CN106191080A - Cyp78a基因在增加玉米株高和增强植株长势中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CYP78A基因在增加玉米株高和增强植株长势中的应用，所述CYP78A基因编码的氨基酸序列为下列之一或具有75％以上同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3；本发明提供CYP78A基因的一种新应用，通过在玉米中过表达CYP78A基因，提高玉米的株高和生长势，进而提高玉米的生物量，并最终实现玉米增产；同时，作为一种改进，将CYP78A基因与TEL基因联合导入玉米植株，实现植株株高增加、叶片变宽、生长势增加、生物量增加，并且棒子变大、种子变大或变多的表型变化。

Description

CYP78A基因在增加玉米株高和增强植株长势中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种CYP78A基因的应用，特别是在增加玉米株高和增强植株长势中的应用。

(二)背景技术

随着人类对粮食的需求不断增加，高产作物的培育也越来越重要。转基因技术已经被广泛用来改良农作物的性状，如获得抗虫能力、抗除草剂能力、增强抗干旱、抗病能力等。高产也是转基因农作物改良的重要内容。例如，利用转基因表达一种植物的转录因子(Transcription factor)可以提高农作物的产量(U.S.Pat.No.7,598,529,4)。农作物产量是一个复杂的数量性状，受到很多基因的调控(Xing and Zhang,(2010)Annual Review of Plant Biology,61:421-442)。因此，研究和发掘有重大应用价值的新基因或者已知基因的新功能，并利用这些基因提高农作物产量仍然十分需要。

20世纪50～60年代，中国的实践与株型理论相结合的第一个发展阶段是矮化育种，这个阶段的研究中心是作物的株高，通过降低株高使品种的耐肥、抗倒性和密植性显著增强，进而提高叶面积指数和生物产量，从而提高作物群体的产量。但是，随着株型理论研究的深入和生产实践发展，对株高有了新的认识，矮秆主要是提高了经济系数，生物产量并无明显变化，认为产量上要有较大的突破必须在生物产量上有大幅度的提高。适当增加一点株高，可以降低叶面积密度，有利于CO₂扩散和中下部叶片的受光，对生物量和后期籽粒充实显然是有利的。同时也有研究证明，株高与生物量呈显著的正相关，尤其是在高产条件下关系更为密切，而生物量增加又是穗粒数和千粒重增加的物质基础。因此，发掘和利用株高调控基因是提高作物生物量和产量的一个重要途径。

细胞色素P450是植物中最大的酶蛋白家族，在植物体内担当重要的功能。P450的主要特征是在所有结构已知的P450蛋白中都含有一个保守的血红素结合域，这个结构域含有保守的FxxGxRxCxG序列。P450具有广泛的催化活性，其催化的反应类型广泛而复杂，如烯基的环氧化反应，烷基的烃化作用，氮、硫、氧位的脱烷基作用，烃基的氧化作用，过氧化作用，脱硫作用，氧化性的碳-碳键断裂，氧化性脱氨、脱卤和脱氢等10多种。植物细胞色素P450的功能主要可归为两大类：1)参与生物合成途径，2)参与生物解毒途径。参与生物合成途径的植物P450在苯丙烷类、生物碱、萜类、生菁糖苷类、植物激素等的合成中起重要作用(He et al.,(2008)PharmaceuticalBiotechnology,15:142-147)。

CYP78A是P450家族的一个亚族，具有重要的功能(Bak et al.,(2011)TheArabidopsis Book/American Society of Plant Biologists,9:e0144)。植物CYP78A基因中，功能研究展开的比较早的是玉米中的CYP78A基因CYP78A1。该基因主要在发育的花序中表达，可能参与脂肪酸的代谢，但由于没有对应的突变体，CYP78A1在玉米中的具体功能尚不清楚(Imaishi et al.,(2000)Biosci Biotech Bioch,64:1696-1701)。拟南芥的cyp78a5/kluh(klu)突变体和水稻中的cyp78a11/plastochron1(pla1)突变体表现出叶片起始加快和器官变小等表型变化(Kawakatsu et al.,(2006)Plant Cell,18:612-625；Xiong et al.,(2006)Cell Research,16:267-276)。相反的，在拟南芥中过表达CYP78A5或者CYP78A9基因后植株的器官变大(Anastasiou et al.,(2007)Developmental Cell,13:843-856)。KURATA NORI等发现在水稻中过表达CYP78A11基因后，谷粒的大小和重量都增加，并对利用CYP78A11基因增加水稻粒重的方法申请了专利(日本专利No.2004-017246)。李云海等发现拟南芥中的CYP78A6基因和CYP78A9基因具有类似的调控种子大小的功能，并对利用CYP78A基因调控种子大小的方法申请了专利(U.S.Pat.No.PCT/GB2013/050072)。

尽管已有的研究发现植物CYP78A基因具有调控叶片起始(Kawakatsu et al.,(2006)Plant Cell,18:612-625；Xiong et al.,(2006)Cell Research,16:267-276)和种子大小的功能(Anastasiou et al.,(2007)Developmental Cell,13:843-856；日本专利No.2004-017246；U.S.Pat.No.PCT/GB2013/050072)，但CYP78A在不同植物中的功效并不相同。特别是从水稻CYP78A的功能并不能推测出其对玉米的生长、发育和产量的影响。例如，以前在水稻上的相关研究并没有发现该基因显著增加植株高度和增强生长势方面的功能，而本发明首次公开了在玉米中提高CYP78A基因的表达可以增加株高、增强植株生长势。

玉米的Mei2同源基因“terminal ear1”(ZmTE1)在植物的芽和根的分生组织中表达，失去ZmTE1基因功能的突变体玉米的叶片形态和叶片生长的空间结构发生变化，说明其可能参与决定植株叶片在茎干上生长的空间结构(Veit et al.,(1998)Nature,393:166-168)。水稻中的Mei2的同源基因OsTEL的功能和玉米ZmTE1相似。Kawakatsu等发现失去OsTEL基因(又称为PLA1)功能的水稻突变体的叶片形成速度加快，叶片成熟速度加快，说明其具有调控叶片形成和叶片成熟的功能(Kawakatsu,et al.,(2006)Plant Cell,18:612-625)。最近，我们发现TEL基因具有调控植株生长势、种子大小或种子数量、产量等性状的功能。在植物中过表达TEL基因能使作物的生长势增强、种子变大或数量变多、产量增加(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069)。

本发明首次公开了同时利用CYP78A亚族蛋白质多肽和TEL多肽获得株高增加、生长势增强、棒子变大、生物量提高且产量增加的基因工程玉米的方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种CYP78A基因的新应用，具体为用于调控玉米株高和生长势的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种CYP78A基因在增加玉米株高和增强植株长势中的应用。

本发明提供的CYP78A蛋白可以是来自任何植物，优选自禾本科植物，比如自玉米、水稻、高粱或小麦，特别优选来自水稻或玉米。一般可以预见这些来自不同植物的同源蛋白具有相同或者相似的功能，因此同样可以利用这些基因改良植物的农艺性状。进一步，即使不能预见这些蛋白的功能，本领域的一般技术人员可以根据本发明提供的方法和现有技术测定它们是否具有促进植物生长和光合作用增强的功能。本发明最优选CYP78A基因为下列来源之一的基因或其同源序列(核苷酸同源性达85％以上)：玉米(Zea maize)CYP78A1(氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示)、水稻(Oryza sativa)的CYP78A11基因(氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示)和高粱(Sorghum bicolor)的CYP78A1L基因(氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:6)。

编码本发明CYP78A蛋白的多核苷酸序列可以有多种不同的变异，多核苷酸序列的变异包括但不限于：1)由于编码同一个氨基酸的密码子不同而获得不同的多核苷酸序列，这些序列编码具有相同活性的蛋白质多肽；2)来源于生物的遗传多态性(Genetic Polymorphism)，即同一种植物的不同个体或者群体之间的多样性；3)通过人工操作导入多核苷酸序列的变异。人工导入的这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的定向变异。本领域的一般技术人员就能通过分子生物学的方法产生点突变，插入或者缺失变异等。通过人工操作导入多核苷酸序列的变异也包括通过GeneShuffling等方法获得仍然具有正常功能的杂合基因。例如U.S.Pat.No.2002/0058249；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature,370:389-391；Crameri et al.(1997)Nature Biotech.,15:436-438；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.,272:336-347；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4504-4509；Crameri et al.(1998)Nature,391:288-291；and U.S.Pat.NOs.5,605,793and 5,837,458。

本发明所述CYP78A基因的多核苷酸序列，本领域的一般技术人员通常可以利用PCR方法、DNA杂交方法等从一种植物中克隆到相应的同源基因。根据本发明提供的多核苷酸序列设计引物，可以通过PCR方法获得同源基因的部分或者全部序列。而一旦获得该基因的部分序列，就可以通过不同的方法克隆到全长基因。另一方面，利用本发明提供的多核苷酸制备探针，可以通过DNA杂交方法从一种植物的DNA文库中克隆获得其同源基因。

本发明所述CYP78A基因编码的多肽可以用于调控玉米的株高、生长势、叶片面积、棒子大小、生物量和产量，优选CYP78A基因编码的多肽为下列之一或具有75％以上同源性的氨基酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3，最优选CYP78A基因编码的多肽为下列之一SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3，所述应用方法包括提高玉米中CYP78A基因的表达或活性，具体方法包括：1)构建包含本发明提供的多核苷酸序列的表达框；表达框可以通过一个或者几个控制表达的多核苷酸序列(比如启动子和终止子)与CYP78A1或其同源基因功能性连接而获得；本发明特别提供了利用CYP78A1或其同源基因本身的表达框，即包含这些基因本身的启动子和终止子的整个DNA片段；2)将表达框导入到植物中，并获得表达；特别是通过利用基因表达调控序列，使导入的基因在时间和空间上的表达特点与其内生基因相同或者类似，以减少非组织特异性过量表达CYP78A1或其同源基因可能对植物产生的不利影响。

本发明获得的CYP78A1或其同源基因过表达植株鉴定的方法包括：观察植株表型、喷洒除草剂、分子物学方法等，当然，在实际应用中可以多种方法一起使用。由于本发明提供的CYP78A1或其同源基因过表达植株和对照植株有比较明显的表型差异，可以通过肉眼辨别。CYP78A1或其同源基因表达的玉米植株表现为株高增加、或生长势增加、或叶片变宽、或生物量增加、或同时具备上述两种或两种以上的表型变化。如果标记基因和目的基因紧密连锁，可以用喷洒除草剂的方法来鉴定目的基因。例如，将CYP78A1或其同源基因构建在以抗草甘膦基因(EPSPS)为筛选标记的载体上，抗草甘膦的植株很可能就是CYP78A1或其同源基因过表达了的植株。鉴定CYP78A1或其同源基因过表达植株还可以用分子生物学方法，这些方法主要包括Southern杂交法和PCR等技术，检测目标基因的DNA；荧光定量PCR或者定量PCR等技术，检测目标基因mRNA的水平；Western杂交法和酶联免疫吸附实验(ELISA)等技术，检测目标基因的蛋白水平。

进一步，本发明所述CYP78A基因在增加玉米株高、增强植株长势和产量中的应用是将CYP78A基因与TEL基因通过杂交或者其它方式转入玉米植株，实现玉米株高、长势和产量的增加。本发明通过提高玉米中CYP78A基因和TEL基因的表达或活性，能够使玉米株高增加、生长势增强、叶片面积变大、棒子变大、种子变大或变多、生物量增加且产量增加，具体方法包括：1)构建包含本发明提供的多核苷酸序列的表达框，表达框可以通过一个或者几个控制表达的多核苷酸序列(比如启动子和终止子)分别与CYP78A或其同源基因以及TEL或其同源基因功能性连接而获得。本发明特别提供了利用CYP78A1或其同源基因，以及ZmTE1或其同源基因本身的表达框，即包含这些基因本身的启动子和终止子的整个DNA片段；2)将CYP78A1或其同源基因的表达框和ZmTE1或其同源基因的表达框构建在同一个载体上导入到植物中，或者将CYP78A1或其同源基因的表达框和ZmTE1或其同源基因的表达框分别构建在两个独立的载体上再通过共侵染或者杂交的方法以及其它方法把上述两种表达框导入到同一植株中，最终获得同时提高上述两种基因表达的植株。特别是通过利用基因表达调控序列，使导入的基因在时间和空间上的表达特点与其内生基因相同，以减少非组织特异性过量表达CYP78A1或其同源基因以及ZmTE1或其同源基因可能对植物产生的不利影响。目前，多基因转化主要有以下几种方法：杂交法(Cao,j.,et.al.,(2002)Theor.Appl.Genet.,105:258-264)、再转化法(Rosati,C.,2003,Mol.Breed,12:197-208)、共转化法、基因连接法(Halpin,(2005)Plant Biotechnology J,3:141-155)和多顺反子转基因法(Halpin et al.,(2001)Plant Mol Biol,47:295-310)等。

本发明中获得的同时提高CYP78A(优选CYP78A1)或其同源基因以及TEL(优选ZmTE1)或其同源基因表达的植株进行鉴定的方法包括观察植株表型、喷洒除草剂、分子物学方法等。当然，在实际应用中可以多种方法一起使用。

由于CYP78A(优选CYP78A1)或其同源基因过表达植株与TEL(优选ZmTE1)或其同源基因过表达植株在表型上有显著差异，可以通过肉眼辨别。所以同时具有提高这两种基因表达后的表型的植株很可能同时提高了这两种基因的表达。例如，提高CYP78A(优选CYP78A1)或其同源基因表达的玉米植株表现为株高增加、或叶片变宽、或生长势增加、或生物量增加、或同时具备上述两种或两种以上的表型变化；提高TEL(优选ZmTE1)或其同源基因表达的玉米植株最大的表型变化是棒子变大且种子变大或变多。而同时提高了上述两类基因表达的植株则具有株高增加、叶片变宽、生长势增加或生物量增加、并且棒子变大、种子变大或变多的表型变化。

如果CYP78A(优选CYP78A1)或其同源基因以及TEL(优选ZmTE1)或其同源基因分别构建在两个以不同的抗除草剂基因作为筛选标记的载体上时，鉴于标记基因和目的基因紧密连锁，可以用喷洒除草剂的方法来鉴定目的基因，喷洒两种除草剂后仍能成活的转基因植株为两个目标基因都存在。例如，将CYP78A11或其同源基因构建在以抗草甘膦基因(EPSPS)为筛选标记的载体上，而把ZmTE1或其同源基因构建在以抗草丁膦(Bar)为筛选标记的载体上。既抗草甘膦又抗草丁膦的转基因植株则很可能是同时提高了两个基因的表达。

鉴定同时提高CYP78A(优选CYP78A1)或其同源基因以及TEL(优选ZmTE1)或其同源基因表达的植株还可以用分子生物学方法，这些方法主要包括Southern杂交法和PCR等技术，分别检测两个目标基因的DNA；荧光定量PCR或者定量PCR等技术，分别检测两个目标基因mRNA的水平；Western杂交法和酶联免疫吸附实验(ELISA)等技术，分别检测两个目标基因的蛋白水平。

本发明提供的多核苷酸可以被克隆到质粒载体中，在细胞中获得大量复制。利用这种DNA重组技术，本发明获得的多核苷酸可以和控制基因表达的启动子和终止子功能性地连接而构成表达框。所谓功能性地连接指启动子和终止子能够发挥控制与它连接的多核苷酸的表达。通常启动子连接在5’端，终止子连接在3’端。

控制基因表达的启动子是本领域的技术人员都已经知道的技术。Potenza等的综述详细介绍和总结了有关启动子的研究(Potenza et al(2004)In Vitro Cell Dev Biol-Plant,40:1-22)。启动子包括组成型表达的启动子、组织特别表达启动子、可以诱导表达的启动子等。

本发明特别提供了来源于CYP78A1或其同源基因以及ZmTE1或其同源基因的启动子。启动子的区域可以通过试验得到确定。一般启动子可以是编码蛋白质的阅读框5’端外面至少0.25kb、0.5kb、1.0kb、2.0kb或3.0kb的DNA片段。CYP78A1或其同源基因以及ZmTE1或其同源基因的天然启动子除了可以用来控制其本身基因的表达以外，也可以与其他植物的同源基因功能性地连接，在其他植物中控制这些基因的表达，以获得改良的转基因植物。例如水稻CYP78A11的启动子用来控制玉米CYP78A1基因在玉米中的表达，以及水稻OsTEL的启动子用来控制玉米ZmTE1基因在玉米中的表达。

控制本发明提供的基因的启动子还可以是组织特异的启动子，例如STM特异启动子(U.S.Pat.No.5880330)，ARSK1根特异表达启动子(United States Patent Application20040067506)，AP1花分生组织启动子(Sasaki,Katsutomo,et al.(2011)Plantbiotechnology,28:181-188)。这些启动子可以导致CYP78A1或其同源基因以及ZmTE1或其同源基因在一些组织中特异性表达，从而促进这些特异组织的生长。

控制本发明提供的基因的启动子还可以是组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒的CaMV 35S启动子(Terada and Shimamoto,(1990)Molecular&General Genetics,220:389-392)，水稻的actin 1启动子(Mcelroy et al.,(1990)The Plant Cell,2:163-171)。这些启动子可以导致CYP78A1或其同源基因以及ZmTE1或其同源基因在植物的大部分组织中特异性表达，从而促进这些组织的生长。

控制基因表达的终止子可以是提供基因的天然终止子，也可以是同种植物的其他基因或者其他植物基因的终止子。常用的终止子包括来源于农杆菌的Octopine合成酶终止子和nopaline合成酶终止子等。参考文献包括：Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.,262:141-144；Proudfoot(1991)Cell,64:671-674；Sanfacon et al.(1991)GenesDev.,5:141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell,2:1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene,91:151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.,17:7891-7903；and Joshi et al.(1987)Nucleic Acids Res.,15:9627-9639。

为了提高基因在目标植物中的表达水平，基因的多核苷酸序列可以进一步修饰和改变。这些改变包括删除内含子、清除一些可能影响基因正常表达的序列，如隐藏的非成熟的PolyA信号序列等。根据目标植物的密码子使用情况，编码相同蛋白质多肽的多核苷酸序列可以优化，以提高其在目标植物中的表达量。

本发明的另外一个方面是利用本发明提供的基因，找到这个基因在基因组中的位置，然后通过DNA定点插入技术，将基因表达的调控序列，如CaMV的35S增强子，插入到可以增强本发明基因表达的位点上。一个增强子往往能够影响附近基因的表达，有的增强子可以提高相距20kb或更远的基因的表达。目前植物的DNA定点插入技术已经很成熟(Townsend,Jeffrey A.,et al.(2009)Nature,459:442-445；Jiang,W.,etal.(2013).Nat.Biotechnol.,31:233–239；Cong,L.et al.(2013)Science,339:819–823)。因此，利用定点插入的方法，将增强子插入CYP78A基因附近就可能提高这个基因的表达。

本发明用于构建基因表达框的载体也可以同时包含一个选择标记基因表达框。这个选择标记基因可以用来选择转化了的细胞，常用的基因包括抗生素抗性基因，如neomycin phosphotransferase II(NEO)和hygromycin phosphotransferase(HPT)、抗除草剂基因，如抗草甘膦基因EPSPS等。其他选择标记基因同样可以用作本发明转化的选择基因。

本发明提供的基因可以导入植物从而获得转基因的高产植物，这些植物包括但不限于玉米、小麦、大麦、高粱、水稻、甘蔗、大豆、胡萝卜、马铃薯、棉花、向日葵、油菜、橡树、草坪草、牧草。

目前本领域的一般技术人员能够利用现有技术将本发明提供的多核苷酸导入到植物中进行表达。比较常用的方法是基因枪方法(Klein et al,1987,Nature(London),327:70-73；U.S.Pat.No.4,945,050))或农杆菌介导方法((De Blaere et al,1987,Meth.Enzymol.,143:277)。但是本发明不限于这种方法。

不同植物的转化方法和步骤有所不同。通常使用较广的方法是通过农杆菌或基因枪导入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈伤组织或原生质体。然后用相应的筛选培养基进行筛选培养。再进行分化而获得转化芽，通过生根培养基培养就可以获得可以种植的转基因苗。进一步，抗除草剂转基因植物可以通过喷施除草剂筛选，例如喷施烟嘧磺隆可以杀灭非转基因的水稻。本发明涉及的植物包括但不限于水稻、玉米、高粱、甘蔗、棉花、小麦、大豆、油菜、草坪草或牧草。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供CYP78A基因的一种新应用，通过在玉米中过表达CYP78A基因，提高玉米的株高和生长势，进而提高玉米的生物量，并最终实现玉米增产；将CYP78A基因与TEL基因联合导入玉米植株，实现植株株高增加、叶片变宽、生长势增加、生物量增加，并且棒子变大、种子变大或变多的表型变化。

(四)附图说明

图1：植物转化载体pCambia1300-G10-pCYP78A1-CYP78A1的T-DNA结构示意图，玉米CYP78A1基因，CYP78A1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，包括编码区和终止子的核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示。

图2：植物转化载体pCambia1300-G10-pCYP78A11-CYP78A11的T-DNA结构示意图，水稻CYP78A11基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示，包括编码区和终止子的核苷酸序列为SEQ ID NO：8所示。

图3：CYP78A基因过表达的苗期玉米植株，其中CK为对照，T为CYP78A1基因过表达植株。

图4：CYP78A基因和TEL基因同时加强表达的玉米植株，其中CK为对照，T为转基因植株。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology和J.Sambrook等编写Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的MolecularCloning:A Labortory Manual,3rd ED.等文献均有详细的说明。

实施例1.玉米CYP78A基因--CYP78A1过量表达载体的构建

玉米CYP78A1基因编码区域(核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)和终止子DNA片段通过人工合成获得，其核苷酸序列如SEQ ID No.7，该片段可以通过BamHI和KpnI酶切以后获得。

CYP78A1基因的启动子片段pCYP78A1通过PCR获得。PCR的2个引物分别是：pCYP78A1-F(5’-AAGCTTCTCAAGACTCCTAATTCTCAGC-3’)和pCYP78A1-R(5’-AGATCTTTCTGGCTAGCTGCTTCTAGTAGC-3’)。引物中分别设计了HindIII和BglII酶切位点。以玉米(B73)基因组为模板，PCR获得的大约1.9kb的DNA片段后克隆到pMD-18-T-Vector载体(TaKaRa)中，测定序列，最终获得如核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示的启动子序列，该片段可以利用HindIII和BglII酶切获得。

PCR的反应体系为：5x PrimeSTAR^TM Buffer(Mg²⁺plus)(购自TaKaRa公司)，10μl；dNTP Mixture(各2.5mM)，4μl；引物pCYP78A1-F(10μM)，1μl；引物pCYP78A1-R(10μM)，1μl；模板DNA100ng；PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(2.5U/μl)，0.5μl；灭菌蒸馏水，加至最终体积为50μl。

PCR的条件为：95℃预变性2min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸10min。

农杆菌T-DNA载体的构建：

双元载体pCambia1300-pZmUbi-G10的全部DNA序列如SEQ ID NO.11所示，该载体包含一个耐草甘膦基因(EPSPS)，作为转化的标记基因；包含HindIII和KpnI位点，作为目的基因的克隆位点。HindIII和BglII酶切获得CYP78A1基因的启动子片段以及BamHI和KpnI酶切以后获得的CYP78A1基因编码区域和终止子DNA片段被同时连接到经过HindIII和KpnI酶切的pCambia1300-pZmUbi-G10中，获得包括耐草甘膦基因和CYP78A1基因的T-DNA载体。这个载体的T-DNA中包含如下基因结构：“启动子-CYP78A1基因-终止子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-G10-pCYP78A1-CYP78A1(图1)。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LB4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。

实施例2.水稻CYP78A基因CYP78A11过量表达载体的构建

水稻CYP78A11基因编码区域(核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示)和终止子DNA片段通过PCR获得。PCR的2个引物分别是：CYP78A11-F1(5’-GGATCCAACAATGGCAATGGCCACCGCCAC-3’)和CYP78A11-R1(5’-GGTACCCATCTCACAAGCTCACACGGC-3’)。以浙江主栽水稻品种秀水134基因组为模板，PCR获得的大约2.2kb的DNA片段克隆到pMD-18-T-Vector载体(TaKaRa)中，测定序列，获得如SEQ ID NO.8所示的DNA片段，这个DNA片段除了编码水稻CYP78A11氨基酸的DNA序列以外，还包含了一个内含子和终止子。PCR的反应体系为：5x PrimeSTAR^TM Buffer(Mg²⁺plus)(购自TaKaRa公司)，10μl；dNTP Mixture(各2.5mM)，4μl；引物CYP78A11-F1(10μM)，1μl；引物CYP78A11-R1(10μM)，1μl；模板DNA100ng；PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(2.5U/μl)，0.5μl；灭菌蒸馏水，加至最终体积为50μl。PCR的条件为：95℃预变性2min；94℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸140sec，32个循环；72℃延伸10min。

水稻CYP78A11基因的启动子片段pCYP78A11通过PCR获得。PCR的2个引物分别是：pCYP78A11-F1(5’-GGTACCGATTAGATAAAGCCACTTCCAC-3’)和pCYP78A11-R1(5’-GGATCCAGGTGTTTGTGGTTTTGCTTGTG-3’)。引物中分别设计了KpnI和BamHI酶切位点。以浙江主栽水稻品种秀水134的基因组CYP78A11基因为模板，PCR获得的大约1.9kb的DNA片段克隆到pMD-18-T-Vector载体(TaKaRa)中，测定序列，获得如SEQ ID NO.10的所示的启动子序列。PCR的反应体系为：5x PrimeSTAR^TM Buffer(Mg²⁺plus)(购自TaKaRa公司)，10μl；dNTPMixture(各2.5mM)，4μl；引物pCYP78A11-F1(10μM)，1μl；引物pCYP78A11-R1(10μM)，1μl；模板DNA100ng；PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(2.5U/μl)，0.5μl；灭菌蒸馏水，加至最终体积为50μl。PCR的条件为：95℃预变性2min；94℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸10min。

农杆菌T-DNA载体的构建：

双元载体pCambia1300-pZmUbi-G10的全部DNA序列如SEQ ID NO.11所示，该载体包含一个耐草甘膦基因(EPSPS)，作为转化的标记基因；包含KpnI位点，作为目的基因的克隆位点。pCambia1300-pZmUbi-G10经过KpnI酶切以后，去磷酸化，作为克隆的载体与经过适当酶切的2个目的基因片段共同连接。目的基因的2个片段分别是经过KpnI和BamHI酶切的启动子(pCYP78A11)以及包括目的基因编码区域和终止子的片段。获得的克隆有2个不同的可能，通过酶切选择T-DNA中如下基因结构的克隆：“启动子-CYP78A11基因-终止子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-G10-pCYP78A11-CYP78A11(图2)。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LB4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。

实施例3.

(1)玉米转化

玉米的转化方法已经比较成熟，例如Frame等描述了利用农杆菌转化玉米的方法(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22)。分别取含载体pCambia1300-G10-pCYP78A1-CYP78A1和pCambia1300-G10-pCYP78A11-CYP78A11的农杆菌(即含T-DNA载体的农杆菌)划板，挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。取授粉后8－10天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0－1.5mm)。将含有T-DNA载体的农杆菌与未成熟胚共培养2－3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(培养基中含有200mg/L的Timentin，用于杀灭农杆菌，参照(Frame et al.,(2002)PlantPhysiol,129:13-22))，28℃暗培养10－14天。将所有的愈伤转到带有终浓度2mM草甘膦的筛选培养基上(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22)，28℃暗培养2－3周。

转移所有的组织到新鲜含终浓度2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2－3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上(Frame et al.,(2002)PlantPhysiol,129:13-22)，28℃暗培养10－14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10－14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22)，26℃光照培养直到根发育完全，然后移植到温室中单株培养，检测转基因玉米的抗除草剂能力。用稀释300倍的孟山都的41％的草甘膦水剂喷洒，7天后叶片发黄，枯死的为阴性；和喷清水对照长势一样的为阳性植株。

(2)CYP78A基因转基因玉米的鉴定

通过上述方法，分别获得含转化载体pCambia1300-G10-pCYP78A1-CYP78A1、pCambia1300-G10-pCYP78A11-CYP78A11和只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因玉米植株。将T0代植株移栽到温室中，对7叶期的含CYP78A基因的转基因玉米植株和空载体对照植株的生长势和株高进行比较分析。我们获得的60个CYP78A1过表达植株(命名为ZmCYP)中有32个植株生长势和对照相比显著增强，株高和对照相比显著增加，典型表型见图(图3)。其中两个典型品系成熟期的株高如表1。

表1：

品系	株高(cm)
		CK	221.5±8.3
ZmCYP12	246.2±9.4
		ZmCYP55	248.6±8.5

*CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因玉米植株；ZmCYP为载体pCambia1300-G10-pCYP78A1-CYP78A1的T-DNA转化植株，其中ZmCYP后面的编号(12，55)是对不同品系随机编号，以便于区分不同的转化事件。

CYP78A11基因过表达玉米植株的表型变化和ZmCYP类似，55个CYP78A11过表达植株中有30个植株生长势和对照相比显著增强，株高和对照相比显著增加。

为了比较增加表达CYP78A在水稻和玉米中表型上的异同，参考本实验室已有的水稻转化方法(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069)，我们转化获得了45个转CYP78A1基因的独立水稻转化体和30个转CYP78A11基因的独立水稻转化体。结果发现这些转化体水稻与空载体对照转化体在植株高度和植株生长势方面没有显著差异。

实施例4.

(1)转基因玉米的杂交

在转基因玉米试验田中把通过实施例3的方法转化出来的CYP78A基因过表达玉米植株和申请人之前已经获得的TEL基因过表达玉米植株(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069)分别种植在不同的区块。在开花前用羊皮纸袋把将要杂交的转基因玉米植株的雌花和雄花分别套袋。在玉米开花后，把CYP78A基因转基因玉米的花粉授到TEL基因转基因玉米的雌花上或者把TEL基因转基因玉米的花粉授到CYP78A基因转基因玉米雌花上。等到授粉后的玉米棒子灌浆并且成熟后，采下来晒干，用于繁种和进一步研究。

(2)同时增强了CYP78A基因和TEL基因表达的玉米的鉴定

分子生物学方法：从CYP78A基因转基因玉米和TEL基因转基因玉米杂交后代中用分别针对两个目标基因设计的引物采用荧光定量PCR的方法鉴定出ZmTE1基因和CYP78A1基因同时过表达的玉米植株。

鉴定ZmTE1基因表达的引物为：ZmTE1-RT-F:TGCATCCAATCCAACGAGTG和ZmTE1-RT-R:GCGATGTCAGGTTGACGAAG；

鉴定CYP78A1基因表达的引物为：ZmCYP-RT-F:TACGACCCAAGCAACGTCAC和ZmCYP-RT-R:ACGTCGACGAAGTCAG CATT。

上述2个基因的过表达植株中，ZmTE1基因和CYP78A1基因的相对表达量与空载体对照植株相比分别增加至少3倍。

表型观察法：TEL基因过表达植株的表型变化为植株变高，棒子变大，种子变大或变多；CYP78A基因过表达植株的表型变化为植株变高，生长势增强。同时增强了ZmTE1基因表达和CYP78A1基因表达的玉米和空载体对照植株相比，株高增加，生长势增强，棒子变大，棒子上的种子变大或者变多，产量增加，典型表型见图(图4)。

Claims (8)

1.CYP78A基因在增加玉米株高和增强植株长势中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述CYP78A基因来源于禾本科植物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述禾本科植物为玉米、水稻、高粱或小麦。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述CYP78A基因编码的氨基酸序列为下列之一或具有75％以上同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述CYP78A基因的核苷酸序列为下列之一或具有85％以上同源性的核苷酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用是将CYP78A基因导入玉米植株，实现玉米株高和长势的增加。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述CYP78A基因转入玉米植株的方法为：1)将CYP78A基因核苷酸序列与启动子和终止子连接，构建表达框；2)将表达框导入到玉米植株中，并获得表达。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用是将CYP78A基因与TEL基因联合导入同一玉米植株，实现玉米株高、长势和产量的增加。