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CN106318956A - 一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用 - Google Patents

一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用 Download PDF

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CN106318956A
CN106318956A CN201610847151.XA CN201610847151A CN106318956A CN 106318956 A CN106318956 A CN 106318956A CN 201610847151 A CN201610847151 A CN 201610847151A CN 106318956 A CN106318956 A CN 106318956A
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CN
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lygus
atpase
gene
cdna
dsrna
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CN201610847151.XA
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王桂荣
刘方舟
刘杨
杨斌
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Institute of Plant Protection of FAAS
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Abstract

本发明公开了一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用，属于生物防治领域。本发明首次从绿盲蝽中克隆得到的V‑ATPase‑A基因，其序列如SEQ ID NO：1所示，以该基因作为RNAi的靶标，设计与合成绿盲蝽V‑ATPase‑A dsRNA，采用注射法向绿盲蝽若虫导入dsV‑ATPase‑A后，V‑ATPase‑A基因表达分别受阻，绿盲蝽生长与代谢受抑制，死亡率提高。实验表明，本发明绿盲蝽V‑ATPase‑A基因为未来绿盲蝽RNA干扰(RNAi)介导的害虫防治策略提供了防治效果良好的候选基因。

Description

一种绿盲蝽V-ATPase-A基因cDNA及其应用
技术领域
本发明属于昆虫分子生物学与生理学领域，具体涉及绿盲蝽V型ATP酶A亚基(V-ATPase-A)cDNA的克隆，绿盲蝽V-ATPase-A基因双链RNA(dsRNA)的设计，合成与及其在生物防治绿盲蝽害虫中的应用。
背景技术
绿盲蝽(Lygus lucorum)，隶属于半翅目，盲蝽科，又称花叶虫，小臭虫。除青海西藏等少数地方，几乎遍布我国所有省份，是我国黄河流域长江流域为害棉花的多种绿盲蝽的优势种，几遍全国各棉区。绿盲蝽为杂食性害虫，寄主范围十分广泛，寄主包括棉花、十字花科蔬菜、豆类、玉米、瓜类、花卉、马铃薯、以及各种果树等，给我国农业和林业造成了巨大损失。2000年以前，绿盲蝽并非是我国棉产区农业生产的主要害虫，其种群数量低，基本不需专门防治。在防治棉花其它主要害虫的同时即可将绿盲蝽杀死。近几年来，由于蔬菜、果树以及其他寄主作物种植面积的大幅度增加，给绿盲蝽提供了适宜的越冬场所和多样的寄主，规模化种植转基因Bt棉花有效的减少以绿盲蝽为主的鳞翅目害虫的危害，减少了农药的使用。另外，多种高毒农药的停用，致使绿盲蝽的种群数量迅速上升，并呈灾变的趋势。在很多地区已经成为了农业生产的重要害虫。目前对绿盲蝽的防治主要依靠化学防治，该方法不仅容易导致其产生抗药性，而且对环境造成污染。因此，发展一种经济有效、环境友好的方法控制绿盲蝽具有重要意义。利用转基因作物进行抗虫可以有效抵抗虫害，并且安全环保，这些优点使转基因作物成为抗虫策略的首选。基于目前以RNAi为基础发展抗虫转基因作物是当前的研究热点，且该技术在害虫防治领域已经取得一些进展，然而目前很少有关于绿盲蝽合适靶标基因的报道。因此，寻找合适的杀虫靶标是一项非常紧迫的工作。
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA引发的基因沉默现象，其作用机制是通过阻止同源基因的翻译或者转录而实现基因沉默。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生断裂而导致基因表达沉默。
V型ATP酶(V-ATPase)是一种存在于几乎所有真核生物膜结构上的质子泵之一。它能将ATP水解所释放的能量转化为生物膜两侧的H+质子势能。H+质子势能进一步推动细胞内各种生理反应的进行。在农业害虫防治领域，Buam等人在2007年取得了突破性进展。他们选取鞘翅目昆虫西方玉米根虫(WCR)多达290种基因作为靶标，合成dsRNA，将其涂在西方玉米根虫的食物表面。最终得到125种基因有明显致死效果。其中，对效果最为显著的V-ATPase-A，构建了可以表达其靶标基因的dsRNA玉米，转基因玉米相对于对照，在WCR取食时表现出良好的防护性，可以明显的降低WCR的侵害。这个研究表明了通过RNAi技术防治农业害虫的可行性，展现出良好的前景可见，昆虫的V-ATPase在昆虫的生长、发育、生殖等重要生命活动过程中起着非常重要的作用。
发明内容
本发明提供一种绿盲蝽(Lygus lucorum)V型ATP酶A亚基(V-ATPase-A)的cDNA及其应用，设计与合成绿盲蝽V-ATPase-A基因dsRNA，然后用显微注射法将dsRNA输入到绿盲蝽体内，绿色荧光蛋白(GFP)作为对照组，统计饲喂后7天内每日死亡率，结果实验组7天后死亡率达到60％以上，同时实时荧光定量PCR结果显示靶标基因表达水平显著降低，绿盲蝽生长与代谢受抑制，从而用于绿盲蝽的生物防治。
一种绿盲蝽V-ATPase-A基因的cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述cDNA的克隆方法，包括以下步骤：
(1)从绿盲蝽幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA；
(2)设计V-ATPase-A的特异性引物，所述特异性引物正向序列分别如SEQ ID NO.2所示，反向序列如SEG ID NO.3所示；
(3)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用步骤(2)所述的引物进行PCR扩增，得到扩增片段；
(4)纯化PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pGME-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top 10，筛选含目的片段的阳性克隆；
(5)将阳性克隆进行序列测定，得到目标基因的cDNA。
上述cDNA在绿盲蝽RNA干扰介导的植物害虫防治中的应用。
所述绿盲蝽RNA干扰介导中以上述cDNA序列中的第82-473位作为V-ATPase-A干涉靶标合成dsRNA。
所述绿盲蝽RNA干扰介导以显微注射方法传递。
所述植物为棉花、烟草、小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵。
本发明人首次从绿盲蝽中克隆得到的V-ATPase-A基因，其序列如SEQ ID NO：1所示，该基因能够作为RNAi的靶标，在绿盲蝽的防治中具有很大的应用价值。
从上述的cDNA序列中选取SEQ ID NO.1中第82-473位作为V-ATPase-A干涉靶标合成dsRNA。将合成的dsRNA通过显微注射方法传递到体内，绿色荧光蛋白(GFP)作为对照组，统计饲喂后7天内每日死亡率，结果实验组7天后死亡率分别达到60％以上，同时实时荧光定量PCR结果显示靶标基因表达水平显著降低。
本发明为未来绿盲蝽RNA干扰(RNAi)介导的害虫防治策略提供了防治效果良好的候选基因。
本发明首次克隆绿盲蝽V-ATPase-A基因cDNA。V-ATPase-A是一种真核生物膜结构上的质子泵，在真核生物细胞内行使基础的、必不可少的功能，在昆虫的生长、发育、生殖等生命活动过程中发挥非常重要的作用。V-ATPase-A的沉默会破坏细胞基本的代谢与生理过程，造成昆虫生长、发育、生殖等一系列生命活动的紊乱与异常。
目前，RNAi技术已经在害虫生物防治领域展现出广阔的应用前景，以害虫靶基因dsRNA或siRNA作为有效成分研制生物农药是一个新的发展方向。本发明人首次以绿盲蝽V-ATPase-A作为干涉靶标，设计与合成V-ATPase-A的dsRNA，对绿盲蝽进行显微注射，以沉默V-ATPase-A的转录表达，抑制绿盲蝽的种群数量，研究基础好，前瞻性高，害虫产生抗性的风险低，是一种防治绿盲蝽的好方法，因此本发明具有重大的应用前景。
由于绿盲蝽食性杂，寄主广泛，除为害棉花外，十字花科蔬菜、豆类、玉米、瓜类、花卉、马铃薯、以及各种果树等作物。因此，本发明所设计的V-ATPase-A的dsRNA可施用于其它寄主植物，同样可用于绿盲蝽的生物防治。
附图说明
图1为V-ATPase-A dsRNA饲养7天内绿盲蝽的存活率。以GFP(绿色荧光蛋白)dsRNA为对照。
图2为绿盲蝽V-ATPase-A dsRNA对其靶标基因的干扰效率。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售常规生化试剂。
实施例1：V-ATPase-A基因克隆、V-ATPase-A基因dsRNA的具备，显微注射法注射V-ATPase-A基因dsRNA。
基因的生物信息学分析
1.利用生物信息学技术及软件对绿盲蝽转录组数据进行初步的分析，筛选到绿盲蝽V-ATPase-A基因。本发明从绿盲蝽克隆到V型ATP酶A亚基(V-ATPase-A)的cDNA，其具有SEQ ID NO.1所示的序列：
2.供试昆虫及组织收集
绿盲蝽为中国农业科学院植物保护研究所使用新鲜玉米(Zea mays)及四季豆(Phaseolus vulgaris L)饲养，饲养温度为25-28℃，相对湿度为60％-70％，光照为16:8(L:D)。
3.RNA的提取
a)昆虫总RNA提取的全部过程在无RNase条件下进行。整个提取步骤如下所示：
b)取-70℃保存的昆虫组织，加入已经用液氮预冷的玻璃匀浆器中，立即向匀浆器内加入1mL Trizol试剂，将组织充分研磨磨碎；将研磨好的组织溶液用无RNA酶的枪头转移到无RNA酶的1.5mL离心管中，暂时至于冰上。
c)4℃，12000g离心15min，将上清转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中。
d)将上清在室温下放置5min后，向离心管中加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡15s，再室温静置2-3min。
e)4℃，12000g离心15min，混合物在此后分层，下层为有机相，上层为水相(RNA就在水相中)，用无RNA酶的枪头将上层水相转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中，注意尽量不要吸到中间层，以免造成蛋白质或DNA污染。
f)加入0.5mL异丙醇，混匀后，室温静置10min来沉淀RNA。
g)4℃，12000g离心10min后，观察到的沉淀即为RNA,弃上清(尽量吸净)，加入1mL75％的乙醇(用DEPC水配置，现用现配)，轻轻震荡离心管悬浮沉淀，洗涤沉淀。
h)4℃，7500g离心10min后，弃上清(尽量吸净)，超净台中干燥沉淀5-10min。
i)加入10-20μL RNase-free H2O(根据RNA量而定)，轻弹离心，使沉淀充分溶解。
j)55-60℃温育后，取1μL样品稀释至5μL，其中2.5μL进行电泳检测，2.5μL用NanoDrop仪器检测；剩余的样品用于cDNA合成或者保存于-70℃冰箱。
5.第一链cDNA的合成
整个反转录过程在无RNA酶污染的条件下进行，操作步骤按Revert Aid FirstStrand cDNA Synthesis Kit进行，具体如下：
a)在无RNA酶的PCR管中依次加入：2μg RNA(根据NanoDrop定量的结果计算应该加入RNA的体积数)，DNaseⅠ1μL，1μL Ribolock RNase Inhibitor，1μL 10×Reaction Bufferwith MgCl2，用RNase-free水将体系补足到10μL；轻微震荡后离心；
b)37℃温育30min后，向体系内加入1μL 50mM EDTA，震荡后离心，然后65℃温育10min,以去除DNA酶I；
c)加入1μL Oligo-dT，用RNase-free H2O补至12μL；
d)65℃温育5min后，立即置于冰上；
e)依次加入下列试剂，使体系达到20μL：4μL的5×Reaction buffer；2μL的dNTPMix(10mM)；1μL的Revert Aid Reverse Transcriptase和1μL的Ribolock RNaseInhibitor；简单混匀离心；
f)42℃温育1h，然后再70℃温育5min；
g)合成后存于-20℃或者-70℃冰箱，使用前按情况稀释若干倍。
3、靶标基因的克隆
本发明从绿盲蝽克隆到V型ATP酶A亚基(V-ATPase-A)的cDNA，其具有SEQ ID NO.1所示的序列。
靶标基因引物的设计：
(1)利用BLAST检索数据库，搜索绿盲蝽的相近物种同一靶标基因的蛋白或者cDNA编码的氨基酸序列，用绿盲蝽成虫若虫转录组组建的本地BLAST库进行比对查询，确定所选基因的序列。
(2)根据靶标基因的片段，用Primer Premier 5.0软件设计带T7启动子的引物，引物设计原则如下：
a)引物设计的区间要在靶标基因的编码区，中间片段大小在400～500bp左右。
b)中间片段尽量选在靶标基因的特异区域。
c)引物之间不能形成引物二聚体，交叉二聚体。
d)根据以上引物设计原则设计引物后，送至华大基因进行引物合成。V-ATPase-A的T7启动
子的正引物如SEQ ID NO.2所示，T7启动子的反向序列如SEG ID NO.3所示：
SEQ ID NO.2：TAATACGACTCACTATAGGGTTTACCCAGAATCCGTGAT
SEQ ID NO.3：TAATACGACTCACTATAGGGATGGAGTGAAGTCCCAAGC
4.目的片段的PCR扩增、测序及序列分析
以绿盲蝽cDNA为模板，用ExTaq酶扩增V型ATP酶A亚基(V-ATPase-A)的cDNA。反应体系为25μl：17μl重蒸水，2.5μl 10×反应缓冲液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl cDNA，1μl F引物(10mM)，1μl R引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60-65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。
PCR产物用溶解在1×TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测正确的PCR产物，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(操作步骤按试剂盒内附带的说明书进行)，回收的片段连接到pGME-T载体上(体系为8μl胶回收产物、1μl 10×T4链接反应缓冲液、0.5μlpGME-T载体和0.5μl T4连接酶，16℃条件下连接过夜)，连接体系转化Top10感受态细胞(转化步骤按感受态细胞附带的说明书进行)，培养过夜后，挑取8个阳性克隆进行PCR验证(体系和条件同上)，将检测正确的克隆用液体LB培养基(含氨苄抗生素)培养过夜检验目的片段序列。
根据测序结果，将正确的菌株加入含有氨苄抗生素的新鲜LB培养基重新摇菌，获得新鲜的菌液，进行质粒提取。
5、dsRNA模板的制备
以带有靶标基因片段的质粒为模板，用聚合酶扩增。反应体系为25μl：17μl重蒸水，2.5μl10×反应缓冲液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl载有靶标基因片段的质粒，1μl带有T7序列的正向引物(10mM)，1μl带有T7序列的正向反向引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-60℃退火45s，72℃延伸30秒，35个循环；最后72℃延伸10min。
将1μl PCR产物用溶解在1×TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。如果所得条带长度与目的片段长度一致，并且结果显示为单一明亮的条带，则将剩余的PCR产物进行酚氯仿抽提与纯化。
PCR产物的酚氯仿抽提的步骤：
a)将需要纯化的PCR产物用无RNA酶的H2O定容至200μl
b)加入等体积(200μl)的酚氯仿试剂(一定取酚氯仿试剂的下层，并且拿试剂瓶时要平稳，不能晃动)。
c)温和混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min.
d)4.取上清，加入1/10体积(20μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2倍体积(400μl)的100％乙醇(-20℃贮存)，温和混匀后放于-20℃静置沉淀至少3小时或者过夜。
e)在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)30min.
f)白色沉淀积于离心管底部，弃上清液(为防止沉淀一起被吸出，可保留些许上清液)，加入75％乙醇(-20℃贮存)轻轻混匀，洗涤沉淀
g)在4℃离心机下离心(7500rpm，4℃)5min.
h)将乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的残留液体用10μl移液枪慢慢吸出。将离心管开盖放入37℃恒温培养箱干燥，10min左右，待乙醇全部挥发。
i)加入5μl RNase-free H2O轻弹管底，让沉淀充分均匀溶解于无RNA酶的H2O。
j)取1μl溶液溶于4μl无RNA酶的H2O中，用浓度测量仪器检测浓度和OD值。用凝胶电泳检测产物单一性，如果检测条带是单一明亮的条带，并且其OD值为：
260/280:1.8-2.0
260/230:1.8-2.0
则说明PCR产物质量良好，可以作为下一步合成dsRNA的模板使用。
6、dsRNA的合成
a)将ATP，CTP，GTP，UTP(100mM)放于冰上慢慢融化，5×反转录缓冲液室温融化，T7RNA聚合酶放于-20℃贮存，随用随拿，用完立即放入-20℃环境下贮存。溶解以后轻弹管底，瞬时离心，将试剂离心到管底。
b)按以下比例将试剂混合：
按以下比例将试剂混合：
轻弹混匀，瞬时离心。放入37℃金属浴中4小时。
c)从金属浴中取出离心管，放入75℃金属浴中5min，然后放置室温冷却(切勿放在冰上)。
吸出1μl，稀释5倍，凝胶电泳检测产物条带。
d)去除DNA和ssRNA.按照比例加入下列试剂：
充分混匀，轻弹管底，瞬时离心后，放入金属浴37℃30min，加入EDTA试剂1μl,65℃金属浴中放置5min终止反应。取1μl产物，稀释5倍，凝胶电泳检测产物单一性，浓度检测仪器检测浓度和OD值。如果检测条带是单一明亮的条带，并且其OD值为：
260/280:1.8-2.0
260/230:1.8-2.0
则说明dsRNA质量良好，可以进行下一步dsRNA酚氯仿抽提。
7、dsRNA的酚氯仿抽提
a)将需要纯化的dsRNA(～60μl)用无RNA酶的H2O定容至200μl(可根据实际需要等比例扩大体系)。
b)加入1/2体积(100μl)的水饱和酚试剂(一定取水饱和酚试剂的下层，并且拿试剂瓶时要平稳，不能晃动)和1/2体积的氯仿(100μl)。
c)轻轻混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min。
d)取上层水相，加入的等体积氯仿(200μl)，轻轻混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min。
e)取上层水相，加入1/10体积(20μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积(500μl)的100％乙醇(-20℃贮存)，温和混匀后放于-20℃静置沉淀至少3小时或者过夜。
f)在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)30min。
g)白色沉淀积于离心管底部，弃上清液(为防止沉淀一起被吸出，可保留些许上清液)，加入80％乙醇(-20℃贮存)轻轻混匀，洗涤沉淀。
h)在4℃离心机下离心(7500rpm，4℃)5min。
i)将乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的残留液体用10μl移液枪慢慢吸出。将离心管开盖放入37℃恒温培养箱干燥，10min左右，待乙醇全部挥发。
j)加入5μl无RNA酶的H2O轻弹管底，让沉淀充分均匀的溶解于无RNA酶的H2O中。
k)取1μl溶解的dsRNA产物稀释于4μl DEPC H2O中，用凝胶电泳检测产物单一性，并用浓度检测仪器检测浓度和OD值。如果检测的条带是单一明亮的条带，并且其OD值为：
260/280:1.8-2.0
260/230:1.8-2.0
则证明dsRNA质量良好，可以进行绿盲蝽体内注射RNAi实验。
8、3龄(3L)绿盲蝽的准备
本发明中所选绿盲蝽为3L若虫，现以3L若虫的收集方法如下：收集1L初孵若虫(200～300头)，放入养虫盒中，盒中放入干净滤纸和一根去皮的新鲜玉米，约4天后所有1L若虫成长为3L若虫，准备铺好滤纸和7～8粒新鲜玉米粒的塑料培养皿，每个培养皿里放15只3L若虫，放若虫时，用软毛刷轻轻挑取，以免对若虫造成不必要的机械损伤。见图1。
同时设计绿色荧光蛋白基因(GFP)双链dsRNA作为对照，将所述dsRNA用显微注射法注入绿盲蝽若虫体内，7天内随机取样用于荧光定量PCR方法检测干扰效率，其V-ATPase-A的荧光定量PCR正引物如SEQ ID NO.4，荧光定量PCR反引物序列如SEG ID NO.5所示：
SEQ ID NO.4：GTTGAAATTGATGGCGTTACTGAG
SEQ ID NO.5：CGGAAGTATTCGGACAAGGTGA
如图2，结果显示V-ATPase-A表达受抑制，正常的代谢与生理过程受破坏，绿盲蝽死亡率提高，从而用于绿盲蝽的生物防治。
所述植物为棉花、烟草、小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵等绿盲蝽寄主植物。

Claims (6)

1.一种绿盲蝽V-ATPase-A基因的cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述绿盲蝽V-ATPase-A基因的cDNA克隆方法，包括以下步骤：
(1)从绿盲蝽幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA；
(2)设计V-ATPase-A的特异性引物，所述特异性引物正向序列分别如SEQ ID NO.2所示，反向序列如SEG ID NO.3所示；
(3)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用步骤(2)所述的引物进行PCR扩增，得到扩增片段；
(4)纯化PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pGME-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top 10，筛选含目的片段的阳性克隆；
(5)将阳性克隆进行序列测定，得到绿盲蝽V-ATPase-A基因的cDNA。
3.权利要求1所述的绿盲蝽V-ATPase-A基因的cDNA在绿盲蝽RNA干扰介导的植物害虫防治中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述绿盲蝽RNA干扰介导中以上述cDNA序列中的第82-473位作为V-ATPase-A干涉靶标合成dsRNA。
5.根据权利要求3所述的应用，所述绿盲蝽RNA干扰介导以显微注射方法传递。
6.根据权利要求3所述的应用，所述植物为棉花、烟草、小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵。
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