CN106267370B

CN106267370B - 丝素蛋白/纤维素3d打印墨水

Info

Publication number: CN106267370B
Application number: CN201610674481.3A
Authority: CN
Inventors: 张耀鹏; 黄利; 朱钰方; 邵惠丽; 胡学超
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Anhui Xianfeng Additive Manufacturing Co ltd
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2016-08-16
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2036-08-16
Also published as: CN106267370A

Abstract

本发明涉及一种丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，主要组分为：生物相容性良好的水溶性丝素蛋白、生物相容性良好的非水溶性的纤维素微/纳米材料、能够诱导丝素蛋白物理交联的无毒性多元醇、能够促进组织再生的生物活性物质和水。本发明的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水粘度较大，动态粘度为1000～5000cP，成型固化速度快，自凝胶化时间为0.5～3min，打印条件温和，打印温度为25～37℃，得到的打印支架精度较高，且力学性能优良，分辨率为50～300μm，压缩模量为10～50MPa。本发明的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水形成的支架可用于人体各种损伤组织或器官的修复与重建领域。

Description

丝素蛋白/纤维素3D打印墨水

技术领域

本发明属于生物3D打印墨水领域，涉及一种丝素蛋白/纤维素3D打印墨水。

背景技术

目前，全世界每年约有上千万人遭受各种形式的创伤，有数百万人因疾病康复过程中重要器官发生纤维化导致功能丧失，有数十万人迫切希望进行各种器官移植。器官移植作为一种不可或缺的临床治疗手段，主要还是依赖于自体或异体移植的治疗模式，这就不可避免要受到器官来源、伦理及机体免疫排斥等方面的限制而难以满足临床救治的需求。据统计结果显示，目前等待器官移植的患者中只有大概20％的人可以进行正常器官移植，其余的只能继续等待或采取其他的治疗方法。

近年来，生物3D(三维)打印技术的兴起在人体组织或器官的再生重建方面备受关注。生物3D打印技术是通过CAD技术模拟人体不同的组织器官并由计算机控制以生物材料、种子细胞及其他一些生物试剂为墨水来打印进行重建人体组织和器官。通过生物3D打印出的支架结构不仅具有准确性、特异性，而且能够维持细胞活力，从而满足人体各类复杂组织器官的重建需求。所以，生物3D打印必将引起生物医学领域的技术革命。然而，生物3D打印技术面临的主要挑战之一在于所打印生物墨水的选择，传统的用于3D打印的材料主要是一些合成高聚物如PEG、PCL、PGA、PGS、PLA、PVA等，这一类材料易于成型、分辨率高，但存在加工温度较高，细胞相容性差的缺点，而常用的一些天然高分子如胶原、弹性蛋白、纤维蛋白、明胶、海藻酸、壳聚糖、透明质酸等虽然打印温度温和，但是存在支架的分辨率低、结构稳定性较差的不足，因此一种兼具细胞相容性、结构稳定性及高分辨率的生物墨水亟待开。

中国专利公开号CN105238132A公开了一种用于3D打印生物支架的生物墨水，所述生物墨水包括具有交联功能的水溶性合成聚合物、具有交联功能的水溶性天然高分子、能自发形成特殊超微结构的生物活性组分、交联引发剂和溶剂及生物活性组分。但是，该墨水的交联需要采用紫外光固化，从而会不可避免的对细胞造成一定程度的损伤。

近期，美国塔夫茨大学Kaplan课题组公开了一种丝素蛋白水溶液和无毒多元醇混合生物墨水，该墨水打印过程中由于丝素蛋白生理温度下的物理交联产生自凝胶化，从而克服了毒性溶剂和打印温度的难题。但是，该墨水在分辨率及对应支架的力学性能方面还差强人意，需要进一步的改进。

针对于不同的组织部位，组织工程支架材料需具备与之匹配的空间几何结构和力学性能，例如，利于骨组织再生的支架应具备10～500μm的孔径分布，此外，密质骨的压缩强度约30MPa，松质骨的压缩强度为2～12MPa。虽然生物可降解的三维网络结构水凝胶与细胞外基质结构具有相似性，但与之相比，3D打印技术能够对支架材料的外部形态和内部微结构进行更精确调控，从而有利于调控细胞的分布及材料与生物体的匹配。然而，由于3D打印技术需要使生物墨水在很短的时间内从流体状态变成固体状态，墨水的初始粘度会影响打印支架的结构完整性，进而影响支架的精确性，墨水的成分会影响支架力学性能。而目前的3D打印生物墨水很难同时兼顾支架的结构精确性和力学性能。因此，寻找一种既能满足生物相容性良好、温和打印条件，又能够进一步满足打印支架的高仿生性和更佳的力学性能的生物墨水是目前需要解决的难题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种生物相容性良好、打印条件温和、能够得到力学性能优良且精度较高的打印支架的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，包括以下组分：水溶性丝素蛋白、非水溶性的纤维素微/纳米材料、无毒性多元醇和水。

作为优选的技术方案：

如上所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，各组分的含量为：水溶性丝素蛋白5～40wt％，非水溶性的纤维素微/纳米材料1～30wt％，无毒性多元醇1～10wt％，余量为水。

如上所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，所述丝素蛋白/纤维素3D打印墨水的动态粘度为1000～5000cP，自凝胶化时间为0.5～3min，打印温度为25～37℃，丝素蛋白/纤维素3D打印墨水打印支架的分辨率为50～300μm，压缩模量为10～50MPa。

如上所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，所述水溶性丝素蛋白的分子量为50～150kDa；所述水溶性丝素蛋白的来源为桑蚕茧、柞蚕茧、蓖麻蚕茧、木薯蚕茧、马桑蚕茧、惠利蚕茧、天蚕茧、琥珀蚕茧、樟蚕茧、栗蚕茧、樗蚕茧、乌桕蚕茧或柳蚕茧。丝素蛋白是一种天然结构性蛋白质，其二级结构包括无规卷曲、α-螺旋、β-折叠构象，其中，β-折叠构象是丝素蛋白结晶形态的主要存在形式，在醇类、温度、外力的作用下，其它的构象会转变为β-折叠构象，而β-折叠构象的形成是丝素蛋白粘度增加、不溶于水、力学性能提高的主要原因，因此，可以通过调控丝素蛋白的分子量、β-折叠构象的含量来达到调节墨水的粘度及最终支架的结构与性能的目的。

如上所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，所述非水溶性的纤维素微/纳米材料为纤维素纳米纤维、纤维素纳米晶须、纤维素微米纤维或纤维素微纳米纤维聚集体；纤维素纳米纤维、纤维素纳米晶须和纤维素微米纤维的长径比为100～200，直径为5nm～10μm；所述非水溶性的纤维素微/纳米材料的纤维素来源为陆生植物、海底植物或细菌。

如上所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，所述陆生植物为棉花、木、竹、麻、草或秸秆，所述海底植物为海藻或海草。

如上所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，所述无毒性多元醇为乙醇、丙三醇、核糖醇、赤藓醇、丁二醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、半乳糖或海藻糖。

如上所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，所述组分还包括生物活性物质，生物活性物质的含量为0.01～10wt％。

如上所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，所述生物活性物质为生物活性玻璃、骨形成蛋白、生物活性磷酸钙、羟基磷灰石、硅酸钙、硅酸镁、血管内皮生长因子或成纤维细胞生长因子。

如上所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，所述组分还包括交联剂，交联剂的含量为0.1～5wt％。

如上所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，所述交联剂为京尼平，京尼平可以增加水溶性丝素蛋白的分子量，相同浓度下，分子量越大，丝素蛋白粘度越大。

本发明以丝素蛋白作为3D打印墨水基体，同时利用纤维素纤维改善墨水的粘度及打印支架材料的分辨率和力学强度。丝素蛋白作为一种天然结构性蛋白质，不仅具有良好的生物相容性，可忽略的免疫反应和炎症反应，而且具有非凡的力学强度，在过去几十年中，一直被作为再生医学材料被不断探索，在皮肤、骨、软骨、血管、神经等方面取得了大量的研究成果。而纳米纤维素纤维如细菌纤维素等也凭借优良的生物相容性而广泛应用于生物医学中。同时，纤维素纤维因其具有较高长径比以及高强、高模、高结晶度特性而作为聚合物增强材料，根据纤维素结构性质的差异，常用于聚合物增强的纤维素纤维成分包括纤维素纳米纤维、纤维素纳米晶须、纤维素微米纤维、纤维素微纳米纤维聚集体。加入不同尺寸、不同含量的纤维素纤维时墨水制备的支架的性能不同，纤维素纤维的浓度越高，粘度越大，支架材料的强度也越大，在同等浓度下，增强效果顺序：纤维素纳米纤维>纤维素纳米晶须>纤维素微米纤维，纤维素纳米纤维、纤维素纳米晶须的分辨率要好于纤维素微米纤维。添加纤维素纳米纤维的粘度要大于纤维素微米纤维。

本发明的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水在打印过程中无需各种化学反应的存在，仅仅依靠丝素蛋白的物理交联作用在室温到生理温度条件下即可固化成型，对细胞几乎没有损伤作用，温和的条件极大保护了打印墨水所负载的细胞及各类生物因子的活性。因此，可以根据具体修复的组织部位在混合墨水中加入能够促进组织再生的信号分子，如促进新骨再生的生物活性玻璃和骨形成蛋白等生物活性物质。

有益效果：

1)本发明的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水是一种生物墨水，各成分均以水作为溶剂，因而都具有优异的生物相容性，可与细胞良好地复合并进行3D打印；

2)本发明的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水以纤维素作为增稠剂来提高丝素蛋白溶液的黏度，相比于纯的丝素蛋白溶液，混合墨水的粘度增加50～100倍，打印支架的分辨率也增加了40％～80％，从而极大提高了打印支架的精度；

3)本发明的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水中纤维素的加入使打印支架的压缩模量增加了50～2500倍，极大地满足了组织工程骨修复中对支架力学性能的要求；

4)本发明利用无毒性多元醇诱导丝素蛋白物理交联，从而避免了化学交联剂的使用；

5)本发明的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水在打印过程中可快速自凝胶化，解决了目前3D打印中水凝胶的成型固化慢的难题；

6)本发明的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水的打印是在室温到生理温度条件下，有利于加载各类生物因子及包埋细胞实现活性打印；

7)本发明的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水可以通过调节丝素蛋白和纤维素等的浓度和比例来调控打印支架的力学性能和降解时间，从适应不同组织对支架力学性能和降解性的需求；

8)采用本发明的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水打印的支架中纤维素的微纤网络结构实现了对细胞外基质的仿生，可诱导细胞的迁移和分化等行为，能创造有利的重建组织微环境。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一种桑蚕丝素蛋白/细菌纤维素纳米晶须3D打印墨水，由40wt％的桑蚕丝素蛋白、4wt％的细菌纤维素纳米晶须、10wt％的丙三醇、4wt％的生物活性玻璃和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为0.5wt％的Na₂CO₃水溶液对桑蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0mol/L的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为65kDa的水溶性桑蚕丝素蛋白；

(2)将细菌纤维素膜用0.5％氢氧化钠水溶液煮沸以除去细菌纤维素膜中的菌体及残留的培养基，然后用去离子水反复冲洗至中性，用匀浆机将碱处理过的细菌纤维素悬液打成浆液，离心分离得到细菌纤维素匀浆，最后冷冻干燥获得细菌纤维素纳米纤维材料，然后进一步利用硫酸水解，纯化后获得长径比为100、直径为50nm的细菌纤维素纳米晶须；

(3)将桑蚕丝素蛋白溶于水，然后加入细菌纤维素纳米晶须、丙三醇和生物活性玻璃，制得桑蚕丝素蛋白/细菌纤维素纳米晶须3D打印墨水。

制得的桑蚕丝素蛋白/细菌纤维素纳米晶须3D打印墨水的动态粘度为4500cP，自凝胶化时间为2min，打印温度为25℃，体积溶胀率为30％，打印支架的分辨率为100μm，压缩模量为20MPa。

对比例1

一种桑蚕丝素蛋白3D打印墨水，由40wt％的桑蚕丝素蛋白、10wt％的丙三醇、4wt％的生物活性玻璃和水组成，制备步骤为：

(2)将桑蚕丝素蛋白溶于水，然后加入丙三醇和生物活性玻璃，制得桑蚕丝素蛋白3D打印墨水。

制得的桑蚕丝素蛋白3D打印墨水的动态粘度为50cP，自凝胶化时间为3min，打印温度为25℃，体积溶胀率为50％，打印支架的分辨率为150μm，压缩模量为0.02MPa。

对比实施例1和对比例1的结果可以看出，与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，添加细菌纤维素纳米晶须的3D打印墨水的动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了近90倍、50％和1000倍，细菌纤维素纳米晶须的加入增大了墨水的动态粘度，缩短了凝胶化时间，3D打印线条尺寸精度明显提高，固化成型后得到的支架的分辨率提高，力学性能增强明显，具有良好的保真性。本发明将纤维素添加入墨水中能够提高墨水和支架的性能，为目前生物墨水存在的结构精确性低、力学性能差等问题提供了一种新的解决途径。

实施例2

一种柞蚕丝素蛋白/细菌纤维素纳米纤维3D打印墨水，由5wt％的柞蚕丝素蛋白、30wt％的细菌纤维素纳米纤维、1wt％的乙醇和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为的0.5wt％Na₂CO₃水溶液对柞蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0mol/L的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为50kDa的水溶性柞蚕丝素蛋白；

(2)将细菌纤维素膜用0.5wt％氢氧化钠水溶液煮沸以除去细菌纤维素膜中的菌体及残留的培养基，然后用去离子水反复冲洗至中性，用匀浆机将碱处理过的细菌纤维素悬液打成浆液，离心分离得到细菌纤维素匀浆，最后冷冻干燥获得长径比为125、直径为5nm的细菌纤维素纳米纤维；

(3)将柞蚕丝素蛋白溶于水，然后加入细菌纤维素纳米纤维和乙醇，制得柞蚕丝素蛋白/细菌纤维素纳米纤维3D打印墨水。

制得的柞蚕丝素蛋白/细菌纤维素纳米纤维3D打印墨水的动态粘度为5000cP，自凝胶化时间为2min，打印温度为30℃，体积溶胀率为28％，打印支架的分辨率为50μm，压缩模量为50MPa。与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了近100倍、80％和2500倍。

实施例3

一种蓖麻蚕丝素蛋白/桑皮纤维素微米纤维3D打印墨水，由14wt％的蓖麻蚕丝素蛋白、25wt％的桑皮纤维素微米纤维、3wt％的核糖醇、8wt％的骨形成蛋白和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为0.5wt％的Na₂CO₃水溶液对蓖麻蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0mol/L的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为80kDa的水溶性蓖麻蚕丝素蛋白；

(2)将桑树韧皮晒干，剪成10cm的小段，用清水洗去杂质，经过碱煮预处理、高温碱煮脱胶、漂白、晾干，得到长径比为150、直径为4μm的桑皮纤维素微米纤维；

(3)将蓖麻蚕丝素蛋白溶于水，然后加入桑皮纤维素微米纤维、核糖醇和骨形成蛋白，制得蓖麻蚕丝素蛋白/桑皮纤维素微米纤维3D打印墨水。

制得的蓖麻蚕丝素蛋白/桑皮纤维素微米纤维3D打印墨水的动态粘度为3500cP，自凝胶化时间为1.8min，打印温度为32℃，体积溶胀率为40％，打印支架的分辨率为200μm，压缩模量为10MPa。与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了近70倍、50％和1000倍。

实施例4

一种木薯蚕丝素蛋白/海藻纤维素纳米纤维3D打印墨水，由18wt％的木薯蚕丝素蛋白、22wt％的海藻纤维素纳米纤维、4wt％的赤藓醇、6wt％的生物活性磷酸钙和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为0.5wt％的Na₂CO₃水溶液对木薯蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0mol/L的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为88kDa的水溶性木薯蚕丝素蛋白；

(2)将晒干的海藻，剪碎，用清水洗去杂质，经过分离、纯化、晾干后得到长径比为150、直径为20nm的海藻纤维素纳米纤维；

(3)将木薯蚕丝素蛋白溶于水，然后加入海藻纤维素纳米纤维、赤藓醇和生物活性磷酸钙，制得木薯蚕丝素蛋白/海藻纤维素纳米纤维3D打印墨水。

制得的木薯蚕丝素蛋白/海藻纤维素纳米纤维3D打印墨水的动态粘度为4900cP，自凝胶化时间为0.5min，打印温度为35℃，体积溶胀率为29％，打印支架的分辨率为125μm，压缩模量为26MPa。与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了近80倍、58％和1300倍。

实施例5

一种马桑蚕丝素蛋白/海草纤维素纳米纤维3D打印墨水，由24wt％的马桑蚕丝素蛋白、20wt％的海草纤维素纳米纤维、5wt％的丁二醇、0.1wt％的京尼平和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为0.5wt％的Na₂CO₃水溶液对马桑蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0mol/L的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为95kDa的水溶性马桑蚕丝素蛋白；

(2)将晒干的海草，剪碎，用清水洗去杂质，经过分离、纯化、晾干后得到长径比为180、直径为500nm的海草纤维素纳米纤维；

(3)将马桑蚕丝素蛋白溶于水，然后加入海草纤维素纳米纤维、丁二醇和京尼平，制得马桑蚕丝素蛋白/海草纤维素纳米纤维3D打印墨水。

制得的马桑蚕丝素蛋白/海草纤维素纳米纤维3D打印墨水的动态粘度为4100cP，自凝胶化时间为0.8min，打印温度为36℃，体积溶胀率为35％，打印支架的分辨率为130μm，压缩模量为34MPa。与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了近70倍、57％和1200倍。

实施例6

一种惠利蚕丝素蛋白/海藻纤维素纳米晶须3D打印墨水，由30wt％的惠利蚕丝素蛋白、15wt％的海藻纤维素纳米晶须、6wt％的木糖醇、1wt％的京尼平和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为0.5wt％的Na₂CO₃水溶液对惠利蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0mol/L的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为100kDa的水溶性惠利蚕丝素蛋白；

(2)将晒干的海藻，剪碎，用清水洗去杂质，经过分离、纯化、晾干后得到长径比为200、直径为10nm的海藻纤维素纳米晶须；

(3)将惠利蚕丝素蛋白溶于水，然后加入海藻纤维素纳米晶须、木糖醇和京尼平，制得惠利蚕丝素蛋白/海藻纤维素纳米晶须3D打印墨水。

制得的惠利蚕丝素蛋白/海藻纤维素纳米晶须3D打印墨水的动态粘度为4000cP，自凝胶化时间为1min，打印温度为37℃，体积溶胀率为34％，打印支架的分辨率为100μm，压缩模量为32MPa。与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了近60倍、60％和1100倍。

实施例7

一种天蚕丝素蛋白/棉纤维素微米纤维3D打印墨水，由32wt％的天蚕丝素蛋白、12wt％的棉纤维素微米纤维、7wt％的山梨醇、1.5wt％的京尼平和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为0.5wt％的Na₂CO₃水溶液对天蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0mol/L的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为115kDa的水溶性天蚕丝素蛋白；

(2)将棉花经过粉碎并分离提纯得到长径比为200、直径为10μm棉纤维素微米纤维；

(3)将天蚕丝素蛋白溶于水，然后加入棉纤维素微米纤维、山梨醇和京尼平，制得天蚕丝素蛋白/棉纤维素微米纤维3D打印墨水。

制得的天蚕丝素蛋白/棉纤维素微米纤维3D打印墨水的动态粘度为3800cP，自凝胶化时间为1.2min，打印温度为25℃，体积溶胀率为36％，打印支架的分辨率为160μm，压缩模量为20MPa。与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了近76倍、47％和1000倍。

实施例8

一种琥珀蚕丝素蛋白/竹纤维素微米纤维3D打印墨水，由35wt％的琥珀蚕丝素蛋白、8wt％的竹纤维素微米纤维、8wt％的甘露醇、3wt％的羟基磷灰石、2.6wt％的京尼平和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为0.5wt％的Na₂CO₃水溶液对琥珀蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0mol/L的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为130kDa的水溶性琥珀蚕丝素蛋白；

(2)将竹子经过粉碎并分离提纯后得到长径比为100、直径为9μm的竹纤维素微米纤维；

(3)将琥珀蚕丝素蛋白溶于水，然后加入竹纤维素微米纤维、甘露醇、羟基磷灰石和京尼平，制得琥珀蚕丝素蛋白/竹纤维素微米纤维3D打印墨水。

制得的琥珀蚕丝素蛋白/竹纤维素微米纤维3D打印墨水的动态粘度为3600cP，自凝胶化时间为1.6min，打印温度为26℃，体积溶胀率为37％，打印支架的分辨率为162μm，压缩模量为15MPa。与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了近60倍、46％和750倍。

实施例9

一种樟蚕丝素蛋白/麻纤维素微米纤维3D打印墨水，由30wt％的樟蚕丝素蛋白、10wt％的麻纤维素微米纤维、5wt％的甘露醇、5wt％的硅酸钙、2wt％的京尼平和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为0.5wt％的Na₂CO₃水溶液对樟蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0mol/L的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为115kDa的水溶性樟蚕丝素蛋白；

(2)将麻纤维原料经过粉碎并分离提纯后得到长径比为110、直径为4μm麻纤维素微米纤维；

(3)将樟蚕丝素蛋白溶于水，然后加入麻纤维素微米纤维、甘露醇、硅酸钙和京尼平，制得樟蚕丝素蛋白/麻纤维素微米纤维3D打印墨水。

制得的樟蚕丝素蛋白/麻纤维素微米纤维3D打印墨水的动态粘度为3700cP，自凝胶化时间为1.5min，打印温度为29℃，体积溶胀率为36％，打印支架的分辨率为160μm，压缩模量为17MPa。与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了74倍、47％和850倍。

实施例10

一种栗蚕丝素蛋白/草纤维素微米纤维3D打印墨水，由38wt％的栗蚕丝素蛋白、5wt％的草纤维素微米纤维、9wt％的半乳糖、1wt％的硅酸镁、3.5wt％的京尼平和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为0.5wt％的Na₂CO₃水溶液对栗蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0mol/L的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为142kDa的水溶性栗蚕丝素蛋白；

(2)将草纤维原料经过粉碎并分离提纯后得到长径比为160、直径为5μm草纤维素微米纤维；

(3)将栗蚕丝素蛋白溶于水，然后加入草纤维素微米纤维、半乳糖、硅酸镁和京尼平，制得栗蚕丝素蛋白/草纤维素微米纤维3D打印墨水。

制得的栗蚕丝素蛋白/草纤维素微米纤维3D打印墨水的动态粘度为2000cP，自凝胶化时间为2min，打印温度为30℃，体积溶胀率为38％，打印支架的分辨率为180μm，压缩模量为42MPa。与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了近50倍、40％和600倍。

实施例11

一种樗蚕丝素蛋白/秸秆纤维素微米纤维3D打印墨水，由39wt％的樗蚕丝素蛋白、11wt％的秸秆纤维素微米纤维、7wt％的半乳糖、4wt％的血管内皮生长因子、4wt％的京尼平和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为0.5wt％的Na₂CO₃水溶液对樗蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0mol/L的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为140kDa的水溶性樗蚕丝素蛋白；

(2)将秸秆纤维原料经过粉碎并分离提纯后得到长径比为137、直径为4μm的秸秆纤维素微米纤维；

(3)将樗蚕丝素蛋白溶于水，然后加入秸秆纤维素微米纤维、半乳糖、血管内皮生长因子和京尼平，制得樗蚕丝素蛋白/秸秆纤维素微米纤维3D打印墨水。

制得的樗蚕丝素蛋白/秸秆纤维素微米纤维3D打印墨水的动态粘度为3600cP，自凝胶化时间为1.7min，打印温度为31℃，体积溶胀率为37％，打印支架的分辨率为265μm，压缩模量为28MPa。与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了近72倍、40％和50倍。

实施例12

一种乌桕蚕丝素蛋白/花生壳微米纤维3D打印墨水，由40wt％的乌桕蚕丝素蛋白、1wt％的花生壳微米纤维、10wt％的海藻糖、0.01wt％的成纤维细胞生长因子、5wt％的京尼平和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为0.5wt％的Na₂CO₃水溶液对乌桕蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为150kDa的水溶性乌桕蚕丝素蛋白；

(2)将花生壳经过粉碎并分离提纯后得到长径比为110、直径为1μm的花生壳微米纤维；

(3)将乌桕蚕丝素蛋白溶于水，然后加入花生壳微米纤维、海藻糖、成纤维细胞生长因子和京尼平，制得乌桕蚕丝素蛋白/花生壳微米纤维3D打印墨水。

制得的乌桕蚕丝素蛋白/花生壳微米纤维3D打印墨水的动态粘度为1000cP，自凝胶化时间为3min，打印温度为32℃，体积溶胀率为45％，打印支架的分辨率为300μm，压缩模量为10MPa。与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了60倍、45％和500倍。

实施例13

一种柳蚕丝素蛋白/草微纳米纤维聚集体3D打印墨水，由37wt％的柳蚕丝素蛋白、9wt％的草微纳米纤维聚集体、6wt％的海藻糖、0.01wt％的成纤维细胞生长因子、5wt％的京尼平和水组成，制备步骤为：

(1)用浓度为0.5wt％的Na₂CO₃水溶液对柳蚕茧进行脱胶，然后用浓度为9.0的LiBr水溶液将其溶解，经稀释、离心、抽滤、透析、浓缩后获得分子量为150kDa的水溶性柳蚕丝素蛋白；

(2)将草纤维原料经过粉碎并分离提纯后得到草微纳米纤维聚集体；

(3)将柳蚕丝素蛋白溶于水，然后加入草微纳米纤维聚集体、海藻糖、成纤维细胞生长因子和京尼平，制得柳蚕丝素蛋白/草微纳米纤维聚集体3D打印墨水。

制得的柳蚕丝素蛋白/草微纳米纤维聚集体3D打印墨水的动态粘度为1800cP，自凝胶化时间为2.5min，打印温度为28℃，体积溶胀率为45％，打印支架的分辨率为180μm，压缩模量为19MPa。与相同条件下未添加纤维素的3D打印墨水相比，动态粘度、分辨率和压缩模量分别增加了65倍、63％和1200倍。

Claims

1.丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，其特征是包括以下组分：水溶性丝素蛋白、非水溶性的纤维素微/纳米材料、无毒性多元醇和水；

各组分的含量为：水溶性丝素蛋白5～40wt％，非水溶性的纤维素微/纳米材料1～30wt％，无毒性多元醇1～10wt％，余量为水；

所述非水溶性的纤维素微/纳米材料为纤维素纳米纤维、纤维素纳米晶须、纤维素微米纤维或纤维素微纳米纤维聚集体；纤维素纳米纤维、纤维素纳米晶须和纤维素微米纤维的长径比为100～200，直径为5nm～10μm。

2.根据权利要求1所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，其特征在于，所述丝素蛋白/纤维素3D打印墨水的动态粘度为1000～5000cP，自凝胶化时间为0.5～3min，打印温度为25～37℃，丝素蛋白/纤维素3D打印墨水打印支架的分辨率为50～300μm，压缩模量为10～50MPa。

3.根据权利要求1所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，其特征在于，所述水溶性丝素蛋白的分子量为50～150kDa；所述水溶性丝素蛋白的来源为桑蚕茧、柞蚕茧、蓖麻蚕茧、木薯蚕茧、马桑蚕茧、惠利蚕茧、天蚕茧、琥珀蚕茧、樟蚕茧、栗蚕茧、樗蚕茧、乌桕蚕茧或柳蚕茧。

4.根据权利要求1所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，其特征在于，所述非水溶性的纤维素微/纳米材料的纤维素来源为陆生植物、海底植物或细菌。

5.根据权利要求4所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，其特征在于，所述陆生植物为棉花、木、竹、麻、草或秸秆，所述海底植物为海藻或海草。

6.根据权利要求1所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，其特征在于，所述无毒性多元醇为乙醇、丙三醇、核糖醇、赤藓醇、丁二醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、半乳糖或海藻糖。

7.根据权利要求1所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，其特征在于，所述组分还包括生物活性物质，生物活性物质的含量为0.01～10wt％。

8.根据权利要求7所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，其特征在于，所述生物活性物质为生物活性玻璃、骨形成蛋白、生物活性磷酸钙、羟基磷灰石、硅酸钙、硅酸镁、血管内皮生长因子或成纤维细胞生长因子。

9.根据权利要求1所述的丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，其特征在于，所述组分还包括交联剂，交联剂的含量为0.1～5wt％；所述交联剂为京尼平。