CN106399331A - 绿盲蝽ApEps15基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绿盲蝽ApEps15基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用。所述一种ApEps15基因，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过dsRNA注射或饲喂方法传递到体内，绿色荧光蛋白(GFP)和未加dsRNA作为对照组，统计注射或饲喂后7天的死亡率，结果实验组7天后死亡率达到30％左右，同时有明显的蜕皮困难的异常表型，后续实时荧光定量PCR结果也证实了靶标基因明显的被沉默。本发明为将来绿盲蝽RNA干扰(RNAi)介导的害虫防治策略提供了效果较好的候选基因，同时本发明为将来的田间试验应用提供理论依据。

Description

绿盲蝽ApEps15基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用

技术领域

本发明涉及昆虫基因工程技术领域，具体涉及一种绿盲蝽ApEps15基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用。

背景技术

昆虫害虫和人类战争常常伴随着难以预测的新趋势。2000年以前，绿盲蝽并非是我国棉产区农业生产的主要害虫，原因是为了防止棉铃虫所使用的农药把绿盲蝽的数量保持低水平。然而1997年开始，Bt棉花的商业化种植有效控制了棉铃虫等鳞翅目害虫的危害，绿盲蝽逐渐成为危害棉花的主要害虫。目前对绿盲蝽的防治主要依靠化学防治，该方法不仅容易导致其产生抗药性，而且对环境造成污染。因此，发展一种经济有效、环境友好的方法控制绿盲蝽具有重要意义。利用转基因作物进行抗虫可以有效抵抗虫害，并且安全环保，这些优点使转基因作物成为抗虫策略的首选。基于目前以RNAi为基础发展抗虫转基因作物是当前的研究热点，且该技术在害虫防治领域已经取得一些进展。

RNAi指的是内源或外源RNA被RNase III内切酶DICER切成大小20–25bp，小dsRNA片段，然后这些小片段进一步被进入RNAi诱导的沉默复合体内并被解开双链，把反义链作为识别同源性mRNA的引导者，最后降解同源性mRNA的过程。表皮生长因子是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，是类EGF大家族的一个成员，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。表皮生长因子通过与细胞表面的受体，表皮生长因子受体(EGFR)结合而起作用。EGF一旦同应答细胞表面的特异受体结合，便促进受体二聚化并使细胞质位点磷酸化。被激活的受体至少可与5种具有不同信号序列的蛋白结合，进行信号转导。EGF能够广泛促进细胞的增殖。

Eps15起初被鉴定为与表皮生长因子受体(EGFR)激酶活性有关。其由三个部分组成的。研究表明Eps15的干扰影响表皮生长因子受体(EGFR)对生长因子(EGF)的内吞作用。所以对昆虫生长发育中起着重要的作用。由此可见，该基因很有可能将成为一种新的靶标来设计研发RNAi介导的害虫防治策略方面能够应用。然而至今在昆虫中RNAi介导Eps15沉默研究几乎没有。

发明内容

本发明的目的提供一种绿盲蝽表皮生长因子途径底物15命名为ApEps15基因，在绿盲蝽生长发育和生理过程中起着非常重要的作用，沉默该基因后，对绿盲蝽个体发育造成的影响。

本发明的另一个目的提供一种绿盲蝽ApEps15基因在RNAi介导的害虫防治方面的应用。

绿盲蝽ApEps15基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

绿盲蝽ApEps15基因在RNAi介导的害虫防治方面的应用。

所述RNAi介导中，合成的dsRNA通过注射或饲喂进入绿盲蝽体内。

所述合成dsRNA所对应的靶标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述注射体积为41.6nl，注射dsRNA浓度为10μg/μl，注射部位为绿盲蝽的后胸与腹部节间膜的最外侧。

所述饲喂的饲料总体积200ul，dsRNA浓度0.5ug/ul。

所述绿盲蝽为三龄绿盲蝽。

本发明中利用生物信息学技术，分析了绿盲蝽成虫和幼虫转录组，并获得了ApEps15基因，然后按下面循序进项(1)取绿盲蝽总RNA，通过RT-PCR得到cDNA；(2)设计带有T7序列的特异性引物；(3)通过PCR技术扩增目的基因片段：以第一步得到的cDNA为模板，第二步设计的特异引物扩增，得到带有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(4)构建含有选定目的基因片段的载体并转入宿主大肠杆菌中，培养，提取含有目的基因片段的质粒；

(5)以上一步所提取含有目的基因片段的质粒为模板，第二步设计的特异性引物扩增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(6)利用T7RNA聚合酶将上一步得到的PCR产物合成为目的基因片段dsRNA；(7)进行显微注射实验把靶标dsRNA传递到体内

(8)人工饲料的配制(9)将dsRNA混合到人工饲料中通过封口膜包装饲喂3龄幼虫24小时后用正常饲料继续饲养(9)统计死亡率，观察表型。在此基因内重新设计一对引物，提取绿盲蝽不同组织RNA并反转录成cDNA，以这些cDNA为模板进行RT-PCR反应。

附图说明

图1实验所用dsRNA琼脂糖凝胶电泳结果图。

其中A为ESP-15的dsRNA，B为GFP的dsRNA琼脂糖凝胶电泳结果。

图2 ESP-15dsRNA显微注射后存活率。

图3 ESP-15dsRNA显微注射后Qpcr结果。

图4 ESP-15dsRNA显微注射诱导的异常表型，其中左图为空白对照，右图为实验组。

图5绿盲蝽ApEps15的dsRNA饲喂传递7天后存活率。

图6绿盲蝽ApEps15的dsRNA饲喂后表型，其中左图为空白对照，右图(2张)为实验组。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售常规生化试剂。

实施例1ApEps15基因克隆、dsApEps15的具备，注射和饲喂实验

1、ApEps15基因的生物信息学分析

本实验室事前对绿盲蝽进行转绿组测序，成功得到绿盲蝽63029条基因序列，并注释了其中25760条基因序列。利用生物信息学技术及相关在线软件对绿盲蝽转录组数据进行初步的分析，通过在线程序NCBI Blast等程序的帮助下确定了到绿盲蝽ApEps15基因，见序列表SEQ ID NO1。

2、供试昆虫及组织收集

绿盲蝽为中国农业科学院植物保护研究所使用新鲜玉米(ZeamaysL)及四季豆(Phaseolusvulgaris L.)饲养，饲养温度为25-28℃，相对湿度为60％-70％，光照为16:8(L:D)。

3、RNA的提取

昆虫总RNA提取的全部过程在无RNase条件下进行。整个提取步骤如下所示：

1)取-70℃保存的昆虫组织，加入已经用液氮预冷的玻璃匀浆器中，立即向匀浆器内加入1mL Trizol试剂，将组织充分研磨磨碎；将研磨好的组织溶液用无RNA酶的枪头转移到无RNA酶的1.5mL离心管中，暂时置于冰上。

2)4℃，12000g离心15min，将上清转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中。

3)将上清在室温下放置5min后，向离心管中加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡15s，再室温静置2-3min。

4)4℃，12000g离心15min，混合物在此后分层，下层为有机相，上层为水相(RNA就在水相中)，用无RNA酶的枪头将上层水相转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中，注意尽量不要吸到中间层，以免造成蛋白质或DNA污染。

5)加入0.5mL异丙醇，混匀后，室温静置10min来沉淀RNA。

6)4℃，12000g离心10min后，观察到的沉淀即为RNA,弃上清(尽量吸净)，加入1mL75％的乙醇(用DEPC水配置，现用现配)，轻轻震荡离心管悬浮沉淀，洗涤沉淀。

7)4℃，7500g离心10min后，弃上清(尽量吸净)，超净台中干燥沉淀5-10min。

8)加入10-20μL RNA-free水(根据RNA量而定)，轻弹离心，使沉淀充分溶解。

9)55-60℃温育后，取1μL样品稀释至5μL，其中2.5μL进行电泳检测，2.5μL用NanoDrop仪器检测；剩余的样品用于cDNA合成或者保存于-70℃冰箱。

4、第一链cDNA的合成

整个反转录过程在无RNA酶污染的条件下进行，操作步骤按Revert Aid FirstStrand cDNA Synthesis Kit进行，具体如下：

1)在无RNA酶的PCR管中依次加入：2μg RNA(根据NanoDrop定量的结果计算应该加入RNA的体积数)，DNaseⅠ1μL，1μL Ribolock RNase Inhibitor，1μL 10×Reaction Bufferwith MgCl₂，用RNA-free水将体系补足到10μL；轻微震荡后离心；

2)37℃温育30min后，向体系内加入1μL 50mM EDTA，震荡后离心，然后65℃温育10min,以去除DNA酶I；

3)加入1μLoligo-dT，用RNA-free水补至12μL；

4)65℃温育5min后，立即置于冰上；

5)依次加入下列试剂，使体系达到20μL：4μL的5×Reaction buffer；2μL的dNTPMix(10mM)；1μL的Revert Aid Reverse Transcriptase和1μL的Ribolock RNaseInhibitor；简单混匀离心；

6)42℃温育1h，然后再70℃温育5min；

7)合成后存于-20℃或者-70℃冰箱，使用前按情况稀释若干倍。

5、靶标基因的克隆

本发明选取了持家基因、能量代谢相关基因和细胞凋亡相关基因上的基因片段，通过注射法研究其对昆虫的影响，GFP基因上的片段作为对照。持家基因又称管家基因，是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的；而能量代谢相关基因和细胞凋亡相关基因也在绿盲蝽生长发育和生理过程中起着非常重要的作用。本发明选取此类基因上的片段，利用注射法进行RNAi将其沉默，研究观察沉默该基因后，对绿盲蝽个体发育造成的影响。GFP即绿色荧光蛋白，在昆虫体内并不存在，故大量研究中将其作为对照基因合成dsRNA。

1.靶标基因引物的设计：

(1)利用BLAST检索数据库，搜索绿盲蝽的相近物种同一靶标基因的蛋白或者cDNA编码的氨基酸序列，用绿盲蝽成虫若虫转录组组建的本地BLAST库进行比对查询，确定所选基因的序列。

(2)根据靶标基因的片段，用Primer Premier 5.0软件设计带T7启动子的引物，引物设计原则如下：

a.引物设计的区间要在靶标基因的编码区，中间片段大小在400～500bp左右。

b.中间片段尽量选在靶标基因的特异区域。

c.引物之间不能形成引物二聚体，交叉二聚体。

2.根据以上引物设计原则设计引物后，送至华大基因进行引物合成。

3.相关靶标基因的引物序列见表1。

表1.实验所用引物

4.目的片段的PCR扩增、测序及序列分析

1).以绿盲蝽cDNA为模板，用ExTaq酶扩增表1-1中基因。反应体系为25μl：17μl重蒸水，2.5μl 10×反应缓冲液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl cDNA，1μl F引物(10mM)，1μl R引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60-65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

2).PCR产物用溶解在1×TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测正确的PCR产物，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(操作步骤按试剂盒内附带的说明书进行)，回收的片段连接到pGME-T载体上(体系为8μl胶回收产物、1μl 10×T4链接反应缓冲液、0.5μlpGME-T载体和0.5μl T4连接酶，16℃条件下连接过夜)，连接体系转化Top10感受态细胞(转化步骤按感受态细胞附带的说明书进行)，培养过夜后，挑取8个阳性克隆进行PCR验证(体系和条件同上)，将检测正确的克隆用液体LB培养基(含氨苄抗生素)培养过夜检验目的片段序列。

3).根据测序结果，将正确的菌株加入含有氨苄抗生素的新鲜LB培养基重新摇菌，获得新鲜的菌液，将1ml菌液和百分之八十的甘油按照9:1比例混合，存于-80℃低温冰箱保存。将剩余的菌液进行质粒提取。序列结果见序列表SEQ ID NO2。

5.dsRNA模板的制备

以带有靶标基因片段的质粒为模板，用聚合酶扩增。反应体系为25μl：17μl重蒸水，2.5μl 10×反应缓冲液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl载有靶标基因片段的质粒，1μl正向(F)引物(10mM)，1μl反向(R)引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-60℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。

将1μl PCR产物用溶解在1×TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。如果所得条带长度与目的片段长度一致，并且结果显示为单一明亮的条带，则将剩余的PCR产物进行酚氯仿抽提与纯化。

PCR产物的酚氯仿抽提的步骤：

1).将需要纯化的PCR产物用无RNA酶的H2O定容至200μl

2).加入等体积(200μl)的酚氯仿试剂(一定取酚氯仿试剂的下层，并且拿试剂瓶时要平稳，不能晃动)。

3).温和混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min.

4).4.取上清，加入1/10体积(20μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2倍体积(400μl)的100％乙醇(-20℃贮存)，温和混匀后放于-20℃静置沉淀至少3小时或者过夜。

5).在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)30min.

6).白色沉淀积于离心管底部，弃上清液(为防止沉淀一起被吸出，可保留些许上清液)，加入75％乙醇(-20℃贮存)轻轻混匀，洗涤沉淀

7).在4℃离心机下离心(7500rpm，4℃)5min.

8).将乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的残留液体用10μl移液枪慢慢吸出。将离心管开盖放入37℃恒温培养箱干燥，10min左右，待乙醇全部挥发。

9).加入5μl RNase–free H2O轻弹管底，让沉淀充分均匀溶解于无RNA酶的H₂O。

10).取1μl溶液溶于4μl无RNA酶的H2O中，用浓度测量仪器检测浓度和OD值。用凝胶电泳检测产物单一性，如果检测条带是单一明亮的条带，并且其OD值为：

260/280:1.8-2.0

260/230:1.8-2.0

则说明PCR产物质量良好，可以作为下一步合成dsRNA的模板使用。

6、dsRNA的合成

1.将ATP，CTP，GTP，UTP(100mM)放于冰上慢慢融化，5×反转录缓冲液室温融化，T7RNA聚合酶放于-20℃贮存，随用随拿，用完立即放入-20℃环境下贮存。溶解以后轻弹管底，瞬时离心，将试剂离心到管底。

2.按以下比例将试剂混合：

试剂 50μl体系

反转录缓冲液 10μl

ATP，CTP，GTP，UTP(100mM) 各1μl

RNA酶抑制剂 1.25μl

模板 1.5μg

无RNA酶的H2O定容至 49μl

T7RNA聚合酶 1μl

轻弹混匀，瞬时离心。放入37℃金属浴中4小时。

3.从金属浴中取出离心管，放入75℃金属浴中5min，然后放置室温冷却(切勿放在冰上)。吸出1μl，稀释5倍，凝胶电泳检测产物条带。

4.去除DNA和dsRNA.按照比例加入下列试剂：

试剂 60μl体系

10×反应缓冲液 6μl

DNA酶Ⅰ 2μl

RNA酶 0.5μl

无RNA酶的H2O 2.5μl

dsRNA产物49μl

充分混匀，轻弹管底，瞬时离心后，放入金属浴37℃30min，加入EDTA试剂1μl,65℃金属浴中放置5min终止反应。取1μl产物，稀释5倍，凝胶电泳检测产物单一性，浓度检测仪器检测浓度和OD值。如果检测条带是单一明亮的条带，并且其OD值为：

260/280:1.8-2.0

260/230:1.8-2.0

则说明dsRNA质量良好，可以进行下一步dsRNA酚氯仿抽提。

7、dsRNA的酚氯仿抽提

1.将需要纯化的dsRNA(～60μl)用无RNA酶的H2O定容至200μl(可根据实际需要等比例扩大体系)。

2.加入1/2体积(100μl)的水饱和酚试剂(一定取水饱和酚试剂的下层，并且拿试剂瓶时要平稳，不能晃动)和1/2体积的氯仿(100μl)。

3.轻轻混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min。

4.取上层水相，加入的等体积氯仿(200μl)，轻轻混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min。

5.取上层水相，加入1/10体积(20μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积(500μl)的100％乙醇(-20℃贮存)，温和混匀后放于-20℃静置沉淀至少3小时或者过夜。

6.在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)30min。

7.白色沉淀积于离心管底部，弃上清液(为防止沉淀一起被吸出，可保留些许上清液)，加入80％乙醇(-20℃贮存)轻轻混匀，洗涤沉淀。

8.在4℃离心机下离心(7500rpm，4℃)5min。

9.将乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的残留液体用10μl移液枪慢慢吸出。将离心管开盖放入37℃恒温培养箱干燥，10min左右，待乙醇全部挥发。

10.加入5μl无RNA酶的H2O轻弹管底，让沉淀充分均匀的溶解于无RNA酶的H2O中。

11.取1μl溶解的dsRNA产物稀释于4μl DEPC H2O中，用凝胶电泳检测产物单一性，并用浓度检测仪器检测浓度和OD值。如果检测的条带是单一明亮的条带，并且其OD值为：

260/280:1.8-2.0

260/230:1.8-2.0

则证明dsRNA质量良好，可以进行绿盲蝽体内注射RNAi实验。

8、事实荧光定量PCR与分析

实验采用的是2-ΔΔCT法进行相对定量，即通过内参基因校准不同样品的模板加入总量的差异。ΔΔCT＝(CT目的基因-CT内参基因)实验组-(CT目的基因-CT内参基因)对照组，2-ΔΔCT的意义即为：实验组的目的基因相对于对照组的目的基因的倍数，由此即可得到相对表达量。本实验所用的引物如表2所示

表2实时荧光PCR实验所用引物

本实验中，以α-tubulin,GADPH为内参基因，按照TakaRa公司的SYBR PRemix ExTaqTM试剂盒说明书对绿盲蝽对照组和实验组进行Real Time PCR反应，以实验的三组基因的第1d、2d、3d、4d、5d样品的cDNA模板。反应体系以及反应条件如下：

反应体系为20μL

9、绿盲蝽RNAi饲喂方法的具体实施

9.1龄(3L)绿盲蝽的准备

本发明中所选绿盲蝽为3L若虫，现以3L若虫的收集方法如下：收集1L初孵若虫(200～300头)，放入养虫盒中，盒中放入干净滤纸和一根去皮的新鲜玉米，约4天后所有1L若虫成长为3L若虫，准备铺好滤纸和7～8粒新鲜玉米粒的塑料培养皿，每个培养皿里放15只3L若虫，放若虫时，用软毛刷轻轻挑取，以免对若虫造成不必要的机械损伤。饥饿处理两个小时

人工饲料的配制

人工饲料是按照中国农业科学院植物保护研究所棉花害虫研究组所提供的配方来配制的(棉虫组已经在人工饲料的配制和实际应用方面通过了实验验证)。

9.2注射筛选Eps15基因片段的dsRNA对绿盲蝽生长发育的影响

合成完dsRNA以后先用注射法传递dsRNA，dsGFP和dsβ-actin分别作为对照。注射法使用3L绿盲蝽，注射参数如下：注射体积为41.6nl，注射dsRNA浓度为10μg/μl，注射部位为绿盲蝽的后胸与腹部节间膜的最外侧。结果表3所示。

表3盲蝽Eps15dsRNA注射7天存活率

9.3饲喂传递Eps15dsRNA基因对绿盲蝽生长发育的影响

三龄绿盲蝽的准备和人工饲料的配制

为饲喂实验所准备的绿盲蝽前期准备阶段与注射实验一样然而最后开始做实验前饥饿处理两个小时。

人工饲料是按照中国农业科学院植物保护研究所棉花害虫研究组所提供的配方来配制的(棉虫组已经在人工饲料的配制和实际应用方面通过了实验验证)

饲料总体积200ul，dsRNA浓度0.5ug/ul。结果如表3所示。

表4绿盲蝽Eps15的dsRNA饲喂7天存活率

Claims (7)

1.绿盲蝽ApEps15基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的绿盲蝽ApEps15基因在RNAi介导的害虫防治方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述RNAi介导中，合成的dsRNA通过注射或饲喂进入绿盲蝽体内。

4.根据权利要求3所述的应用，所述合成dsRNA所对应的靶标片段的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

5.根据权利要求3所述的应用，所述注射体积为41.6nl，注射dsRNA浓度为10μg/μl，注射部位为绿盲蝽的后胸与腹部节间膜的最外侧。

6.根据权利要求3所述的应用，所述饲喂的饲料总体积200ul，dsRNA浓度0.5ug/ul。

7.根据权利要求3所述的应用，所述绿盲蝽为三龄绿盲蝽。