦治疗。

在一些实施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治疗的患者为在抗雌激素疗法后具有疾病进展的妇女。在一些实施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治疗的患者为在用芳香酶抑制剂的疗法后具有疾病进展的妇女。在一些实施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治疗的患者为在用阿那曲唑、来曲唑或依西美坦的疗法后具有疾病进展的妇女。

在一些实施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治疗的患者为绝经后妇女。在一些实施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治疗的患者为在抗雌激素疗法后具有疾病进展的绝经后妇女。在一些实施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治疗的患者为在用芳香酶抑制剂的疗法后具有疾病进展的绝经后妇女。在一些实施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治疗的患者为在用阿那曲唑、来曲唑或依西美坦的疗法后具有疾病进展的绝经后妇女。

在一些实施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治疗的患者未经受化学疗法(chemotherapy-)。

在一些实施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治疗的患者正在用至少一种抗癌剂针对癌症进行治疗。在一个实施方案中，所述癌症为激素难治性癌症。

在一些实施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物用于治疗具有一种或多种ESR1突变的患者的ER相关疾病或病症。示例性ER相关疾病或病症包括但不限于与癌症(例如骨癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、卵巢癌和子宫癌)相关的ER-α功能障碍、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、平滑肌瘤(例如子宫平滑肌瘤)、中枢神经系统(CNS)缺陷(例如酒精中毒、偏头痛)、心血管系统缺陷(例如主动脉瘤、对心肌梗塞的易感性、主动脉瓣硬化、心血管疾病、冠状动脉疾病、高血压)、血液系统缺陷(例如深静脉血栓形成)、免疫和炎症疾病(例如格雷夫斯病、关节炎、多发性硬化、肝硬化)、感染易感性(例如乙型肝炎、慢性肝病)、代谢缺陷(例如骨密度、胆汁郁积、尿道下裂、肥胖、骨关节炎、骨质减少、骨质疏松)、神经缺陷(例如阿尔茨海默病、帕金森病、偏头痛、眩晕)、精神缺陷(例如神经性厌食、注意缺陷多动障碍(ADHD)、痴呆、重度抑郁症、精神病)和生殖缺陷(例如月经初潮年龄、子宫内膜异位症、不育症)。

本申请还提供了降低具有一种或多种ESR1突变的患者中ER激活的方法，包括向哺乳动物给予至少一种具有式(A)、(B)、(C)或(D)的结构的化合物或其药用盐或N-氧化物。在一些实施方案中，所述方法包括降低哺乳动物中乳腺细胞、卵巢细胞、结肠细胞、前列腺细胞、子宫内膜细胞或子宫细胞中的ER活化。在一些实施方案中，降低哺乳动物中ER激活的方法包括降低哺乳动物中雌激素与雌激素受体的结合。在一些实施方案中，降低哺乳动物中ER激活的方法包括降低哺乳动物中的ER浓度。

给药途径

本申请所述的雌激素受体调节剂化合物的合适的给药途径包括但不限于口服、肠胃外(例如、静脉内、皮下、肌肉内)、鼻内、经颊、局部、经直肠、气雾剂、眼部、肺部、透粘膜、透皮、阴道、耳部、经鼻和局部给予。此外，仅通过举例的方式，肠胃外递送包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射、以及鞘内、直接心室内、腹膜内、淋巴内和鼻内注射。在某些实施方案中，本申请所述的雌激素受体调节剂化合物以全身方式给予。在某些其它实施方案中，本申请所述的雌激素受体调节剂化合物以局部而非全身方式给予。在一些实施方案中，某些实施方案，本申请所述的雌激素受体调节剂化合物口服给予。

药物组合物/制剂

在一些实施方案中，如本申请所述的雌激素受体调节剂化合物被配制成药物组合物。药物组合物以常规方式使用一种或多种药用非活性成分配制，所述成分促进活性化合物加工成药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径。本申请所述药物组合物的概述可见于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,NineteenthEd(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.and Lachman,L.,Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Seventh Ed.(Lippincott Williams&Wilkins1999)，通过引用的方式将上述公开内容并入本申请。

本申请所用的药物组合物是指式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物与其它化学组分(即药用无活性成分)的混合物，所述其它化学组分诸如载体、赋形剂、粘合剂、填充剂、助悬剂、矫味剂、增甜剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、湿润剂、增塑剂、稳定剂、渗透增强剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或一种或多种它们的组合。药物组合物有助于向哺乳动物给予化合物。

药物组合物将包含至少一种式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐，其作为呈游离酸或游离碱形式或呈药用盐形式的活性成分。此外，本申请所述的方法和药物组合物包括使用N-氧化物(适当时)、结晶形式、无定形相以及具有相同类型活性的这些化合物的活性代谢物。在一些实施方案中，本申请所述的化合物以非溶剂化形式或以与药用溶剂诸如水、乙醇等的溶剂化形式存在。

本申请所述的药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固体溶液、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、粉剂、即时释放制剂、控制释放制剂、速溶制剂、片剂、胶囊剂、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、肠溶衣制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂和混合的即时释放和控制释放制剂。

在一些实施方案中，全身性给予所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐。

在一些实施方案中，口服给予所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐。所有用于口服给予的制剂都呈适于所述给药的剂量。在一些实施方案中，本申请公开的固体剂型呈片剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、固体分散体、固体溶液、生物可蚀性剂型、控制释放制剂、脉冲释放剂型、多颗粒剂型、珠粒、药丸(pellets)、颗粒剂的形式。在其它实施方案中，药物制剂呈粉末形式。在其它实施方案中，药物制剂呈片剂形式。在其它实施方案中，药物制剂呈悬浮片剂、速溶片剂、嚼崩(bite-disintegration)片剂、速崩片剂、泡腾片剂或囊片形式。在其它实施方案中，药物制剂呈胶囊剂形式。

在一些实施方案中，配制药物固体口服剂型以提供活性化合物的控制释放。控制释放特性包括例如持续释放、延长释放、脉冲释放和延迟释放性质。

在一个方面，用于口服给予的液体制剂剂型呈选自包括但不限于以下的水性混悬剂形式：药用水性口服分散体、乳剂、溶液、酏剂、凝胶剂和糖浆剂。参见，例如，Singh etal.,Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,2nd Ed.,pp.754-757(2002)。

对于经颊或舌下给予，组合物任选地采取以常规方式配制的片剂、锭剂或凝胶剂的形式。

在一个方面，将式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐配制成适于肌内、皮下或静脉内注射的药物组合物。肠胃外注射涉及推注(bolus injection)和/或连续输注。

在一些实施方案中，静脉内给予所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐。在一些实施方案中，皮下给予所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐。

在一些实施方案中，局部给予所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐。在所述实施方案中，将所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐配制成各种可局部给予的组合物，诸如溶液剂、悬浮剂、洗剂、凝胶剂、糊剂、洗发剂、擦洗剂、擦拭剂、涂抹剂、药棒、药用绷带、香膏剂、乳膏剂或软膏剂。在一些实施方案中，向哺乳动物的皮肤局部给予所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐。在一些实施方案中，将所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物制备成经皮剂型。

在另一方面，其为式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐在制备用于治疗其中雌激素受体的活性有助于疾病或病症的病理学和/或症状的疾病、障碍或病症(例如，特征在于ESR1基因中的突变的激素抗性癌症)的药物中的用途。在一个方面，所述疾病或病症为任何本申请所述的疾病或病症。

治疗有效量的雌激素受体调节剂或其药用盐可取决于疾病的严重度、受试者的年龄和相对健康以及其它因素而广泛变化。

给药和治疗方案

在一个实施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐用于制备治疗具有一种或多种ESR1突变包括从雌激素受体活性降低中获益的疾病或病症(例如，特征在于ESR1基因中的突变的激素抗性癌症)的药物。在需要所述治疗的哺乳动物中治疗本申请所述的任何疾病或病症的方法包括以治疗有效量向所述患者给予药物组合物，所述药物组合物包含至少一种式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐、N-氧化物、活性代谢物、前药或药用溶剂化物。

治疗有效量取决于疾病或病症的严重度和病程、先前疗法、患者的健康状况、体重和对药物的响应，以及治疗医师的判断。治疗有效量任选地通过包括但不限于剂量递增临床试验的方法来确定。

在本申请所述的任何治疗方法中，将所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物的有效量：(a)全身性给予于哺乳动物；和/或(b)口服给予于哺乳动物；和/或(c)静脉内给予于哺乳动物；和/或(d)通过注射给予于哺乳动物；和/或(e)局部给予于哺乳动物；和/或(f)非全身性或局部给予于哺乳动物。

在一些情况下，治疗方法包括单次给予有效量的化合物，包括另外的实施方案，其中(i)给予化合物一次；(ii)在一天的时间内多次向哺乳动物给予化合物；(iii)持续(continually)给予；或(iv)连续(continuously)给予。

在任意上述方面中是包括多次给予有效量的化合物的另外的实施方案，包括另外的实施方案，其中(i)连续或间歇给予化合物：如单剂量；(ii)多次给予之间的时间为每6小时；(iii)每8小时向哺乳动物给予化合物；(iv)每12小时向哺乳动物给予化合物；(v)每24小时向哺乳动物给予化合物。在进一步或备选的实施方案中，所述方法包括休药期，其中暂时中止所述化合物的给予或暂时减少所给予的化合物的剂量；在休药期结束时，恢复化合物的给药。在一个实施方案中，休药期的长度从2天到1年不等。

在其中患者的状况不改善的某些实施方案中，根据医生的判断，长期(即延长的时间)给予化合物。

在其中患者的状态改善的某些实施方案中，所给予的药物的剂量暂时减少或暂时中止一段时间(即，“休药期”)。

在一些实施方案中，成人治疗所采用的剂量范围通常为每日0.01mg-5000mg的式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物。在一个方面，成人治疗所采用的剂量范围通常为每日约1mg至约2000mg的式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物。在一个实施方案中，期望的剂量方便地以同时或以适当的间隔给予的单剂量或分开剂量存在，例如每日两次、三次、四次或更多次亚剂量。在一个实施方案中，适于本申请所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐的每日剂量为约0.01至约50mg/kg体重。

在一些实施方案中，向绝经后妇女口服给予雌激素受体调节剂或其药用盐。

在一些实施方案中，每天向所述患者给予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐。在一些实施方案中，每隔一天向所述患者给予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐。在一些实施方案中，每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次向所述患者给予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐。

在一些实施方案中，以连续每日给药方案向所述患者口服给予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐。

在一些实施方案中，向所述患者给予约5mg/天至约1000mg/天的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐。在一些实施方案中，向所述患者给予约10mg/天至约100mg/天的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐。

在一些实施方案中，向所述患者给予约10mg/天、约15mg/天、约20mg/天、约25mg/天、约30mg/天、约35mg/天、约35mg/天、约40mg/天、约45mg/天、约50mg/天、约55mg/天、约60mg/天、约65mg/天、约70mg/天、约75mg/天、约80mg/天、约85mg/天、约90mg/天、约100mg/天、约150mg/天、约200mg/天、约250mg/天、约300mg/天、约350mg/天、约400mg/天、约450mg/天、约500mg/天、约550mg/天、约600mg/天、约650mg/天、约700mg/天、约750mg/天、约800mg/天、850mg/天、约900mg/天、约950mg/天、约1000mg/天的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐。

在一些实施方案中，向所述患者给予约600mg/天的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐。

在一些实施方案中，向所述患者给予约1000mg/天的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐。

在一个实施方案中，期望的每日剂量方便地以同时(或在短时间内)或以适当的间隔给予的单剂量或分开剂量存在，例如作为每日两个、三个、四个或更多个亚剂量。在一些实施方案中，期望的每日剂量方便地以分开的剂量存在，所述剂量每日一次同时(或在短时间内)给予。在一些实施方案中，期望的日剂量方便地以分开的剂量提供，所述剂量以等份每日两次、每日三次或每日多于三次给予。

在一些实施方案中，向患者给予的期望每日量的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐每日给予一次。

在一些实施方案中，向患者给予的每日量的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐以均分剂量每日给予两次。

在一些实施方案中，向患者给予的每日量的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐以均分剂量每日给予三次。

在一些实施方案中，向患者给予的每日量的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐以均分剂量每日给予多于三次。

在其中未观察到患者中乳腺癌的状态改善的某些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐的每日剂量增加。在一些实施方案中，每日一次给药方案变为每日两次给药方案。在一些实施方案中，采用每日三次给药方案增加给予的雌激素受体调节剂或其药用盐的量。

在一些实施方案中，向处于禁食状态的患者给予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐。在一些实施方案中，向处于进食状态的患者给予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐。

在一些实施方案中，向患者给予的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂或其药用盐的量取决于以下因素而变化，诸如但不限于乳腺癌的情况和严重度及妇女的特征(identity)(例如，体重)。

18F-氟雌二醇(FES)是雌激素受体的特异性和选择性放射性示踪剂，其可通过对良好耐受剂量的新治疗剂的充分靶标结合进行非侵入性监测来辅助临床药物开发。在患有晚期或转移性ER+乳腺癌的妇女中，使用18F-FES的正电子发射断层扫描(PET)在多中心、I期、剂量探寻、安全性和药物动力学临床试验中用于验证雌激素受体靶标与ERM1-3的结合。图10显示了在基线、治疗前(左)和以600mg/日的连续口服每日给药药物制剂ERM 1-3一个月后(ARN-810)(右)的乳腺癌患者的[¹⁸F]FES-PET(氟雌二醇-正电子发射断层扫描)图像，其中在给药后23小时收集图像。患者被证实具有ESR1D538G突变的软组织损害。患者状态是部分响应。FES-PET/CT成功地证明了ERM1-3临床试验的靶标结合。临床试验中的其它患者与用ERM 1-3药物制剂的治疗显示出相似的响应。

组合疗法

在一些实施方案中，用于治疗具有一种或多种ESR1突变的患者的药物组合物还包含一种或多种选自以下的额外治疗活性剂：皮质类固醇、止吐剂、镇痛剂、抗癌剂、抗炎剂、激酶抑制剂、受体抑制剂、抗体、HSP90抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、免疫系统调节剂、PD-1抑制剂、聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂和芳香酶抑制剂。

在某些情况下，适当地给予至少一种式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与一种或多种额外治疗剂的组合。在某些实施方案中，药物组合物还包含一种或多种抗癌剂。

在一个具体的实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与第二治疗剂共同给予，其中式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐和第二治疗剂调节所治疗的疾病、障碍或病症的不同方面，从而提供比单独给予任一治疗剂更佳的总体益处。

在任何情况下，不考虑待治疗的疾病、障碍或病症，患者所经历的总体益处是两种治疗剂的累加效应，或者患者可经历协同益处。

在组合疗法中，多种治疗剂(其中之一是本申请所述的化合物之一)以任何顺序或甚至同时给予。如果同时给予，仅通过举例的方式，多种治疗剂以单一形式、统一形式或以多种形式提供(例如，作为单一丸剂或作为两种单独的丸剂)。

在一些实施方案中，治疗雌激素受体依赖性或雌激素受体介导的病症或疾病(诸如增殖性病症，包括癌症)的方法包括向哺乳动物给予式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐以及至少一种额外治疗剂。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与激素阻断治疗、化学疗法、放射疗法、手术、癌症疫苗、生物疗法或它们的组合组合给予。在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与肽、细胞因子、治疗性病毒、治疗性细菌、基因疗法、siRNA、过继性T细胞转移、抗体、单克隆抗体或它们的组合组合给予。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与芳香酶抑制剂、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR途径抑制剂、CDK 4/6抑制剂、HER-2抑制剂、EGFR抑制剂、PD-1抑制剂、聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、HSP90抑制剂、VEGFR抑制剂、AKT抑制剂、化学疗法或它们的任何组合组合给予。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与芳香酶抑制剂组合给予。在一些实施方案中，所述芳香酶抑制剂为阿那曲唑、来曲唑或依西美坦。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与CDK 4/6抑制剂组合给予。在一些实施方案中，所述CDK 4/6抑制剂为LEE011或LY283519。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR途径抑制剂组合给予。在一些实施方案中，所述磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR途径抑制剂为依维莫司、坦西莫司、BEZ235、BYL719、GDC0032、BKM120、BGT226、GDC0068、GDC-0980、GDC0941、INK128(MLN0128)、INK1117、MK-2206、OSI-027、CC-223、AZD8055、SAR245408、SAR245409、PF04691502、WYE125132、GSK2126458、GSK-2636771、BAY806946、PF-05212384、SF1126、PX866、AMG319、ZSTK474、Cal101、PWT33597、CU-906或CUDC-907。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂组合给予。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂为恩替司他(entinostat)或莫西司他(mocetinostat)。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与HER-2抑制剂组合给予。在一些实施方案中，所述HER-2抑制剂为曲妥单抗、帕妥珠单抗或TDM-1。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂组合给予。在一些实施方案中，所述EGFR抑制剂为拉帕替尼、吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔单抗(cetuximab)、卡奈替尼(canertinib)、帕尼单抗(panitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、OSI-632、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、MP-412、AEE-788、来那替尼(neratinib)、XL-647、达克替尼(dacomitinib)、AZD-8931、CUDC-101、AP-26113或CO-1686。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与抗血管生成剂组合给予。在一些实施方案中，所述抗血管生成剂为VEGFR抑制剂。在一些实施方案中，所述抗血管生成剂抑制多种激酶(例如，为多激酶靶向剂)。在一些实施方案中，所述抗血管生成剂为贝伐单抗、ABR-215050(他喹莫德(tasquinimod))、CHIR-258(多韦替尼(dovitinib))、EXEL-7647、OSI-930、BIBF-1120、BAY-73-4506、BMS-582664(布立尼布(brivanib))、RO-4929097、JNJ-26483327、AZD-2171(西地尼布(cediranib))、索拉非尼(sorafenib)、阿柏西普(aflibercept)、恩扎妥林(enzastaurin)、AG-013736(阿西替尼(axitinib))、GSK-786034(帕唑帕尼(pazopanib))、AP-23573或舒尼替尼(sunitinib)。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与抗-PD-1剂组合给予。在一些实施方案中，所述抗-PD-1剂为MK-3475、纳武单抗(Nivolumab)、MPDL3280A或MEDI4736。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与AKT抑制剂组合给予。在一些实施方案中，所述AKT抑制剂为GDC0068、MK-2206、AT7867、GSK2110183、GSK2141795或GSK690693。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与多柔比星、环磷酰胺、卡培他滨、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛和顺铂组合给予。

在一些实施方案中，与式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐组合使用的额外治疗剂包括一种或多种以下治疗剂：阿比特龙(abiraterone)；阿巴瑞克(abarelix)；阿霉素(adriamycin)；放线菌素(actinomycin)；阿维菌素(acivicin)；阿柔比星(aclarubicin)；盐酸阿考达唑(acodazole hydrochloride)；阿克罗宁(acronine)；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；阿仑单抗(alemtuzumab)；别嘌呤醇(allopurinol)；阿利维甲酸(alitretinoin)；六甲蜜胺(altretamine)；安波霉素(ambomycin)；乙酸阿美蒽醌(ametantrone acetate)；氨鲁米特(aminoglutethimide)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；氨磷汀(amifostine)；安吖啶(amsacrine)；阿那曲唑(anastrozole)；氨曲霉素(anthramycin)；阿瑞吡坦(aprepitant)；三氧化二砷(arsenictrioxide)；天冬酰胺酶(asparaginase)；曲林菌素(asperlin)；阿扎胞苷(azacitidine)；阿扎替派(azetepa)；阿佐霉素(azotomycin)；巴马司他(batimastat)；盐酸苯达莫司汀(bendamustine hydrochloride)；苯佐替哌(benzodepa)；贝伐单抗(bevacizumab)；贝沙罗汀(bexarotene)；比卡鲁胺(bicalutamide)；盐酸比生群(bisantrene hydrochloride)；二甲磺酸双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新(bizelesin)；博来霉素(bleomycin)；硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)；硼替佐米(bortezomib)；布喹那钠(brequinarsodium)；溴匹立明(bropirimine)；白消安(busulfan)；放线霉素C(cactinomycin)；卡芦睾酮(calusterone)；卡拉酰胺(caracemide)；卡贝替姆(carbetimer)；卡铂(carboplatin)；卡莫司汀(carmustine)；盐酸卡柔比星(carubicin hydrochloride)；卡折来新(carzelesin)；卡培他滨(capecitabine)；西地芬戈(cedefingol)；西妥昔单抗(cetuximab)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；西罗霉素(cirolemycin)；顺铂(cisplatin)；克拉屈滨(cladribine)；氯法拉滨(clofarabine)；甲磺酸克立那托(crisnatol mesylate)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；阿糖胞苷(cytarabine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；达沙替尼(dasatinib)；盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)；更生霉素(dactinomycin)；达贝泊汀α(darbepoetin alfa)；地西他滨(decitabine)；地加瑞克(degarelix)；地尼白介素毒素连接物(denileukin diftitox)；右奥马铂(dexormaplatin)；盐酸右雷佐生(dexrazoxane hydrochloride)；地扎呱宁(dezaguanine)；甲磺酸地扎呱宁(dezaguanine mesylate)；地吖醌(diaziquone)；多烯紫杉醇(docetaxel)；多柔比星(doxorubicin)；盐酸多柔比星(doxorubicinhydrochloride)；屈洛昔芬(droloxifene)；枸橼酸屈洛昔芬(droloxifene citrate)；丙酸倍他米松(dromostanolone propionate)；达佐霉素(duazomycin)；依达曲沙(edatrexate)；盐酸依氟鸟氨酸(eflornithine hydrochloride)；伊沙芦星(elsamitrucin)；艾曲波帕(eltrombopag olamine)；恩洛铂(enloplatin)；恩普氨酯(enpromate)；依匹哌啶(epipropidine)；盐酸表柔比星(epirubicinhydrochloride)；阿法依泊汀(epoetinalfa)；厄布洛唑(erbulozole)；盐酸厄洛替尼(erlotinib hydrochloride)；盐酸依索比星(esorubicin hydrochloride)；雌莫司汀(estramustine)；雌莫司汀磷酸钠(estramustinephosphate sodium)；依他硝唑(etanidazole)；依托泊苷(etoposide)；磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)；氯苯乙嘧胺(etoprine)；依维莫司(everolimus)；依西美坦(exemestane)；GDC0032；盐酸法倔佐(fadrozole hydrochloride)；法扎拉滨(fazarabine)；芬维甲胺(fenretinide)；非格司亭(filgrastim)；氟尿苷(floxuridine)；磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)；氟尿嘧啶(fluorouracil)；氟西他滨(flurocitabine)；磷喹酮(fosquidone)；福司曲星钠(fostriecin sodium)；氟维司群；吉非替尼(gefitinib)；吉西他滨(gemcitabine)；盐酸吉西他滨(gemcitabinehydrochloride)；吉西他滨-顺铂(gemcitabine-cisplatin)；吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)；乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)；乙酸组胺瑞林(histrelin acetate)；羟基脲(hydroxyurea)；盐酸伊达比星(idarubicinhydrochloride)；异环磷酰胺(ifosfamide)；iimofosine；替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)；伊达比星(idarubicin)；异环磷酰胺(ifosfamide)；甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)；咪喹莫特(imiquimod)；白介素Il(包括重组白介素II或rlL2)；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-l a；干扰素γ-lb；异丙铂(iproplatin)；盐酸伊立替康(irinotecan hydrochloride)；伊沙匹隆(ixabepilone)；乙酸兰瑞肽(lanreotide acetate)；拉帕替尼(lapatinib)；来那度胺(lenalidomide)；来曲唑(letrozole)；乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)；亚叶酸钙(leucovorin calcium)；乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)；左旋咪唑(levamisole)；阿糖胞苷脂质体(liposomalcytarabine)；盐酸利阿唑(liarozole hydrochloride)；洛美曲索钠(lometrexolsodium)；洛莫司汀(lomustine)；盐酸洛索蒽醌(losoxantrone hydrochloride)；马索罗酚(masoprocol)；美登素(maytansine)；盐酸氮芥(mechlorethamine hydrochloride)；(megestrol acetate)；(melengestrol acetate)；美法仑(melphalan)；美诺立尔(menogaril)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；甲氨蝶呤钠(methotrexate sodium)；甲氧沙林(methoxsalen)；氯苯氨啶(metoprine)；美乌替派(meturedepa)；米丁度胺(mitindomide)；米托克星(mitocarcin)；丝裂红素(mitocromin)；米托菌素(mitogillin)；米托马星(mitomalcin)；丝裂霉素C(mitomycin C)；米托司培(mitosper)；米托坦(mitotane)；盐酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)；霉酚酸(mycophenolic acid)；苯丙酸诺龙(nandrolone phenpropionate)；奈拉滨(nelarabine)；尼洛替尼(nilotinib)；诺考达唑(nocodazoie)；若莫单抗(nofetumomab)；诺加霉素(nogalamycin)；奥法木单抗(ofatumumab)；奥普瑞白介素(oprelvekin)；奥马铂(ormaplatin)；奥沙利铂(oxaliplatin)；奥西舒仑(oxisuran)；多西他赛(paclitaxel)；帕利夫明(palifermin)；盐酸帕诺洛司琼(palonosetron hydrochloride)；帕米磷酸盐(pamidronate)；培非格司亭(pegfilgrastim)；培美曲塞二钠(pemetrexed disodium)；喷司他丁(pentostatin)；帕尼单抗(panitumumab)；盐酸帕唑帕尼(pazopanibhydrochloride)；培美曲塞二钠(pemetrexed disodium)；普乐沙福(plerixafor)；普拉曲沙(pralatrexate)；培加帕酶(pegaspargase)；佩里霉素(peliomycin)；戊氮芥(pentamustine)；硫酸培洛霉素(peplomycin sulfate)；过磷酰胺(perfosfamide)；哌泊溴烷(pipobroman)；哌泊舒凡(piposulfan)；盐酸吡罗蒽醌(piroxantrone hydrochloride)；光神霉素(plicamycin)；普洛美坦(plomestane)；卟吩姆钠(porfimer sodium)；紫菜霉素(porfiromycin)；泼尼莫司汀(prednimustine)；盐酸丙卡巴肼(procarbazinehydrochloride)；嘌呤霉素(puromycin)；盐酸嘌呤霉素(puromycin hydrochloride)；吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)；奎纳克林(quinacrine)；盐酸雷洛昔芬(raloxifenehydrochloride)；拉布立酶(rasburicase)；重组HPV二价疫苗；重组HPV四价疫苗；利波腺苷(riboprine)；洛太米特(rogletimide)；利妥昔单抗(rituximab)；罗米地辛(romidepsin)；罗米司亭(romiplostim)；沙芬戈(safingol)；盐酸沙芬戈(safingol hydrochloride)；沙莫司亭(sargramostim)；司莫司汀(semustine)；辛曲秦(simtrazene)；sipuleucel-T；索拉非尼(sorafenib)；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosate sodium)；司帕索霉素(sparsomycin)；盐酸螺锗(spirogermanium hydrochloride)；螺莫司汀(spiromustine)；螺铂(spiroplatin)；链黑菌素(streptonigrin)；链佐星(streptozocin)；磺氯苯脲(sulofenur)；苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)；他利霉素(talisomycin)；他莫昔芬；枸橼酸他莫昔芬；替可加兰钠(tecogalan sodium)；替加氟(tegafur)；盐酸替洛蒽醌(teloxantrone hydrochloride)；替莫唑胺(temozolomide)；替莫卟吩(temoporfin)；坦西莫司(temsirolimus)；替尼泊苷(teniposide)；替罗昔隆(teroxirone)；睾内酯(testolactone)；沙利度胺(thalidomide)；硫咪嘌呤(thiamiprine)；硫鸟嘌呤(thioguanine)；塞替派(thiotepa)；噻唑扶林(tiazofurin)；替拉扎明(tirapazamine)；盐酸托泊替康(topotecan hydrochloride)；托瑞米芬(toremifene)；托西莫单抗(tositumomab)和I¹³¹碘托西莫单抗；曲妥单抗(trastuzumab)；乙酸曲托龙(trestoloneacetate)；维甲酸(tretinoin)；磷酸曲西立滨(triciribine phosphate)；三甲曲沙(trimetrexate)；葡糖醛酸三甲曲沙(trimetrexate glucuronate)；曲普瑞林(triptorelin)；盐酸妥布氯唑(tubulozole hydrochloride)；尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；乌瑞替派(uredepa)；戊柔比星(valrubicin)；伐普肽(vapreotide)；维替泊芬(verteporfin)；长春碱(vinblastine)；硫酸长春碱(vinblastine sulfate)；硫酸长春新碱(vincristine sulfate)；长春地辛(vindesine)；硫酸长春地辛(vindesine sulfate)；硫酸长春匹定(vinepidine sulfate)；硫酸长春甘酯(vinglycinate sulfate)；硫酸环氧长春碱(vinleurosine sulfate)；酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)；硫酸异长春碱(vinrosidine sulfate)；硫酸长春利定(vinzolidine sulfate)；伏立诺地(vorinostat)；伏氯唑(vorozole)；折尼铂(zeniplatin)；净司他丁(zinostatin)；唑来膦酸(zoledronic acid)；和盐酸佐柔比星(zorubicin hydrochloride)。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与止吐剂组合使用以治疗由使用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物、抗癌剂和/或放射疗法引起的恶心或呕吐。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与用于治疗贫血和中性粒细胞减少的药物组合使用。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与皮质类固醇给予。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与镇痛药共同给予。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与放射疗法(或放疗)组合使用。放射疗法是用电离放射治疗癌症和其它疾病。任选地使用放射疗法治疗局部实体瘤，诸如皮肤、舌、喉、脑、乳腺、前列腺、结肠、子宫和/或子宫颈的癌症。它还任选地用于治疗白血病和淋巴瘤(分别为造血细胞和淋巴系统的癌症)。

用于向癌细胞递送放射的技术是将放射性植入物直接放置在肿瘤或体腔中。这称为内部放射疗法(近距离放射疗法、间质辐照和腔内辐照是内部放射疗法的类型)。使用内部放射疗法、放射剂量集中在小区域，并且患者住院若干天。内部放射疗法经常用于舌、子宫、前列腺、结肠和子宫颈的癌症。术语“放射疗法”或“电离放射”包括所有形式的放射，包括但不限于α、β和γ放射和紫外光。

在一些实施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其药用盐与至少一种额外用于乳腺癌的治疗选择组合用于治疗乳腺癌。在一些实施方案中，所述额外治疗选择包括乳腺癌手术。在一些实施方案中，乳腺癌手术包括乳房切除术(lumpectomy)、乳头切除术(mastectomy)、前哨淋巴结活检(sentinel node biopsy)或腋窝淋巴结切除术(axillarynode dissection)。在一些实施方案中，所述额外治疗选择包括放射疗法。在一些实施方案中，放射包括外部束放射或近距离放射疗法。在一些实施方案中，所述额外治疗选项包括激素疗法(即激素阻断疗法)。在一些实施方案中，激素疗法包括使用选择性雌激素受体调节剂(例如他莫昔芬)、芳香酶抑制剂或氟维司群。在一些实施方案中，所述额外治疗选择包括去除卵巢的手术或使卵巢终止产生雌激素的药物。在一些实施方案中，所述额外治疗选择包括使用曲妥单抗、拉帕替尼或贝伐单抗。在一些实施方案中，所述额外治疗选择包括使用预防乳腺癌复发(例如唑来膦酸(Reclast,Zometa))的骨形成药物。

试剂盒/制品

为了用于本申请所述的诊断和治疗应用，本申请还描述了试剂盒和制品。这样的试剂盒可包括被分隔以接收一个或多个容器诸如小瓶、管等的载体、包装或容器，每个容器包括在本申请所述方法中使用的单独元件之一。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器由任何可接受的材料形成，包括例如玻璃或塑料。

在一些实施方案中，本申请提供的试剂盒用于在受试者中检测编码突变型ER-α多肽的核酸或用于检测受试者中的突变型ER-α多肽(即诊断试剂盒)。在一些实施方案中，所述试剂盒用于选择用式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂化合物治疗的患者，用于鉴定对激素疗法具有抗性或可能变得具有抗性的受试者，用于监测对激素疗法的抗性的发展，或它们的组合。本申请提供的试剂盒含有一种或多种试剂，其用于检测编码突变型ER-α多肽的核酸，用于检测突变型ER-α多肽，用于检测来自受试者的细胞中ER活性，或它们的组合。示例性试剂包括但不限于缓冲液、PCR试剂、抗体、用于酶染色的底物、发色团或其它材料，诸如载玻片、容器、微量滴定板，以及任选地用于进行所述方法的说明书。本领域技术人员将认识到许多其它可能的可用于接触各种材料的容器和板及试剂。试剂盒还可含有对照样品，例如核酸或蛋白质，诸如本申请提供的突变型ER-α多肽或编码本申请提供的突变型ER-α多肽的核酸。在一些实施方案中，试剂盒含有一组或多组用于检测内源性ER基因表达的寡核苷酸引物。

在一些实施方案中，所述容器可包含一种或多种式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂化合物，任选地在组合物中或与本申请公开的另一种药物组合。所述容器任选地具有无菌入口(例如，所述容器可为静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒任选地包含具有与其在本申请所述方法中的用途相关的识别描述或标记或说明书的化合物。

试剂盒通常包含一个或多个额外的容器，每个容器具有从商业和用户角度考虑使用本申请所述的化合物所需的各种材料(诸如试剂，任选地呈浓缩形式和/或装置)中的一种或多种。这种材料的非限制性实例包括但不限于缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器；列出内容和/或使用说明的载体、包装、容器，小瓶和/或管标签，以及具有使用说明的包装插页。通常还将包括一组说明书。

标签可在容器上或与容器相关联。当形成标签的字母、数字或其它字符附接、模制或蚀刻到容器本身时，标签可在容器上；当容器存在于同样托住容器的容器(receptacle)或载体内时，标签可与容器相关联，例如作为包装插页。标记可用于指示内容物将用于特定的治疗应用。标签还可用于指示使用内容物的指导，诸如在本申请所述的方法中。

本申请提供了制品，其包括包装材料、在包装材料内的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂化合物以及标签，所述标签指示化合物或组合物或其药用盐、互变异构体、药用N-氧化物、药学活性代谢物、药用前药或药用溶剂化物，所述制品用于降低、减少或消除活化的雌激素受体的作用，或用于治疗、预防或改善一种或多种将受益于雌激素受体活性降低或消除的疾病或病症的症状。

实施例

提供这些实施例仅用于说明目的而非限制本申请提供的权利要求的范围。

实施例1:MCF-7 3x ERE荧光素酶转录报道蛋白测定

在本实施例中，在MCF7乳腺癌细胞中，使用3x ERE-荧光素酶报道蛋白针对ER调节剂雌二醇、4-OH他莫昔芬、氟维司群和一组化合物，评估了对选择的突变型雌激素受体和刺激的野生型雌激素受体活性的组成性转录活性的抑制的最大相对IC50。在该测定中使用的条件下，野生型和所有突变型雌激素受体展现可通过ER配体调节的可测量的组成性、序列依赖性和雌二醇非依赖性基础活性。因此，所有数据都是在不存在雌二醇的情况下相对于野生型雌激素受体而言。

将MCF7细胞保持在补充有10％FCS的RPMI 1640中。转录测定通过如下进行：将100μL细胞以250,000个细胞/mL的密度接种到补充有10％活性炭处理的(charcoal stripped)血清的RPMI 1640的96孔细胞培养板中，并使其附着过夜。使用Lipofectin(LifeTechnologies)根据制造商的方案瞬时转染细胞。使用150ng 3X ERE-TK-Luc(报道蛋白载体)、30ng CMVpRL(标准化载体)和300ng pCDNA ERα(或ERα突变体)进行一式三份转染。将转染的细胞孵育过夜，然后用配体处理。将化合物连续稀释，向细胞中添加50μL化合物+补充有活性炭处理的血清的RPMI 1640。孵育24小时后，除去培养基，将细胞在40μL裂解缓冲液(25mM Tris磷酸盐、2mM CDTA、10％甘油、0.5％Triton X-100、2mM DTT)中裂解。在添加40μL荧光素酶缓冲液(20mM Tricine、0.1mM EDTA、1.07mM(MgCO₃)₄Mg(OH)₂·5H₂O、2.67mMMgSO₄、33.3mM DTT、270μM辅酶A、470μM荧光素酶、530μM ATP)后立即测量萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)活性。在添加40μL腔肠素(coelenterazine)缓冲液(1.1M NaCl、2.2mM Na₂EDTA、0.22M K_xPO₄(pH 5.1)、0.44mg/mL BSA、1.3mM NaN₃、1.43μM腔肠素，最终pH调节至5.0)后测量花虫型荧光素酶(Renilla luciferase)。每种化合物的最大相对激动剂活性源自代表每个突变体受体的最大响应(剂量响应曲线的底部)的剂量响应曲线上的点，如以下图表所示：RLU样品/RLU wtER-αDMSO×100＝相对活性。每种化合物的相对IC50如下确定：IC50ER-α突变体/IC50wt ER-α。

本申请公开的代表性化合物的示例性转录数据示于表5：

表5

:‘+’:>10nM；‘++’:1–10nM；‘+++’:<1nM

实施例2:ERM化合物1-3在具有局部晚期或转移性ER+乳腺癌和局部确认的ESR1突变的绝经后妇女中的临床试验

这是一个开放标签的临床试验，评价ERM化合物1-3、(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其药用盐在患有具有确认的ESR1突变的局部晚期或转移性ER+(HER2-)乳腺癌的绝经后妇女中的疗效和安全性。

目的：为了在局部晚期或转移性ER+(HER2-)乳腺癌和确认的ESR1突变的绝经后妇女中评价ERM化合物1-3，即(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其药用盐的药物动力学(PK)、安全性和耐受性并评估它们的抗肿瘤活性的初步证据。额外目的包括：用[¹⁸F]-氟雌二醇(FES)正电子发射断层扫描(PET)[FESPET]进行药效学(PD)响应的生物标志物的探索性评价；进行ER靶基因表达的探索性评价；在单次或多次剂量治疗(例如C_max、T_max、AUC、T_1/2)后，进行对(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其药用盐的抗性机制的探索性评价。

试验设计：对本研究中的妇女给予推荐的第2阶段剂量的(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其药用盐，或指定逐渐升高剂量的(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其药用盐，其中起始剂量为约400mg/天的(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其药用盐，接着此后以约200mg增量进行剂量递增。在用芳香酶抑制剂治疗之后，患者应具有可测量的疾病进展以及确认的ESR1突变。

所有患者将被治疗直到疾病进展、不可接受的毒性或患者撤回同意。

患者选择

纳入标准：

1.具有以下证据的组织学或细胞学证明的乳腺腺癌的诊断：不适合具有治疗意图的切除或放射疗法的局部复发性疾病，或转移性疾病，两者在ER+乳腺癌的激素疗法至少6个月后进展

2.ER阳性肿瘤(通过免疫组织化学[IHC]按照实验室测试在≥1％细胞中染色)

3.按照当地实验室测试，HER2阴性乳腺癌(对于细胞膜蛋白表达的IHC结果为0或+1，或对于不含有内部对照探针的系统，显示HER2/CEP17比例<1.8的FISH结果或每个细胞核平均少于4个HER2基因拷贝)

4.根据RECIST v1.1可评估的疾病进一步定义如下：

可测量的疾病或可评估的骨病，即，在没有可测量的损害的情况下裂解或混合(裂解+硬化)的骨损害。注意：先前辐照的损害被认为是可测量的，只有在放射完成后当场记录进展。具有不可测量的、不可评估的损害(诸如胸腔积液)的患者不适合于试验的剂量扩大部分

5.根据实验室测试的ESR1突变。用芳香酶抑制剂治疗后的疾病进展。

6.从使用他莫昔芬已经经过至少2个月

7.从使用任何其它抗癌激素疗法已经经过至少2个月

8.从使用化学疗法已经经过至少3周

9.女性，18岁或更年长

10.绝经后状态定义如下：

先前的双侧外科卵巢切除术

年龄≥56岁：自上次月经后≥1年的自然性闭经

年龄<56岁，自上次月经后闭经≥1年且血清雌二醇水平(<20pg/mL)和FSH水平(>40mIU/mL)在绝经后范围内

年龄<56岁，其经历子宫切除术，其中一个或两个卵巢留在原位，或具有他莫昔芬诱导的闭经以及他莫昔芬停用≥1年且血清雌二醇水平(<20pg/mL)和FSH水平(>40mIU/mL)在绝经后范围内

11.东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG)体力状态≤2(对于A组)或≤1(对于B1组和B2组)。

12.先前疗法或外科手术的所有急性毒性作用相对于基线的分辨率或等级≤1级(除非脱发或其它毒性不被认为是针对患者的安全性风险)

13.适当的器官功能如以下标准所定义：

绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1500/μL

血小板≥100,000/μL

血清天冬氨酸转氨酶(AST)和血清丙氨酸转氨酶(ALT)≤3x正常上限(ULN)，或如果肝功能异常是由于潜在的恶性肿瘤，则AST和ALT≤5xULN

总血清胆红素≤1.5x ULN，不考虑继发于肿瘤肝转移。允许纳入具有由于吉尔伯特综合征而增加的血清间接胆红素(≤3x ULN)的患者

血清肌酐≤1.5x ULN

QTc≤460毫秒

14.签署并注明日期的知情同意文件，表明该受试者(或法律上可接受的代表)在入选前已被告知试验的所有相关方面

15.遵守定期访问、治疗计划、实验室测试和其它试验操作的意愿和能力

排除标准：

1.未治疗或有症状的CNS转移。注意：如果长期使用皮质类固醇在招录前4周内已经中止，则允许在招录前12周内具有放射学稳定的治疗和无症状CNS转移的患者

2.子宫内膜病症

3.在晚期/转移性环境中大于1的先前化学疗法。

4.使用针对晚期疾病的任何系统性抗癌疗法的当前治疗或对另一临床试验的任何系统性实验性治疗

5.在招录前2年内诊断任何继发性恶性肿瘤，除了充分治疗的基底细胞或鳞状细胞皮肤癌或原位癌之外

6.在招录前12个月内具有任何以下情况：心肌梗塞、严重/不稳定型心绞痛、≥2级的持续性心律失常、任何等级的心房纤维颤动、冠状动脉/外周动脉旁路移植术、有症状的充血性心力衰竭，或脑血管意外(包括短暂性缺血发作)

7.活动性炎性肠病或慢性腹泻、短肠综合征或上胃肠外科手术(包括胃切除术)

8.已知的人类免疫缺陷病毒感染

9.招录前4周内进行大手术或放射疗法

10.其它严重急性或慢性医学或精神病症或实验室异常，其可能增加与研究参与或研究产品管理相关的风险，或可能干扰研究结果的解释，并且在研究者的判断中，将使受试者不适合进入这项研究

肿瘤评估：将进行疾病评估。成像研究将包括胸部、腹部和骨盆的CT扫描，以及骨扫描。目标肿瘤响应或疾病进展的放射学确认将基于RECIST v1.1(Eisenhauer,2009)。对于在骨扫描上检测到的新的骨损害，将需要第二成像模式(例如，CT或MRI)以确认进展。

在筛选和随访期间应使用相同的评估方法和相同的技术。当没有医学禁忌时，需要静脉内(IV)造影(contrast)。对IV造影具有禁忌症的患者可进行腹部和骨盆的MRI检查来代替CT和胸部的非造影CT。通过正电子发射断层扫描(PET)扫描或通过超声的肿瘤评估可能不能代替CT。

相关研究

用¹⁸FES-PET靶标结合(Target Engagement)的药效学：使用[18F]-氟雌二醇(FES)正电子发射断层扫描(PET)进行成像以定量肿瘤中的ER表达，并评估对用(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其药用盐的疗法的药效学响应。虽然FES摄取可在患者之间变化，但是一般来说，在给定时间点的损害处的FES摄取是相当一致的，并且平均摄取提供了个体患者的ER表达的合理概括。将影响标准摄取值(SUV)的因素，诸如性激素结合球蛋白(SHBG)，根据标准方案(Peterson,2011)进行调整。此外，由于每种药物的半衰期长及它们可能干扰FES摄取，对于先前用他莫昔芬(至少2个月)或氟维司群(至少6个月)治疗的患者可能需要清除期。FES-PET研究将作为混合PET/CT成像用于衰减校正和损害定位。

组织芯活检(Core Biopsies)：收集治疗前和治疗后的肿瘤活检(软组织或内脏损害)，以评估：

-肿瘤组织学；肿瘤vs基质，vs纤维组织

-通过免疫组织化学与免疫荧光评估ERα和PR蛋白水平

-增殖指数(Ki67)

-ER靶基因调节：可监测的ER靶基因的实例包括但不限于：AGR2、AREG、C3、CCND1、CXCL12、ERBB2、GREB1、IL6、IRS1、PDZK1、PGR、SEMA3B、TFF1、TFF2、TFF3、TOP2A、WISP2。

循环肿瘤DNA(ctDNA)：在所有患者中，在剂量递增和剂量扩展期间，在筛选、治疗和在研究终止时收集额外血液样品用于分析循环肿瘤DNA(ctDNA)。

最近的临床前和临床数据表明ER-α和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化的亚基α(PIK3CA)的突变与内分泌抗性乳腺癌相关。为了深入了解(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其药用盐和抗性机制之间潜在的因果关系，将会使用高级DNA分析技术在分离自血浆的ctDNA中监测这些基因的突变状态：诸如敏感性、基于乳化PCR的BEAMing(Beads,Emulsions,Amplification,and Magnetics)方法(Dressman,2003)或下一代测序。

实施例3:ERM化合物1-3(ARN-810)对临床相对ESR1突变的活性

本研究的目的是评估表1中的ERM 1-3即(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸对临床相关雌激素受体突变的功效，已提出该突变赋予对抗激素疗法诸如芳香酶抑制剂的抗性。在稳定表达ER-α突变体的MCF-7细胞的ER依赖性转录报道蛋白测定和活力测定中体外测量ERM 1-3的效力和功效。将ERM 1-3活性与临床相关的ER-α靶向乳腺癌治疗剂4-羟基他莫昔芬(他莫昔芬的活性代谢产物)和氟维司群比较。在基于细胞的转录报道蛋白测定中，ERM 1-3抑制所有ER-α突变(E380Q、L536R、L536P、Y537C、Y537N、Y537S和D538G)的活性，测试具有纳摩尔浓度效力，并且功效接近或大于针对野生型受体所观察到的。在稳定表达ER-α突变体的MCF-7细胞中，ERM 1-3使活细胞的数目减少44％-78％(在5天增殖性测定中与DMSO对照相比)，这取决于突变和测定格式。在报道蛋白和增殖性测定两者中，在ESR1突变组中，与野生型ER-α相比，ERM 1-3展现0.8至210倍降低的效力。然而，与转录报道蛋白测定相比，在活力测定中ERM 1-3通常比稳定表达野生型ER-α的细胞展现出降低的效能。

化合物和制剂：

如WO 2012/037410实施例36和WO 2012/037411实施例50中所述制备ERM 1-3。药品样品具有>95％纯度(纯度评估：核磁共振/液相色谱-质谱)且为灰白色粉末。采用该分子的钠盐或N-甲基-D-葡糖胺盐形式。ARN-810以10mM溶于DMSO中的储备溶液形式提供，其在-20℃储存。

氟维司群(中性形式)购自Waterstone Technology(WS10032)并以10mM的终浓度再混悬于无水DMSO中，然后分配成等分试样并在-80℃储存。

4-羟基他莫昔芬购自Sigma Aldrich，以10mM的终浓度再混悬于无水DMSO中，然后分配成等分试样并在-80℃储存。

MCF-7细胞可获自ATCC( HTB-22^TM)。在培养中一次传代后，将细胞扩增并储存在液氮中。将一小瓶冷冻细胞解冻，并每两个月进行培养，然后每周两次分开。将解冻的细胞培养两周以允许在任何测定中使用之前从冷冻过程中恢复。在本报告中详述的测定中使用的细胞经历了从初始解冻起5至22次传代。

细胞培养生长介质

Corning^TM cellgro^TM RPMI 1640(Corning,Catalog No.15-040)

Corning^TM cellgro^TM RPMI 1640，不含酚红(Corning,Catalog No.17-105)

Thermo Scientific^TM HyClone^TM胎牛血清(U.S.),具有特征的-(FBS)(ThermoScientific Catalog No.SH3007103)

Thermo Scientific^TM HyClone^TM胎牛血清(U.S.),经炭/葡聚糖处理的-(ThermoScientific,Catalog No.SH3006803)

其它试剂

试剂(Promega,Catalog No.G7572)

带盖、平底、低法兰、经组织培养处理的、无菌、白色聚苯乙烯384孔测定板(Corning,Catalog No.3570)

无水二甲基亚砜(Sigma Aldrich,Catalog No.276855-100mL)

Matrix 12通道电子移液器,0.5-12.5μL,2-125μL,和Matrix 8通道电子移液器,15-1250μL

96-孔经TC-处理的无菌聚苯乙烯板(Corning Inc.,Catalog Nos.3903,3904或3917)

Lipofectin(Invitrogen,Catalog No.18292037)

D-荧光素钾盐(Gold Biotechnology,Catalog No.LUCK-500)

Perkin Elmer EnVision 2103^TM多标签阅读器

Molecular Devices Analyst^TM GT多模式阅读器

Reichert 改良的Neubauer血细胞计数板(Hausser Scientific,Catalog No.1490)

统计学分析：以GraphPad 软件使用log(抑制剂)对响应可变斜率(四参数)曲线拟合，使用GraphPad Prism Version 6.01和Microsoft Office Excel(2010)产生曲线拟合及IC₅₀和E_max值。

实施例4:ER-α转录报道蛋白测定

将MCF7细胞保持在补充有10％FCS的RPMI 1640中。转录测定通过如下进行：将100μL细胞以250,000个细胞/mL的密度接种到补充有10％活性炭处理的血清的RPMI 1640的96孔细胞培养板中，并使其附着过夜。使用Lipofectin(Life Technologies)根据制造商的方案瞬时转染细胞。使用180ng 3X ERE-TK-Luc(报道蛋白载体)、30ng pRL-CMV(标准化载体)和270ng pCDNA ERα(或ERα突变体)进行一式三份转染。将转染的细胞孵育过夜，然后用配体处理。针对ER激动剂测定，将化合物连续稀释，向细胞中添加50μL化合物及补充有活性炭处理的血清的RPMI 1640。

对于ER拮抗剂测定，将化合物连续稀释并向细胞中添加于补充有活性炭处理的血清的RPMI 1640中的50μL化合物及3nM 17β-雌二醇。孵育24小时后，除去培养基，将细胞在40μL裂解缓冲液(25mM Tris磷酸盐、2mM CDTA、10％甘油、0.5％Triton X-100、2mM DTT)中裂解。

在添加40μL荧光素酶缓冲液(20mM Tricine、0.1mM EDTA、1.07mM(MgCO₃)₄Mg(OH)₂·5H₂O、2.67mM MgSO₄、33.3mM DTT、270μM辅酶A、470μM荧光素、530μM ATP)后立即测量萤火虫荧光素酶活性。在添加40μL腔肠素缓冲液(1.1M NaCl、2.2mM Na₂EDTA、0.22MK_xPO₄(pH 5.1)、0.44mg/mL BSA、1.3mM NaN₃、1.43μM腔肠素，最终pH调节至5.0)后测量花虫型荧光素酶。每种化合物的最大相对激动剂活性源自代表每个突变体受体的剂量响应曲线的底部，如以下所示：RLU样品/RLU wtER-αDMSO＝相对活性。

MCF-7突变型ER-α稳定细胞系产生：通过将包含氨基末端血凝素标签的ESR1野生型和突变型cDNA亚克隆到pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro)(称为EF1HA-ER-α)和pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro(称为UbC HA-ER-α)中，产生稳定表达野生型或ER-α突变体的MCF-7细胞。除了空载体阴性对照外，随后根据制造商的方案用pPACKH1包装质粒混合物(SystemBiosciences)将所得质粒共转染到HEK293T细胞中。转染后4天，从细胞培养基纯化慢病毒颗粒，分层并储存在-80℃。用纯化的病毒颗粒转导MCF-7细胞，并通过在含有10％FBS及分别用于pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro)和pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro的1μG/mL嘌呤霉素或200μG/mL潮霉素的RPMI中生长来选择稳定的细胞系。选择后，使用6E2小鼠单克隆HA抗体(CellSignaling)通过蛋白免疫印迹法(western blot)证实野生型和突变型ER-α的表达。

MCF-7稳定细胞系存活率：在含有10％CSS及NEAA和丙酮酸钠的不含苯酚的RPMI中，使用浓度调节至40,000个细胞/mL的血细胞计数器对MCF-7细胞计数。使用Matrix 16通道电子移液器将16微升细胞混悬液添加至384孔经组织培养处理的白色透明底聚苯乙烯板(Corning)的每个孔中。将细胞孵育过夜以允许细胞粘附。第二日，使用Matrix 16通道电子移液器将16微升含有10％CSS及NEAA和丙酮酸钠的不含苯酚的RPMI添加至一个板的孔中，然后添加16μL CellTiter-Glo(Promega,Madison WI)发光细胞存活力试剂(luminescentcell viability reagent)。在室温孵育20分钟后，在Perkin Elmer Envision 2103多标签阅读器上测量发光，其中发光测量高度设定为6.5mm，且最大积分时间为1秒。孔的相对发光单位(RLU)的“平均值”被认为是时间＝零时的基线值。此外，使用Matrix 12通道电子移液器在DMSO(Sigma-Aldrich)中进行10点、1:5连续稀释(包括仅作为阳性对照的DMSO)。然后将4μL的各稀释液添加至196μL含有10％CSS及NEAA和丙酮酸钠的RPMI中。将16μL含有化合物的培养基以10μM至5pM的终浓度添加至细胞中。使用Matrix 12通道电子移液器在培养基中稀释化合物并随后添加至细胞中。化合物暴露5天后，使用Matrix 16通道电子移液器向细胞中添加16μL CellTiter-Glo(Promega,Madison WI)发光细胞存活力试剂。使用添加至32μL无细胞培养基中的CellTiter-Glo获得背景值。在Perkin Elmer Envision 2103多标签阅读器上测量发光，其中发光测量高度设定为0mm，且最大积分时间为0.1秒。测量每个孔的相对发光单位(RLU)，并如下确定每个样品的相对增殖(倍数)：(RLU样品-RLU背景)/(T＝0时的RLU)＝相对增殖

实施例5化合物1-3(ARN-810)和ER转录报道蛋白测定

在瞬时表达野生型ER-α或ER-α突变体的MCF-7乳腺癌细胞中评价化合物1-3(ARN-810)、4-羟基他莫昔芬和氟维司群对临床相关ESR1突变(E380Q、L536R、L536P、Y537C、Y537N、Y537S和D538G)的转录活性的作用。用ER应答转录报道蛋白及野生型或突变型ER-α表达质粒瞬时转染MCF-7细胞，并用范围为0.1pM至10μM的ARN-810、4-羟基他莫昔芬或氟维司群或范围为0.1pM至1μM的17β-雌二醇处理。为了评估化合物的潜在激动剂活性，在不存在雌二醇的情况下处理细胞。在1nM雌二醇存在的情况下进行拮抗剂测定。如表6所示，在不存在雌二醇的情况下，所有分析的临床突变表现出可检测的配体非依赖性活性，其被ARN-810、4-羟基他莫昔芬和氟维司群抑制达到接近野生型的水平。所有拮抗剂对测试的突变保持纳摩尔浓度效力(表7)。然而，除了少数例外(4-羟基他莫昔芬对E380Q和L536P的活性)，在激动剂模式中，与野生型ER-α相比，所有拮抗剂表现出对突变型受体的效力的适度降低(1.1至61倍)，其中对于在ARN-810对Y537S突变中观察到最大61倍的降低。当在拮抗剂模式转录测定中分析ESR1突变(L536R、Y537C、Y537N、Y537S和D538G)的亚组时，观察到对功效的类似效应。然而，在雌二醇存在的情况下，用ARN-810观察到的效力变化不太明显。具体来说，在临床相关突变ARN-810上，IC₅₀改变0.8至1.7倍，并且最大功效接近在野生型受体上观察到的功效(表8和9)。

表6 ARN-810抑制临床相关ER-α突变的转录活性(激动剂模式,-E2)

E_max是相对于媒介物处理的野生型ER-α而言的最大刺激活性。还展示了与媒介物相比的抑制百分比(％)。

数据是从n次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表7 ARN-810为临床相关ER-α突变的转录拮抗剂(激动剂模式,-E2)

数据是从n次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表8 ARN-810拮抗临床相关ER-α突变的转录活性(拮抗剂模式,+E2)

E_max是相对于媒介物处理的野生型ER-α而言的最大刺激活性。还展示了与媒介物相比的抑制百分比(％)。

数据是从n次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表9 ARN-810为临床相关ER-α突变的转录拮抗剂(拮抗剂模式,+E2)

数据是从n次独立实验得到的平均值和标准偏差。

存活力测定：为了评估ARN-810拮抗患者中鉴定的组成型活性ER-α突变的配体非依赖性增殖活性的能力，产生稳定表达野生型、E380Q、L536P、L536R、Y537N、Y537S、Y537C和D538G氨基末端血凝素标签的ER-α(HA-ER-α)的MCF-7细胞系。因为ER-α过表达可诱导配体非依赖性生长并且还可使配体介导的降解途径饱和，所以利用UbC和EF1启动子驱动ER-α表达，针对每个受体产生独立的稳定细胞系(Li S,,et al.Cell Rep(2013)；4(6):1116-1130；Wardell SE,et al.Biochem Pharmacol(2011)；82(2):122-130)。UbC启动子由制造商(System Biosciences)报道以表达低至中等RNA水平，而EF1启动子表达高水平(SystemBiosciences)。如通过定量蛋白免疫印迹分析所确定，基于UbC的细胞系以小于10％内源性ER-α的水平表达HA-ER-α蛋白。在另一方面，基于EF1启动子的细胞系以比内源性蛋白高2至6倍的水平表达HA-ER-α和突变体。

与其在转录报道蛋白测定中的活性一致，临床鉴定的ER-α突变体在MCF-7细胞中通过UbC或EF1启动子的表达赋予细胞在不存在17β-雌二醇的情况下增殖的能力(表10和14)。然而，使用EF1启动子获得的高水平的野生型ER-α表达(约为内源性蛋白水平的2-3倍)也足以促进配体非依赖性生长。

在基于UbC启动子的细胞系中，化合物1-3(ARN-810)、4-羟基他莫昔芬和氟维司群以激动剂和拮抗剂模式两者拮抗稳定表达野生型、E380Q、L536P、L536R、Y537N、Y537S、Y537C和D538G HA-ER-α的细胞系的增殖(表10和12)。氟维司群和ARN-810表现出相似的功效(对于激动剂和拮抗剂模式分别为47％至67％和71％至78％抑制)，而4-羟基他莫西芬在所测试的所有突变上展现出降低的功效。在激动剂和拮抗剂模式中，所有三种拮抗剂对UbCHA-ER-α突变型细胞系展现出高皮摩尔浓度至低纳摩尔浓度IC₅₀(表11和13)。在激动剂模式下，UbC野生型HA-ER-α细胞系没有充分增殖以得到准确的IC₅₀，然而，在拮抗剂模式中，与野生型ER-α相比，所有拮抗剂均展现出效力的适度降低(1.3-至5.4倍，表13)。

在EF1衍生的细胞系中，在激动剂模式中，与野生型相比，所有拮抗剂对突变型受体表现出降低的效力(对于4-羟基他莫昔芬、氟维司群和ARN-810分别为8至140倍、2-至47倍和2-至210倍)。此外，与氟维司群和4-羟基他莫昔芬两者相比，ARN-810在Y537突变体上展现出降低的功能(表15和16)。当以拮抗剂模式进行增殖测定时，观察到拮抗剂功效和效力的类似观察(表16和17)。然而，在17β-雌二醇存在的情况下，在携带野生型和突变型HA-ER-α的细胞系之间拮抗剂效力的差异不如在EF-1激动剂测定中所观察到的显著(最大15倍)。

表10孵育5天后ARN-810减少稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的存活细胞数(UbC HA-ER-α；激动剂模式；-E2)

MCF-7细胞用作阴性对照。

E_max是相对于第0天而言的第5天的最大刺激增殖响应。还展示了与媒介物相比的抑制百分比(％)。数据是从4次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表11 ARN-810为稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的强效增殖拮抗剂(UbC HA-ER-α；激动剂模式；-E2)

MCF-7细胞用作阴性对照。

数据是从4次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表12孵育5天后ARN-810减少稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的存活细胞数(UbC HA-ER-α；拮抗剂模式；+E2)

MCF-7细胞用作阴性对照。

E_max是相对于第0天而言的第5天的最大刺激增殖响应。还展示了与媒介物相比的抑制百分比(％)。数据是从2次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表13 ARN-810为稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的强效增殖拮抗剂(UbC HA-ER-α；拮抗剂模式；+E2)

MCF-7细胞用作阴性对照。

数据是从2次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表14孵育5天后ARN-810减少稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的活细胞数(EF1HA-ER-α；激动剂模式；-E2)

将用空EF1慢病毒载体转导的MCF-7细胞用作阴性对照。

E_max是相对于第0天而言的第5天的最大刺激增殖响应。还展示了与媒介物相比的抑制百分比(％)。数据是从2次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表15 ARN-810为稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的增殖拮抗剂(EF1HA-ER-α；激动剂模式；-E2)

将用空EF1慢病毒载体转导的MCF-7细胞用作阴性对照。

数据是从2次独立实验得到的平均值和标准偏差。ND＝未确定。

表16孵育5天后ARN-810减少稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的存活细胞数(EF1HA-ER-α；拮抗剂模式；+E2)

将用空EF1慢病毒载体转导的MCF-7细胞用作阴性对照。

E_max是相对于第0天而言的第5天的最大刺激增殖响应。还展示了与媒介物相比的抑制百分比(％)。数据是从2次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表17 ARN-810为稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的增殖拮抗剂(EF1HA-ER-α；拮抗剂模式；+E2)

将用空EF1慢病毒载体转导的MCF-7细胞用作阴性对照。

数据是从2次独立实验得到的平均值和标准偏差。

结论：化合物1-3(ARN-810)在基于细胞的转录报道蛋白和细胞存活力测定中抑制临床相关ESR1突变E380Q、L536R、L536P、Y537C、Y537N、Y537S和D538G的活性。ARN-810将ER依赖性转录报道蛋白测定中所有ESR1突变的转录活性抑制为达到接近野生型受体所观察到的水平。在通过UBC启动子以低水平稳定表达ER-α突变体的MCF-7细胞中，与DMSO对照相比，ARN-810将存活细胞数减少了47％-78％。虽然ARN-810在此测定中展现出纳摩尔浓度效力，但与野生型相比，ARN-810在突变型ER-α上表现出1.3至2.7倍的降低的效力。相反，当ER-α突变体通过EF1启动子过表达时，与野生型受体相比，ARN-810展现出效力降低0.6至210倍，并且与4-羟基他莫昔芬和氟维司群相比，降低最大功效(E_max)响应。

实施例6:ERM化合物4-23对临床相关ESR1突变的活性

本研究的目的是评估ERM 4-23，即(S)-2-(4-(2-(3-(氟甲基)氮杂环丁-1-基)乙氧基)苯基)-3-(3-羟基苯基)-4-甲基-2H-色烯-6-醇(表4)对临床相关雌激素受体突变的功效，已提出该突变赋予对抗激素疗法诸如芳香酶抑制剂的抗性。在稳定表达ER-α突变体的MCF-7细胞的ER依赖性转录报道蛋白测定和存活力测定中，体外测量ERM 4-23的效力和功效。将ERM 4-23活性与临床相关的ER-α靶向乳腺癌治疗剂4-羟基他莫昔芬(他莫昔芬的活性代谢产物)和氟维司群进行比较。在基于细胞的转录报道蛋白测定中，ERM 4-23抑制所有ER-α突变(E380Q、L536R、L536P、Y537C、Y537N、Y537S和D538G)的活性，测试具有纳摩尔浓度效力，并且功效接近野生型受体所观察到的。类似地，在稳定表达ER-α突变体的MCF-7细胞中，ERM 4-23使存活细胞的数目减少49％-90％(与DMSO对照相比)，这取决于突变和测定格式。然而，在两种测定中，在ESR1突变组中，与野生型ER-α相比，ERM 4-23展现0.7至23倍降低的效力。

如实施例3所示，本研究的目的是确定ERM 4-23对临床相关ER-α突变的活性。在稳定表达野生型或突变型ER-α(alpha)的MCF-7细胞的ER-α转录报道蛋白和细胞存活力中监测ERM 4-23活性。

如WO 2014/025138中所述制备ERM 4-23。采用该分子的盐酸盐形式。药品样品具有>95％纯度(纯度评估：核磁共振/液相色谱-质谱)且为灰白色粉末。将ERM 4-23溶于二甲基亚砜(DMSO)中作为10mM储备溶液并在-20℃储存。采用如实施例3中所述的其它化合物和制剂。

在如实施例5所示的瞬时表达野生型ER-α或ER-α突变体的MCF-7乳腺癌细胞中，评价ERM化合物4-23、4-羟基他莫昔芬和氟维司群对临床相关ESR1突变(E380Q、L536R、L536P、Y537C、Y537N、Y537S和D538G)的转录活性的作用。用ER应答转录报道蛋白及野生型或突变型ER-α表达质粒瞬时转染MCF-7细胞，并用范围为0.1pM至10μM的ERM 4-23、4-羟基他莫昔芬或氟维司群或范围为0.1pM至1μM的17β-雌二醇处理。为了评估化合物的潜在激动剂活性，在不存在雌二醇的情况下处理细胞。在1nM雌二醇存在的情况下进行拮抗剂测定。如表18所示，在不存在雌二醇的情况下，所有分析的临床突变表现出可检测的配体非依赖性活性，其被ERM 4-23、4-羟基他莫昔芬和氟维司群抑制到接近野生型的水平。所有拮抗剂对测试的突变保持纳摩尔浓度效力(表19)。然而，除了少数例外(4-羟基他莫昔芬对E380Q和L536P的活性)，在激动剂模式中，与野生型ER-α相比，所有拮抗剂表现出对突变型受体的效力的适度降低(1.1至5.9倍)，其中对于在ERM 4-23对Y537S突变中观察到最大5.9倍的降低。当在拮抗剂模式转录测定中分析ESR1突变(L536R、Y537C、Y537N、Y537S和D538G)的亚组时，观察到对功效和效力的类似效应。具体来说，在临床相关突变ERM 4-23上，IC₅₀增加0.8至1.7倍，但最大功效接近在野生型受体上所观察到的功效(表20和21)。

表18 ERM 4-23抑制临床相关ER-α突变的转录活性(激动剂模式,-E2)

E_max是相对于经媒介物处理的野生型ER-α而言的最大刺激活性。还展示了与媒介物相比的抑制百分比(％)。

数据是从n次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表19 ERM 4-23为临床相关ER-α突变的活性的强效转录抑制剂(激动剂模式,-E2)

数据是从n次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表20 ERM 4-23拮抗临床相关ER-α突变的转录活性(拮抗剂模式,+E2)

Emax是相对于经媒介物处理的野生型ER-α而言的最大刺激活性。还展示了与媒介物相比的抑制百分比(％)。

数据是从n次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表21 ERM 4-23为临床相关ER-α突变的活性的强效转录拮抗剂(拮抗剂模式,+E2)

数据是从n次独立实验得到的平均值和标准偏差。

存活力测定：为了评估ERM 4-23拮抗患者中鉴定的组成型活性ER-α突变的配体非依赖性增殖活性的能力，产生稳定表达野生型、E380Q、L536P、L536R、Y537N、Y537S、Y537C和D538G氨基末端血凝素标签的ER-α(HA-ER-α)的MCF-7细胞系。因为ER-α过表达可诱导配体非依赖性生长并且还可使配体介导的降解途径饱和，所以利用UbC和EF1启动子驱动ER-α表达，针对每个受体产生独立的稳定细胞系。UbC启动子由制造商(System Biosciences)报道以表达低至中等RNA水平，而EF1启动子表达高水平(System Biosciences)。如通过定量蛋白免疫印迹分析所确定的，基于UbC的细胞系以小于10％内源性ER-α的水平表达HA-ER-α蛋白。在另一方面，基于EF1启动子的细胞系以比内源性蛋白高2至6倍的水平表达HA-ER-α和突变体。

与其在转录报道蛋白测定中的活性一致，临床鉴定的ER-α突变体在MCF-7细胞中通过UbC或EF1启动子的表达赋予细胞在不存在17β-雌二醇的情况下增殖的能力(表22和265)。然而，使用EF1启动子获得的高水平的野生型ER-α表达(约为内源性蛋白水平的2-3倍)也足以促进配体非依赖性生长。在激动剂模式中，ERM 4-23、4-羟基他莫昔芬和氟维司群通过任一启动子拮抗稳定表达野生型、E380Q、L536P、L536R、Y537N、Y537S、Y537C和D538G HA-ER-α的细胞系的增殖(表22和26)。氟维司群和ERM 4-23表现出相似的功效(对于UbC和EF1-衍生的细胞系分别为47％至66％和42％至96％抑制)，而4-羟基他莫西芬在所测试的所有突变上展现出降低的功效。在激动剂模式中，所有三种拮抗剂对UbC HA-ER-α突变型细胞系展现出高皮摩尔浓度至低纳摩尔浓度IC₅₀，且在EF1-衍生的细胞系中展现出低纳摩尔浓度效力(表23和27)。在不存在E2的情况下，UbC野生型HA-ER-α细胞系没有充分增殖以得到准确的IC₅₀，然而，在EF1-衍生的细胞系中，与野生型相比，所有拮抗剂均展现出降低的效力(对于4-羟基他莫昔芬、氟维司群和ERM 4-23分别为8至140倍、2至47倍和0.7至24倍)。当以拮抗剂模式进行增殖测定时，观察到拮抗剂功效和效力的类似观察(表24、25、28、29)。然而，在17β-雌二醇存在的情况下，在携带野生型和突变型HA-ER-α的细胞系之间拮抗剂效力的差异不如在EF-1激动剂测定中所观察到的显著(最大13倍)。

表22孵育5天后ERM 4-23减少稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的存活细胞数(UbC HA-ER-α；激动剂模式；-E2)

MCF-7细胞用作阴性对照。

E_max是相对于第0天而言第5天的最大刺激增殖反应。还展示了与媒介物相比的抑制百分比(％)。

数据是从4次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表23ERM 4-23为稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的强效增殖拮抗剂(UbC HA-ER-α；激动剂模式；-E2)

MCF-7细胞用作阴性对照。

数据是从4次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表24孵育5天后ERM 4-23减少稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的存活细胞数(UbC HA-ER-α；拮抗剂模式；+E2)

MCF-7细胞用作阴性对照。

E_max是相对于第0天而言第5天的最大刺激增殖反应。还展示了与媒介物相比的抑制百分比(％)。

数据是从2次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表25 ERM 4-23为稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的强效增殖拮抗剂(UbC HA-ER-α；拮抗剂模式；+E2)

MCF-7细胞用作阴性对照。

数据是从2次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表26孵育5天后ERM 4-23减少稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的存活细胞数(EF1HA-ER-α；激动剂模式；-E2)

将用空EF1慢病毒载体转导的MCF-7细胞用作阴性对照。

E_max是相对于第0天而言第5天的最大刺激增殖反应。还展示了与媒介物相比的抑制百分比(％)。

数据是从2次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表27 ERM 4-23为稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的强效增殖拮抗剂(EF1HA-ER-α；拮抗剂模式；-E2)

将用空EF1慢病毒载体转导的MCF-7细胞用作阴性对照。

数据是从2次独立实验得到的平均值和标准偏差。ND＝未确定。

表28孵育5天后ERM 4-23减少稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的存活细胞数(EF1HA-ER-α；拮抗剂模式；+E2)

将用空EF1慢病毒载体转导的MCF-7细胞用作阴性对照。

E_max是相对于第0天而言第5天的最大刺激增殖反应。还展示了与媒介物相比的抑制百分比(％)。

数据是从2次独立实验得到的平均值和标准偏差。

表29 ERM 4-23为稳定表达临床相关ER-α突变体的MCF-7细胞的强效增殖拮抗剂(EF1HA-ER-α；拮抗剂模式；+E2)

将用空EF1慢病毒载体转导的MCF-7细胞用作阴性对照。

数据是从2次独立实验得到的平均值和标准偏差。

结论：ERM 4-23在基于细胞的转录报道蛋白和细胞存活力测定中抑制临床相关ESR1突变E380Q、L536R、L536P、Y537C、Y537N、Y537S和D538G的活性。ERM 4-23将ER依赖性转录报道蛋白测定中所有ESR1突变的转录活性抑制为达到接近野生型受体所观察到的水平。在稳定表达ER-α突变体的MCF-7细胞中，与DMSO对照相比，ERM 4-23使存活细胞数减少了49％-90％。虽然ERM 4-23在这些测定中展现出纳摩尔浓度效力，但与野生型相比，ERM 4-23在突变型ER-α上表现出0.7至24倍的降低的效力。ERM 4-23展现出与4-羟基他莫昔芬和氟维司群类似的IC₅₀效力以及与氟维司群类似的最大功效(E_max)响应。

实施例7体外细胞增殖测定

雌激素受体调节剂化合物和化疗化合物的功效通过采用以下方案的细胞增殖测定来测量(Mendoza et al(2002)Cancer Res.62:5485-5488)。

发光细胞存活力测定是一种基于对存在的ATP定量而用于确定培养物中存活细胞数量的均相方法，这表示代谢活性细胞的存在。测定设计用于多孔板格式，使其对于自动化高通量筛选(HTS)、细胞增殖和细胞毒性测定而言是理想的。均相测定操作涉及将单一试剂(试剂)直接添加至在补充有血清的培养基中培养的细胞中。不需要细胞清洗、去除培养基或多个移液步骤。Cell发光细胞存活力测定包括试剂和方案是可商购得到的(Promega Corp.,Madison,WI,TechnicalBulletin TB288)。

该测定评估化合物进入细胞和抑制细胞增殖的能力。测定原理基于通过定量存在于均相测定中的ATP来确定存在的存活细胞的数目，其中添加Cell试剂导致细胞裂解并通过荧光素酶反应产生发光信号。发光信号与存在的ATP的量成比例。

操作：第1天-接种细胞板(来自Falcon#353962的384孔黑色、透明底部、微透明、有盖TC板)，收获细胞，以1000个细胞/54μl/孔接种细胞至384孔细胞板中以用于3天测定。细胞培养基：RPMI或DMEM高葡萄糖、10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺,P/S。在37℃,5％CO₂孵育O/N(过夜)。

第2天-向细胞添加药物，化合物稀释，DMSO板(连续稀释1:2,9个点)。在96孔板的第二列加入20μl 10mM的化合物。使用来自Nunc(cat.#249946)的Precision Media Plates96孔圆底聚丙烯板，跨板(10μl+20μl 100％DMSO)进行连续稀释1:2共9个点(1:50稀释)。向所有孔中添加147μl培养基。使用(Caliper,a Perkin-Elmer Co.)将DMSO板中每个孔的3μlDMSO+化合物转移至培养基板上每个相应的孔中。对于2种药物组合研究，使用Rapidplate将DMSO板中每个孔的一种药物1.5μl DMSO+化合物转移至培养基板上每个相应的孔中。然后，转移另一种药物1.5μl至培养基板。

添加药物至细胞，细胞板(1:10稀释)：直接添加6μl培养基+化合物至细胞(在细胞上已经有54μl培养基)。在不会经常打开的培养箱中在37℃，5％CO₂孵育3天。

第5天-铺板，在室温解冻Cell Titer Glo缓冲液：从37℃移去细胞板并平衡至室温约30分钟。添加Cell缓冲液至Cell底物(瓶到瓶)。向每个孔的细胞中添加30μl CellReagent(Promega cat.#G7572)。在板振荡器上放置约30分钟。在Analyst HT板阅读器上读取发光(每孔半秒)。

细胞存活力测定和组合测定：历经16小时将细胞以1000-2000个细胞/孔接种在384孔板中。在第二天，在96孔板中在DMSO中制备9个连续稀释的1:2化合物稀释液。使用自动化设备(Zymark Corp.,Hopkinton,MA)将化合物进一步稀释至生长培养基中。然后将稀释的化合物一式四份添加至384孔细胞板的孔中，并在37℃和5％CO₂下孵育。4天后，根据制造商的说明书使用Cell(Promega)通过发光测量存活细胞的相对数目，并在Wallac Multilabel(PerkinElmer,Foster City)上读取。使用4.0software(GraphPad,San Diego)计算EC₅₀值。组合测定中的药物以4X EC₅₀浓度开始给药。如果在药物的EC₅₀>2.5μM的情况下，使用的最高浓度为10μM。在所有测定中同时添加或分隔4小时添加(一个接一个)雌激素受体调节剂化合物和化学治疗剂。

另外的示例性体外细胞增殖测定包括以下步骤：

1.将培养基中含有约10⁴个细胞(对于细胞系和肿瘤类型参见表3)的100μl细胞培养物的等分试样沉积在384孔不透明壁板的每个孔中。

2.准备含有培养基和无细胞的对照孔。

3.将化合物添加至实验孔中并孵育3-5天。

4.将板平衡至室温约30分钟。

5.添加与每个孔中存在的细胞培养基的体积相等的体积的试剂。

6.将内容物在定轨振荡器上混合2分钟以诱导细胞裂解。

7.将板在室温孵育10分钟以稳定发光信号。

8.记录发光并在图中报告为RLU＝相对发光单位。

9.使用Chou和Talalay联合方法并使用软件(Biosoft,Cambridge,UK)的剂量-效应分析进行分析，以获得联合指数(Combination Index)。

可选择地，将细胞以最佳密度接种在96孔板中并在测试化合物存在的情况下孵育4天。随后将Alamar Blue^TM添加至测定培养基中，并将细胞孵育6小时，然后在544nm激发、590nm发射读取。使用S形剂量响应曲线拟合计算EC₅₀值。

可选择地，使用Cell试剂(Promega Inc.,Madison,WI)在药物治疗48小时后分析增殖/存活力。在所有存活力测定中DMSO处理用作对照。使用XL拟合软件(IDBS,Alameda,CA)计算IC₅₀值。

细胞系获自ATCC(American Type Culture Collection,Manassas,VA)或DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig,DE)。将细胞在补充有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、2mM L-谷氨酰胺和100mg/ml链霉素(Life Technology,Grand Island,NY)的RPMI 1640培养基中在37℃在5％CO₂培养。

实施例8体内小鼠肿瘤异种移植物功效

小鼠：雌性严重联合免疫缺陷小鼠(Fox ChaseC.B-17/IcrHsd,Harlan)或裸鼠(Taconic Farms,Harlan)为8至9周龄，在研究的第0天的BW范围为15.1至21.4克。对动物随意饲喂水(反渗透，1ppm Cl)以及由18.0％粗蛋白、5.0％粗脂肪和5.0％粗纤维组成的NIH 31改良和辐照实验室饮食(Modified and Irradiated Lab)。将小鼠安置在21-22℃(70-72°F)和40-60％湿度、以12小时光照循环的静态微隔离器(staticmicroisolator)中经辐照的实验室动物垫料(LaboratoryAnimal Bedding)上。PRC特别遵守“实验动物护理和使用指南(Guide for Care and Useof Laboratory Animals)”关于约束、饲养、手术操作、饲料和流体调节以及兽医护理的建议。PRC的动物护理和使用计划由实验动物护理国际评估和认证协会(the Associationfor Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)(AAALAC)认证，确保遵守关于实验动物护理和使用的公认标准。

肿瘤植入：用癌细胞启动异种移植。将细胞在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100单位/mL青霉素、100μg/mL硫酸链霉素和25μg/mL庆大霉素的RPMI 1640培养基中培养。在指数生长期间收集细胞，并根据细胞系的倍增时间以5x 10⁶或10x 10⁶个细胞/mL的浓度重新混悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将肿瘤细胞皮下植入右胁腹，并且当平均大小接近100至150mm³的目标范围时监测肿瘤生长。在肿瘤植入后21天(指定为研究的第0天)，将小鼠置于四组中，每组由10只小鼠组成，所述小鼠具有75-172mm³的单个肿瘤体积和120-121mm³的组平均肿瘤体积(参见附录A)。使用下式计算体积：

肿瘤体积(mm³)＝(w²x l)/2，其中w＝肿瘤的宽度且l＝肿瘤的长度(以mm为单位)。假设1mg等于1mm³的肿瘤体积，可估计肿瘤重量。

治疗剂：雌激素受体调节剂化合物和化学治疗剂通常由干粉制备，在室温储存，并且免受光照。在去离子水(“媒介物”)中的0.5％甲基纤维素:0.2％吐温80中每周制备药物剂量并在4℃储存。在给药的每一天通过用无菌盐水(0.9％NaCl)稀释储备液的等分试样来制备化合物的剂量。配制所有剂量以每20克体重0.2mL的体积(10mL/kg)递送所述mg/kg剂量。

治疗：将所有剂量按比例调整至单个动物的体重并通过各图中所示的途径提供。

终末点：以2维(长度和宽度)使用Ultra Cal IV卡尺(Model 54 10 111；FredV.Fowler Company)如下测量肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)＝(长度x宽度²)×0.5并使用Excelversion 11.2(Microsoft Corporation)进行分析。使用线性混合效应(LME)建模方法分析来自同一动物的肿瘤体积随时间的重复测量(Pinheiro J,et al.nlme:linear andnonlinear mixed effects models.R package version 3.1 92.2009；Tan N,etal.Clin.Cancer Res.2011；17(6):1394–1404)。该方法解决了由于在研究结束之前动物的任何非治疗相关的死亡所导致的重复测量和适度退出(dropout)。使用三次回归样条(cubic regression spline)在每个剂量水平将非线性分布拟合为log2肿瘤体积的时程。然后，这些非线性分布与混合模型内的剂量相关。使用下式将作为媒介物对照的百分比的肿瘤生长抑制(％TGI)计算为针对相应剂量组/天相对于媒介物的拟合曲线下面积(AUC)的百分比：％TGI＝100×(1-AUC_dose/AUC_veh)。使用该式，TGI值为100％表示肿瘤停滞，TGI值＞1％但＜100％表示肿瘤生长延迟，且TGI值>100％表示肿瘤消退。将动物的部分响应(PR)定义为肿瘤消退＞50％的起始肿瘤体积但＜100％的起始肿瘤体积。将完全响应(CR)定义为在研究过程的任一天100％肿瘤消退(即，无可测量的肿瘤)。

毒性：在研究的前五天每天称重动物，然后每周两次称重。使用AdventurerAV812量表(Ohaus Corporation)测量动物体重。重量变化百分比计算如下：体重变化(％)＝[(重量_新的一天-重量_第0天)/重量_第0天]×100。频繁观察小鼠并在观察时记录任何不良的、治疗相关的副作用的明显体征和临床毒性体征。将可接受的毒性定义为在研究期间小于20％的组平均体重(BW)减轻，并且在10只治疗的动物中有不超过一只治疗相关的(TR)死亡。导致更大毒性的任何给药方案被认为高于最大耐受剂量(MTD)。若可归因于由临床体征和/或尸体剖检所证明的治疗副作用，则将死亡归类为TR，或者若归因于给药期期间或最后一次给药的10天内的未知原因，则也可将死亡归类为TR。若没有证据表明死亡与治疗副作用相关，则将死亡归类为NTR。

尽管为了清楚理解的目的通过说明和实施例的方式相当详细地描述了前述发明，但是描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。通过引用的方式将本申请引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地整体并入本申请。本申请所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且本领域技术人员所建议的各种修改或变化将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 赛拉根医药股份有限公司(SERAGON PHARMACEUTICALS, INC.)

<120> 调节雌激素受体突变体的方法和组合物

<130> 45202-739.101

<140> 待确定

<141> 2014-03-13

<160> 2

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1788

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

atgaccatga ccctccacac caaagcatct gggatggccc tactgcatca gatccaaggg 60

aacgagctgg agcccctgaa ccgtccgcag ctcaagatcc ccctggagcg gcccctgggc 120

gaggtgtacc tggacagcag caagcccgcc gtgtacaact accccgaggg cgccgcctac 180

gagttcaacg ccgcggccgc cgccaacgcg caggtctacg gtcagaccgg cctcccctac 240

ggccccgggt ctgaggctgc ggcgttcggc tccaacggcc tggggggttt ccccccactc 300

aacagcgtgt ctccgagccc gctgatgcta ctgcacccgc cgccgcagct gtcgcctttc 360

ctgcagcccc acggccagca ggtgccctac tacctggaga acgagcccag cggctacacg 420

gtgcgcgagg ccggcccgcc ggcattctac aggccaaatt cagataatcg acgccagggt 480

ggcagagaaa gattggccag taccaatgac aagggaagta tggctatgga atctgccaag 540

gagactcgct actgtgcagt gtgcaatgac tatgcttcag gctaccatta tggagtctgg 600

tcctgtgagg gctgcaaggc cttcttcaag agaagtattc aaggacataa cgactatatg 660

tgtccagcca ccaaccagtg caccattgat aaaaacagga ggaagagctg ccaggcctgc 720

cggctccgta aatgctacga agtgggaatg atgaaaggtg ggatacgaaa agaccgaaga 780

ggagggagaa tgttgaaaca caagcgccag agagatgatg gggagggcag gggtgaagtg 840

gggtctgctg gagacatgag agctgccaac ctttggccaa gcccgctcat gatcaaacgc 900

tctaagaaga acagcctggc cttgtccctg acggccgacc agatggtcag tgccttgttg 960

gatgctgagc ccccgatact ctattccgag tatgatccta ccagaccctt cagtgaagct 1020

tcgatgatgg gcttactgac caacctggca gacagggagc tggttcacat gatcaactgg 1080

gcgaagaggg tgccaggctt tgtggatttg accctccatg atcaggtcca ccttctagaa 1140

tgtgcctggc tagagatcct gatgattggt ctcgtctggc gctccatgga gcacccaggg 1200

aagctactgt ttgctcctaa cttgctcttg gacaggaacc agggaaaatg tgtagagggc 1260

atggtggaga tcttcgacat gctgctggct acatcatctc ggttccgcat gatgaatctg 1320

cagggagagg agtttgtgtg cctcaaatct attattttgc ttaattctgg agtgtacaca 1380

tttctgtcca gcaccctgaa gtctctggaa gagaaggacc atatccaccg agtcctggac 1440

aagatcacag acactttgat ccacctgatg gccaaggcag gcctgaccct gcagcagcag 1500

caccagcggc tggcccagct cctcctcatc ctctcccaca tcaggcacat gagtaacaaa 1560

ggcatggagc atctgtacag catgaagtgc aagaacgtgg tgcccctcta tgacctgctg 1620

ctggagatgc tggacgccca ccgcctacat gcgcccacta gccgtggagg ggcatccgtg 1680

gaggagacgg accaaagcca cttggccact gcgggctcta cttcatcgca ttccttgcaa 1740

aagtattaca tcacggggga ggcagagggt ttccctgcca cggtctga 1788

<210> 2

<211> 595

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Met Thr Met Thr Leu His Thr Lys Ala Ser Gly Met Ala Leu Leu His

1 5 10 15

Gln Ile Gln Gly Asn Glu Leu Glu Pro Leu Asn Arg Pro Gln Leu Lys

20 25 30

Ile Pro Leu Glu Arg Pro Leu Gly Glu Val Tyr Leu Asp Ser Ser Lys

35 40 45

Pro Ala Val Tyr Asn Tyr Pro Glu Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Asn Ala

50 55 60

Ala Ala Ala Ala Asn Ala Gln Val Tyr Gly Gln Thr Gly Leu Pro Tyr

65 70 75 80

Gly Pro Gly Ser Glu Ala Ala Ala Phe Gly Ser Asn Gly Leu Gly Gly

85 90 95

Phe Pro Pro Leu Asn Ser Val Ser Pro Ser Pro Leu Met Leu Leu His

100 105 110

Pro Pro Pro Gln Leu Ser Pro Phe Leu Gln Pro His Gly Gln Gln Val

115 120 125

Pro Tyr Tyr Leu Glu Asn Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Val Arg Glu Ala

130 135 140

Gly Pro Pro Ala Phe Tyr Arg Pro Asn Ser Asp Asn Arg Arg Gln Gly

145 150 155 160

Gly Arg Glu Arg Leu Ala Ser Thr Asn Asp Lys Gly Ser Met Ala Met

165 170 175

Glu Ser Ala Lys Glu Thr Arg Tyr Cys Ala Val Cys Asn Asp Tyr Ala

180 185 190

Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe

195 200 205

Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala Thr

210 215 220

Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys

225 230 235 240

Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly Gly Ile Arg

245 250 255

Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp

260 265 270

Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala

275 280 285

Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn

290 295 300

Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu

305 310 315 320

Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro

325 330 335

Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg

340 345 350

Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val

355 360 365

Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu

370 375 380

Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly

385 390 395 400

Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys

405 410 415

Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser

420 425 430

Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu

435 440 445

Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser

450 455 460

Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp

465 470 475 480

Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr

485 490 495

Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser

500 505 510

His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met

515 520 525

Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu

530 535 540

Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val

545 550 555 560

Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ser

565 570 575

His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe Pro

580 585 590

Ala Thr Val

595

Claims (56)

1.用于治疗ER相关疾病或病症的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂化合物，

其中患者具有ESR1基因突变；

其中所述式(A)化合物具有以下结构：

其中，

R^a为-CO₂H或选自以下的5元杂环：

R^b为C₁-C₆烷基或C₃-C₆环烷基；

R^c为H或F；

每个R^d独立地选自H、卤素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每个R^e独立地选自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

每个R^f独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

X为CH或N；且

n为0、1或2，

或其药用盐或溶剂化物；

其中所述式(B)化合物具有以下结构：

其中，

R^a为-CO₂H或选自以下的5元杂环：

环C为

环D为苯基或噻吩基；

每个R^d独立地选自H、卤素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每个R^e独立地选自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

每个R^f独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

n为0、1或2，

或其药用盐或溶剂化物；

其中所述式(C)化合物具有以下结构：

其中，

R^a为-CO₂H或选自以下的5元杂环：

R^b为C₁-C₆烷基或C₃-C₆环烷基；

每个R^d独立地选自H、卤素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每个R^e独立地选自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

每个R^f独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；且

n为0、1或2，

或其药用盐或溶剂化物；且

其中所述式(D)化合物具有以下结构：

其中，

R¹为H、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

R²为H、F、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

R³为H、卤素、-CN、-OR⁶、-NHR⁶、-NR⁶R⁷、-SR⁶、-S(＝O)R⁷、-S(＝O)₂R⁷、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

每个R⁴独立地选自H、卤素、-CN、-OH、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₄烷基、氟C₁-C₄烷氧基和C₁-C₄烷氧基；

每个R⁵为H、F、Cl、-OH、-CH₃、-CF₃或-OCH₃；

每个R⁶独立地选自H、-C(＝O)R⁷、-C(＝O)OR⁷、-C(＝O)NHR⁷、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

每个R⁷独立地选自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、经取代的或未经取代的C₃-C₆环烷基、经取代的或未经取代的单环C₂-C₆杂环烷基、经取代的或未经取代的苯基和经取代的或未经取代的单环杂芳基；

n为0、1或2；且

t为1或2，

或其药用盐或溶剂化物。

2.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述雌激素受体调节剂为具有以下结构的式(A-1)化合物：

3.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述雌激素受体调节剂为具有以下结构的式(C-1)化合物：

4.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述雌激素受体调节剂为选自具有以下结构的式(D-1)、(D-2)、(D-3)和(D-4)的化合物：

5.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述雌激素受体调节剂选自化合物1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11和1-12。

6.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述雌激素受体调节剂为化合物1-3。

7.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述雌激素受体调节剂选自化合物2-1、2-2、2-3、2-4和2-5。

8.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述雌激素受体调节剂选自化合物3-1、3-2、3-3和3-4。

9.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述雌激素受体调节剂选自化合物4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11、4-12、4-13、4-14、4-15、4-16、4-17、4-18、4-19、4-20、4-21、4-22、4-23、4-24、4-25、4-26、4-27、4-28、4-29、4-30、4-31、4-32、4-33、4-34、4-35、4-36、4-37、4-38、4-39、4-40、4-41、4-42、4-43、4-44和4-45。

10.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述雌激素受体调节剂为化合物4-23。

11.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述ER相关疾病或病症为癌症。

12.权利要求11的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述癌症选自乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胶质瘤、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。

13.权利要求12的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述癌症为乳腺癌。

14.权利要求13的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述乳腺癌为转移性乳腺癌、激素抗性乳腺癌、雌激素受体阳性乳腺癌、雌激素受体阴性乳腺癌、孕激素受体阴性乳腺癌、HER2阳性乳腺癌或HER2阴性乳腺癌。

15.权利要求12的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述乳腺癌对用芳香酶抑制剂治疗具有抗性。

16.权利要求15的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述芳香酶抑制剂为阿那曲唑、来曲唑或依西美坦。

17.权利要求13的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述乳腺癌为Basal或Luminal亚型。

18.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者为绝经前或绝经后女性患者。

19.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者已经历一种或多种抗癌疗法失败。

20.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述ESR1基因中的突变为体细胞突变。

21.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者表达野生型ER和突变型ER。

22.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者表达两种突变型ER-α多肽的同二聚体。

23.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者表达两种野生型ER-α多肽的同二聚体。

24.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者表达一种野生型ER-α多肽和一种突变型ER-α多肽的异二聚体，或一种野生型ER-β多肽和一种突变型ER-α多肽的异二聚体。

25.权利要求24的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者具有肿瘤且多数肿瘤细胞表达突变型ER。

26.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者已接受化学治疗剂、生物疗法、癌症疫苗、血管生成抑制剂、激素疗法、放射疗法、外科手术或它们的任意组合。

27.权利要求26的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述生物疗法是肽、细胞因子、抗体、治疗性病毒、治疗性细菌、基因疗法、siRNA、过继性T细胞转移或它们的任意组合。

28.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者已接受芳香酶抑制剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、选择性雌激素降解剂(SERD)、PI3激酶/mTOR途径抑制剂，CDK4/6抑制剂、HER-2抑制剂、EGFR抑制剂、PD-1抑制剂、聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、HSP90抑制剂、VEGFR抑制剂、AKT抑制剂、化学疗法或它们的任意组合。

29.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者已接受氟维司群、他莫昔芬、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、戈舍瑞林、亮丙瑞林、雷洛昔芬、托瑞米芬、乙酸甲地孕酮、巴多昔芬或它们的任意组合。

30.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者已接受蒽环类抗生素、紫杉烷、铂剂、埃坡霉素或核苷类似物。

31.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者已接受顺铂、卡铂、卡培他滨、环磷酰胺、多西他赛、多柔比星、表柔比星、艾日布林、氟尿嘧啶、吉西他滨、伊沙匹隆、米托蒽醌、甲氨蝶呤、紫杉醇、帕米膦酸、长春瑞滨或它们的任意组合。

32.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述患者已接受帕妥珠单抗、曲妥单抗、拉帕替尼、依维莫司、贝伐单抗、坦西莫司或它们的任意组合。

33.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述ESR1突变导致替换、插入或缺失ER多肽中的一个或多个氨基酸。

34.权利要求33的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述ESR1突变导致雌激素受体的N末端结构域、DNA结合域、铰链区或配体结合域中的氨基酸替换。

35.权利要求33的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述ESR1突变导致雌激素受体的配体结合域中的氨基酸替换。

36.权利要求35的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述氨基酸替换位于SEQ ID NO:2的6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538或555位氨基酸。

37.权利要求36的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述氨基酸替换选自H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。

38.权利要求37的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述氨基酸替换选自L536R、Y537N、Y537C、Y537S和D538G。

39.权利要求1的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中通过以下步骤针对用所述雌激素受体调节剂化合物的治疗选择患者：

a)在包含来自患者的核酸的样品中检测ESR1基因中的突变；和

b)若患者具有ESR1突变，则针对用所述雌激素受体调节剂化合物的治疗选择患者。

40.权利要求39的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述核酸为RNA或DNA。

41.权利要求40的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述DNA为基因组DNA。

42.权利要求39的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述方法还包括从核酸样品中分离mRNA。

43.权利要求39的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述方法还包括从核酸样品中扩增包含所述突变的核酸分子。

44.权利要求43的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中通过聚合物酶链式反应(PCR)或数字PCR进行扩增。

45.权利要求44的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中PCR扩增包括使用一对侧翼具有包含所述突变的区域的寡核苷酸引物。

46.权利要求39的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其包括使所述核酸与序列特异性核酸探针接触，其中所述序列特异性核酸探针与具有所述突变的核酸结合且不与野生型核酸结合。

47.权利要求37的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述样品包含来自一种或多种肿瘤细胞的核酸。

48.权利要求47的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述肿瘤细胞取自肿瘤活检样品、血液样品、血清样品、淋巴样品或骨髓穿刺液。

49.权利要求48的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述肿瘤细胞是循环肿瘤细胞。

50.权利要求49的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物，其中所述样品包含循环肿瘤DNA(ctDNA)。

51.试剂盒，其包含一种或多种用于检测ESR1突变的试剂以及权利要求1的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受体调节剂化合物。

52.药物组合物，其包含权利要求1至50中任一项的用于治疗ER相关疾病或病症的雌激素受体调节剂化合物和一种或多种药用赋形剂。

53.权利要求1至50中任一项的雌激素受体调节剂化合物在制备用于治疗ER相关疾病或病症的药物中的用途。

54.权利要求1至50中任一项的雌激素受体调节剂化合物在治疗ER相关疾病或病症中的用途。

55.用于治疗患者的ER相关疾病或病症的方法，其包括向患者给予权利要求1至34中任一项的雌激素受体调节剂化合物。

56.如本申请所述的发明。