CN106170700A - 用于狼疮肾炎的治疗性随访中的预测、诊断和监测的体外方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预测和/或诊断受全身性红斑狼疮影响或潜在影响的受试者体内狼疮肾炎的体外方法、用于监测针对受全身性红斑狼疮影响或潜在影响的受试者体内狼疮肾炎的治疗的体外方法以及用于预测狼疮肾炎的进展和/或用于监测针对受红斑狼疮影响或潜在影响的受试者体内狼疮肾炎的治疗的试剂盒。

Description

用于狼疮肾炎的治疗性随访中的预测、诊断和监测的体外 方法

发明的技术领域

本发明涉及在患有狼疮肾炎的患者中的肾中毒抗体的表征。关于这样的疾病分类学演变，提出了用于预测、诊断受全身性红斑狼疮影响或潜在影响的受试者体内狼疮肾炎的体外方法、用于监测针对受全身性红斑狼疮影响或潜在影响的受试者体内狼疮肾炎的治疗的体外方法以及用于预测狼疮肾炎的进展和/或用于监测针对患有或潜在含有红斑狼疮的受试者体内狼疮肾炎的治疗的试剂盒。

现有技术状态

狼疮肾炎(LN)是以肾结构和肾功能发生改变为特征的临床病理病症，其可以影响患有全身性红斑狼疮(SLE)的受试者。特别地，受SLE影响的患者的相关百分比发展这样的病症，其如果没有被及时识别和治疗，则可以导致肾功能不全和死亡。相反，狼疮肾炎的快速诊断，以及如果可能对其的预测开启了有效和潜在解决如果在疾病开始时使用的药物的使用。

不同的科学证据显示LN受肾小球中的抗体的沉积介导。

在由科学家提出的关于LN的发展的理论之中，盛行的一种提议，抗-dsDNA循环抗体(双链DNA)或对抗DNA的蛋白质组分(如组蛋白)的抗体，通过形成上皮下层免疫沉积和系膜免疫沉积而可以与肾小球成分交叉反应。特别地，认为由于其正电荷所致，当染色质和组蛋白的组合连接至肾小球基底膜的阴性加载组分，特别是硫酸肝素和蛋白聚糖时，通过变为针对其它面对肾小球的蛋白结构(足细胞和基底膜)的抗体的靶抗原，染色质和组蛋白有助于充当针对其它不面对DNA的抗体的沉积的触发剂。

当今这种理论没有澄清导致患有SLE的受试者体内免疫沉积的形成和肾损伤的继发出现的机制。特别地，尚不清楚哪一个是触发抗体(即，抗-DNA)的一般作用并且它们是否充当触发剂或参与抗体沉积机制。更一般地，高水平丝状抗Dna抗体存在于几乎所有的患有SLE的患者中但仅其一部分发展肾病的事实表明，伴随且可能是主要的因素在决定肾损伤中具有核心作用。由于LN以沉积在自身抗体的肾小球中为特征，所以可以假定与抗-肾脏抗体的形成相关且更精确地指向肾小球的细胞组分如足细胞的机制。明显的是，有必要直接在病变位置(即在肾小球)验证自身抗体的组成，并且仅在已对此项目澄清之后，才可以进行鉴别早期疾病标记。用于狼疮肾炎的有效标记的缺乏转化为临床医师不可能早期鉴别将发展LN的患者并采取最适合的治疗方式。如今诊断仍然基于非特异性循环抗体(ANA,抗DNA,抗C1q)的评价，这些非特异性循环抗体可能涉及疾病发病机制，但是事实上当循环时，它们对于肾不具有特异性并且仅一般性地与肾病变的发展相关。

对于鉴别人中的狼疮肾炎的特异性标记和开发允许可能在受全身性红斑狼疮影响的受试者体内的狼疮肾炎的早期诊断的非侵入性诊断/预兆仪器的需要由科学界共享，以便定义合适且及时的治疗策略。其在治疗随访中的使用将对临床医师在试图调节通常是长时间且提供涉及具有高毒性的药物的若干治疗联合中提供帮助。

发明内容

本发明涉及基于确定能够预测、诊断和监测在受全身性红斑狼疮(SLE)影响的受试者中的治疗随访中的狼疮肾炎(LN)的循环抗体的体外方法，并且本发明提供了对抗代表狼疮肾炎中的抗体损伤的靶标的内源性或植入的肾抗原的特异性抗体的用途。导致该发现的检索开始目的是表征存在于肾脏中的靶抗原、炎性病变(即肾小球肾炎)的位置。基于肾脏研究的结果，其导致鉴别对抗内源性和植入其中的蛋白质的特异性自身抗体，然后达到确定血清中的相同抗体以及显示高循环水平与LN的存在相关。通过使用借助于体内器官活检直接获得的肾组织，这样的研究首次在人上实现。然后由其得出的结论基于这样的研究，其首次在人肾组织上实现并且通过开发蛋白质组学研究技术(激光捕获，质谱仪，双向电泳等)而成为可能。

本发明基于这样的发现，即受全身性红斑狼疮影响的受试者，并且其中观察到典型狼疮肾炎的肾结构和功能发生变化，具有比IgG2同种型的一些自身抗体更高的肾脏和循环水平，具有作为抗原性靶标的由肾脏表达的内源性蛋白质如α-烯醇酶、膜联蛋白AI和/或本文中植入的蛋白质如DNA以及若干类别的组蛋白(组蛋白2a,3,4)的抗体。本发明的发明人首次对在肾小球中存在对抗上述蛋白质(即α-烯醇酶、膜联蛋白AI和若干类别的组蛋白)的IgG2类别的抗体进行了证实，其代表本文描述的发明的基础。肾毒性(上述所有的抗-α烯醇酶)抗体的新靶标蛋白质的鉴别和对于狼疮肾炎的抗体的特异性IgG2同种型的表征允许对于涉及肾脏损伤的机制和对于直接评价作为疾病标记的这样的特异性抗体的肾脏和循环的可能性二者的进展。事实上，在本文中，证实了相对于由不具有狼疮肾炎的患者形成的对照，受狼疮肾炎影响的患者具有高浓度的抗-α烯醇酶和抗-膜联蛋白AI、抗-类别2a、3和4组蛋白的IgG2。主要的IgG2同种型的新颖性在本文报道，甚至是对于对抗DNA的抗体。然后，很重要注意到，存在涉及LN的自身抗体的多种组成，但是在本文中证实了这样的混杂性是极大选择性的并且作为靶标它仅具有一些内源性肾脏蛋白和/或植入其中的抗原，此外它涉及IgG2同种型的特异方式抗体。如在下文部分“材料与方法”中证实的，关于健康受试者和没有肾炎的受SLE影响的受试者或受具有来自全身性红斑狼疮的不同病因学的肾炎影响的受试二者，证实了在发展或将发展LN的患者体内更高水平的对抗抗-α烯醇酶和抗-膜联蛋白AI抗原、抗-类别2a、3和4的组蛋白的IgG2。

要注意的是，相对于在肾脏组织中检测到的一组抗原(即α-烯醇酶、膜联蛋白AI、组蛋白3和DNA)并且相对于其他风湿性疾病(例如类风湿性关节炎)和正常人，IgG2同种型的抗体在血清中的伴随存在以高特异性和敏感性(在曲线下方的面积ROC>0.85；P<0.001)鉴别出患有SLE的患者。

特别地，抗-α烯醇酶、抗-膜联蛋白AI IgG2抗体以及抗-组蛋白2A、3和4IgG2可以有利地用作狼疮肾炎的标记。事实上，其作为标记的用途已显示用于与全身性红斑狼疮相关的肾炎的高度灵敏和特异性仪器，因为它们导致受来自SLE的不同病因学的肾炎影响的受试者的样品中缺乏并且它们不与其它潜在肾脏抗原交叉反应。

看起来明显的是，与本文描述的发明相关的优势之一在于相对于这种病理学的典型症状如例如重要的肾赤字的开始，以重大进展获得LN的诊断的可能性。

本发明的一个特别有利的方面在于，借助于通过活检的肾组织收集，抗-α烯醇酶、抗-膜联蛋白AI、抗-组蛋白2A、3和4IgG2抗体可以甚至在血液或血清样品中给药，而无需随后的以侵入方式对受试者进行干预。

因此，在本文中首次描述用于在治疗性随访中预测、诊断和/或监测受全身性红斑狼疮影响的受试者的狼疮肾炎的特异、灵敏且很小侵入性的体外方法。

因此，本申请的第一主题通过以下形成：

-用于在治疗性随访中预测、诊断和监测受全身性红斑狼疮影响或潜在影响的受试者体内狼疮肾炎的体外方法，包括以下步骤：

a)确定所述受试者的生物学样品中对抗选自以下组的抗原中的至少一种的IgG2抗体的浓度：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白2A，组蛋白3，组蛋白4和DNA；

b)将所述生物学样品中的所述浓度与对照值进行比较，

其中相对于所述对照值，所述抗体的浓度的升高指示狼疮肾炎的发展。

本发明的第二主题是：

-用于监测受全身性红斑狼疮影响的受试者体内狼疮肾炎的进展的体外方法，包括以下步骤：

a)确定所述受试者的至少第一生物学样品中和在至少第二生物学样品中的对抗选自以下组的抗原中的至少一种的IgG2抗体的浓度：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白2A，组蛋白3，组蛋白4和DNA，所述至少第一和第二样品在不同时间获得，

b)将对于所述至少第一和第二样品获得的所述浓度进行比较。

还是本发明的一个主题是用于预测和/或诊断狼疮肾炎和/或用于监测针对患有或潜在患有红斑狼疮的受试者体内狼疮肾炎的治疗的试剂盒，包括：

-用于确定所述受试者的生物学样品中的对抗选自以下组的抗原中的至少一种的IgG2抗体的一种以上试剂的至少一个等分试样：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白2A，组蛋白3，组蛋白4和DNA，和

-包括对抗选自以下组的抗原中的至少一种的IgG2的一种阳性对照的至少一个等分试样：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白2A，组蛋白3，组蛋白4和DNA。本发明的另外的主题是用于诊断指定受试者中的SLE和LN的存在并将它们与其它风湿性病症和其它原发性肾小球肾炎区分开的体外方法。特别是所述方法包括以下步骤：

a)确定在所述受试者的生物学样品中的对抗来自以下组中的所有靶抗原的IgG2同种型的自身抗体的水平：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白3和DNA，和

b)将以上自身抗体的水平与从对照样品开始获得的那些进行比较，

其中相对于所述对照水平，所述自身抗体的水平增大指示受试者中存在SLE和LN。

本发明另外的优点、以及特征和应用方式从以下一些优选实施方案的详细描述将变得明显，这些实施方案单纯通过实例的方式而不具有限制性目的。

附图描述

图1图1a-d显示在患有LN的患者的肾小球洗出液中存在对抗一些肾脏抗原的抗体，其用从A至L的字母表大写字母标记；它们的身份明确地显示在表2中。图1e-f显示在血清中存在患有LN的相同患者(图1a)的肾脏中检测到的一些抗体。

图2

图2a-e显示在患有LN的患者的单个活检中，在患者的肾小球洗出液中的抗体抗-α烯醇酶(图2a)、抗-膜联蛋白AI(图2b)、抗-组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4(图2c)、抗-DNA(图2d)、抗-C1Q(图2e)分别的表达和可能的同种型。单个活检中的单个抗体的阳性的伴随显示在(f)中，图示地表示为色标度(热强度图)，对于抗体家族的层次分析，全都属于针对所有抗原的IgG2类别。

图3

图3a显示与对抗本发明的不同类别的抗原的抗体在血清中的所有主要同种型的表征相关的斑点印迹。得出在血清中，存在更少的抗体的特异性，因为可以显示除了IgG2(其保留主要同种型)之外，甚至IgG1和IgG3同种型的抗体。图3b显示与所有抗-α烯醇酶同种型的血清水平相关的数据。图3c显示相对于患有SLE的患者，在患有盛行LN、SLE、RA(类风湿性关节炎)和/或患有其它自发性肾炎(膜性肾炎-MN，局灶性节段性肾小球硬化症-FSGS，具有IgA-IgA沉积的肾病)的患者体内抗α烯醇酶IgG2的水平，并且这样的值在从特定免疫抑制治疗开始起6个月(T6)和12个月(T12)之后的免疫抑制治疗阶段期间降低(图c和图d)。

图4

图4显示在患有兴盛LN和/或患有SLE而没有肾炎的患者体内和在其它类别的患有类风湿性关节炎(RA)和患有其它肾炎(MN,IgA,FSGS)的患者体内的血清抗体抗-膜联蛋白AI的同种型(a)和抗-膜联蛋白AI IgG2的循环水平(b)。在(c)中显示在免疫抑制治疗之前(T0)和在6-12个月之后(T6和T12)相同抗体的水平。

图5

图5显示在患有LN和SLE的患者体内的抗体抗-组蛋白2A、3和4的血清水平(分别为图5a,5b,5c)。

图6

图6a-c显示通过比较以患有LN的患者的血清纯化的IgG2同种型的抗体(结构示于图6b)的反应性与以患有膜性肾炎的患者纯化的IgG4同种型的抗体抗-α烯醇酶(结构示于图6c)的反应性评价的IgG2同种型的抗体抗-α烯醇酶的特异性。该特异性通过使用利用CNBr获得的α烯醇酶的片段进行评价(a)。结果显示IgG2和IgG4识别源自CNBr片段化的不同肽，即分别是具有1.3KDa和6.8kDa的产物。

(d)人狼疮肾炎和小鼠狼疮肾炎之间的组织学的评价。本文中研究的LN鼠类模型是患有在小鼠中诱发肾炎的活化细胞克隆体(IgG2克隆体H147)的自发性狼疮(MRL-lpr/lpr)的模型。源自此细胞克隆体(IgG2克隆体H147)的抗体的靶抗原被识别为46kDa的蛋白，其在本文中被证实为α烯醇酶。

图7

图7显示：a)在借助于‘激光捕获’的显微切割之前的肾脏片段，b)借助于‘激光捕获’的显微切割的结果。此图显示仅肾小球细胞从激光显微切割移除，显示源自该显微切片组织的自身抗体明显地具有肾小球起源。

图8

图8显示利用两种不同方法(ELISA和斑点印迹法)确定的抗-α烯醇酶IgG2的循环水平的关联性。

图9

图9显示：a)在腹膜内注射产生IgG抗-α烯醇酶抗体或IgM抗-dsDNA抗体(作为阴性对照)的杂交瘤之后，与患有蛋白尿的BALB/c小鼠的百分比相关的曲线图；b)在腹膜内注射产生IgG抗-α烯醇酶抗体或IgM抗-dsDNA抗体(作为阴性对照)的杂交瘤之后，患有增殖性肾小球病变BALB/c小鼠的百分比。

图10

在定义与所有肾小球自身抗体相关的同种型之后，最相关的同种型的血清水平在患有LES的184位患者(其104位具有LN)体内借助于ELISA确定。结果表示为中值四分位数间距。ROC曲线对于具有高循环水平的抗体进行计算，用于确定相对于SLE、类风湿性关节炎和正常受试者的特异性和灵敏度。(a)抗-α烯醇酶和IgG2抗-膜联蛋白AI IgG2；(b)抗-H3IgG2和IgG3；(c)抗-DNA IgG2和IgG3。

图11

利用层次聚类分析(HCA)来分析每个相关自身抗体的血清水平，该层次聚类分析(HCA)结合并同期地比较每个特定抗体(并且包括不同同种型)的血清水平；所得的热图，其中从(最大)黑色至(最小)白色的颜色表示相关的边界，它提供了不同参数如何鉴别不同患者组的评价。看起来血清抗-α烯醇酶和抗-膜联蛋白AI IgG2比其它抗体更好地将LN和AR分开，而抗-H3和抗-DNA IgG2/IgG3允许将LN与SLE区分开。

表1

与20位患有狼疮肾炎的患者相关的临床特征，所述患者具有诊断该疾病的肾活检并且对于存在沉积在肾脏中的对抗肾蛋白的抗体的存在进行研究。所有患者具有来自肾小球肾炎和红斑狼疮的体液的临床征兆。

缩写：LN，狼疮肾炎；SCreat，血清中的肌酸酐；UProt，蛋白尿；ANA，抗核抗体。

表2

该表显示利用MALDI-MS/LC-MS获得且与如图1中所示的2D电泳的蛋白斑点(A-L)相关的谱图。利用2D-电泳鉴别的蛋白用MALDI(斑点A,B,C,D,E,F,F,G,H,K,J,L)和/或用LC-MS(斑点I)表征；它们的鉴别显示在该表中。

缩写：MALDI-MS＝具有辅助激光基质的质谱法；LC-MS＝具有液相色谱的质谱法-

表3它显示参与研究中的所有患者(包括患有红斑狼疮和狼疮肾炎的患者)的临床特征。该临床特征在收集血清样品后定义。

发明详述

本发明涉及用于预测和/或诊断受全身性红斑狼疮(SLE)影响的受试者体内的狼疮肾炎(LN)的体外方法、用于监测受全身性红斑狼疮影响的受试者体内的针对狼疮肾炎的治疗的体外方法以及用于预测狼疮肾炎的发展和/或用于监测受红斑狼疮影响的受试者体内的针对狼疮肾炎的治疗的试剂盒。

所述方法甚至可以用于诊断患有所述疾病的临床征兆和对于经典生物标记的不确定阳性的患者体内的SLE的诊断以及用于诊断具有活跃肾炎的尿征兆的患者体内的LN。

用于预测和/或诊断狼疮肾炎的体外方法

本文描述的体外方法允许预测和/或诊断受全身性红斑狼疮影响或潜在影响的受试者体内的狼疮肾炎。

在本发明中的表述“潜在影响”下，基于总体和(ANA,抗-DNA)体液病理症状，受试者因此意味着对其已经制定了全身性红斑狼疮的诊断，但还没有确认，并且其中没有被怀疑或者暂时地排除了存在肾病变。这涉及IgG2同种型的自身抗体关于如本文中描述的靶抗原之一的阳性比用于诊断SLE的当前标准更加特异和灵敏。

在本发明中的全身性红斑狼疮(本文甚至指定在来自全身性红斑狼疮的英文术语的缩写SLE下)下，根据在医学/科学文献中指明的内容，其涉及具有自身免疫特性的慢性疾病，其特征在于一般临床症状如关节的、神经的问题，发展皮肤红斑，可能的发热攻击，粘膜如胸膜和心包膜的炎症。这样的一般症状经常代表疾病开始的典型要素，其通常不形成临床管理的特定问题。然而，所述疾病可以通过涉及特定器官如肾脏而演变，提供肾炎的起源(其6个类别已知通过特有的组织学方面定义)，如果不进行治疗，其朝向慢性肾功能不全演变。由于狼疮所致的肾病称为狼疮肾炎并且它可以涉及多至50％的受全身性红斑狼疮影响的患者。狼疮肾炎的发生被认为是需要用免疫抑制剂靶向治疗的全身性狼疮的重要并发症。如果不及时鉴别和治疗，通常它朝向末端慢性肾功能不全演变，以至需要透析和移植。此外，该疾病特征在于存在疾病标记，其按惯例被认为对它们(抗核抗体，抗-DNA抗体)是特异性的，但它们不提供关于与靶器官(参见肾脏)相关的病理学发展的信息并且不提供任何有用的预测数据。

在狼疮肾炎下，(本文中甚至指定为狼疮肾炎的英语术语的缩写LN)，在本发明中，根据临床/医学实践，临床-病理病症意指特征在于在全身性红斑狼疮期间结构和肾功能发生变化，全身性红斑狼疮是即使在没有狼疮一般标记的情况下具有典型免疫病理学特征的肾病变。病理学特征为：a-对抗免疫球蛋白(IgG,IgA,IgM)以及补体(C3,C4,C1q)的抗体在肾小球中沉积；b-存在病灶性或扩散的增生性病变(类别1-4)和/或免疫复合物的上皮下层沉积(类别5)。

本发明中描述的体外方法旨在，优选地在外周血中，确定已经在受LN影响的患者的肾脏中发现的抗体，并且因此，在本文中首次表征作为疾病。其剂量允许在没有或甚至存在可能与狼疮肾炎相关的轻微症状下早期地预测和/或诊断受SLE影响的受试者体内的LN。

特别地，可以不仅在所述疾病的常规阶段(类别)的每一个中而且甚至在出现与LN相关的任何临床表现之前完成诊断。为了跟踪患有狼疮的患者，这将是关键性的，所述患者还没有发展肾征兆，但其中病变的未来发展可以借助于特定抗-α烯醇酶、抗-膜联蛋白AI、抗-C1q、抗-组蛋白2A、3和4、DNA IgG2的循环水平的变化进行预测。因此，如从一般临床症状开始并且在没有肾损害下通过继续进行和提供其开始，这样的方法可以用于已患有狼疮的患者的随访中。

特别地，本文中描述的方法特征在于，它包括确定受全身性红斑狼疮影响或潜在影响或其不随器官病理学并发的全身性狼疮的一般诊断是已知的受试者的生物学样品中的选自以下组中的至少一种抗原的IgG2抗体的浓度的通道a)：α烯醇酶，膜联蛋白AI，补体C1q，组蛋白2A，组蛋白3和组蛋白4，DNA。在本发明的一个优选实施方案中，浓度被确定的抗体是抗-α烯醇酶IgG2抗体。

从任何生物学材料开始的上述抗体的浓度的确定可以根据由本领域技术人员考虑适合于此目的的任何方法进行。这样的方法在文献中广泛已知并且详细描述于大多数的实验室手册中，因此在此场合不会导致有必要紧密地考查它们。

单纯通过实例的方式，生物学样品中的抗体抗-α烯醇酶、抗-膜联蛋白AI、抗-补体C1q、IgG2类型的抗-组蛋白2A、IgG2类型的抗-组蛋白3和抗-组蛋白4、IgG2类型的抗-DNA的浓度可以借助于方法如ELISA(酶联免疫吸附测定)、蛋白质印迹法、RIA(放射性免疫测定)、蛋白阵列、斑点印迹法或质谱法并且在任何情况下更一般地利用临床化学中使用的所有技术进行确定，其允许通过利用定量方法检测其发生的反应来检测抗原和抗体之间的反应。上述技术开拓了使得处于评价的抗体与特定抗原相互作用然后检测与对抗人IgG2的特异性抗体连接的抗体的量的可能性；检测最后的反应，例如，借助于与抗-人IgG2抗体结合的辣根过氧化物酶(HRP)。通过催化由于过氧化氢的底物的氧化，辣根过氧化物酶产生有色的、荧光的或发光的产物，其可以借助于分光光度计测量。显然可以使用与抗-IgG2抗体连接的任何检测系统。特别地，确定方法优选将是免疫学方法。

在本发明的一个实施方案中，抗体抗α烯醇酶、膜联蛋白AI、补体C1q、组蛋白2A、组蛋白3和组蛋白4、IgG2类型的DNA的确定可以利用单克隆一抗如例如可由Invitrogen(对抗人IgG2的单克隆抗体-克隆体HP6014，由InVitrogen Corporation,Camarillo,CA提供)商购的那些或者不管怎样能够连接至上述抗原的多克隆抗体。

通过依照本领域技术人员已知的用于检测抗原和抗原-抗体复合物的技术，则在生物学样品中将确定特异于α烯醇酶、膜联蛋白AI、补体C1q、组蛋白2A、3和4DNA的IgG2抗体的水平。特别地，(一)抗将以特定方式识别存在于所述蛋白中的表位并且然后其反过来又可以由针对(一)抗的合适二抗(抗-人IgG2)识别。这样的二抗可以例如用通常用于标记二抗的任何荧光色素标记，如，例如荧光物质(通过举例说明方式：FITC，Cy3，Cy5，Alexa 488，PEe)或酶，或者这样的物质，其可以借助于酶细胞化学(例如辣根过氧化物酶)检测以接着允许检测一抗然后检测抗体抗-α烯醇酶、抗-膜联蛋白AI、抗-补体C1q、IgG2类型的抗-组蛋白2A、3和4。

以示例方式，抗体抗-α烯醇酶和不管怎样能够识别本文所述抗原的IgG2类型的任何抗体的确定，可以甚至通过使用由其上沉积了不同试剂(以时间和逻辑系列)的固体支撑物构建的蛋白阵列进行，以获得抗原和特定抗体之间的反应(方法称为斑点印迹法)。以示例方式，例如在抗-α烯醇酶IgG2抗体的情况下，对于抗-α烯醇酶IgG2抗体的特定抗原，即α烯醇酶以已知浓度沉积(“形成斑点”，技术俚语)在固体支撑物(纸张，树脂，其它支撑物)；在支撑物上的第二通道中沉积复杂混合物，如例如细胞溶解产物、血液或血清样品以允许存在于该混合物中的抗原和特定抗体之间反应；在第三通道中，显示了借助于抗-人IgG2抗体与α烯醇酶反应的IgG2。同等方法可以用于确定对抗膜联蛋白AI、补体C1q、组蛋白2A、3和4、DNA的IgG2抗体。

根据本文描述的内容，从有理由地包含想要检测的抗体的任何生物学样品开始，可以进行这样的IgG2类别的抗体的浓度的确定。

在本发明的一个实施方案中，生物学样品选自包括以下的组：血液，血清，肾组织活检。有利地，在本发明的一个优选实施方案中，生物学样品通过所考察受试者的血液或血清的样品代表。

根据选择用于确定本发明的抗体的浓度的样品的类型和技术的类型，基于常规实验知识，本领域技术人员将能够安排必要事项(如例如样品制备/处理)以进行本文所述的体外方法。

在确定对抗所述抗原(抗-α烯醇酶，抗-膜联蛋白AI，抗-组蛋白2A、3和4)中的至少一种的IgG2抗体的浓度之后，主题方法提供通道，其中将在所考察受试者的生物学样品中确定的浓度与对照值进行比较。在对照值之下，意味着涉及对于通过不具有与SLE相关的狼疮肾炎的受试者获得的样品中的特定抗原的IgG2抗体的浓度的参考值。这样的对照可以例如选自以下的组：健康受试者，受SLE影响但无LN的受试者，受具有不同于SLE的病因学如例如类风湿性关节炎的肾炎影响的受试者。

在本发明的一个优选实施方案中，这样的对照值从健康受试者或受其它风湿疾病(类风湿性关节炎)或其它肾小球肾炎影响的受试者的样品获得。

如对于本领域技术人员将清楚的是，对照值优选地将是基于一组健康受试者或者受其它风湿和/或肾病影响的受试者计算的能够识别本文指定的抗原的IgG2抗体的浓度的平均值。

特别地，根据本文描述的用于预测和/或诊断受全身性红斑狼疮影响或潜在影响的受试者体内狼疮肾炎体外方法，相对于对照值，抗-α烯醇酶和/或抗-膜联蛋白AI和/或抗-补体C1q和/或抗-组蛋白2A和/或抗-组蛋白3和/或抗-组蛋白4IgG2抗体的浓度的升高指示狼疮肾炎的发展。例如抗体量可以被确定为对应于确定的化学发光信号强度单位的表示为[O.D.单位]的光密度的任意单位，以举例的方式，利用配备有QuantyOne软件的VersaDoc系统(Bio-Rad)，然后通过参照具有已知含量的IgG2的标准曲线，进行计算并表示为以每升血清中以mg计的抗体浓度(mg/l)。通过实例并且绝对不是限制的方式，涉及单个自身抗体的浓度和多个同种型的浓度的正常和病理值可以是在图3b-d中显示的那些。

本发明的另一个主题是用于诊断受试者体内全身性红斑狼疮和狼疮肾炎并将它们与其它风湿性病症和原发性肾小球肾炎区分开的体外方法，所述方法包括：

a)确定所述受试者的生物学样品中的对抗选自包括以下的组中的所有抗原的IgG2同种型的自身抗体的浓度：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白3和DNA，和

b)将所述自身抗体的水平与从对照样品获得的那些进行比较，

其中相对于所述对照水平，所有所述自身抗体的水平的升高指示狼疮肾炎的发展。

关于在实验室确定期间的通道和所述比较，我们送回到在本文档的之前部分中已指出的那些内容。

体外监测方法

本发明甚至涉及一种用于监测受全身性红斑狼疮影响或潜在影响的受试者体内狼疮肾炎的进展的方法。

对于“狼疮肾炎”、“全身性红斑狼疮”和“潜在影响”的定义，参见之前对于上述预测和/或诊断的体外方法所述的内容。

特别地，所述监测体外方法包括a)确定在受全身性红斑狼疮影响或潜在影响的受试者的至少第一和至少第二生物学样品中的对抗选自以下组的抗原中的至少一种的IgG2抗体的浓度的通道：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白2A，组蛋白3和组蛋白4，DNA，其中样品在不同时间获得。

在本文的术语“监测”下，意指及时控制患者的病理状态或病理状况(在这种情况下为狼疮肾炎)的进展。因此，在术语监测下，在本发明中，表明以某一时间间隔在所考察的受试者中进行一次或多次抗-α烯醇酶、抗-膜联蛋白AI、抗-组蛋白2A、抗-组蛋白3和抗-组蛋白4、抗-DNA IgG2抗体的浓度的确定。纯粹通过实例且不以限制的目的的方式，监测可以具有作为目的的评价受试者对确定的治疗(优选针对狼疮肾炎)的响应。在这样的光学中，然后，抗-α烯醇酶、抗-膜联蛋白AI、抗-组蛋白2A、抗-组蛋白3和抗-组蛋白4、DNA IgG2抗体的确定可以例如在一般时间间隔或治疗路径期间和/或之后，首先在从受LN影响的指定受试者获得的样品上进行。在这种情况下，依据在所考虑时间间隔中抗-α烯醇酶IgG2抗体的浓度的变化，在主题方法中病理状态的可能改善或恶化或稳态对应于受试者服从的治疗的可能益处或不是益处。

即使在这种情况下，IgG2抗体抗-α烯醇酶、抗-膜联蛋白AI、抗-组蛋白2A、抗-组蛋白3和抗-组蛋白4、抗-DNA的浓度的确定可以从有理由地包含想要检测的抗体的任何生物学样品开始进行。对于关于生物学样品的更详细信息，参考在以上用于预测和/或诊断LN的体外方法中存在的类似部分。特别地，用于监测例如第一和第二样品进行比较的生物学样品可以独立地选自包括以下的组：血液，血清，肾组织活检。

此外，涉及用于确定可用于监测方法的目的的抗-α烯醇酶、抗-膜联蛋白AI、抗-组蛋白2A、抗-组蛋白3和抗-组蛋白4、抗-DNA IgG2抗体的浓度的方法的技术方面被认为类似于以上对于用于预测和/或诊断狼疮肾炎已经描述的那些。

用于监测目的的所关注的抗体的浓度的确定应在不同时间(那么例如分别在时间t＝0和t>0)获得的受试者的至少第一生物学样品中和至少第二生物学样品中进行。特别地，所考察的受试者可以是服从针对狼疮肾炎的治疗的受试者和及时监测而没有必需地服从任何类型的治疗的受试者。换句话说，则是，在时间t＝0获得的所述至少第一生物学样品可以是例如在开始治疗本身之前的样品，并且相反在没有服从治疗的受试者中，在总体时间t＝0处获得。不同地，第二生物学样品可以在从所述时间t＝0开始的一个或多个时间间隔处获得，因此定义为时间t>0，通过单纯实例的方式其可以是几小时、几天或几个月的间隔，例如每15天。在每种情况下，取决于受试者类型和病理学的重力，本领域技术人员基于他/她的知识将能够鉴别用于本文所述监测方法的目的的最合适时间间隔。优选地，第一和第二样品分别在开始针对LN的治疗之前和所述治疗期间和/或之后获得。随后，在所述第一和所述至少第二样品中获得的抗-α烯醇酶IgG2抗体的浓度之间的比较将提供关于患者的病理状态的进展的信息。

然后所关注抗体例如抗-α烯醇酶IgG2的浓度的变化是允许临床医师评价所选治疗策略的有效性或不是有效的手段。在一个特别实施方案中，相对于第一样品，第二样品中的IgG2抗体的浓度升高指示受全身性红斑狼疮影响或潜在影响的受试者体内狼疮肾炎的进展。

可选地，相对于第一样品，第二样品中的IgG2抗体的浓度降低表明受全身性红斑狼疮影响或潜在影响的受试者的狼疮肾炎无进展。

特别地，要监测的治疗类型是针对狼疮肾炎的一般治疗。特别地，所述治疗可以包括利用血管紧张素转化酶(ACE)的抑制剂、高剂量可的松、环磷酰胺、环孢霉素和/或生物学疗法(利妥昔单抗)的治疗。

用于预测和/或诊断狼疮肾炎和/或用于监测针对狼疮肾炎的试剂盒。

本发明的主题还是用于在患有或潜在患有红斑狼疮的受试者体内预测和/或诊断狼疮肾炎和/或用于监测针对狼疮肾炎的试剂盒，包括。

特别地，这样的试剂盒至包括用于确定所考察受试者的生物学样品中的对抗选自以下组的抗原中的至少一种的IgG2抗体的一种以上试剂的至少一个等分试样：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白2A，组蛋白3和组蛋白4，DNA，还至少包括对抗选自以下组的抗原中的至少一种的IgG2抗体的一种阳性对照的至少一个等分式样：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白2A，组蛋白3和组蛋白4，DNA。

在本发明的一个优选实施方案中，需要所述一种以上试剂用于确定抗-α烯醇酶、抗-膜联蛋白AI、抗-组蛋白2A、抗-组蛋白3和抗-组蛋白4、抗-DNA IgG2抗体的浓度。

优选地，根据本发明的试剂盒可以至少包括能够识别这样的抗原的多克隆或单克隆一抗(以用作标准曲线)和任选的抗-人IgG2抗体。所述试剂盒甚至可以包括标记或未标记二抗的一个或多个等分试样，所述二抗显然是特异于由此实现标准曲线中使用的一抗的免疫系统。然后，如果一抗在小鼠中实现，则二抗将是抗-小鼠的；如果在兔中实现，则将是抗-兔的；等类似。可选地，所述试剂盒可以包括其上存在剂量主题抗原以允许进行剂量ELISA的板。

所述试剂盒可以另外地包括阴性对照和/或阳性对照。特别地，单纯通过实例而不以限制性目的的方式，所述试剂盒可以包括作为阳性对照的具有记载的高血清水平的抗-α烯醇酶和/或膜联蛋白AI和/或组蛋白2A和/或组蛋白3和/或组蛋白4IgG2的患者(患者可以不同)的血清。作为阳性对照，甚至可以提供所关注蛋白的等分试样，即α烯醇酶和/或膜联蛋白AI和/或组蛋白2A和/或组蛋白3和/或组蛋白4和/或DNA。作为阴性对照，例如可以使用具有已知的肾小球肾炎的一组患者的血清，其中所关注的抗体不能进行给药。在这种情况下，将使用具有膜性肾小球肾炎的患者的阴性血清。此外，所述试剂盒可以包括用于确定抗-α烯醇酶和/或抗-膜联蛋白AI和/或抗-组蛋白2A和/或抗-组蛋白3和/或抗-组蛋白4和/或DNAIgG2抗体的浓度的过程的合适试剂和工具，如缓冲溶液的等分试样、无菌水或通常用于检测例如一抗-二抗复合物的其它试剂。

以下实施例和实验结果具有指定用于实现本发明但不限制本发明的目的。

在试剂盒以及以上所述方法的优选实施方案中，确定能够识别选自以下组中的抗原的IgG2类型的抗体的浓度借助于斑点印迹法或ELISA完成：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白2A，组蛋白3和组蛋白4，DNA。

斑点印迹法。通过使用Bio-Rad(Hercules,CA,USA)的用于斑点印迹法的设备进行分析并且其基于在剂量下的抗原(α烯醇酶，膜联蛋白AI，补体C1q，组蛋白H2A，H3和H4)在硝基纤维素膜上的固定化。将用TBS预处理的膜通过斑点印迹法固定至设备，然后装载恒定量的在TBS中的抗原(100ng)。首先将抗原在接触下留置24h然后另外地在负压力(利用真空形成)下连接至硝基纤维素。连接有抗原的膜然后在TBS-T(TBS-5％白蛋白-0.05％gr/v，吐温20v/v)中饱和。在TBS-T中1:50稀释的在剂量下的血清在此时施加到孔中并在环境温度留置温育6小时，然后在4C过夜；在结束时将膜在TBS-T中洗涤3次。此时通过在环境温度温育，利用用辣根过氧化物酶(HPR)标记的在TBS-T中1:2000稀释的抗-人IgG2抗体(克隆体：HP6014-InVitrogen Corporation,Camarillo,CA)来检测IgG2的存在。在TBST-T中3次洗涤之后，反应物在化学发光(SuperSignal,West Pico,Chemiluminescent,Thermoscientific,Rockford,USA)中显影。制备使用具有不同稀释度的IgG2抗体的标准曲线以评价反应线性度并建立读出范围。

用于确定IgG2连接所关注的抗原的ELISA置于具有96孔板的单个孔中(MaxiPrep板，96孔)并在室温温育5h然后在4℃过夜。将封闭溶液(在PBS中的5％BSA和0.05％吐温20)的等分试样(200μl)添加到每个孔中，然后添加在PBS-T(PBS–吐温20 0.05％v/v–BSA 1％gr/v)中1:50稀释的血清(100μl)，将其在室温温育4小时然后在4C°过夜。在PBS-T中3次洗涤之后，利用用辣根过氧化物酶(HPR)标记的在TBS-T中1:3000稀释的抗-人IgG2抗体(克隆体:HP6014-InVitrogen Corporation,Camarillo,CA)。

对过氧化物酶反应的显影通过添加100μl的底物TMB/H₂O₂(10:1)并取决于色度反应(Mx 30分钟)而温育不同的时间获得。这样的色度反应然后通过添加100μl的0.45M的H₂SO₄的溶液封闭并在30min内读出。

然后在合适读出器，多板读出器iMark(BioRad,Hercules,CA,USA)中在450nm读数。制备使用在不同稀释度的IgG2抗体的标准曲线用于评价反应线性度并建立读出范围。

材料和方法

患者。总体上，研究了216位患有红斑狼疮的患者，103位患有LN并且113位患有LES同时没有肾病。所有情况用于给药抗-烯醇酶、抗-膜联蛋白AI和抗组蛋白IgG2。在免疫抑制治疗之后，即在疾病开始后6个月和12个月，研究了患有狼疮肾炎的相同患者的一部分。对通过来自20位患者的活检获得的肾脏样品进一步研究以定义在肾脏中存在的肾的抗体的组成(表1)。在这种情况情况下，狼疮肾炎通过由文献显示的已知参数定义。关于冷冻肾脏的活检样品的实验部分如在后续会议中报道那样进行。

正常肾脏/血清。正常肾脏的活检从由于肿瘤原因的肾切除术获得。在这种情况下仅使用未受肿瘤组织损害的部分。使用134位正常受试者的血清来使对于各单个抗体的正常水平稳定。

类风湿性关节炎。从患有处于处于活跃期的类风湿性关节炎的50位患者获得的血清用于在急性风湿病症下的所有抗体给药。

其它肾病。来自患有与狼疮无关联的原发性肾小球肾炎的278位患者的血清如上进行处理：186位是患有膜性肾病的患者，32位患有局灶性节段性肾小球硬化症，60位患有IgA型的肾炎。

伦理委员会。对研究的批准在2010年6月10日通过San Carlo BorromeoHospital,Milan(I)的伦理委员会获得。对该研究的知情同意从所有参与者获得。

细胞培养。永生化人足细胞获自Saleem博士(University of Bristol,UK)。将细胞保持在补充有10％胎牛血清(FCS)、胰岛素转铁蛋白、硒、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI 1640中。

抗体。

α烯醇酶-1：对抗非神经元烯醇酶(NNE)(α-α)的兔抗体，AbD Serotec MorphoSysLtd.(Endeavour House,Kidlington Oxford,UK)。抗-膜联蛋白A1：对抗人膜联蛋白AI的兔抗体，Millipore Corp.(Billerica,MA,USA.)。抗-组蛋白2A、3、4.：对抗组蛋白2A、3、4的兔抗体，Novus(Biologicals,Cambridge,UK)。对抗人C1q的抗-C1q.小鼠抗体，Abcam(Cambridge,UK9)抗-IgG1-IgG2-IgG3-IgG4：对抗人IgG1-4的单克隆抗体(克隆体：HP6070,HP6014,HP6047和HP6023，分别用于IgG1,IgG2,IgG3和IgG4)InVitrogen Corporation,(Camarillo,CA)。

二抗-对抗以亲和性色谱法纯化并连接至异硫氰酸荧光素(FITC)的兔抗-IgG的亲和性纯化的异硫氰酸荧光素(FITC)F(ab’)2驴抗体均购自Jackson Immunoresearch(WestGrove,PA,USA)。

重组蛋白。α烯醇酶：重组体，Abnova Corporation(台北,台湾)；膜联蛋白A1：重组体，Creative BioMart,(Shirley,NY,USA)；组蛋白：重组体，New England BioLabs inc.(Whitby,Canada)；C1q：纯化的蛋白，Calbiochem-Merck KG,(Darmstad,Deutschland)；DNA：纯化的质粒，Invitrogen,(Carlsbad,CA,USA)。

激光捕获显微切割术(LCM)和从组织的洗脱抗体。为了从剩余肾组织显微切割掉肾小球，使用了适用于冷冻组织的“激光捕获”技术。使肾组织的冷冻切片(5μm)适应于涂覆有恒温膜(Molecular Machines&Industries AG；Glattburg,Zurich,Switzerland)的金属支撑物并通过使用Arcturus HistoGene系统、LCM冷冻切片染色试剂盒(ArcturusBioscience,Mountain View,CA)脱水。鉴别肾小球并利用Molecular Machines&Industries Cellcut LMD系统分离，该系统通过使用由激光源产生的热选择性地切开Bowman胶囊。对于每个活检肾样品，平均制备25至30个肾小球，然后利用特种粘合剂材料(Nikon Instruments)分离。从分离的肾小球的洗脱出免疫球蛋白是通过使用盐水渗透梯度完成的。

双向电泳。双向电泳在聚丙烯酰胺的软凝胶中进行。样品制备在4℃在冰中在磷酸三正丁酯中提供初始去脂质化达90min。在离心和在相同去脂质溶液中洗涤之后，将没有悬浮的材料离心并在空气中脱水。在电泳影响之前，将样品溶解在7M脲、2M硫脲、4％(w/v)3-[3-(胆酰胺丙基)-二甲基铵]-1-丙烷磺酸酯(CHAPS)、5mM三丁基-膦(TBP)、20mM碘乙酰胺(IAA)、40mM Tris、0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)pH 8.5中并向其中加入1％(v/v)的两性电解质的混合物，其含有60％的pH 3.5-10和40％的pH范围为4-8的两性电解质。过量的IAA通过添加二硫苏糖醇(DTT)化学地除去。在第一个电泳维度，条带具有18cm的pH-梯度；在第二个维度，在尺寸为180×160×1.5mm的凝胶中，使蛋白基于它们在8-16％T梯度聚丙烯酰胺中的尺寸进行分离。

染色技术和图像分析。

在SDS-PAGE凝胶中分离之后，通过双染色程序对蛋白质可视化：在第一阶段，利用三氯乙酸甲酯负染色，接着对于准备用于质谱法的凝胶进行银胶体考马斯蓝G250染色。来自凝胶的图像使用GS800光度计数字化并利用Versa DOC 400获取。分析图像利用PD Quest软件(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行。

单向电泳。这样的技术根据Laemmli在具有聚丙烯酰胺梯度的平板凝胶中进行。

蛋白质印迹。对患有LN的患者的肾小球洗出液和血清的蛋白质印迹通过使用肾足细胞和系膜细胞的细胞提取物完成。在分离之后，通过使用专用设备“Novablot半干系统”和通过使用含有2-氨基2-羟甲基1,3-丙二醇tris 38mM、甘氨酸39mM、十二烷基硫酸钠(SDS)0.035％w/v和甲醇20％v/v的连续梯度缓冲系统，将通过单向或双向电泳分离的蛋白质转移到硝基纤维素膜Protean BA(Schleicher&Schuell,Dassel Germany)上。转移以1.55mA/cm2进行达1.5h。将血清(0.2ml，稀释在20ml TBS中)在室温温育过夜并将该膜在TBS-T 0.15％v/v漂洗，并利用HRP-结合的抗-人IgG(Invitrogen Corporation,Camarillo,CA-2h,1:5000)温育。

MALDI-MS。通过双向凝胶电泳纯化的蛋白用在5mM碳酸氢铵pH 8.9中的50％(v/v)乙腈(ACN)漂洗直至完全脱色，然后在100％(v/v)CAN中以及在1mM CaCl2和100mM碳酸氢铵pH 8.9中漂洗。作为质量分析的准备的酶消化在37℃利用在100mM碳酸氢铵缓冲液pH 7.8中的胰蛋白酶过夜进行。在结束时，消化反应通过添加甲酸pH 2猝灭。消化的样品首先脱盐并在MALDI(基质辅助激光解吸电离)–MS分析之前，通过使用乙腈作为洗脱剂，利用μZipTipC18柱(Millipore,Bedford,MA,U.S.A.)浓缩。通过使用合适的片剂和α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质，将肽混合物加载到MALDI上。分析利用Voyager-DE PRO系统(AppliedBiosystems,Framingham,MA,U.S.A.)进行。参照国家生物技术信息中心(National Centrefor Biotechnology Information)和SwissProt非冗余序列数据库，使用PROWL软件来鉴别非模糊斑点。

LC-MS。将LC-ESI MS-MS/MS用于表征两种单个蛋白质(然后表征为波形蛋白和烯醇酶)。对于液体质量分析，对蛋白初步处理用于MALDI。蛋白斑点如上处理。酶消化在37℃利用在100mM碳酸氢铵pH 7.8中的胰蛋白酶过夜。反应通过添加甲酸酯pH 2猝灭。使用的质谱仪是LTQ线性离子阱质谱仪(Thermo Electron,San Jose,USA)，其连接至装配有JupiterC18柱250mm×1mm(Phenomenex)的HPLC Surveyor(Thermo Electron)。在50μl/min的低流速下用乙腈梯度(5％B持续6’，接着在109’内5至90％B–洗脱剂A：在水中的0.1％甲酸，洗脱剂B：在乙腈中的0.1％甲酸)洗脱肽。流出物直接引入到电喷雾(电压5.0kV)，其又将离子引入处于200℃且电压在2.85V的毛细管中。MS/MS谱图具有第一次MS扫描(m/z 400–1800)，接着5次MS/MS分析。将通过谱仪获得的数据转换为用于在专门数据库(Extract_msn inBioworks 3.3.1Sp1personalized with LTQ spectra)中搜索的文件。对于蛋白鉴别，使用SEQUEST软件3.3.1(Thermo Electron)，其在10个处理器集群(AETHIA,(Torino,Italia)Turin,Italy)上运行。作为MS/MS的单个肽的鉴别根据严格标准过滤：根据HUPO标准，对于单个离子Xcorr≥1.9，对于双电荷离子Xcorr≥2.2，并且对于三电荷离子Xcorr≥3.7，其中概率≤0.01,δCn≥0.1和Rsp≤4。

关于肾活检的免疫荧光。将OCT中的肾活检(Tissue Tek,Miles Inc.,Elkhart,IN,USA)储存在液氮中。组装在用聚L赖氨酸处理的玻璃上的3-μm切片利用免疫荧光处理。在第一阶段，将肾切片在4℃在改性Carnoy溶液中漂洗10’，随后在磷酸缓冲溶液(PBS-pH7.2)中洗涤。室温下在PBS中的牛白蛋白血清(BSA)3％w/v中洗涤之后，将切片利用在PBS中1:100稀释的对抗所关注抗原的单-多克隆抗体(关于种源参见关于抗体的部分)在室温温育2h。然后反应发展利用异硫氰酸荧光素-结合的(FITC)特异性抗体进行。阴性对照通过使用PBS或等同浓度的非免疫兔或小鼠血清作为一抗平行地处理。

足细胞抗原和植入有igG2的抗原的共定位和共聚焦分析。

即使对于共定位研究，将用OCT处理的肾活检(Tissue Tek,Miles Inc.,Elkhart,IN,USA)储存在液氮中。在4℃下将冷冻切片(3μM)在Carnoy溶液中固定10’并在PBS pH 7.2中洗涤。室温下利用PBS中的牛血清白蛋白(BSA)3％w/v对非特异性相互作用封闭30’。然后在室温将切片连续用在PBS中1:100稀释的多克隆或单克隆抗体温育2h。在另外的洗涤之后，将切片在室温暴露于稀释(1:20)的具有对抗兔IgG F(ab’)2片段的驴抗体的德克萨斯红-缀合物(Texas Red-conjugate)达1h。然后在室温将反应物以PBS中1:10稀释的对抗人IgG2(Invitrogen,CA)的小鼠抗体显影1h。然后将沉积的IgG2利用1:100稀释的对抗FITC-缀合的小鼠IgG(Jackson Immunoresearch,PA)的驴抗体显示1h。图像通过使用装配有43x/1.30油物镜的共聚焦显微镜(LSM 510Meta，其集成有Axiovert 200M倒置显微镜CarlZeiss,Jena Germany)进行分析。

肾小球洗出液中和血清中的同种型的表征和自身抗体的确定。

斑点印迹。通过使用Bio Rad(Hercules,CA,USA)的用于斑点印迹的设备进行分析并且它基于在硝基纤维素膜上的定量抗原(α烯醇酶(αeolasi)、膜联蛋白AI、DNA、C1Q、组蛋白H2A、H3和H4)的固定化。将用TBS预处理的膜固定在斑点印迹设备上，然后装载恒定量的在TBS中的抗原(100ng)。在剂量(α烯醇酶，膜联蛋白AI，DNA，C1Q，组蛋白H2A，H3和H4)期间，将100μl的这种溶液用于所述系统(“多孔”型)的多个孔，其中将抗原首先在接触下留置24h，然后在利用真空生成的负压力下进一步连接至硝基纤维素。然后将连接有抗原的膜在TBS-T(TBS-5％白蛋白-0.05％gr/v,吐温20v/v)中饱和。在此时将在TBS-T中1:50稀释的定量血清施加到孔中并留置以在室温温育6小时，然后在4C°温育过夜；结束时将膜在TBS-T中洗涤3次。在此时利用用辣根过氧化物酶(HPR)标记的在TBS-T中1:200稀释的抗-人IgG2抗体(克隆体：HP6014-InVitrogen Corporation,Camarillo,CA)，通过在室温温育检测IgG2存在。在用TBST-T 3次洗涤之后，反应物在化学荧光中显影(SuperSignal,West Pico,Chemiluminescent,Thermo scientific,Rockford,USA)。制备使用具有不同稀释度的IgG2抗体的标准曲线以评价反应线性度并建立读出范围。

用于确定在PBS中所关注的IgG2的ELISA放置在9-孔板(MaxiPrep板，96孔)的单个孔中并在室温温育5h，然后在4℃温育过夜。向每个孔加入封闭溶液(PBS,5％w/v BSA和0.05％v/v吐温20)的等分试样(200μl)，然后加入在PBST(PBS–吐温20 0.05％v/v-BSA 1％w/v)中的1:50稀释的血清(100μl)，将其在室温温育4小时然后在4C°温育过夜。在PBS-T中3次洗涤之后，利用用辣根过氧化物酶(HPR)标记的在TBS-T中1:3000稀释的抗-人IgG2抗体(克隆体：HP6014-InVitrogen Corporation,Camarillo,CA)。

对过氧化物酶反应的显影通过添加100μl的TMB/H2O2底物(10:1)并取决于色度反应(Mx 30分钟)温育可变化的时间段而获得。然后这样的色度反应通过添加100μl的0.45M的H2SO4溶液终止并在30min内读数。然后在特定读数器，多板读数器iMark(BioRad,Hercules,CA,USA)中在450nm读出吸光度。制备使用在不同稀释度的IgG2抗体的标准曲线以用于评价反应线性度并建立读出范围。

从血清和肾小球洗出液纯化抗-DNA抗体。

从患有红斑狼疮的患者的血清和/或从患有狼疮肾炎的患者的肾小球洗出液的纯化抗-dsDNA抗体是利用色谱技术进行的，使用用25mM tris-缓冲液pH 8.0平衡的对于天然DNA具有亲和性的纤维素柱(Amersham Pharmacia Biotech.)。弃去对于DNA没有亲和性的蛋白质部分，随后在PBS中洗涤，而抗-DNA抗体利用线性梯度NaCl梯度洗脱。

α烯醇酶的CNBr消化和片段化产物的分析。对于利用溴化氰(CNBr)的消化，将α烯醇酶(100μg)在室温在0.4M碳酸氢铵中与1％v/v 2-巯基乙醇在黑暗中温育1h。然后，样品利用真空脱水并重新悬浮在5μL的去离子水、15μL的三氟乙酸(TFA)和5μL的在乙腈(ACN)中的5M CNBr中；温育在4℃持续过夜并且反应用新的脱水程序结束。将终样品重新悬浮在Tris-HCl 62.5mM pH 6.8、2％w/v SDS和10％甘油中。片段的分析在聚丙烯酰胺梯度中的电泳中进行。

由来源于患有MRL-lpr/lpr自发性狼疮的小鼠的单克隆抗-DNA(IgG2克隆体H147)识别的抗原的表征。

来源于患有MRL-lpr/lpr自发性狼疮的小鼠的克隆体(H147)的IgG2同种型的抗-DNA抗体由Michael Madaio博士(Georgia Health Sciences University,Augusta,Georgia,USA)提供。

BALB/c中的抗-α烯醇酶IgG灌注。将二十二只BALB/c和六只SCID小鼠腹膜内注射1×106个产生单克隆抗-α烯醇酶抗体的杂交瘤；将产生IgM抗-DNA抗体的杂交瘤细胞注射入3只BALB/c和2只SCID小鼠中作为对照。为确定蛋白尿进行每日尿液收集至两周，处死日期。所有肾制备的组织学评价通过两个独立的病理学家一式三份地进行评价。所有实验依照用于在实验室动物中完成实验的NIH标准进行。

实施例

来自患有LN的受试者的肾小球洗出液包括识别一组肾小球抗原的抗体。示于图1的此系列实验是作为在专利申请中显示的诊断发展的准备。事实上，该专利潜在的构思在于仅存在于患有LN的患者肾脏中(图1a,b,c,d)并且可以甚至在其血清中确定(图1e,f)的抗体将是致病性的，并且因此在临床上与狼疮肾炎相关。相同抗体在肾脏中和在血清中的存在之间的关联构成发现的逻辑基础，基于其形成早期诊断的可能性并通过对其血清水平(然后在具有易于访问的流体中)给药而预防疾病。发现作为开发诊断试剂盒的准备的第二逻辑基础在于，仅相同患者的肾脏中和血清中可检测的抗体的同种型具有诊断价值。

为了分析肾小球洗出液，我们利用了从顺从诊断目的的活检程序的受SLE与蛋白尿影响的20位患者获得的活检；大多数受检的患者已用低剂量类固醇或免疫抑制药物治疗。通过活检获得的肾脏组织根据编码技术冷冻(液氮)然后将肾小球借助于‘激光捕获’切开；免疫球蛋白如上所述的通过分离的肾小球洗脱并利用蛋白质印迹技术(单向和双向电泳)分析，其中作为固定抗原利用来自足细胞(即构成肾小球的结构和功能基础的上皮细胞)的细胞提取物。

为了表征由洗脱的抗体识别的蛋白质，首先我们分析了利用双向电泳从来自不同LN类别的样品获得的这组数据。然后借助于用于所选抗原的单向电泳和斑点印迹法进行每个样品的单独分析(图2)。来自第一种方法的结果表明存在对抗被纯化并通过质谱法(LC-MS或MALDI)表征的特定蛋白质的多种抗体。利用相同的逻辑程序和相同的技术来证实在有和没有LN的考察下在患者的血清中存在相同的抗体(图1e,f)。基于患有多种LN类别的患者的肾脏中存在对抗特定蛋白质的抗体，定义了对抗α-烯醇酶和膜联蛋白AI的优势抗体。这些抗体特征在于与各单个活检中的同种型、肾共定位和阳性相关(图2)。为了验证对抗α-烯醇酶和膜联蛋白AI的抗体存在的实体，作为比较，考虑了广义抗体，通过评价其在肾脏中的存在，其在患有红斑狼疮的患者的血清中升高是已知的。其中评价了在对抗DNA和对抗其蛋白成分(抗-组蛋白)的抗体的肾小球洗出液中的存在；也评价了对抗C1q的抗体。这些抗体的靶抗原不以暴露方式存在于肾脏中并且因此它们被定义为可植入的，即它们可以沉积在来自血清的肾小球循环中。对于由肾脏洗出的各个抗体(即抗-α烯醇酶，抗-膜联蛋白AI，抗-DNA，抗-组蛋白和抗C1q)，表征特定同种型，然后是各单个活检中的主要同种型的抗体的频度，最后是在肾小球中的共定位。在图中，显示了对于发现对抗由肾细胞表达的蛋白的抗体(抗-α烯醇酶和抗-膜联蛋白AI)的分析(a,b)和对于可植入抗原(抗-DNA，抗-C1Q，抗-组蛋白2A、3和4)的分析(c，d，e)。在所有情形中，全部可能的同种型(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)利用斑点印迹法进行评价，并且在确定对于所有上述抗体(抗-α烯醇酶，抗-膜联蛋白AI，抗-DNA，抗C1q，抗-组蛋白2A、3、4)，独特的同种型为IgG2后，在所有收集的活检中制备个性化剂量(a-e)。最后，单个活检中的单个抗体的阳性并存显示在(f)中，其图示地表示为色标(热强度图)，对于对抗所有抗原的IgG2同种型的抗体家族的层次分析。相比于植入的抗原，对抗α烯醇酶和膜联蛋白AI的抗体的单个患者的肾小球中的数量上优势是明显的(在图2f中，从灰色至黑色的颜色表示高水平的抗体)。

在已证实抗-α烯醇酶和抗-膜联蛋白AI IgG2抗体(以及具有小强度的抗-DNA，抗-C1Q，抗-组蛋白2A、3和4抗体)在患有LN的患者肾小球中的数量上优势之后，通过首先表征相同抗体的所有同种型然后表征其循环水平，评价血清组分。在这个研究部分，集中在对抗α烯醇酶、抗-膜联蛋白AI和组蛋白2A、3和4的抗体。在实验的制备部分，进行在对抗所有不同类别的抗原的抗体的血清中的所有主要同种型的表征(图3a)。得出在血清中，存在较少的抗体的同型特异性，能够证实除了IgG2(其保留主要的同种型)抗体之外，甚至IgG1和IgG3同种型。临床研究涉及所有自身抗体的循环水平，调查的对象涉及具有不同临床征象的544位患者(103位患者患有LN，113位患有SLE，50位患有类风湿性关节炎，278位患有原发性肾小球肾炎，即60IgA，186膜性肾病，32位患有局灶性肾小球硬化症局灶性硬化肾小球)和130位正常受试者。在患有LN的患者的相关部分，剂量在严格免疫抑制治疗的6个月(63位)和12个月(68位)之后以及在改善炎症和肾脏损害期间重复。对于关于抗-α烯醇酶IgG2的水平(图3b)的部分，利用斑点印迹法制备剂量并与ELISA进行比较(图8)。

在抗-抗-α烯醇酶IgG2的情况下，证实了相对于患有SLE的患者，所述水平高，特别是在患有急性LN的患者中，并且这样的值在免疫抑制治疗阶段期间降低(图3c,d)。发现抗-α烯醇酶IgG2的水平在患有类风湿性关节炎的患者中低并且在患有其他肾小球肾炎的患者中不能整体给药。ROC曲线(图10)显示相对于所有其他类别的患者，包括SLE、类风湿性关节炎和原发性肾小球肾炎，对于鉴别患有LN的患者的高特异性和敏感性。

在抗-膜联蛋白AI IgG2的情况下(图4a，b)，显示了相对于SLE在LN中增大的抗体循环水平。在12个月之后所述水平随着治疗而下降(图4c)。

在抗-组蛋白2A、3和4抗体的情况下(图5a，b，c)，显示了对于所有抗原的特异性IgG2水平，其阳性涉及大部分的患者。即使在此情况下，相对于其他组(SLE、RA、其他肾小球肾炎)，抗体水平在患有LN的患者中显著更高，但是相对于抗-α烯醇酶IgG2，所述水平更低一到二个数量级(0.5mg/l对40mg/l)。在抗-组蛋白2a抗体的情况下(a)，还存在IgG1和IgG3类别的抗体的增多，即使阳性涉及较少部分的患者。

在图11中，显示层次分析(热图)与在鉴别属于不同研究组的患者中的各个特定抗体给出的贡献相关。显然高血清水平的抗-α烯醇酶和抗-膜联蛋白AI IgG2的存在以非常明显的方式鉴别出在有和没有肾病的情况下受SLE影响的患者(深色)与受类风湿性关节炎影响的患者(浅色)；高水平的抗H3e IgG2和抗-DNA IgG3显著有助于鉴别患有SLE的患者，但是它们对于鉴别患有类风湿性关节炎的患者不敏感。总的来说，本文中描述的所有抗体的剂量允许将多个子组并且主要是患有SLE、患有SLE和相关肾病的患者与患有类风湿性关节炎并且明显是正常对照的患者区分开。

研究的最后一部分致力于验证抗-α烯醇酶IgG2抗体对于狼疮肾炎的特异性以及甚至定义在疾病动物模型中其并发症。涉及特异性的结果示于图6。IgG2同种型的抗体的反应性通过患有膜性肾病的患者血清纯化，所述患有膜性肾病的患者是一类最近被识别在肾小球和血清中具有高水平的抗-α烯醇酶IgG4的患者。通过使用利用CNBr获得的烯醇酶的片段来评价特异性(a)。结果显示，IgG2和IgG4识别源自CNBr片段化的不同肽，即分别是具有1.3KDa和6.8kDa的产物。实验的结果使得人类狼疮性肾病和鼠类狼疮性肾病之间的同源性突显。它们示于图6d和图9中。在第一种情况下，表征了负责易于患有狼疮的小鼠(MRL-lpr/lpr)的肾病特性的抗体。在这种模型中，实验性狼疮性肾病借助于灌注由源自受试者小鼠的细胞产生的抗-DNA IgG2单克隆抗体而再现。在被动转移至正常小鼠之后，由克隆体H147(由7183/81X VH基因编码的IgG2)产生的这样的抗体的原型诱发形成肾小球和肾小管基底膜形成、系膜免疫沉积和增生性肾小球肾炎。这些抗体的靶抗原已被识别是α烯醇酶(图6d)。因此在本文中，证实了α烯醇酶通过源自易患有狼疮的小鼠的致肾炎抗体所识别。

在第二组实验中，确认了抗-α烯醇酶IgG2可以在实验动物中诱发狼疮肾炎。实验在22只BALB/c小鼠中进行，所述小鼠腹膜内注射产生抗-α烯醇酶IgG抗体或抗-dsDNA IgM抗体作为对照的杂交瘤。在距注射的10天之后，在25％的注射小鼠中发现蛋白尿(100-300mg％)(图9a)；检查用小鼠中的蛋白尿恒定地低于10mg％。肾组织分析显示在注射有抗-α烯醇酶单克隆抗体的22只中的5只中的增生性肾小球病变(b)，在2只小鼠中增生性病变与基底膜增厚并存并且在2只中与肾小管渗透并存(c)。在六只以类似方式注射有杂交瘤的SCID小鼠中：4只发展了肾小球增生性病变与半月形和肾小管-间质渗透(c)。注射有单克隆抗-DNA IgM的小鼠仅发展病灶性肾小管渗透。

总起来说，在动物中进行的实验的结果应被考虑为支持这样的构思，即抗-α烯醇酶IgG2对于肾脏是有毒的，然后其在患有狼疮肾炎的受试者中发现的高水平在疾病的发病机制中找到直接理由。

Claims (12)

1.一种用于预测和/或诊断受全身性红斑狼疮影响或潜在影响的受试者体内狼疮肾炎的体外方法，包括以下步骤：

a)确定所述受试者的生物学样品中的对抗选自以下组的抗原中的至少一种的IgG2抗体的浓度：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白2A，组蛋白3，组蛋白4和DNA；

b)将所述生物学样品中的所述浓度与对照值进行比较，

其中相对于所述对照值，所述抗体的浓度的升高指示狼疮肾炎的发展。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物学样品选自包括以下的组：血液，血清，肾组织活检。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述确定通过ELISA(酶联免疫吸附测定)、斑点印迹法、蛋白质印迹法、RIA(放射性免疫测定)、免疫化学、质谱法。

4.一种用于监测受全身性红斑狼疮影响的患者体内狼疮肾炎的进展的体外方法，包括以下步骤：

a)确定在所述受试者的至少第一和至少第二生物学样品中的对抗选自以下组的抗原中的至少一种的IgG2抗体的浓度：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白2A，组蛋白3，组蛋白4和DNA，所述至少第一和第二样品在不同时间获得，

b)将对于所述第一和第二样品获得的所述浓度进行比较。

5.根据权利要求7所述的方法，其中所述至少第一和第二样品分别在开始治疗之前和在所述治疗期间和/或之后获得。

6.根据权利要求5所述的体外方法，其中相对于所述第一样品，所述第二样品中的所述抗体的浓度的升高指示所述受试者体内狼疮肾炎的进展。

7.根据权利要求5所述的体外方法，其中相对于所述第一样品，所述第二样品中的所述抗体的浓度的降低表明所述受试者体内狼疮肾炎的无进展。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二样品独立地选自包括以下的组：血液，血清，肾组织活检。

9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其中所述治疗包括用甾体药物、免疫抑制剂、利妥昔单抗、血管紧张素转化酶抑制剂进行的治疗。

10.一种用于诊断受试者体内全身性红斑狼疮和狼疮肾炎并将它们与其它风湿性病症和原发性肾小球肾炎区别开的体外方法，所述方法包括：

a)确定所述受试者的生物学样品中的对抗选自包括以下的组中的所有抗原的IgG2同种型的自身抗体的浓度：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白3和DNA，和

b)将所述自身抗体的水平与从对照样品获得的那些进行比较，

其中相对于所述对照水平，所有所述自身抗体的水平的升高指示狼疮肾炎的发展。

11.一种用于预测和/或诊断狼疮肾炎和/或用于监测针对患有或潜在患有红斑狼疮的受试者体内狼疮肾炎的治疗的试剂盒，包括：

-一种以上试剂的至少一个等分试样，所述试剂用于确定所述受试者的生物学样品中的对抗选自以下组的抗原中的至少一种的IgG2抗体：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白2A，组蛋白3，组蛋白4和DNA，和

-一种阳性对照的至少一个等分试样，所述阳性对照包括对抗选自以下组的抗原中的至少一种的IgG2抗体：α烯醇酶，膜联蛋白AI，组蛋白2A，组蛋白3，组蛋白4和DNA。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中：

-所述一种以上试剂至少包括能够识别所述抗原中的至少一种的多克隆一抗或单克隆一抗和任选的抗-IgG2抗体，

-所述阳性对照的至少一个等分试样包括从患有狼疮肾炎的患者获得的系膜细胞和/或足细胞的总提取物。