CN106467918A - 一种基于人皮肤细胞的胰岛素分泌细胞的诱导方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于人皮肤细胞的胰岛素分泌细胞的诱导方法及应用，属于分子细胞学技术领域。本发明所提供的方法是将获得的外源转录因子PDX1、Mafa、Ngn3、Hnf6和NeuroD1构建到慢病毒载体Psin上，再将病毒载体与包装质粒一起转染到病毒孵育细胞中培养，培养结束后再将病毒感染到人皮肤细胞中，培养后获得胰岛素分泌细胞。本发明首次确定了利用PDX1，Mafa，Ngn3，Hnf6与NeuroD15个转录因子能够有效的将人成纤维细胞诱导分化为具备完全功能的胰岛beta细胞，并且诱导形成的细胞在体内不会成瘤，只具备单一分泌胰岛素的能力，在体内能够有效的降低血糖的水平。

Description

一种基于人皮肤细胞的胰岛素分泌细胞的诱导方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基于人皮肤细胞的胰岛素分泌细胞的诱导方法及应用，属于分子细胞学技术技术领域。

背景技术

糖尿病是一组由于胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍所导致的以高血糖为特征的代谢性疾病。持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致全身组织器官，特别是眼、肾、心血管及神经系统的损害及其功能障碍，甚至衰竭。在糖尿病的治疗过程中胰岛素起到重要作用，尤其是对I型糖尿病患者。

目前，通过干细胞定向分化或者利用小分子药物直接将成纤维细胞转化为胰岛素产生或者分泌细胞中时，在客观上存在定向分化步骤繁琐，诱导形成的细胞不具备胰岛beta细胞的完全功能或者形成的细胞不够单一，在形成的细胞中具备多种细胞的功能，例如同时产生胰岛素，胰高血糖素等。现有技术中虽然存在将人体其他细胞或干细胞定向诱导为胰岛素分泌细胞的报道，但尚无将人体皮肤细胞诱导为胰岛素分泌细胞的报道。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种基于人皮肤细胞的胰岛素分泌细胞的诱导方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种基于人皮肤细胞的胰岛素分泌细胞的诱导方法。该方法是将获得的外源转录因子PDX1、Mafa、Ngn3、Hnf6和NeuroD1构建到慢病毒载体Psin上，再将病毒载体与包装质粒一起转染到病毒孵育细胞中培养，培养结束后再将病毒感染到人皮肤细胞中，培养后获得胰岛素分泌细胞。

所述方法的步骤如下：

1)通过克隆获得外源转录因子PDX1、Mafa、Ngn3、Hnf6和NeuroD1；

2)将步骤1)所得的外源转录因子构建的慢病毒载体Psin上，获得病毒载体；

3)将步骤2)所得的病毒载体与包装质粒一起转染到病毒孵育细胞中培养，培养结束后孵育病毒；

4)利用步骤3)所得的孵育病毒感染人皮肤细胞后进行培养，培养结束后获得胰岛素分泌细胞。

优选地，步骤3)所述包装质粒，是包装质粒PMD2G和包装质粒PSPAX2；所述病毒孵育细胞，是293T细胞；所述转染，转染比例是PMD2G：PSPAX2：293T＝2:2:1。

优选地，步骤4)所述人皮肤细胞，是人皮肤成纤维细胞。

优选地，步骤4)所述培养，是在感染后24h更换培养液，使用诱导培养基进行培养。

更优选地，所述诱导培养基，是含有胰岛素铁硒传递蛋白ITS，10ng/ml EGF，10ng/ml bFGF的IMDM培养基。

所述方法的具体步骤如下：

1)克隆获得外源转录因子PDX1、Mafa、Ngn3、Hnf6和NeuroD1；

2)将步骤1)所得的5个外源转录因子连接到慢病毒载体Psin上，获得病毒载体；

3)以293T细胞为病毒孵育细胞，将步骤2)所得的病毒载体与包装质粒PMD2G和PSPAX2按照PMD2G：PSPAX2：293T＝2:2:1的比例转染到293T细胞中，培养后获得孵育病毒；

4)将利用步骤3)所得的孵育病毒感染人皮肤成纤维细胞后培养24h，培养结束后更换培养液使用诱导培养基；所述诱导培养基，是含有胰岛素铁硒传递蛋白ITS，10ng/ml EGF，10ng/ml bFGF的IMDM培养基。

所述任一方法在胰岛素分泌细胞的诱导培养过程中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明获得的有益效果如下：

本发明利用基因PDX1，Mafa，Ngn3作为组合核心，并在此基础上分别加入基因Hnf6和NeuroD1，实现了选择最少基因数目的组合来诱导人成纤维细胞产生胰岛素。同时，本发明还成功使诱导获得的细胞具备能够响应葡萄糖的能力，能够通过葡萄糖的浓度变化来调整胰岛素的产生分泌。

另外，本发明首次确定了利用PDX1，Mafa，Ngn3，Hnf6与NeuroD15个转录因子能够有效的将人成纤维细胞诱导分化为具备完全功能的胰岛beta细胞，并且诱导形成的细胞在体内不会成瘤，只具备单一分泌胰岛素的能力，在体内能够有效的降低血糖的水平。

附图说明

图1为实施例2电泳检测图。

图2为实施例2细胞荧光检测图。

图3为实施例3RT-PCR检测图。

图4为实施例3细胞免疫荧光检测图。

图5为不同葡萄糖浓度对胰岛素水平的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例所用试剂、材料、仪器和方法，未经特殊声明，均为本技术领域中常规试剂、材料、仪器和方法，均可以通过商业渠道获得。

生物及细胞样品：NOD-SCID小鼠，细胞样品为人包皮成纤维细胞以及诱导形成的胰岛beta细胞。

培养基：IMDM培养基。

实施例1外源转录因子感染人包皮成纤维细胞胰岛素分泌细胞的诱导

在本实施例中，发明人将基因首先构建到慢病毒载体Psin上，与PMD2G和PSPAX2包装质粒在293T细胞中进行转染，转染比例为2:2:1。在转染病毒48小时后，收集病毒。将病毒感染到人成纤维细胞中，24小时后进行换液。在细胞感染病毒2天后，使用特定的培养基进行培养(IMDM+1×ITS+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF)。

实施例2胰岛素分泌测定

RT-PCR实验：在病毒感染人成纤维细胞20天时，收集细胞利用Trizol进行裂解，抽提RNA，利用逆转录试剂盒对RNA进行逆转录，利用PCR的方式对相关基因进行PCR，通过电泳检测，观察相关基因表达水平。如图1所示。

细胞免疫荧光：在病毒感染人成纤维细胞20天时，使用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞10分钟，Triton-100穿孔处理15分钟，2％BSA封闭孵育1小时，一抗(缓冲液为2％BSA)孵育2小时，ALEXA-二抗(带有荧光的二抗)孵育1小时后封片。在荧光显微镜下观察胰岛素的产生情况，如图2所示。

实施例3细胞葡萄糖响应实验

RT-PCR实验步骤如实施2，结果如图3所示。

细胞免疫荧光实验步骤如实施2，结果如图4所示。

胰岛素体外分泌实验：培养的细胞首先用KRB缓冲液进行多次洗涤。然后预孵育含有2mM葡萄糖的KRB缓冲液2小时除去残留在培养基中的胰岛素。细胞再次用KRB缓冲液洗2次，然后用含有2mM葡萄糖的KRB缓冲液孵育30min，收集上清。然后细胞再次用KRB缓冲液洗2次，然后用含有20mM葡萄糖的KRB缓冲液孵育30min，收集上清。细胞用BCA法进行蛋白标准定量；用人胰岛素检测试剂盒检测2mM葡萄糖以及20mM葡萄糖下细胞释放胰岛素的水平。结果如图5所示。

实施例4小鼠降血糖实验

在对5因子诱导形成的细胞进行克隆筛选，并且进行扩大培养。用1％的巴比妥对NOD-SCID小鼠(该小鼠被STZ处理过，成为糖尿病小鼠)进行麻醉后，在其腰腹处进行剃毛处理，然后用70％的酒精进行擦拭，这样能够更加方便看到小鼠肾所在的位置。在小鼠肾所在位置剪开一个大约1-2cm的伤口，然后剪开肌肉层，找到肾脏后，通过挤压的方式，使肾脏从伤口处出来。用无菌的PBS对肾脏进行润湿，防止肾脏过于干涸。然后利用注射器的针头轻轻的在肾脏上划出一个开口，轻轻的将注射针头推进肾囊中，然后慢慢注射细胞。每个肾脏注射50万的细胞量。注射完毕后，缝合肌肉层与表皮，放在37℃恒温器上，加快小鼠的苏醒。每隔相应的时间取小鼠尾静脉血检测血糖水平。实验结果发现注射了5因子诱导的细胞后，能够有效的降低糖尿病小鼠中的血糖水平。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种基于人皮肤细胞的胰岛素分泌细胞的诱导方法，其特征在于，是将获得的外源转录因子PDX1、Mafa、Ngn3、Hnf6和NeuroD1构建到慢病毒载体Psin上，再将病毒载体与包装质粒一起转染到病毒孵育细胞中培养，培养结束后再将病毒感染到人皮肤细胞中，培养后获得胰岛素分泌细胞。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)通过克隆获得外源转录因子PDX1、Mafa、Ngn3、Hnf6和NeuroD1；

2)将步骤1)所得的外源转录因子构建的慢病毒载体Psin上，获得病毒载体；

3)将步骤2)所得的病毒载体与包装质粒一起转染到病毒孵育细胞中培养，培养结束后孵育病毒；

4)利用步骤3)所得的孵育病毒感染人皮肤细胞后进行培养，培养结束后获得胰岛素分泌细胞。

3.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述包装质粒，是包装质粒PMD2G和包装质粒PSPAX2；所述病毒孵育细胞，是293T细胞；所述转染，转染比例是PMD2G：PSPAX2：293T＝2:2:1。

4.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述人皮肤细胞，是人皮肤成纤维细胞。

5.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述培养，是在感染后24h更换培养液，使用诱导培养基进行培养。

6.权利要求5所述方法，其特征在于，所述诱导培养基，是含有胰岛素铁硒传递蛋白ITS，10ng/ml EGF，10ng/ml bFGF的IMDM培养基。

7.权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)克隆获得外源转录因子PDX1、Mafa、Ngn3、Hnf6和NeuroD1；

2)将步骤1)所得的5个外源转录因子连接到慢病毒载体Psin上，获得病毒载体；

3)以293T细胞为病毒孵育细胞，将步骤2)所得的病毒载体与包装质粒PMD2G和PSPAX2按照PMD2G：PSPAX2：293T＝2:2:1的比例转染到293T细胞中，培养后获得孵育病毒；

4)将利用步骤3)所得的孵育病毒感染人皮肤成纤维细胞后培养24h，培养结束后更换培养液使用诱导培养基；所述诱导培养基，是含有胰岛素铁硒传递蛋白ITS，10ng/mlEGF，10ng/ml bFGF的IMDM培养基。

8.权利要求1-7所述任一方法在胰岛素分泌细胞诱导培养过程中的应用。