CN106432173B - 一种新型化学合成的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种化学合成的药物胡椒酸钾及其用于制备乳腺癌靶向治疗药物的应用。乳腺癌靶向药物胡椒酸钾(GBK)，其结构式如下：通过对乳腺癌靶向药物胡椒酸钾的药理药效鉴定证明，胡椒酸钾对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，而对正常细胞的增殖没有影响，因此，可开发为一种新型的抗肿瘤临床药物，或与现有抗肿瘤药物联合用药，进一步也可研发出低毒性、具有选择性的抗肿瘤辅助药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种化学合成的药物胡椒酸钾及其用于制备乳腺癌靶向治疗药物的应用,更具体地说涉及药物胡椒酸钾的化学合成、抗癌效果以及对于乳腺癌靶向治疗的应用研究。
背景技术
心血管疾病主要是由于血液中胆固醇的增加引起的，据世界卫生组织估计大约有20％的中风和50％的心脏病与血液中的高胆固醇含量有关。在临床上广泛使用的降血脂药物为他汀类药物(statins)，例如辛伐他汀(simvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)等。他汀类药物作为3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的抑制剂,可以可逆的抑制HMG-CoA向甲羟戊酸转变，使细胞内胆固醇和类异戊二烯的生物合成降低。荜茇(Piper longum L.)是常见的胡椒科植物,是传统的具有降脂作用的蒙药。针对荜茇的有效成分鉴定，可以得到胡椒碱(piperine,GBO)、荜茇环碱(pipernonaline)、荜茇宁(piperlonguminine,GBN)三种有效成分。这些有效成分可以显著的降低实验大鼠血清总胆固醇(TC)、血清中甘油三酯(TG)的含量，显著增加高密度脂蛋白胆固醇(high densitylipoprotein cholesterol，HDL-C)的含量，轻度的减少低密度脂蛋白胆固醇的含量(lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C)，降脂的效果与降脂西药辛伐他汀相类似。以胡椒碱为起始原料，已经成功地合成了具有降血脂生物活性的荜茇宁，并且在合成过程中产生了一系列具有降血脂活性的衍生物，比如胡椒酸钾(potassium piperate，GBK)。通过大鼠体内实验，证实化学合成的荜茇宁及衍生物胡椒酸钾可以显著的降低实验大鼠血清总胆固醇(TC)、血清中甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇的含量(LDL-C)，增加高密度脂蛋白胆固醇的含量(HDL-C)，降脂的效果与胡椒碱及辛伐他汀相类似。
他汀类药物除了具有降血脂的作用之外，还具有抗肿瘤、抗炎症反应、抗增殖等作用。脂类代谢异常是细胞癌变的一个重要特点，因为参与胆固醇生物合成和蛋白质异戊烯化的甲羟戊酸途径参与了肿瘤形成的多个方面。致癌基因,例如Ras蛋白家族的Ras和RhoGTPases的翻译后修饰也与上述途径有关。他汀类药物可以通过类异戊二烯中间物焦磷酸法尼酯(farnesyl pyrophosphat，FPP)和牛龙牛儿醇焦磷酸酯(geranyl pyrophosphate，GPP)抑制癌基因蛋白异戊烯化，这对Ras蛋白家族的修饰非常重要。临床研究表明他汀类药物可降低炎症标志物高敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)表达水平，减少炎症反应等作用。通过降低类异戊二烯中间物FPP和GPP的合成，可以抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤组织血管再生、肿瘤转移和侵染等。
蒙药荜茇有效成分及其衍生物是否也具有抗肿瘤的效果,是否可以作为某些肿瘤治疗的辅助药物尚未见相关报道。基于上述原理，申请人探索了蒙药荜茇有效成分及其衍生物的抗肿瘤的效果，以便作为某些肿瘤治疗的辅助药物。申请人选取化学合成的荜茇有效成分胡椒碱(GBO)、荜茇宁(GBN)以及衍生物胡椒酸钾(GBK)，探索其对肿瘤细胞增殖的抑制作用和分子机理。实验发现在胡椒碱(GBO)、荜茇宁(GBN)及胡椒酸钾(GBK)中，只有胡椒酸钾对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，而对正常细胞的增殖没有影响。进一步的实验发现GBK对乳腺肿瘤细胞的增殖有较强的抑制作用,GBK特异性阻止乳腺肿瘤细胞MCF-7的G1/S转接(transition)。GBK抗肿瘤机理主要是通过作用于细胞周期的G1期，激活肿瘤抑制因子p53，促进细胞周期依赖性激酶抑制剂p27的表达，抑制G1/S期转接过程中关键复合物CyclinE/CDK2活性及CDK2的表达，抑制S期关键复合物CyclinA/CDK2的活性及CyclinA的表达，抑制M期关键复合物CyclinB/CDK1的活性及CyclinB的表达，最终抑制细胞周期进程。并通过使转录因子E2F的表达量下调，影响DNA复制起始解旋酶复合物MCM2-7中蛋白组分的转录及翻译，抑制DNA复制。同时GBK也可以通过诱导细胞对于还原氧引起的压力应答，诱导乳腺癌细胞凋亡。GBK可能会通过抑制DNA甲基化和促进组蛋白去乙酰化等表观遗传修饰方式抑制乳腺癌细胞的增殖。通过小鼠异种移植模型实验，证实在体内作用的过程中，GBK处理可以在不影响小鼠正常生长发育的情况下抑制乳腺癌瘤体的进一步生长。GBK与依托泊苷联合用药，可以在达到相同肿瘤细胞抑制率的情况下，减少依托泊苷的用量，因此有可能在临床中与依托泊苷联合使用，用于乳腺癌的化疗过程。
探索化学合成化合物的药理药效，特别是抗肿瘤的药理药效,常用的手段为测定IC50(能够诱导细胞凋亡50％的药品浓度)、细胞增殖实验、细胞集落形成实验、细胞周期检测、鼠异种移植实验。通过上述实验，可以检测药物是否可以抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞周期，是否在小鼠体内实验中具有与体外实验相似的抑制肿瘤细胞增殖的功能。
发明内容
本发明的目的是通过化学合成的胡椒酸钾对乳腺肿瘤细胞增殖的特异性抑制作用和内在分子机理研究，提供一种用于治疗乳腺癌靶向药物胡椒酸钾，为胡椒酸钾进入治疗乳腺癌的临床阶段奠定基础。
同时，本申请的目的还在于提供了乳腺癌靶向药物胡椒酸钾制备方法和乳腺癌靶向药物胡椒酸钾的药理药效鉴定方法。
本申请的目的是这样实现的：一种乳腺癌靶向药物胡椒酸钾(GBK)，其结构式如下：
乳腺癌靶向药物胡椒酸钾制备方法，其特征在于：胡椒酸钾是以胡椒碱为原料合成的水溶性降脂胡椒碱衍生物，具体的合成步骤如下：首先将3.5kg氢氧化钾在15升95％乙醇中充分溶解，然后加入2kg胡椒碱搅拌充分溶解，回流反应10h,此时将温度控制在88℃，抽滤，即得到胡椒酸钾。
乳腺癌靶向药物胡椒酸钾的药理药效鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)化学合成:胡椒酸钾是以胡椒碱为原料合成的水溶性降脂胡椒碱衍生物，具体的合成步骤如下：首先将3.5kg氢氧化钾在15升95％乙醇中充分溶解，然后加入2kg胡椒碱搅拌充分溶解，回流反应10h,此时将温度控制在88℃，抽滤，即得到胡椒酸钾盐；
(2)肿瘤细胞系及正常对照细胞系的培养：
实验过程中用到的肿瘤细胞系及正常对照细胞系的名称及培养方式如下：
三种培养基的不同成分购自不同的生物公司，其中DMEM、RPMI-1640购自HyClone公司，F12购自gibco公司、青链霉素混合液Pen Strep(+10000Units/ml Penicillin、+10000μg/ml Streptomycin)、谷氨酰胺L-Glu(100×L-Glutamin)，胰岛素(insulin)和地塞米松(dexamethasone)购自SIGMA公司；
培养步骤：贴壁细胞在相应培养基中置于37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养，当细胞密度达到培养器皿底面积的80％的时候，按照1：10的比例进行细胞传代。传代时先用适量胰酶消化细胞，直至大多数的细胞从培养皿底部消化起来，之后用9倍于胰酶体积的完全培养基终止消化反应。按照所需细胞浓度进行细胞的传代；
(3)胡椒酸钾对正常细胞和癌细胞毒性测定
通过测定胡椒酸钾对正常细胞和癌细胞毒性，以确定在后续实验过程中药物的使用浓度，步骤如下：
将多种正常细胞(GES-1，L132，HSF，COS-7)和癌细胞(MCF-7，SUM159，HepG2，A549，BGC-823，SGC-7901)从37℃，5％CO2培养箱中拿出来，在超净台中去掉各自的培养基，加入10ml 1×PBS(Transgen Biotech)洗去残留的培养基，在每个培养皿中加1ml 0.05％的胰酶，放回到细胞培养箱中37℃，5％CO2中消化3min。3min后取出培养皿，在显微镜下观察是否将细胞消化起来，在消化起来的细胞培养皿中加入适量相应培养基终止消化，吹打均匀后，取10μl于血细胞计数板上，用血细胞计数板计数1ml培养基中细胞的个数，之后调节培养基中的细胞个数，使其终浓度为5×103/100μl。取出96孔板，在96孔板最外层每孔加入100μl 1×PBS，然后向96孔板的最左侧一列加入100μl空白培养基，作为阴性对照组，在其余孔中各加入100μl相应的细胞悬液，摇匀后重新放回培养箱中37℃，5％CO2培养24h，用于细胞贴壁生长。24h后除阴性对照和阳性对照外，从左向右依次加入0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml浓度梯度的GBK作用于细胞中48h，48h后向每孔(包括阴性对照组和阳性对照组)均加入10μl CCK-8溶液，在细胞培养中继续培养90min，在酶标仪上OD＝450nm波长下，测定细胞的存活率，预测GBK对不同细胞作用的IC50值；
(4)胡椒酸钾的选择性抑制作用实验
通过测定胡椒酸钾对于不同的癌细胞系以及正常细胞系生长的抑制作用，确定胡椒酸钾是否对某些癌细胞的增殖具有选择性的抑制作用，步骤如下：
将贴壁的正常细胞及癌细胞消化起来，细胞计数后调节细胞浓度，使其浓度为5×103/100μl，在96孔板最外层每孔加入100μl 1×PBS，向第一列加入每种细胞相应的空白培养基，向96孔板的其余每个孔中各加100μl细胞悬液，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h；24h后按照0μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、290μg/ml、400μg/ml的浓度向每孔中加入无菌无酶水或GBK溶液，每种细胞分别都设置这6个GBK的浓度梯度；每次实验相同浓度重复3次，且独立实验重复3次，每种细胞均使用各自培养基作为调0孔，到相应时间点后向每孔加入10μl CCK-8溶液继续培养90min，用酶标仪在OD＝450nm波长下读数，计算细胞活性；
(5)胡椒酸钾对肿瘤细胞周期的影响
抗肿瘤药物对于肿瘤细胞增殖的抑制作用一般是通过产生细胞压力(cellularstress),比如氧化压力、复制压力、代谢和蛋白毒性压力以及DNA损伤；DNA复制压力作用于细胞周期进程的不同阶段，阻碍细胞周期进程，最终达到抑制肿瘤细胞增殖的目的；因此检测胡椒酸钾对肿瘤细胞周期的影响，用于确认其抑制癌细胞增殖的机理。
取出MCF-7、HepG2、SGC-7901，消化细胞后，将细胞分别用6cm板，在细胞培养箱中37℃，5％CO2培养24h；24h后以0μg/ml、1/2IC50μg/ml、IC50μg/ml、2IC50μg/ml浓度加入GBK溶液处理细胞48h；48h后收集细胞，使用流式细胞仪检测：配制70％乙醇，放在-20℃预冷；倒掉培养基，向每个6cm板中加入少量1×PBS，洗去残留的培养基，向每个6cm板中加入0.6ml0.05％的胰酶，放回到37℃，5％CO2细胞培养箱中消化细胞3min。3min后，取出6cm板，向每个6cm板中加入1.4ml 1×PBS吹打均匀，终止消化，并将其收集到2ml离心管中；500rpm，离心10min。取出离心管，弃上清液，重新加入1ml 1×PBS重悬细胞，洗去残留胰酶，500rpm，离心10min。10min后，取出离心管，弃上清液，再次加入200μl 1×PBS重悬细胞；从冰箱中取出提前预冷的70％乙醇，取800μl加入到1.5ml离心管中，置于冰上继续预冷；将200μl 1×PBS重悬的细胞悬液加到预冷的70％乙醇中，置于冰上固定30min；从-20℃中取出RNase A，取1μl 10mg/ml RNase+99μl去离子水配制成100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，备用；从4℃冰箱中取出1mg/ml PI，取62.5μl 1mg/ml PI+937.5μl去离子水将PI稀释为62.5μg/ml，备用；30min后，从冰上取出离心管，置于离心机中500rpm，离心10min；10min后取出离心管，弃上清液，加入500μl 1×PBS重悬细胞，500rpm，离心10min，洗去残留的乙醇。取出离心管，弃上清液，向每个离心管中各自加入100μl 100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，室温下孵育5min；5min后，向每个离心管中加入400μl 62.5μg/ml的PI染料，工作浓度为50μg/ml，置于冰上，避光孵育染色30min；30min后，将细胞悬液用200目的筛子过滤到流式细胞上样管中，每个上样管都须置于冰上，上样检测，分析数据；
(6)胡椒酸钾对肿瘤细胞信号通路的影响
首先从胡椒酸钾处理过的癌细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后进行人类细胞全基因组转录芯片(global transcriptional microarray)筛选，筛选出胡椒酸钾处理后乳腺瘤细胞(MCF-7)及胃癌细胞(SGC-7901)相对于不处理的相应肿瘤细胞系的差异表达基因，筛选出GBK影响的细胞途径；
提取总RNA的过程及反转录过程：将MCF-7及SGC-7901细胞从细胞培养箱中取出后，用胰蛋白酶消化起来，并以2×106个/10ml的细胞量铺板，并放于细胞培养箱中培养24h，24h后取出2个10cm板，按照1.5IC50μg/ml的浓度分别向两个培养皿中加入GBK溶液和无菌无酶的水(对照组)，分别标为实验组和对照组，继续置于培养箱中培养48h，48h后提取总RNA，具体步骤如下：从培养箱中取出2个培养皿，去掉培养基，并用1×PBS洗一次，洗去残留的培养基；向2个培养皿中分别加入1ml TransZolTM Up，轻轻摇晃培养皿，吹打细胞，使裂解液能够均匀的分布在培养皿表面，与细胞密切接触。用细胞刮铲充分刮铲贴壁细胞，使得裂解液中无明显沉淀；用无菌无酶的枪头将细胞裂解液加入到1.5ml无菌无酶离心管中；在无菌无酶的条件下，室温中静置5min；向1.5ml无菌无酶离心管中加入200μl氯仿，剧烈振荡30s，无菌无酶条件下室温放置3min；将离心管置于提前预冷的低温离心机中10000rpm，低温(4℃)离心15min；取500μl上清液于一个新的1.5ml无菌无酶离心管中，然后加入500μl异丙醇，颠倒混匀，在室温条件下放置10min；10000rpm，低温(4℃)，离心10min；从离心机中取出离心管，弃上清；向1.5ml离心管中加入1ml提前配制好的75％乙醇溶液，涡旋1min；7500rpm，低温(4℃)离心5min；弃上清，在无菌无酶条件下室温干燥，使残留的乙醇完全挥发掉；向1.5ml离心管中加入50μl RNA溶解液；在60℃烘箱中放置10min，在超净台中分装3μl于小的无菌无酶PCR管中，用于凝胶电泳和浓度检测，其余保存于-80℃冰箱中用于后续qRT-PCR；用无水乙醇处理电泳槽，并重新配置电泳用凝胶取少量样品跑电泳；反转录的试剂购自TransGen Biotech(货号AT-311)，按照试剂盒说明书进行反转录；
对人类细胞全基因组转录芯片筛选出的差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证：实验所使用的荧光染料为Takara公司的Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(货号RR820A)。
本申请作为一种治疗乳腺癌的临床药物，其特征在于：所述的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾。
本申请乳腺癌靶向药物胡椒酸钾能够在制备治疗乳腺癌临床药物中的应用。
本申请乳腺癌靶向药物胡椒酸钾在制备治疗乳腺癌临床药物中的应用方式之一是，将乳腺癌靶向药物胡椒酸钾与依托泊苷联合用药。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
(1)本发明通过对化学合成药物胡椒酸钾对乳腺肿瘤细胞增殖的特异性抑制作用和内在分子机理的研究，为胡椒酸钾进入治疗乳腺癌的临床阶段奠定基础。胡椒酸钾是具有降脂作用的化学合成药物，因此在高血脂病人长期服用的过程中，可以同时用于预防乳腺癌发病的目的。
(2)有些抗肿瘤药物对于细胞周期的抑制作用没有细胞特异性，导致在杀死肿瘤细胞的同时也抑制了正常细胞的细胞周期进程，对患者的身体造成比较大的伤害。对胡椒酸钾抗肿瘤作用及其机制的研究，胡椒酸钾对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，而对正常细胞的增殖没有影响，因此，具有理论意义和临床应用前景，可以开发为一种新型的抗肿瘤临床药物，或与现有抗肿瘤药物联合用药，进一步可以研发出低毒性、具有选择性的抗肿瘤辅助药物。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1胡椒酸钾在不同的癌细胞系以及正常细胞系中半致死浓度测定。胡椒酸钾对于不同的癌细胞具有细胞毒性，对于正常细胞没有毒性。
图2胡椒酸钾浓度梯度处理对正常细胞增殖基本没有影响。
图3胡椒酸钾浓度梯度处理选择性抑制肿瘤细胞增殖，特别是乳腺癌细胞的增殖。
图4胡椒酸钾浓度梯度处理选择性抑制乳腺癌细胞周期进程，对肝癌及胃癌细胞的细胞周期进程无影响。
图5胡椒酸钾处理影响乳腺癌细胞MCF-7和胃癌细胞SGC-7901的不同信号通路。
图6胡椒酸钾处理下调乳腺癌细胞中与细胞周期及DNA复制相关的基因。
图7胡椒酸钾处理会抑制NOD/SCID鼠体内乳腺癌细胞异种移植肿瘤的生长。
图8胡椒酸钾处理后NOD/SCID鼠乳腺癌细胞异种移植肿瘤组织切片病理分析，A为HE染色显示胡椒酸钾处理会降低组织恶性化水平，B为免疫组化染色显示胡椒酸钾处理会降低血管内皮生长因子的表达水平。
图9胡椒酸钾与依托泊苷联合使用对MCF-7细胞活性的影响，将两种药物共同作用于MCF-7细胞后，可以在达到相似的细胞抑制率的同时减少依托泊苷的用量。
具体实施方式
在下面的实施例中进一步说明了本发明的应用实例，但这并不限制本发明的范围，这些方法可以应用于其他化学合成药物、天然产物的活性成分、以及其他慢性药物抗癌药效的研究。
实施例1：胡椒酸钾对癌细胞的选择性抑制作用
在用0μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、290μg/ml和400μg/ml浓度的GBK处理正常细胞(GES-1，HSF，L132，COS-7)及癌细胞(MCF-7，SUM159，A549，BGC-823，SGC-7901，HepG2)48h，然后每孔加入10μl CCK-8，37℃，5％CO2处理细胞90min，在酶标仪上OD＝450nm的波长下测定光吸收值，并在Excel表格中运用公式：细胞活性＝(加药组的光吸收值-阴性对照组光吸收值)/(加水组的光吸收值-阴性对照组光吸收值)，得出在不同的GBK浓度下细胞活性比率，进行3次彼此独立的实验。发现随着GBK浓度从0到400μg/ml增加，在浓度不断上升过程中，正常细胞的细胞活性没有受到抑制或受到的抑制作用很小，而癌细胞的活性在不断下降(参见图2，图3)。
实施例2：胡椒酸钾选择性抑制乳腺癌细胞周期进程
GBK对癌细胞的抑制作用实验证明，GBK选择性抑制癌细胞的增殖，尤其是乳腺癌细胞，而对正常细胞的增殖基本没有影响。实验结果显示，GBK会特异性阻止乳腺癌细胞MCF-7的G1/S转接(transition)，而对其他癌细胞(SGC-7901，HepG2)的G1/S转接没有影响。用0μg/ml、145μg/ml、290μg/ml、580μg/ml浓度的GBK来处理乳腺癌细胞48h，48h收集细胞，PI避光染色后，进行检测。随着GBK浓度从0到580μg/ml不断上升的过程中，MCF-7细胞系中处于G1期的乳腺癌细胞在不断增加，处于S期的细胞在明显减少(参见图4)。
实施例3：胡椒酸钾处理乳腺癌细胞后对于相关信号通路的影响
通过人类细胞全基因组转录芯片(global transcriptional microarray)技术，筛选出胡椒酸钾处理后乳腺癌细胞(MCF-7)及胃癌细胞(SGC-7901)相对于不处理的相应肿瘤细胞系的差异表达，筛选出GBK影响的细胞途径(参见图5)。从柱状图中可以看出MCF-7细胞中表达量发生改变的基因主要涉及到细胞周期，DNA复制与细胞凋亡等肿瘤发生发展的过程；在SGC-7901细胞中发生改变的基因多数涉及对有机物的应答，细胞迁移，与肥厚性心肌病等疾病相关。
实施例4：胡椒酸钾处理乳腺癌细胞后对相关基因表达水平的影响
通过人类细胞全基因组芯片的分析发现，与细胞周期及DNA复制相关信号通路中差异表达的基因最多。进一步对这些相关基因在GBK处理前后的MCF-7细胞中的表达量进行了实时荧光定量PCR验证。
将290μg/ml GBK处理过的MCF-7细胞提取到的RNA反转录成的cDNA以及未用GBK处理过的MCF-7提取所得RNA反转录成的cDNA作为模板，用待测基因的qRT-PCR引物作为反应引物，进行qRT-PCR实验(参见图6)。从柱状图中可以看出，在用GBK处理的细胞中，与细胞周期及DNA复制相关的基因与未用GBK处理的细胞中相应的基因相比有所下调。
实施例5：在NOD/SCID鼠中建立异种移植肿瘤模型检测胡椒酸钾在体内的抗肿瘤效果
NOD/SCID鼠中异种移植模型的建立所选用的是处于3-4周龄的12只NOD/SCID雌鼠，购买于北京博艾动物技术有限公司，培养在SPF级鼠房中，饲养NOD/SCID鼠所需的所有饲料、水、垫料以及动物需要直接接触的器物等均需通过126℃、20min高压蒸气灭菌。在向NOD/SCID鼠体内注射癌细胞之前需要进行如下处理：将处于对数生长期的MCF-7细胞用0.05％胰蛋白酶消化起来，加入一定量的PBS，吹打均匀后，收集于离心管中，1000rpm，低温(4℃)，离心5min。弃上清，重新向离心管中加入适量的PBS，用于重悬细胞。细胞计数，三次取平均值，作为细胞数的数值。按Matrigel：PBS＝1:1比例，调节细胞浓度，使细胞浓度为2×106个/100μl。在SPF级鼠房中向NOD/SCID鼠双侧后腿皮下注射配制好的肿瘤细胞悬液100μl，随机选定5只裸鼠作为对照组，另7只作为实验组，佩戴耳标。将NOD/SCID鼠以两只为一单位，置于鼠笼中每天给与食物和水，于SPF级鼠房中培养3周。在实验前一天给小鼠喝Neomycin sulfate/Polymycin B sulfate双抗水，并换上高压灭菌的垫料盒。在注射肿瘤细胞后每3天称量小鼠体重，并统计数据。在肿瘤块长到8mm3后，向每只裸鼠注射GBK药物或0.9％生理盐水。实验组按照10μg/g体重注射GBK，对照组注射相应体积的0.9％生理盐水，连续注射21天。在给药期间，每隔3天对小鼠进行称重并做好记录。每隔3天用游标卡尺对瘤块的大小进行测量记录，肿瘤体积按照如下的公式计算，肿瘤体积V＝ab2/2，(其中a是肿瘤最长径，b是肿瘤最短径)，并绘制肿瘤生长曲线和体重变化曲线。21天后，脱颈处死荷瘤鼠，摘取肿瘤块，剥离肿块秤重，并将实验组和对照组放置一起拍照，记录质地、浸润情况及血供情况。置于10％福尔马林中浸泡，用于后续做石蜡包埋、切片、HE染色及免疫组化，分析结果(参加图7)。
从图7-A中可以看出，注射了GBK药物的实验组瘤体大小比注射了生理盐水的对照组瘤体大小明显减小，存在显著性差异。在未注射药物之前，小鼠肿瘤的体积无显著性差异(p＝0.239)。我们可以从图7-B瘤体大小的折线图中看出，从第6天开始，与注射生理盐水组相比，当小鼠注射了GBK药物后，瘤体大小会显著小于对照组，在第21天时，对照组的体积为2.18225±0.512813，GBK组的体积为0.994857±0.384695，p＝0.000487。
实施例6：免疫与组织化学检测注射胡椒酸钾的NOD/SCID鼠肿瘤切片相关蛋白表达水平的变化。
通过免疫组织化学，比较在用GBK处理过的肿瘤块与未处理过的肿瘤块中与细胞周期及细胞凋亡相关蛋白质在组织中的表达差异，来进一步证明GBK药物是作用于细胞周期，通过阻断细胞周期及促进细胞凋亡来起作用的。
免疫组化的具体步骤如下：脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100％酒精-100％酒精-95％酒精-90％酒精-80％酒精-70％酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放10min，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话，就要适当延长脱蜡时间，一般为12-15min.PBS洗3次各5分钟，加入3％H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min(中火)，一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，5％BSA封闭，室温孵育10min。加一抗：弃血清，滴加一抗(1：50稀释抗体)1％BSA稀释，4℃过夜。加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗(山羊抗兔/抗鼠IgG-HRP)，然后置于37℃温箱中30～60min。PBS洗3次，每次5min，每张切片加100μl新配制的DAB溶液，显微镜下观察3～10分钟，控染色，显色完成后加入PBS终止显色。复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-100％酒精-100％酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
为了进一步验证胡椒酸钾注射对肿瘤组织形态的影响，进行了HE染色以及免疫组化分析(参见图8)。从图8-A中可以看出，注射了生理盐水组的小鼠肿瘤结构致密，且肿瘤周围坏死较少，而注射了胡椒酸钾小鼠的肿瘤组织结构较为疏松，且周围坏死较多，胡椒酸钾注射可以减少肿瘤组织的恶性化程度。图8-B为通过免疫组化检测血管内皮生成因子VEGF在胡椒酸钾注射前后的表达情况，从图中可以看出，在注射生理盐水组中VEGF表达阳性，而在注射胡椒酸钾组中VEGF呈现阴性，说明胡椒酸钾可以抑制肿瘤细胞周围的血管形成。
实施例7：胡椒酸钾与依托泊苷联合用药对细胞活性的的影响
依托泊苷为已应用于临床的成熟癌症治疗药物。在临床中依托泊苷与替吉奥胶囊联合使用，用于乳腺癌的化疗过程。但由于替吉奥胶囊本身为化学合成西药，有一定的毒负作用。为了进一步验证胡椒酸钾的药物作用，我们用胡椒酸钾(GBK)与依托泊苷(VP-16)共同作用于MCF-7细胞，测定单独及联合作用后对细胞活性的影响。
将乳腺癌细胞MCF-7消化起来后，细胞计数后调节细胞浓度为5×103/100μl，在96孔板最外层每孔加入100μl 1×PBS，向第一列加入空白培养基，向96孔板的其余每个孔中各加100μl细胞悬液，分别设置1+1、1+10、5+5、5+10和10+10这5种GBK+VP-16的浓度组合测定细胞活性，每次实验相同浓度重复3次，且独立实验重复3次，每种细胞均使用各自培养基作为调0孔，24h加入不同浓度的GBK+VP-16组合，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养48h，48h后向每孔加入10μl CCK-8溶液继续培养90min，用酶标仪在OD＝450nm波长下读数，计算细胞活性。
结果如图9所示，当单独使用依托泊苷处理乳腺癌细胞MCF-7的时候，达到59.72％的抑制率需要的依托泊苷浓度是10μg/ml；当单独使用胡椒酸钾处理乳腺癌细胞MCF-7的时候，达到50.00％的抑制率需要的依托泊苷浓度是290μg/ml；当将两种药物共同作用于MCF-7细胞后，达到45.96％的抑制率需要的组合浓度为依托泊苷5μg/ml+胡椒酸钾5μg/ml，两种药物的使用量都明显减少。所以两种药物共同作用后可以明显抑制乳腺癌细胞的生长，并显著减少依托泊苷的用量。
本发明所述的一种新型化学合成的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾的药理药效鉴定方法，包括以下步骤:
(7)化学合成:胡椒酸钾是以胡椒碱为原料合成的水溶性降脂胡椒碱衍生物，具体的合成过程如下：首先将3.5kg氢氧化钾在15升95％乙醇中充分溶解，然后加入2kg胡椒碱搅拌充分溶解，回流反应10h,此时要将温度控制在88℃，抽滤，即可得到胡椒酸钾盐(为了简化，在说明书的后续部分以GBK作为胡椒酸钾的简写)。
(8)肿瘤细胞系及正常对照细胞系的培养：
本发明实验过程中用到的肿瘤细胞系及正常对照细胞系的名称及培养方式如下：
三种培养基的不同成分购自不同的生物公司，其中DMEM、RPMI-1640购自HyClone公司，F12购自gibco公司、青链霉素混合液Pen Strep(+10000Units/ml Penicillin、+10000μg/ml Streptomycin)、谷氨酰胺L-Glu(100×L-Glutamin)，胰岛素(insulin)和地塞米松(dexamethasone)购自SIGMA公司。
贴壁细胞在相应培养基中置于37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养，当细胞密度达到培养器皿底面积的80％的时候，按照1：10的比例进行细胞传代。传代时先用适量胰酶消化细胞，直至大多数的细胞从培养皿底部消化起来，之后用9倍于胰酶体积的完全培养基终止消化反应。按照所需细胞浓度进行细胞的传代。
(9)胡椒酸钾对正常细胞和癌细胞毒性测定
通过测定胡椒酸钾对正常细胞和癌细胞毒性，以便确定在后续实验过程中药物的使用浓度。
将多种正常细胞(GES-1，L132，HSF，COS-7)和癌细胞(MCF-7，SUM159，HepG2，A549，BGC-823，SGC-7901)从37℃，5％CO2培养箱中拿出来，在超净台中去掉各自的培养基，加入10ml 1×PBS(Transgen Biotech)洗去残留的培养基，在每个培养皿中加1ml 0.05％的胰酶，放回到细胞培养箱中37℃，5％CO2中消化3min。3min后取出培养皿，在显微镜下观察是否将细胞消化起来，在消化起来的细胞培养皿中加入适量相应培养基终止消化，吹打均匀后，取10μl于血细胞计数板上，用血细胞计数板计数1ml培养基中细胞的个数，之后调节培养基中的细胞个数，使其终浓度为5×103/100μl。取出96孔板，在96孔板最外层每孔加入100μl 1×PBS，然后向96孔板的最左侧一列加入100μl空白培养基，作为阴性对照组，在其余孔中各加入100μl相应的细胞悬液，摇匀后重新放回培养箱中37℃，5％CO2培养24h，用于细胞贴壁生长。24h后除阴性对照和阳性对照外，从左向右依次加入0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml浓度梯度的GBK作用于细胞中48h，48h后向每孔(包括阴性对照组和阳性对照组)均加入10μl CCK-8溶液，在细胞培养中继续培养90min，在酶标仪上OD＝450nm波长下，测定细胞的存活率，预测GBK对不同细胞作用的IC50值(参见图1)。
(10)胡椒酸钾的选择性抑制作用实验
通过测定胡椒酸钾对于不同的癌细胞系以及正常细胞系生长的抑制作用，确定胡椒酸钾是否对某些癌细胞的增殖具有选择性的抑制作用。
将贴壁的正常细胞及癌细胞消化起来，细胞计数后调节细胞浓度，使其浓度为5×103/100μl，在96孔板最外层每孔加入100μl 1×PBS，向第一列加入每种细胞相应的空白培养基，向96孔板的其余每个孔中各加100μl细胞悬液，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h。24h后按照0μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、290μg/ml、400μg/ml的浓度向每孔中加入无菌无酶水或GBK溶液，每种细胞分别都设置这6个GBK的浓度梯度。每次实验相同浓度重复3次，且独立实验重复3次，每种细胞均使用各自培养基作为调0孔，到相应时间点后向每孔加入10μl CCK-8溶液继续培养90min，用酶标仪在OD＝450nm波长下读数，计算细胞活性。
(11)胡椒酸钾对肿瘤细胞周期的影响
抗肿瘤药物对于肿瘤细胞增殖的抑制作用一般是通过产生细胞压力(cellularstress),比如氧化压力、复制压力、代谢和蛋白毒性压力以及DNA损伤。DNA复制压力作用于细胞周期进程的不同阶段，阻碍细胞周期进程，最终达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。因此检测胡椒酸钾对肿瘤细胞周期的影响，将有助于探究其抑制癌细胞增殖的机理。
取出MCF-7、HepG2、SGC-7901，消化细胞后，将细胞分别用6cm板，在细胞培养箱中37℃，5％CO2培养24h。24h后以0μg/ml、1/2IC50μg/ml、IC50μg/ml、2IC50μg/ml浓度加入GBK溶液处理细胞48h。48h后收集细胞，使用流式细胞仪检测：配制70％乙醇，放在-20℃预冷。倒掉培养基，向每个6cm板中加入少量1×PBS，洗去残留的培养基，向每个6cm板中加入0.6ml0.05％的胰酶，放回到37℃，5％CO2细胞培养箱中消化细胞3min。3min后，取出6cm板，向每个6cm板中加入1.4ml 1×PBS吹打均匀，终止消化，并将其收集到2ml离心管中。500rpm，离心10min。取出离心管，弃上清液，重新加入1ml 1×PBS重悬细胞，洗去残留胰酶，500rpm，离心10min。10min后，取出离心管，弃上清液，再次加入200μl 1×PBS重悬细胞。从冰箱中取出提前预冷的70％乙醇，取800μl加入到1.5ml离心管中，置于冰上继续预冷。将200μl 1×PBS重悬的细胞悬液加到预冷的70％乙醇中，置于冰上固定30min。从-20℃中取出RNase A，取1μl 10mg/ml RNase+99μl去离子水配制成100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，备用。从4℃冰箱中取出1mg/ml PI，取62.5μl 1mg/ml PI+937.5μl去离子水将PI稀释为62.5μg/ml，备用。30min后，从冰上取出离心管，置于离心机中500rpm，离心10min。10min后取出离心管，弃上清液，加入500μl 1×PBS重悬细胞，500rpm，离心10min，洗去残留的乙醇。取出离心管，弃上清液，向每个离心管中各自加入100μl 100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，室温下孵育5min。5min后，向每个离心管中加入400μl 62.5μg/ml的PI染料，工作浓度为50μg/ml，置于冰上，避光孵育染色30min。30min后，将细胞悬液用200目的筛子过滤到流式细胞上样管中，每个上样管都须置于冰上，上样检测，分析数据。
(12)胡椒酸钾对肿瘤细胞信号通路的影响
首先从胡椒酸钾处理过的癌细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后进行人类细胞全基因组转录芯片(global transcriptional microarray)筛选，筛选出胡椒酸钾处理后乳腺瘤细胞(MCF-7)及胃癌细胞(SGC-7901)相对于不处理的相应肿瘤细胞系的差异表达基因，筛选出GBK影响的细胞途径。
提取总RNA的过程及反转录过程：将MCF-7及SGC-7901细胞从细胞培养箱中取出后，用胰蛋白酶消化起来，并以2×106个/10ml的细胞量铺板，并放于细胞培养箱中培养24h，24h后取出2个10cm板，按照1.5IC50μg/ml的浓度分别向两个培养皿中加入GBK溶液和无菌无酶的水(对照组)，分别标为实验组和对照组，继续置于培养箱中培养48h，48h后提取总RNA，具体步骤如下：从培养箱中取出2个培养皿，去掉培养基，并用1×PBS洗一次，洗去残留的培养基。向2个培养皿中分别加入1ml TransZolTM Up，轻轻摇晃培养皿，吹打细胞，使裂解液能够均匀的分布在培养皿表面，与细胞密切接触。用细胞刮铲充分刮铲贴壁细胞，使得裂解液中无明显沉淀。用无菌无酶的枪头将细胞裂解液加入到1.5ml无菌无酶离心管中。在无菌无酶的条件下，室温中静置5min。向1.5ml无菌无酶离心管中加入200μl氯仿，剧烈振荡30s，无菌无酶条件下室温放置3min。将离心管置于提前预冷的低温离心机中10000rpm，低温(4℃)离心15min。取500μl上清液于一个新的1.5ml无菌无酶离心管中，然后加入500μl异丙醇，颠倒混匀，在室温条件下放置10min。10000rpm，低温(4℃)，离心10min。从离心机中取出离心管，弃上清。向1.5ml离心管中加入1ml提前配制好的75％乙醇溶液，涡旋1min。7500rpm，低温(4℃)离心5min。弃上清，在无菌无酶条件下室温干燥，使残留的乙醇完全挥发掉。向1.5ml离心管中加入50μl RNA溶解液。在60℃烘箱中放置10min，在超净台中分装3μl于小的无菌无酶PCR管中，用于凝胶电泳和浓度检测，其余保存于-80℃冰箱中用于后续qRT-PCR。用无水乙醇处理电泳槽，并重新配置电泳用凝胶取少量样品跑电泳。反转录的试剂购自TransGen Biotech(货号AT-311)，按照试剂盒说明书进行反转录。
对人类细胞全基因组转录芯片筛选出的差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证：实验所使用的荧光染料为Takara公司的Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(货号RR820A)。
如上说明，本发明通过对化学合成药物胡椒酸钾对乳腺肿瘤细胞增殖的特异性抑制作用和内在分子机理的研究，为胡椒酸钾进入治疗乳腺癌的临床阶段奠定基础。应用本发明的相关研究方法，不仅适用于化学合成药物的研究，也适用于天然产物活性提取物的研究，同时也适用于其他慢性病治疗药物的抗癌活性的研究。
Claims (3)
1.胡椒酸钾GBK在制备治疗乳腺癌临床药物中的应用，所述的胡椒酸钾GBK，其结构式如下：
2.根据权利要求1所述的胡椒酸钾GBK在制备治疗乳腺癌临床药物中的应用，其特征在于：权利要求1所述的药物胡椒酸钾GBK与依托泊苷联合用药。
3.权利要求1所述的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾的药理药效鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)化学合成:胡椒酸钾是以胡椒碱为原料合成的水溶性降脂胡椒碱衍生物，具体的合成步骤如下：首先将3.5kg氢氧化钾在15升95％乙醇中充分溶解，然后加入2kg胡椒碱搅拌充分溶解，回流反应10h,此时将温度控制在88℃，抽滤，即得到胡椒酸钾盐；
(2)肿瘤细胞系及正常对照细胞系的培养：
实验过程中用到的肿瘤细胞系及正常对照细胞系的名称及培养方式如下：
三种培养基的不同成分DMEM、RPMI-1640、F12、青链霉素混合液Pen Strep、谷氨酰胺L-Glu、胰岛素和地塞米松购自不同的生物公司；
培养步骤：贴壁细胞在相应培养基中置于37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养，当细胞密度达到培养器皿底面积的80％的时候，按照1：10的比例进行细胞传代；传代时先用适量胰酶消化细胞，直至大多数的细胞从培养皿底部消化起来，之后用9倍于胰酶体积的完全培养基终止消化反应；按照所需细胞浓度进行细胞的传代；
(3)胡椒酸钾对正常细胞和癌细胞毒性测定：
通过测定胡椒酸钾对正常细胞和癌细胞毒性，以确定在后续实验过程中药物的使用浓度，步骤如下：
将多种正常细胞GES-1，L132，HSF，COS-7和癌细胞MCF-7，SUM159，HepG2，A549，BGC-823，SGC-7901从37℃，5％CO2培养箱中拿出来，在超净台中去掉各自的培养基，加入10ml 1×磷酸盐缓冲液PBS去残留的培养基，在每个培养皿中加1ml 0.05％的胰酶，放回到细胞培养箱中37℃，5％CO2中消化3min；3min后取出培养皿，在显微镜下观察是否将细胞消化起来，在消化起来的细胞培养皿中加入适量相应培养基终止消化，吹打均匀后，取10μl于血细胞计数板上，用血细胞计数板计数1ml培养基中细胞的个数，之后调节培养基中的细胞个数，使其终浓度为5×103/100μl；取出96孔板，在96孔板最外层每孔加入100μl1×PBS，然后向96孔板的最左侧一列加入100μl空白培养基，作为阴性对照组，在其余孔中各加入100μl相应的细胞悬液，摇匀后重新放回培养箱中37℃，5％CO2培养24h，用于细胞贴壁生长；24h后除阴性对照和阳性对照外，从左向右依次加入0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml浓度梯度的GBK作用于细胞中48h，48h后向每孔，包括阴性对照组和阳性对照组，均加入10μl CCK-8溶液，在细胞培养中继续培养90min，在酶标仪上OD＝450nm波长下，测定细胞的存活率，预测GBK对不同细胞作用的IC50值；
(4)胡椒酸钾的选择性抑制作用实验：
通过测定胡椒酸钾对于不同的癌细胞系以及正常细胞系生长的抑制作用，确定胡椒酸钾是否对某些癌细胞的增殖具有选择性的抑制作用，步骤如下：
将贴壁的正常细胞及癌细胞消化起来，细胞计数后调节细胞浓度，使其浓度为5×103/100μl，在96孔板最外层每孔加入100μl 1×PBS，向第一列加入每种细胞相应的空白培养基，向96孔板的其余每个孔中各加100μl细胞悬液，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h；24h后按照0μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、290μg/ml、400μg/ml的浓度向每孔中加入无菌无酶水或GBK溶液，每种细胞分别都设置这6个GBK的浓度梯度；每次实验相同浓度重复3次，且独立实验重复3次，每种细胞均使用各自培养基作为调0孔，到相应时间点后向每孔加入10μl CCK-8溶液继续培养90min，用酶标仪在OD＝450nm波长下读数，计算细胞活性；
(5)胡椒酸钾对肿瘤细胞周期的影响：
抗肿瘤药物对于肿瘤细胞增殖的抑制作用一般是通过产生氧化压力、复制压力、代谢和蛋白毒性压力这类细胞压力以及DNA损伤；DNA复制压力作用于细胞周期进程的不同阶段，阻碍细胞周期进程，最终达到抑制肿瘤细胞增殖的目的；因此检测胡椒酸钾对肿瘤细胞周期的影响，用于确认其抑制癌细胞增殖的机理；
取出MCF-7、HepG2、SGC-7901，消化细胞后，将细胞分别用6cm板，在细胞培养箱中37℃，5％CO2培养24h；24h后以0μg/ml、1/2IC50μg/ml、IC50μg/ml、2IC50μg/ml浓度加入GBK溶液处理细胞48h；48h后收集细胞，使用流式细胞仪检测：配制70％乙醇，放在-20℃预冷；倒掉培养基，向每个6cm板中加入少量1×PBS，洗去残留的培养基，向每个6cm板中加入0.6ml0.05％的胰酶，放回到37℃，5％CO2细胞培养箱中消化细胞3min；3min后，取出6cm板，向每个6cm板中加入1.4ml 1×PBS吹打均匀，终止消化，并将其收集到2ml离心管中；500rpm，离心10min；取出离心管，弃上清液，重新加入1ml1×PBS重悬细胞，洗去残留胰酶，500rpm，离心10min；10min后，取出离心管，弃上清液，再次加入200μl 1×PBS重悬细胞；从冰箱中取出提前预冷的70％乙醇，取800μl加入到1.5ml离心管中，置于冰上继续预冷；将200μl 1×PBS重悬的细胞悬液加到预冷的70％乙醇中，置于冰上固定30min；从-20℃中取出RNA酶A，取1μl 10mg/ml RNase+99μl去离子水配制成100μg/ml RNA酶A，备用；从4℃冰箱中取出1mg/mlPI，取62.5μl 1mg/ml PI+937.5μl去离子水将PI稀释为62.5μg/ml，备用；30min后，从冰上取出离心管，置于离心机中500rpm，离心10min；10min后取出离心管，弃上清液，加入500μl1×PBS重悬细胞，500rpm，离心10min，洗去残留的乙醇；取出离心管，弃上清液，向每个离心管中各自加入100μl 100μg/mlRNA酶A，室温下孵育5min；5min后，向每个离心管中加入400μl 62.5μg/ml的PI染料，工作浓度为50μg/ml，置于冰上，避光孵育染色30min；30min后，将细胞悬液用200目的筛子过滤到流式细胞上样管中，每个上样管都须置于冰上，上样检测，分析数据；
(6)胡椒酸钾对肿瘤细胞信号通路的影响：
首先从胡椒酸钾处理过的癌细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后进行人类细胞全基因组转录芯片筛选，筛选出胡椒酸钾处理后乳腺瘤细胞MCF-7及胃癌细胞SGC-7901相对于不处理的相应肿瘤细胞系的差异表达基因，筛选出GBK影响的细胞途径；
提取总RNA的过程及反转录过程：将MCF-7及SGC-7901细胞从细胞培养箱中取出后，用胰蛋白酶消化起来，并以2×106个/10ml的细胞量铺板，并放于细胞培养箱中培养24h，24h后取出2个10cm板，按照1.5IC50μg/ml的浓度分别向两个培养皿中加入GBK溶液和无菌无酶的水，分别标为实验组和对照组，继续置于培养箱中培养48h，48h后提取总RNA，具体步骤如下：从培养箱中取出2个培养皿，去掉培养基，并用1×PBS洗一次，洗去残留的培养基；向2个培养皿中分别加入1ml TransZolTM Up，轻轻摇晃培养皿，吹打细胞，使裂解液能够均匀的分布在培养皿表面，与细胞密切接触；用细胞刮铲充分刮铲贴壁细胞，使得裂解液中无明显沉淀；用无菌无酶的枪头将细胞裂解液加入到1.5ml无菌无酶离心管中；在无菌无酶的条件下，室温中静置5min；向1.5ml无菌无酶离心管中加入200μl氯仿，剧烈振荡30s，无菌无酶条件下室温放置3min；将离心管置于提前预冷的低温离心机中10000rpm，低温4℃离心15min；取500μl上清液于一个新的1.5ml无菌无酶离心管中，然后加入500μl异丙醇，颠倒混匀，在室温条件下放置10min；10000rpm，低温4℃，离心10min；从离心机中取出离心管，弃上清；向1.5ml离心管中加入1ml提前配制好的75％乙醇溶液，涡旋1min；7500rpm，低温4℃离心5min；弃上清，在无菌无酶条件下室温干燥，使残留的乙醇完全挥发掉；向1.5ml离心管中加入50μl RNA溶解液；在60℃烘箱中放置10min，在超净台中分装3μl于小的无菌无酶PCR管中，用于凝胶电泳和浓度检测，其余保存于-80℃冰箱中用于后续qRT-PCR；用无水乙醇处理电泳槽，并重新配置电泳用凝胶取少量样品跑电泳；按照反转录的试剂盒说明书进行反转录；
对人类细胞全基因组转录芯片筛选出的差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证：实验所使用的荧光染料为Premix Ex Taq II，Tli RNaseH Plus。
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