CN106036198A - 一种海参生物发酵饵料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海参生物发酵饵料的制备方法，将海洋假交替单胞菌、混合EM菌接种到饵料中25‑35℃厌氧发酵3‑7天；其中混合EM菌由芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌及乳酸菌组成。本发明方法通过微生物对刺参饵料进行固态发酵，制备发酵饵料。本发明制备的饵料和未发酵的饵料相比，其对刺参的诱食性显著增加；且发酵后的饵料营养更全面，更有利于刺参生长，提高刺参的成活率；改善刺参肠道菌群，提高了刺参对饵料的消化吸收率。同时，由于海藻胶降解菌的加入，能有效的降解饵料中刺参难以消化的富含海藻胶的海带粉，因此可以增加饵料中海带粉的比例来替代部分价格昂贵马尾藻，起到降低企业成本的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵饵料，特别是涉及含有海洋假交替单胞菌的混合EM菌发酵海参饵料的制备方法。
背景技术
刺参体壁富含丰富的胶原蛋白和多聚糖，并且含有钙、铁、锰等多种微量元素，具有较高的食用和药用价值，是我国北方重要的海产经济动物之一。随着刺参养殖业集约化、规模化、自动化的迅猛发展，有限的天然饵料已经不能满足实际市场的需要。但是，目前还缺乏对刺参营养和饵料方面系统性的研究。饵料营养不全阻碍了刺参的快速生长，有的饵料还存在卫生问题，携带致病菌造成疾病的发生，甚至死亡，造成巨大的经济损失。刺参摄食的饵料主要为马尾藻、海带、豆粕等富含褐藻胶及抗营养因子等不易被消化吸收的物质。而饵料经过有益微生物发酵处理后，原料中的抗营养因子被分解或转化，褐藻胶被完全或部分降解，产生易被刺参采食、消化、吸收且无毒害作用的小分子营养物质。目前，利用酵母菌、芽孢杆菌及乳酸菌单菌发酵海参饵料已有相关报道，而利用含有具有褐藻胶降解能力的海洋假交替单胞菌的混菌固态发酵刺参饵料罕有报道，利用此法制备的刺参饵料不仅能够提高刺参的生长性能，提高企业的经济效益，而且发酵料中的活体益生菌可以起到净水的作用。同时固态发酵的饵料较液体发酵饵料含水量低，便于贮存和运输；而且固态发酵操作简单、成本低，对发酵饵料的大规模生产具有重要的经济价值和现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用含有海洋假交替单胞菌的混合EM菌固态发酵刺参饵料的方法，从而提高饵料的消化利用率，提高刺参的生长性能，改善养殖水体环境。
为实现上述目的，我们提供一种海参生物饵料的制备方法，将海洋假交替单胞菌、混合EM菌接种到饵料中25-35℃厌氧发酵3-7天；其中混合EM菌由芽孢杆菌(Bacillus)、光合细菌(Photosynthetic Bacteria,PSB)、酵母菌(Yeast)及乳酸菌(Lactobacillus)组成。
所述饵料按照质量百分数由32～40％脱胶海带粉，16～20％马尾藻粉，16～20％海青粉，6％玉米粉，5％破壁酵母粉，4％发酵豆粕，4％虾粉，3％预混料，3％鱼粉，2％扇贝边粉，1％红糖组成。
进一步地，在上述技术方案中，海参生物饵料的制备方法具体包括以下步骤：
步骤a、海洋假交替单胞菌培养：将斜面上保存的菌种接种到种子培养基中，160rpm，28℃摇床培养18-20小时，取种子液，以2％-3％v/v的接种量接到发酵培养基中，160rpm，28℃摇床培养24-30小时。OD600值为0.8～1.1。
步骤b、混合EM菌培养：混合EM菌包括芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌及乳酸菌。
芽孢杆菌培养条件：将斜面上保存的菌种取2-3环，接种到种子液中，180rpm，30℃摇床培养18-24小时，OD600值为0.8～1.1。
光合细菌培养条件：将斜面上保存的菌种取3-4环，接种到种子液中，30℃光照静置培养72-96小时，OD600值为0.8～1.1。
酵母菌培养条件：将斜面上保存的菌种取2-3环，接种到种子液中，180rpm，30℃摇床培养18-24小时，OD600值为0.8～1.1。
乳酸菌培养条件：将斜面上保存的菌种取3-5环接种到种子液中，37℃静置培养72-96小时，OD600值为0.8～1.1。
取四种菌种的种子液，分别以0.4-0.6％、0.6-0.9％、0.4-0.6％、0.6-0.9％v/v的接种量接种到发酵培养基中，在150-180rpm，30℃条件下，500L发酵罐发酵培养72小时。
步骤c、将海洋假交替单胞菌发酵液和EM菌发酵液混合，按照2-3％(v/w)的接种量(海洋假交替单胞菌发酵液与EM菌发酵液的接种体积比为1:1.5-3)接种到饵料中，调整水分含量为38-50％。混合均匀后装入25kg有单向空气阀的塑封袋中，25-35℃厌氧发酵3-7天。
步骤d、当发酵饵料出现水汽，手触摸略带温热，饵料发出鲜香、有香浓的酒曲和酸味时，发酵饵料制备完成。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤c中，为了保证菌种与饵料充分混合，将菌液与水混合均匀后，再将水与饵料混合、搅拌。
进一步地，在上述技术方案中，步骤a中海洋假交替单胞菌的种子培养基组成：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.1g，海藻酸钠0.5g，NaCl 3g，水100mL，用1M NaOH或1M HCl将pH调节至7.5；
海洋假交替单胞菌发酵培养基组成：海藻酸钠0.5g，(NH4)SO4 0.5g，K2HPO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 2.5g，水100mL，用1M NaOH或1M HCl将pH调节至7.5。
进一步地，在上述技术方案中，步骤b中芽孢杆菌种子培养基组成：牛肉膏1g，蛋白胨1g，葡萄糖1g，NaCl 0.5g，水100mL，用1M NaOH或1M HCl将pH调节至7.0-7.2。
光合细菌种子培养基组成：氯化铵1g，KH2PO4 0.5g，碳酸氢钠5g，NaS2O4 1g,NaCl1g,MgCl2 0.5g,水100mL，用1M NaOH或1M HCl将pH调节至7.5-8.5。
乳酸菌种子培养基组成：牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏0.4g，葡萄糖2g，蔗糖1g，乙酸钠0.5g，柠檬酸铵0.2g，K2HPO4 0.08g，MgSO4·7H2O 0.02g，MnSO4 0.005g，轻质碳酸钙0.1g，吐温80 1ml，水100mL,用1M NaOH或1M HCl将pH调节至6.2。
酵母菌种子培养基组成：酵母膏1g，蛋白胨2g，葡萄糖2g，水100mL，自然pH。
混合EM菌发酵培养基：黄腐酸0.5g，酵母膏0.64g，尿素0.18g，味精0.09g，NaCl0.09g，香菇粉0.125g，KH2PO4 0.31g，轻质CaCO3 1.5g，红糖5.6g，自然pH。
海洋假交替单胞菌来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CCREMSDMCC210342。
芽孢杆菌：来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC20037-枯草芽孢杆菌。
光合细菌：来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CCREMSDMCC150016-球形红细菌。
酵母菌：来自中国农业微生物菌种保藏管理中心中国微生物菌种保藏库，编号为ACCC20165-酿酒酵母。
乳酸菌：来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC11016-植物乳杆菌。
发明有益效果
1.本发明采用有益菌发酵饵料，通过发酵原料中褐藻胶等抗营养因子被降解，粗纤维等大分子物质被分解，产生易被刺参采食、消化、吸收且无毒害作用的小分子营养物质。提高了饵料的营养价值，增加了饵料的利用率，从而节约企业生产成本，具有较大的经济意义和社会价值。
2.饵料经益生菌发酵后含有更多的活性益生菌菌体、多种酶、维生素、代谢产物、活性小肽、氨基酸、寡糖、抑菌物质、免疫增强因子、促生长因子等，起到促进刺参生长、改善刺参肠道菌群结构的作用，同时微生物代谢产生的芳香成分增加了其对刺参的诱食性。
3.发酵饵料中富含的活性菌体还能起到净水的作用。枯草芽孢杆菌能够有效降低刺参养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐及硫化氢水平。乳酸菌及光合细菌能够把养殖水体和底泥中的淀粉、多余的蛋白质、脂肪等有机质分解、起到降低养殖水体富营养化、减少底泥腐败和环境污染的作用。
4.饵料在发酵过程中，益生菌迅速繁殖并成为优势菌群能够抑制有害菌、致病菌的生长，从而降低刺参的发病率，提高刺参的成活率。
5.与液体发酵饵料相比，采用固态发酵的方式，在很大程度上降低了发酵饵料的含水量，使饵料便于贮存和运输，对发酵饵料的大规模生产和推广具有重要的经济价值和现实意义。
具体实施方式
下述实施例中：
海洋假交替单胞菌来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CCREMSDMCC210342。
芽孢杆菌：来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC20037-枯草芽孢杆菌。
光合细菌：来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CCREMSDMCC150016-球形红细菌。
酵母菌：来自中国农业微生物菌种保藏管理中心中国微生物菌种保藏库，编号为ACCC20165-酿酒酵母。
乳酸菌：来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC11016-植物乳杆菌。
海洋假交替单胞菌培养：
将斜面上保存的菌种接种到种子培养基中，160rpm，28℃摇床培养20小时，取种子液，以3％v/v的接种量接到发酵培养基中，160rpm，28℃摇床培养24小时。OD600值为1.0。
海洋假交替单胞菌的种子培养基组成：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.1g，海藻酸钠0.5g，NaCl 3g，水100mL，用1M NaOH或1M HCl将pH调节至7.5；
海洋假交替单胞菌发酵培养基组成：海藻酸钠0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，K2HPO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 2.5g，水100mL，用1M NaOH或1M HCl将pH调节至7.5。
混合EM菌培养：
混合EM菌包括芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌及乳酸菌。
芽孢杆菌培养条件：
将斜面上保存的菌种取2环，接种到种子培养基中，180rpm，30℃摇床培养24小时，OD600值为1.0。
光合细菌培养条件：
将斜面上保存的菌种取3环，接种到种子培养基中，30℃光照静置培养72小时，OD600值为1.0。
酵母菌培养条件：
将斜面上保存的菌种取2环，接种到种子培养基中，180rpm，30℃摇床培养24小时，OD600值为1.0。
乳酸菌培养条件：
将斜面上保存的菌种取3环接种到种子培养基中，37℃静置培养96小时，OD600值为1.0。
芽孢杆菌种子培养基组成：牛肉膏1g，蛋白胨1g，葡萄糖1g，NaCl0.5g，水100mL，用1M NaOH或1M HCl将pH调节至7.0-7.2。
光合细菌种子培养基组成：氯化铵1g，KH2PO4 0.5g，碳酸氢钠5g，NaS2O4 1g,NaCl1g,MgCl2 0.5g,水100mL，用1M NaOH或1M HCl将pH调节至7.5-8.5。
乳酸菌种子培养基组成：牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏0.4g，葡萄糖2g，蔗糖1g，乙酸钠0.5g，柠檬酸铵0.2g，K2HPO4 0.08g，MgSO4·7H2O 0.02g，MnSO4 0.005g，轻质碳酸钙0.1g，吐温80 1ml，水100mL,用1M NaOH或1M HCl将pH调节至6.2。
酵母菌种子培养基组成：酵母膏1g，蛋白胨2g，葡萄糖2g，水100mL，自然pH。
混合EM菌发酵培养基：黄腐酸0.5g，酵母膏0.64g，尿素0.18g，味精0.09g，NaCl0.09g，香菇粉0.125g，KH2PO4 0.31g，轻质CaCO3 1.5g，红糖5.6g，自然pH。
实施例1
步骤a、海洋假交替单胞菌培养：
以上已将海洋假交替单胞菌的发酵液制备出。
步骤b、混合EM菌培养：
取上述制备的芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌及乳酸菌四种菌种的种子液，分别以0.4％、0.6％、0.4％、0.6％的v/v接种量接种到混合EM菌发酵培养基中，在150rpm，30℃条件下，500L发酵罐发酵培养72小时。
步骤c、将海洋假交替单胞菌发酵液和EM菌发酵液混合，按照2％v/w的接种量接种(海洋假交替单胞菌发酵液与EM菌发酵液的接种比例为1:1.5)到饵料中(饵料配方1)，调整水分含量为42％。混合均匀后装入25kg有单向空气阀的塑封袋中25℃厌氧发酵7天。
步骤d、当发酵饵料出现水汽，手触摸略带温热，饵料发出鲜香、有香浓的酒曲和酸味时，发酵饵料制备完成。
饵料配方1：
脱胶海带粉32％，马尾藻粉20％，海青粉20％，玉米粉6％，破壁酵母粉5％，发酵豆粕4％，虾粉4％，预混料3％，鱼粉3％，扇贝边粉2％，红糖1％。
饵料发酵后感官指标见表1-1，理化及微生物指标见表1-2：
表1-1.实施例1饵料1发酵后感官评定结果
表1-2实施例1饵料1发酵后理化及微生物评定结果
实施例2
步骤a、海洋假交替单胞菌培养：
以上已将海洋假交替单胞菌的发酵液制备出。
步骤b、混合EM菌培养：
取上述制备的芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌及乳酸菌四种菌种的种子液，分别以0.4％、0.6％、0.4％、0.6％v/v的接种量接种到混合EM菌发酵培养基中，在180rpm，30℃条件下，500L发酵罐发酵培养80小时。
步骤c、将海洋假交替单胞菌发酵液和EM菌发酵液混合，按照2％v/w的接种量接种(海洋假交替单胞菌发酵液与EM菌发酵液的比例为1:2)到饵料(饵料配方2)中，调整水分含量为45％。混合均匀后装入25kg有单向空气阀的塑封袋中30℃厌氧发酵5天。
步骤d、当发酵饵料出现水汽，手触摸略带温热，饵料发出鲜香、有香浓的酒曲和酸味时，发酵饵料制备完成。
饵料配方2：
脱胶海带粉35％，马尾藻粉17％，海青粉20％，玉米粉6％，破壁酵母粉5％，发酵豆粕4％，虾粉4％，预混料3％，鱼粉3％，扇贝边粉2％，红糖1％。
饵料发酵前后感官指标见表2-1，理化及微生物指标见表2-2：
表2-1.实施例2饵料2发酵后的感官评定结果
表2-2.实施例2饵料2发酵后理化及微生物评定结果
实施例3
步骤a、海洋假交替单胞菌培养：
以上已将海洋假交替单胞菌的发酵液制备出。
步骤b、混合EM菌培养：
取上述制备的芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌及乳酸菌四种菌种的种子液，分别以0.6％、0.9％、0.6％、0.9％v/v的接种量接种到混合EM菌发酵培养基中，在180rpm，30℃条件下，500L发酵罐发酵培养72小时。
步骤c、将海洋假交替单胞菌和EM菌混合，按照3％v/w的接种量接种(海洋假交替单胞菌与EM菌的比例为1:2.5)到饵料(饵料配方3)中，调整水分含量为48％。混合均匀后装入25kg有单向空气阀的塑封袋中35℃厌氧发酵3天。
步骤d、当发酵饵料出现水汽，手触摸略带温热，饵料发出鲜香、有香浓的酒曲和酸味时，发酵饵料制备完成。
饵料配方3：
脱胶海带粉40％，马尾藻粉16％，海青粉16％，玉米粉6％，破壁酵母粉5％，发酵豆粕4％，虾粉4％，预混料3％，鱼粉3％，扇贝边粉2％，红糖1％。
饵料发酵前后感官指标见表3-1，理化及微生物指标见表3-2：
表3-1.实施例3饵料3发酵后的感官评定结果
表3-2.实施例3饵料3发酵后理化及微生物评定结果
对比例1
所有的步骤与实施例1相同，唯一不同的是将海洋假交替单胞菌换为中国微生物保藏库中的CCREMSDMCC210291-海洋假交替单胞菌，饵料发酵前后感官指标见表4-1，理化及微生物指标见表4-2：
表4-1.对比例1饵料发酵前后的感官评定结果
表4-2.对比例1饵料发酵前后理化及微生物评定结果
Claims (4)
1.一种海参生物发酵饵料的制备方法，其特征在于：将海洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)、混合EM菌接种到饵料中25-35℃厌氧发酵3-7天；其中混合EM菌由芽孢杆菌(Bacillus)、光合细菌(Photosynthetic Bacteria,PSB)、酵母菌(Yeast)及乳酸菌(Lactobacillus)组成。
2.根据权利要求1所述的海参生物饵料的制备方法，其特征在于：所述饵料按照质量百分数由32～40％脱胶海带粉，16～20％马尾藻粉，16～20％海青粉，6％玉米粉，5％破壁酵母粉，4％发酵豆粕，4％虾粉，3％预混料，3％鱼粉，2％扇贝边粉，1％红糖组成。
3.根据权利要求1所述的海参生物饵料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤a、海洋假交替单胞菌的培养：将斜面上保存的菌种接种到种子培养基中，160rpm，28℃摇床培养18-20小时，取种子液，以2％-3％的接种量接到发酵培养基中，160rpm，28℃摇床培养24-30小时，OD600值为0.8～1.1；
步骤b、混合EM菌培养：混合EM菌包括芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌及乳酸菌；
芽孢杆菌培养后种子液中，OD600值为0.8～1.1；
光合细菌培养后种子液中，OD600值为0.8～1.1；
酵母菌培养后种子液中，OD600值为0.8～1.1；
乳酸菌培养后种子液中，OD600值为0.8～1.1；
取上述四种接种后的菌种的种子液，分别以0.4-0.6％、0.6-0.9％、0.4-0.6％、0.6-0.9％的体积比接种量接种到发酵培养基中，在150-180rpm，30℃条件下，在500L发酵罐发酵培养72小时；
步骤c、将海洋假交替单胞菌发酵液和EM菌发酵液混合，按照2％-3％的接种量接种到饵料中，加水调整水分含量为38％-50％；混合均匀后装入25kg塑封袋中25-35℃厌氧发酵3-7天；其中，海洋假交替单胞菌发酵液与EM菌发酵液接种体积比为1:1.5～3；
步骤d、当发酵饵料出现水汽，手触摸温热，饵料发出鲜香、有香浓的酒曲和酸味时，发酵饵料制备完成。
4.根据权利要求3所述的海参生物发酵饵料的制备方法，其特征在于，在步骤c中，将菌液与水混合均匀后，再将水与饵料混合、搅拌。
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