CN106019423B - 镀膜玻片在超分辨显微技术上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种镀膜玻片在超分辨显微技术上的应用，包括：1)在衬底上镀设光学薄膜，并将微纳样品放置在所述的光学薄膜上或在所述的光学薄膜上制备微纳结构；2)放置微纳光源，并将微纳光源的倏逝场耦合进所述的光学薄膜，使得传输的倏逝场作用于微纳样品或微纳结构；或者将外界光场直接耦合进光学薄膜波导内传输，并在传输过程中与微纳样品或者微纳结构相互作用；3)通过显微镜获取微纳结构或微纳样品的光学成像，并对像进行频谱分析和图像重构。
Description
技术领域
本发明涉及薄膜和超分辨显微领域，尤其涉及一种镀膜玻片在超分辨显微方向的应用。
背景技术
光学显微镜由于光束直径有限，透镜大小有限，从而具有一个阿贝衍射极限理论(λ为所用照明光的波长，NA为所用显微物镜的数值孔径)。根据该理论，在可见光波段，光学显微镜的极限分辨率被限制在200纳米左右。但是，材料、生物、医学等领域的发展，要求有关设备能够实现更小尺寸的分辨能力，以便能够实现对更小尺寸样品的观察。因此，需要一种对样品的普适性强的可以突破常规衍射极限的新技术，来实现超分辨显微。
当前，人们已经在使用的技术包括受激辐射光淬灭(stimulation emissiondepletion，STED)、随机光学显微重建(stochastic optical reconstructionmicroscopy，STORM)和光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy，PALM)等。但大都面临着花费昂贵，视场较小等限制因素。STED显微镜的困难在于光束波长的选择以及两列脉冲的同步调节，技术难度较大；而STORM技术需要较长的成像时间，难以实现活细胞成像。因此，需要一种价格低廉，普适性强，视场范围大，可以突破常规衍射极限的新技术，来实现超分辨显微。
当在玻片的表面镀有高折射率的光学薄膜时，薄膜波导内传输的光场能够被很好的约束。高折射率薄膜波导能够提供大波矢倏逝场，利用大波矢倏逝场有利于实现超分辨显微功能。同时，良好的光场约束性也有利于实现大的工作视场。
发明内容
本发明提出了镀膜玻片在超分辨显微领域的应用，通过对薄膜材料的选择和薄膜折射率和尺寸等参数的优化，可以适应不同的微纳样品需求，满足不同分辨率和不同的视场范围需求。良好的光场约束性使得镀膜玻片能更好地实现约束场与微纳结构或样品的相互作用，获取近场信息。具体的作用机理是通过玻片上的光学薄膜对微纳光源的倏逝场或者外界的耦合场进行约束传输，薄膜的倏逝场会与微纳样品或者结构发生相互作用，使得样品的频谱发生频移并传到远场。在本发明的薄膜超分辨显微方法中，包括薄膜的镀膜过程、光学薄膜与微纳样品或结构的相互作用过程以及输出结果的处理过程。
要实现镀膜玻片在超分辨显微领域的应用，需要以下步骤：
1)根据实验样品和结果的要求，选择薄膜材料，仿真并优化获取需要的薄膜参数；
2)利用热蒸发，原子层沉积等技术在盖玻片、硅片等衬底上按照已有的优化参数进行光学镀膜；
3)将微纳样品放置在镀好的光学薄膜上，或者利用FIB等技术在光学薄膜上刻蚀所需微纳结构，并做好标记；
4)参照标记放置微纳光源，微纳光源与样品或结构之间的距离根据实际情况而定，并将微纳光源的倏逝场耦合进光学薄膜，使得传输的倏逝场作用于微纳结构样品；或者将外界光场直接耦合进光学薄膜波导内传输，并在传输过程中与微纳样品或者结构相互作用；
5)通过显微镜获取微纳结构的光学成像，并利用CCD等进行拍照记录；并对像进行频谱分析和图像重构。
本发明中，光学薄膜可选用的材料有多种，作为优选的包括三氧化二铝(Al2O3)，二氧化钛(TiO2)等，一般相对于衬底材料，折射率越高的薄膜材料越有利于对光场的约束，更易于实现高的分辨率，同时光学薄膜也可以做的更薄。可以采用的镀膜方式有多种，包括热蒸发，溅射或者原子层沉积(ALD)等方式。作为优选的，一般采用热蒸发的方式进行镀膜，热蒸发方式更有利于大片的进行镀膜，镀膜的成本较低，并且薄膜的质量能够很好的满足微纳显微成像的要求。同时，可以选用的靶材料种类也很丰富。光学薄膜的厚度和薄膜材料的折射率对显微效果具有一定的影响，根据实际要求，需要对所需薄膜进行相应的设计与优化。例如，表1和表2所示的Al2O3膜和TiO2膜在不同厚度下的仿真效果。
表1.不同Al2O3膜厚情况下仿真得到的neff与最佳分辨率值
| Al<sub>2</sub>O<sub>3</sub>薄膜厚度/(nm) | 有效折射率实部n<sub>eff</sub> | 最佳分辨率/(nm) |
| 150 | 1.55964 | 166 |
| 200 | 1.611 | 161 |
| 300 | 1.67391 | 155 |
| 500 | 1.725 | 149 |
表1为仿真得到的，在采用280nm氧化硅层厚度的硅基衬底，入射光波长为520nm，几种不同厚度的氧化铝薄膜对应的有效折射率实部neff值和相应的最佳分辨率值(最佳分辨率＝λ/(2·neff))，可见模场的有效折射率实部也不断增加，相应的最佳分辨效果得到很大提升。
表2.不同TiO2膜厚情况下仿真得到的neff与最佳分辨率值
| TiO<sub>2</sub>薄膜厚度/(nm) | 有效折射率实部n<sub>eff</sub> | 最佳分辨率/(nm) |
| 70 | 2.03 | 128 |
| 100 | 2.24 | 116 |
| 200 | 2.5 | 104 |
表2为采用280nm氧化硅层厚度的硅基衬底，入射光波长为520nm时仿真得到的几种不同厚度下氧化钛薄膜所对应的有效折射率实部neff值和相应的最佳分辨率值，可以看出，与表1中的规律相同，更厚的的氧化钛层，有利于实现更好的分辨效果。
本发明中光学衬底的选择需要与薄膜材料一同考虑，衬底在这里的作用主要是承担对样品的承载作用。但是，当衬底的折射率很高，或者与薄膜材料的折射率相近时，会破坏薄膜对光场的约束性，使得薄膜波导内光场易于耦合到衬底，从而被损耗掉，降低成像的视场范围。制备镀膜玻片时，要求衬底玻片上与薄膜接触部分的折射率小于薄膜材料折射率，且两者的折射率差最好能大于0.5。一般可以选用的衬底材料包括盖玻片和具有一定氧化层厚度的硅片，硅片上氧化层的厚度要根据所选用的高折射率材料而定，一般氧化硅层厚度的厚度会选择在200nm以上。
本发明中，微纳光源有多种实施方式，包括微纳光纤、平板波导结构或者半导体纳米线等。实际使用中，光源的选择应从以下角度考虑:
微纳光纤和平板波导结构内传输的光场由于波矢是沿着轴向方向，这两种光源的倏逝场波矢也因此沿着轴向，这就使得倏逝场在与光传输方向垂直的截面方向传输距离有限，无法实现大视场观察。但是，微纳光纤与平板波导一般采用氧化硅材料，氧化硅的材料稳定性好，适用的工作条件非常广泛。同时，微纳光纤的柔韧性很好，能够绕成多种形状的微环。此外，由于波导的光场是由外界提供的，因此，可以轻易在多工作波长条件下观察微纳样品。
半导体纳米线受到光激发产生荧光，这些荧光的波矢沿着各个方向，耦合到薄膜波导内的光场在纳米线的横截面方向上能传输很远的距离，有利于大视场观察微纳样品。并且，半导体纳米线的直径一般都在百纳米量级，能够很容易的绕成环形，适用于环形照明。但是，半导体纳米线发出的荧光波长受材料特性限制，一种材料一般只对应一种波长，不利于多个工作波长条件下的观察。
本发明中，薄膜波导内的光场也可通过外界光场进行端面耦合的办法获取，采用端面耦合的方法，可以在薄膜波导内光场传输的方向上放置微纳样品或者结构，视场范围可以做的很大。这里光场耦合的端面位置与微纳样品的位置，要根据所选用的薄膜材料、薄膜厚度、薄膜的质量(包括表面平整度、内部散射点的密度等)，以及光场的耦合效率等条件而定。
本发明中，微纳样品可通过微纳操作的方式置于镀膜玻片上，微纳结构可以通过聚焦离子束微纳加工技术(FIB)在高折射率薄膜上直接制备。微纳光源与微纳样品的放置顺序可依据实际情况而定，不限于先放置微纳样品或者结构之后放置微纳光源这一情况。
本发明中，光学薄膜的制备也可以通过镀制多层膜的方式，实现对倏逝场的良好约束；优选的，所述的光学薄膜为两层，包括与衬底贴合的底层低折射率薄膜和镀在底层之上的高折射率薄膜，其中，所述底层薄膜的材料可以位SiO2，MgF2、YbF3、LaF3、SrF3或NdF3等；表层薄膜的材料为Al2O3、TiO2、Ta2O5或ZrO2。例如，在纯硅衬底或者具有一定厚度氧化层的硅衬底上镀制一层低折射率氟化镁、氟化镱、氟化钕、氟化钇层，之后再镀制一层三氧化二铝、二氧化钛层、氧化钽或者氧化锆层等。最终，利用高折射率层实现对倏逝场的约束。
本发明中，也可先将微纳光纤或者半导体纳米线置于衬底之上，之后镀制折射率较高的光学薄膜，即所述的光学薄膜覆盖在微纳光纤或半导体纳米线的表面；这样有利于更多的光被耦合进光学薄膜内部，从而增强倏逝场的强度，实现更好的显微成像效果。同时，也可以降低光学成像时的背景噪声。
附图说明
图1为实施例1，采用在有280nm氧化硅层厚度硅基衬底上镀有200nm三氧化二铝薄膜玻片时，通过环形微纳光源观察ZJU微纳结构的示意图；
图2为实施例2，采用在有280nm氧化硅层厚度硅基衬底上镀有200nm三氧化二铝薄膜玻片时，利用直线型微纳光源观察不同距离的双道微纳结构示意图；
图3为实施例3，采用镀有多层光学薄膜结构的玻片时，利用微纳光纤作为微纳光源观察双道微刻槽或微纳样品时的示意图；
图4为实施例1的实验效果图；
图5为实施例2的实验效果图；
图6为采用在硅上280nm氧化硅层时，观察周期250nm阶梯型微纳结构的实验效果图，可以看出与实施例1和例二相比，视场范围缩小很多。
图7(a)为实施例1中的整体SEM图，图7(b)为实施例1中局部细节SEM图；
图8(a)为实施例2中的整体SEM图，图8(b)为实施例2中的局部细节SEM图；
具体实施方式
要实现镀膜玻片在超分辨显微领域的应用，需要在玻片衬底之上镀制一层高折射率介质膜层。之后将微纳样品通过微纳操作放置到介质膜层上，或者在薄膜上通过FIB等技术制备特定形状和尺寸的微纳结构。最后，将微纳光纤、微纳平板波导或者半导体纳米线放置在距离微纳样品或者结构一定距离的位置处。在完成这些准备工作之后，可以将特定波长的光耦合到微纳光纤或者波导，或者激发半导体纳米线，利用这些微纳光源与光学薄膜之间发生耦合作用，也可直接将外界光源端面耦合进光学薄膜内部，最终实现光场在光学薄膜内的传输。当传输光场的倏逝场遇到微纳样品或者结构时，两者会发生作用，从而使得微纳样品或者结构被分辨。我们可以利用光学显微镜观察微纳样品或者结构分辨情况，并利用CCD等设备记录光场信息，并对微纳样品和结构进行后续分析。
实施例1：
如图1所示的薄膜玻片观察微纳结构ZJU示意图，包括硅基衬底11，硅基衬底上镀的200nm厚度的三氧化二铝光学薄膜12，周期在170nm左右的微纳结构(ZJU)14，以及环绕在微纳结构周围的环形微纳光源13。其中硅基衬底采用了氧化硅层厚度为280nm的硅基衬底，清洗过衬底后，采用热蒸发的方法，在硅基衬底上镀制了200nm的三氧化二铝光学薄膜。之后采用聚焦离子束微纳加工技术，在氧化铝薄膜上刻蚀制备了深度在100nm左右，周期在170nm左右的微纳结构。实验中，微纳光源采用了半导体纳米线照明方法，通过微纳操作，将半导体纳米线在微结构周围进行绕环。之后通过外界激发半导体纳米线，受到激发的半导体纳米线发出的部分光会以倏逝场的形式耦合到三氧化二铝薄膜内，并进行传输。刻蚀微结构的SEM图如图7(a)和图7(b)所示，实验的效果图如图4所示，基本上可以实现环形内的均匀照明，同时能对微纳结构实现超分辨成像。
实施例2：
如图2所示薄膜玻片观察阶梯型微纳结构示意图，与实施例一采用了相同的衬底和光学薄膜参数，包括硅基衬底21和三氧化二铝光学薄膜22。在三氧化二铝上采用聚焦离子束微纳加工技术刻蚀制备了阶梯型微纳结构24，单个的双道结构内周期在170nm左右，双道结构之间的间距在6um左右，微纳光源采用的是与微结构平行的半导体纳米线23。刻蚀微结构的SEM图如图8(a)和图8(b)所示，从实验效果图图5中，可以看出，该玻片结构可以实现单侧30um以上的视场观测范围。
实施例3：
如图三所示采用多层镀膜的方式观察双道结构示意图，包括硅基衬底31，折射率较低的光学薄膜(如MgF2、YbF3、LaF3、SrF3、NdF3等)32,折射率较高的的光学薄膜(如Al2O3、TiO2、Ta2O5和ZrO2等)33，之后利用聚焦离子束微纳加工技术在高折射率薄膜上制备微纳结构，比如双道微结构35，或者其他结构。也可将微纳样品放置在高折射率薄膜之上。之后，将拉锥制备的微纳光纤34，放置在距离微纳结构或样品一定距离的高折射率薄膜上。将外界光利用微纳光纤耦合到高折射率薄膜内，并利用CCD对微纳结构或者样品进行光学成像。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种镀膜玻片在超分辨显微技术上的应用，其特征在于，包括：
1)在衬底上镀设光学薄膜，并将微纳样品放置在所述的光学薄膜上或在所述的光学薄膜上制备微纳结构；
所述衬底与光学薄膜接触部分的折射率小于薄膜材料折射率，且两者的折射率差大于0.5；
2)放置微纳光源，并将微纳光源的倏逝场耦合进所述的光学薄膜并进行传输，利用光学薄膜的倏逝场作用于微纳样品或微纳结构；或者将外界光场直接耦合进光学薄膜波导内传输，并在传输过程中与微纳样品或者微纳结构相互作用；
所述的微纳光源为微纳光纤、平板波导结构或者半导体纳米线；所述的光学薄膜在微纳光纤或半导体纳米线之上；
3)通过显微镜获取微纳结构或微纳样品的光学成像，并对像进行频谱分析和图像重构。
2.如权利要求1所述的镀膜玻片在超分辨显微技术上的应用，其特征在于，所述的衬底为盖玻片或具有氧化硅层的硅片。
3.如权利要求1所述的镀膜玻片在超分辨显微技术上的应用，其特征在于，所述光学薄膜的材料为Al2O3、TiO2、Ta2O5或ZrO2。
4.如权利要求1所述的镀膜玻片在超分辨显微技术上的应用，其特征在于，可以采用端面耦合的方法将外界光场耦合进光学薄膜波导内传输。
5.如权利要求1所述的镀膜玻片在超分辨显微技术上的应用，其特征在于，所述的光学薄膜为两层，包括与衬底贴合的底层和镀在底层上的表层，且底层薄膜的折射率小于表层薄膜的折射率。
6.如权利要求5所述的镀膜玻片在超分辨显微技术上的应用，其特征在于，所述底层薄膜的材料为MgF2、YbF3、LaF3、SrF3或NdF3；表层薄膜的材料为Al2O3、TiO2、Ta2O5或ZrO2。
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