CN105985954B - 水稻miR160b基因在调控分蘖角度中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻miR160b基因在调控分蘖角度中的应用。通过超量表达miR160b基因，使正常水稻植株出现分蘖角度增大的表型变化，抑制miR160b基因可以使超表达miR160b植株的突变表型恢复。miR160b基因具有调控水稻株型的功能，该基因的茎环结构DNA序列如SEQ ID NO:1所示，其转录后形成的茎环结构前体RNA序列如SEQ ID NO:2所示，经转录及切割后形成的成熟miR160b核心区域序列如SEQ ID NO:3所示。公开了利用基因工程技术改变水稻miR160b基因或家族其他成员基因的表达模式，调控水稻分蘖角度形成理想株型，达到增产的目的。

Description

水稻miR160b基因在调控分蘖角度中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种调控水稻分蘖角度基因miR160b的功能验证和应用。本发明通过超量表达miR160b基因，使正常水稻植株出现分蘖角度增大的表型变化，抑制miR160b基因可以使超表达miR160b植株的突变表型恢复，还涉及通过实验验证该miRNA对靶基因的抑制，进而调控水稻的分蘖角度。本发明还涉及通过基因工程技术利用该基因对水稻的株型进行有目的地遗传改良。

背景技术

水稻是世界上主要的粮食作物之一，作为全球超过半数人口的主食。水稻以其较小的基因组(约430Mbp)，精细的物理和遗传图谱，以及与玉米、大麦、小麦等其他禾本科植物在基因组上有较好的共线性，相对成熟和容易操作的遗传转化体系，从而被视为单子叶植物基因功能研究的模式植物。随着全球人口的不断增长和耕地面积的逐年减少，粮食安全问题越来越受到人们的关注，其中提高水稻单位面积的产量是解决该问题的重要措施之一。50年代矮化基因的应用和70年代杂交水稻的培育使我国水稻单产发生了两次革命性的飞跃，但之后很长一段时间我国水稻产量一直处在徘徊不前的局面。近年来，育种家和遗传学家们期望通过选育以理想株型并与杂种优势利用相结合的手段来培育高产水稻新，以实现水稻产量的进一步提升。

株高、分蘖数、分蘖角度和穗形态是影响水稻株型的重要因子，其中分蘖是水稻理想株型和高产的重要农艺性状之一。分蘖是水稻生长的基本特性，它包含有分蘖角度和分蘖力两个方面，前者反映了主茎与分蘖的集散程度；后者表现了分蘖数的多少。分蘖角度是指植株抽穗前分蘖与主茎的夹角，它直接影响了水稻植株间和植株内对光、温度、氧气的竞争，最终影响水稻的产量。松散的株型虽然可以避免病虫的侵害，但是占有太多的空间，使光合效率降低、抗倒伏能力下降，而紧凑的株型限制了光线和空气的渗透，相邻植株的湿度增加，使植株更容易感染病虫害(Wang等，Rice rising.Nat Genet,2008,40:1273-1275)。因此，分蘖角度过大或分蘖角度过小都不利于水稻产量的提高。

目前，已经克隆的与分蘖角度密切相关的重要基因有：TAC1、PRGO1、LAZY1和LPA1。TAC1是2007年被克隆的控制分蘖角度这一数量性状的主效基因，该基因在分蘖基部以及茎节处特异性表达。其第四个内含子中3’端剪切位点处的突变，使得TAC1表达水平下降，与野生型相比其侧芽基部呈更明显的不对称生长模式，从而产生分蘖角度接近0°的突变表型(Baisheng等,TAC1,a major quantitative trait locus controlling tiller angle inrice.Plant J,2007,52:891-898)。2008年克隆的PRGO1基因编码一个C2H2类型锌指蛋白，该基因特异性的在侧生分生组织及顶端分生组织中表达。其开放阅读框内一个碱基的颠换造成编码蛋白序列的改变，从而产生分蘖角度增大的表型。组织切片观察显示，在该突变体中，侧芽基部的近地面和背地面呈对称生长模式，使得侧芽无法弯曲向上生长而呈现伏地生长模式(Lubin等,Control of a key transition from prostrate to erect growthin rice domestication.Nat Genet,2008,40:1360-1364；Jian等,Genetic control ofrice plant architecture under domestication.Nat Genet,2008,40:1356-1369)。2007年克隆的LAZY1基因在茎和胚芽鞘中特异表达，其缺失型突变体侧芽处生长素的极性运输受到破坏，造成内源性生长素分布异常，从而出现分蘖角度增大的突变表型。最新研究显示独角金内酯合成突变体可以使lazy1分蘖角度增大的突变表型回复，独角金内酯通过抑制生长素的合成，减少侧芽中IAA的含量进而影响水稻的分蘖角度(Sang等,Strigolactonesregulate rice tiller angle by attenuating shoot gravitropism throughinhibiting auxin biosynthesis.Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111:11199-11204)，表明独角金内酯可能参与水稻中分蘖角度的调控。LPA1是最近才发现的一个编码植物特有的结构域不确定(ID)的转录抑制因子，其突变体lpa1具有松散的株型，分蘖角和叶角增大，节间变短、增厚，茎细胞壁增厚，谷粒和叶面变短变宽，地上部的向重性减弱。LPA1具有特异的表达模式，其在幼嫩组织的叶夹角和节间以及较老的分蘖基部有较强表达。LPA1通过调解细胞中淀粉体的沉降速率来调控重力感应和信号转导，最终影响水稻地上部分的向重力性反应从而调控分蘖角和叶夹角的大小Wu等,Loose plant architecture1,anINDETERMINATE DOMAIN protein involved in shoot gravitropism,regulates plantarchitecture in rice.Plant Physiol,2013,161:317-329)。虽然目前已经克隆到了一些控制水稻分蘖角度的基因，但是关于水稻分蘖角度的分子机制仍不清楚。

ARF是植物中一类特异的具有B3DNA结合域的转录因子家族，它们通过结合在特定基因启动子区域的AuxRE元件(TGTCTC)上，激活或者抑制生长素应答基因的表达。典型的ARF通常具有三个结构域分别为N末端比较保守的DNA结合域(DBD)、不保守的中间区域(MR)、C末端比较保守的二聚体区域(CTD)。DBD结构域介导ARF与原初生长素应答基因(GH3，SAUR，Aux/IAA)启动子区域的AuxRE特异结合，MR结构域则决定了ARF转录因子的类型，而CTD结构域类似于Aux/IAA蛋白的III和IV结构域，ARF的CTD结构域可以与Aux/IAA蛋白的III和IV结构域结合。最新的研究显示，对拟南芥ARF家族中的ARF5和ARF7的晶体结构分析发现，ARF5和ARF7的CTD区域具有PB1区域，它们可以形成低聚体的形式分别与IAA17和IAA21蛋白互作，进而调控生长素响应的抑制(Korasick等,Molecular basis for AUXINRESPONSE FACTOR protein interaction and the control of auxin responserepression.Proc Natl Acad Sci USA,2014,111:5427-5432；Nanao等,Structural basisfor oligomerization of auxin transcriptional regulators.Nat Commun,2014,5:3617)。水稻ARF家族中有25个成员，已报道的有OsARF1、OsARF12、OsARF16、OsARF19、OsARF23、OsARF24以及OsARF25，它们各自参与水稻的不同生长发育过程。最新的研究显示OsARF12参与影响水稻体内磷的平衡，在osarf12和osarf12osarf25突变体中，在Pi充足/缺乏的条件下，与磷响应相关的基因的表达量都得到增加(Wang等,Auxin response factor(OsARF12),a novel regulator for phosphate homeostasis in rice(Oryza sativa).New Phytologist,2014,201:91-103)。OsARF23和OsARF24可以形成异源二聚体蛋白，共同作用在RMD基因的启动子区域，直接调节RMD基因的表达，调控水稻细胞的生长和形态发生(Li等,Rice actin-binding protein RMD is a key link in the auxin-actinregulatory loop that controls cell growth.Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111:10377-10382)。OsARF19通过调节OsGH3.5和OsBRI1的表达进而调控水稻叶夹角的大小。但水稻中尚无关于OsARF与分蘖角度关系的研究报道。

本发明所涉及的miR160b基因转录后形成一种特殊的小RNA分子miRNA160。miRNAs是一类生物体内源性的、约22-24nt长、不编码蛋白质的小RNA分子，它广泛存在于各个物种中并且在进化上高度保守，参与生物体发育的时空调控、细胞分化、信号转导、疾病、逆境应答等多种生物过程。miRNA基因和其它编码蛋白的基因一样，都由启动子、转录区以及终止子组成。在植物体内，miRNA与下游靶基因的配对几乎是完全匹配的，其调控机制大多属于转录后水平的调控，即含有成熟miRNA的AGO复合体可直接对靶基因的mRNA进行切割，进而整个mRNA分子被降解。拟南芥中的研究结果显示，miRNA160的靶基因是ARF基因家族的ARF6、ARF10和ARF17。miRNA160直接调控ARF17从而进一步调控GH3，影响了生长素在拟南芥各组织器官中的分布。当超表达一个不受miRNA160调控的ARF17基因(mARF17)时，植株出现多种突变表型，包括叶片卷曲、花器官发育异常、开花提前、不育等，而且使生长素早期应答基因GH3基因家族的表达发生异常(Mallory等,MicroRNA-directed regulation ofArabidopsis AUXIN RESPONSE FACTOR 17is essential for proper development andmodulates expression of early auxin response genes.Plant Cell,2005,17:1360-1375)。arf10arf16双突变体和Pro35S:MIR160植株表现出相同的突变表型，包括主根长度的减少、侧根数量的增加、失去重力感应。虽然ARF10和ARF16存在功能冗余现象，但它们对拟南芥根冠的发育是缺一不可的Wang等,Control of root cap formation by microRNA-targeted auxin response factors in Arabidopsis.Plant Cell,2005,17:2204-2216)。当超表达一个不受miRNA160调控的ARF10基因(mARF10)时，植株又出现了锯齿形的叶、卷曲的角果、扭曲的花等突变表型，miR160对ARF10的调控影响了萌发后幼苗对ABA的敏感性，表明IAA和ABA在种子的萌发过程中具有潜在的联系(Liu等,Repression of AUXIN RESPONSEFACTOR 10by microRNA160is critical for seed germination and post-germinationstages.Plant J,2007,52:133-146)。突变体foc在拟南芥MIR160a基因的3’调控区域有一个Ds转座子插入，该突变体表现出锯齿状的叶、不规则的花、异常的种子、胎生幼苗等突变表型，进一步分析发现该突变表型是由于在胚胎形成过程中的不正常细胞分裂导致的，在foc突变体中成熟miR160的积累减少而靶基因ARF10、ARF16和ARF17的表达模式发生改变，由此可知3’调控区域对于miR160a基因的表达是必须的((Liu等,The role of floralorgans in carpels,an Arabidopsis loss-of-function mutation in MicroRNA160a,inorganogenesis and the mechanism regulating its expression.Plant J,2010,62:416-428)。最新的数据显示，miRNA160对ARF10的调控作用还会影响拟南芥体外培养过程中芽的再生(Qiao等,Proper regeneration fromin vitro cultured Arabidopsisthaliana requires the microRNA-directed action of an auxin responsefactor.Plant J,2012)。但是在水稻中，还没有关于miR160b基因调控水稻株型的报道。

发明内容

本发明的目的在于克隆和鉴定一种调控水稻分蘖角度的基因miR160b，通过控制miR160b基因在水稻中的表达模式来塑造水稻理想株型，达到增产的目的。

本发明鉴定的miR160b基因茎环结构DNA序列如SEQ ID NO:1所示，其转录后形成的茎环结构前体RNA序列如SEQ ID NO:2所示，经转录及切割后形成的成熟miR160b核心区域序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明鉴定的miR160b基因超量表达转基因植株主要表现为分蘖角度增大的株型(见实施例4)。超量表达miR160b的转基因阳性使植株从苗期到成熟期都表现出分蘖角度增大的突变表型，而且成熟期更加明显，除此之外还出现了有效分蘖数略微减少，结实率下降。

本发明通过成熟miR160b的在转基因植株中的表达谱分析(见实施例5)，而且miR160b基因的target mimicry超表达载体可以使超量表达miR160b的转基因植株的突变表型恢复正常(见实施例6)，证实了miR160b基因具有调控水稻株型的功能。

本发明通过实验证明了水稻ARF家族的OsARF13、OsARF18和OsARF22是成熟miR160的靶基因(见实施例6)。miR160b通过碱基互补的方式对靶基因的mRNA进行剪切，从而调控水稻的分蘖角度。

实现本发明的具体技术步骤如下：

1.通过构建超表达载体，实现了水稻miR160b基因的超量表达，结果出现了水稻分蘖角度增大的突变表型(见实施例3、4)。

2.利用RLM-5’RACE方法证实了OsARF13、OsARF18和OsARF22是成熟miR160b的靶基因，miR160b基因通过降解OsARF13、OsARF18和OsARF22的mRNA，进而调控水稻的分蘖角度(实施例6.1)。

3.利用定量RT-PCR技术分析miR160b超表达阳性和阴性植株中成熟miR160b以及靶基因OsARF13、OsARF18和OsARF22的表达，发现成熟miR160b与靶基因OsARF13、OsARF18和OsARF22呈相反的表达模式(实施例5)。

4.利用target mimicry技术抑制水稻miR160b基因的表达，可使超表达miR160b的分蘖角度增大的突变表型恢复到野生型状态(实施例6.2)。

更详细的技术发明细节将由下述实施例给出。

本发明的优点

1.拟南芥miR160基因家族中大部分基因已被克隆，其中部分成员被证实参与拟南芥花器官的发育、根冠的发育以及拟南芥体外培养过程中芽的再生等。目前，水稻中尚无关于miR160基因功能的报道。本发明鉴定的miR160b基因控制了水稻分蘖角度，解析了miR160b基因调控水稻株型的生物学功能。

2.虽然水稻中已克隆了一些控制植物分蘖角度的基因，但水稻分蘖角度调控的分子机理仍不清楚。而本发明鉴定的miR160b基因能够控制水稻的分蘖角度，有利于进一步解析水稻分蘖角度调控的分子机理，便于培育合理株型的水稻品种。

3.本发明验证了ARF家族是miR160b的靶基因，miR160b抑制靶基因(OsARF13、OsARF18和OsARF22)的表达，而miR160b基因超量表达使水稻分蘖角度提高，说明OsARF13、OsARF18和OsARF22对水稻的分蘖角度具有一定的调控作用，有利于进一步了解ARF家族与分蘖角度的关系。

4.本发明通过超量表达miR160b基因，增加了水稻分蘖角度的大小。通过基因工程技术提高或者减弱miR160b基因的表达能够改变水稻的分蘖角度，从而改良水稻株型，达到增加水稻产量的目的。

下面结合附图对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限定。

附图说明

序列表SEQ.ID.NO:1是本发明鉴定的水稻miR160b基因茎环结构DNA序列。

序列表SEQ.ID.NO:2是本发明鉴定的水稻miR160b基因转录形成的RNA茎环结构序列。

序列表SEQ.ID.NO:3是本发明鉴定的水稻miR160b基因转录剪切形成的成熟miR160b核心序列。

图1：是水稻miR160b基因在粳稻品种中花11中的表达谱分析。附图标记说明：横坐标表示根(R)、茎(C)、叶(L)、叶鞘(LS)、侧芽(B)及幼穗(P)六个组织部位。

图2.：是水稻miR160b超量表达植株拷贝数检测。使用λ-EcoT14Ⅰdigest DNAMarker，附图标记说明：黑色箭头表示选择的后续研究材料单拷贝植株4-7。

图3：是水稻miR160b超量表达植株的表型分析。附图标记说明：图3A：苗期植株照片。图3B：成熟期植株照片。图3C：垂直观察分蘖角度的照片。图3D：有效分蘖数。图3E：分蘖角度。图3F：结实率。在上述各图中的左边代表miR160b基因超量表达阴性植株(WT)；右边代表miR160b基因超量表达阳性植株(Ubi::miR160b)。

图4：是miR160b和靶基因的表达分析。附图标记说明：图4A：是成熟miR160b在超量表达miR160b转基因植株阳性和阴性中的表达量。图4B：是OsARF13在超量表达水稻miR160b转基因植株阳性和阴性中的表达量。图4C：是OsARF18在超量表达水稻miR160b转基因植株阳性和阴性中的表达量。图4D：是OsARF22在超量表达水稻miR160b转基因植株阳性和阴性中的表达量。图中：黑色柱代表miR160b基因超量表达阴性对照植株(WT)，灰色柱代表miR160b基因超量表达阳性植株(Ubi::miR160b)。横坐标表示根(R)、茎(S)、叶(L)、叶鞘(LS)、侧芽(B)及幼穗(P)六个组织部位。

图5：是RLM-5’RACE分析miR160b剪切靶基因的位置。附图标记说明：图5A：是水稻中miR160家族成熟序列的多序列比对。图5B：是RLM-RACE分析miR160b切断靶基因OsARF13、OsARF18和OsARF22mRNA分子的位置。图5C：是OsARF13、OsARF18和OsARF22的mRNA被剪切的位置示意图，图中箭头和数字表示在箭头对应位置终止RNA分子的比例。

图6：是Ubi::MIM160b使Ubi::miR160b突变表型恢复。附图标记说明：图6A：是MIM160b载体构建的示意图。图6B：是Ubi::MIM160b转中花11(ZH11)表型照片。图6C：是Ubi::MIM160b转Ubi::miR160b的表型照片。图6D：是利用QRT-PCR检测OsARF13、OsARF18和OsARF22三个靶基因在ZH11、Ubi::MIM160b、Ubi::miR160b、Ubi::MIM160b/Ubi::miR160b中的表达量分析。

图7：是利用QRT-PCR方法分析分蘖角度基因(LAZY1、TAC1、PROG1)以及生长素相关基因(GH3.1，GH3.4，GH3.8，PIN1，IAA4，IAA21)在超量表达miR160b阳性植株和阴性植株中的表达量。以水稻UBQ基因作为内对照，平均值取自3次生物学重复和3次技术重复。

图8：是构建水稻miR160b超表达载体所用的pU1301空载体图谱。

图9：是构建水稻MIM160b超表达载体所用的MT375质粒的质粒图。

图10：是pU1301-miR160b超量表达载体的图谱。

图11：是pU2301-MIM160b(即：Ubi::MIM160b)载体图。

图12：是pEASY-T1载体示意图(即T载体pEASY-T 1cloning vector；北京全式金生物技术有限公司)。

具体实施方式

实施例1 水稻miR160基因家族成员分析

根据miRBase(Release 21)(http://www.mirbase.org/index.shtml)数据库最新显示，水稻miR160基因家族一共有6个成员，依次命名为miR160a至miR160f。该基因家族各成员均单独分布于水稻不同染色体，miR160基因家族各成员茎环结构长度及序列各异，经过剪切形成的核心miR160序列只有3种。

表1 水稻miR160基因家族各成员在染色体上的分布及茎环大小分析

实施例2 miR160b基因表达谱分析

为了分析miR160b基因的表达模式，我们抽提插秧后30天即处于分蘖旺盛期的水稻粳稻品种中花11(ZH11)的根(R)、茎(C)、叶(L)、叶鞘(LS)、侧芽(B)、幼穗(P)这六个组织部位的RNA样品，通过miRNA stem-loop RT-PCR(Chen等,Real-time quantification ofmicroRNAs by stem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res,2005,33:e179)的方法检测miR160b基因的表达量，设置3次生物学重复、2次技术重复。所用引物如下所示：

MIR160b ST-RT primer:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGGCAT，MIR160b Forwardprimer CAAATGCCTGGCTCCCTGTA，ST-R:5’GTGCAGGGTCCGAGGT3’。以U6为内参，对应引物为U6-L：5’TACAGATAAGATTAGCATGGCCCC3’，U6-R：5’GGACCATTTCTCGATTTGTACGTG3’。反转录采用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒，体系为5.3μl：20ng/μlRNA模板2μl，2×TS Reaction Mix 2.5μl，Trans Enzyme 0.25μl，MIR160b ST-RT primer/U6-R 0.25μl，DEPC 0.3μl。于ABI 9700上进行反应，程序为：16℃15min，42℃50min，72℃15min。在上述反转录产物中直接进行real-time PCR，real-time PCR采用SYBR Premix ExTaq(Perfect Real Time)试剂盒，反应体系为25.3μl：反转录产物5.3μl，SYBR Premix ExTaq 12.5μl，ROX Reference DyeⅡ0.5μl，MIR160b Forward/U6-L 1μl，ST-R/U6-R 1μl，ddH₂O 7μl。于ABI 7500上进行反应，程序为：95℃10s；95℃5s，60℃34s，共反应40个循环。结果如图1所示，在粳稻品种中花11号中，miR160b在幼穗中的表达量最高，其次是侧芽，在叶中的表达量最低。

实施例3 水稻miR160b基因超量表达载体的构建及转基因植株的获得

1.水稻miR160b基因超表达载体的构建

所用载体是本申请人所在的华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建的pU1301(见图8)。pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(Sun等，2004，Xa26,a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice,encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37:517-527)基础上改造的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的农杆菌介导的遗传转化载体。pCAMBIA1301载体由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of MolecularBiology to International Agriculture)惠赠。采用PCR方法，直接从水稻基因组上对miR160b茎环结构序列进行扩增，如用引物如下

miR160b-L 5'AGAGGTACCTCCGGTCATGGATATGGATAG(KpnI)

miR160b-R 5'CAAGGATCCGGCACAATATGATGGGTGCT(BamHI)

PCR反应体系的总体积为20μl，水稻基因组DNA模板1μl(约50ng)、10×PCR Buffer2μl，2mmol/L dNTP1.5μl，10μm引物各0.3μl，rTaq(购自宝生物工程大连有限公司)0.3μl，dd H₂O 14.6μl。反应程序为：94℃5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min、35cycles，72℃5min，扩增10管，收集PCR产物于1.5ml离心管纯化，加等体积24：1氯仿异戊醇，轻摇5分钟，12000rpm离心15分钟，吸上清，加2倍体积95％乙醇，1/10体积3M醋酸钠(PH5.2)，-20℃放置30分钟，12000rpm离心20分钟，弃上清，加500μl 75％乙醇放置5min，12000rpm离心5分钟，弃上清，晾干，加75μl ddH₂O溶解。把纯化的PCR产物以及pU1301载体酶切，体系：总体积100μl，PCR产物或载体质粒75μl，限制性内切酶BamHI 30U,限制性内切酶KpnI30U,10×KBuffer 5μl，ddH₂O 16μl，37℃酶切4小时。纯化酶切产物，方法同上，最后加10μl ddH₂O溶解。连接反应：10μl PCR产物全部用于连接反应，载体0.5μl，2U T4Ligase，5×LigaseBuffer 3μl，总15μl体积，连接24小时。取1μl连接产物，电压18000V，电转到大肠杆菌DH10β(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，加800μl LB培养基，复苏45分钟，取200μl涂于含卡那霉素的LA平板，37℃，培养过夜。挑单克隆，扩大培养抽质粒，酶切验证，酶切方法同上。挑阳性克隆，把构建好的载体电转化农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(购自MBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)抽质粒，PCR验证，取750μl含构建好载体的农杆菌菌液加等体积的50％甘油混匀，-70℃保存。将含有水稻miR160b基因超量表达的载体pU1301-miR160b(见图10)的农杆菌菌株命名为EHA105-pU1301-miR160b。

2.遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA，1994，Plant J,6:271-282)将超量表达菌株EHA105-pU1301-miR160b导入水稻粳稻品种中花11号愈伤中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗及移栽大田得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化试剂及配方参见申请人的发明专利申请公开说明书，公开号：CN1995346，专利名称：水稻木质素合成基因FC1及应用，申请号：200610018105.5)。

3.转基因植株拷贝数检测

将超量表达菌株EHA105-pU1301-miR160b导入水稻粳稻品种中花11号的愈伤中，共获得转化苗40株，利用Southern杂交(具体操作参考：Wu等，Development of enhancertrap lines for functional analysis of the rice genome.2003,Plant J,35:418-427)分析了这些超表达转基因植株的拷贝数。结果如图2所示，在获得的40株转基因植株中，阳性率为90％，单拷贝植株共有10株。选取4-7号单拷贝植株分离后代为后续研究材料。

实施例4 超量表达miR160b转基因植株的表型分析

通过遗传转化获得40株转基因植株，并且利用southern杂交的方法确定单拷贝植株4-7,对超量表达miR160b单拷贝转基因后代进行表型考察，发现超量表达miR160b转基因阳性使植株从苗期到成熟期都表现出分蘖角度增大的突变表型，而且成熟期更加明显。分别对30株miR160b超表达阴性对照植株(WT)和阳性植株(Ubi::miR160b)植株的分蘖角度、有效分蘖数以及结实率进行统计分析。本发明的分蘖角度定义为水稻成熟期主茎与最边缘有效分蘖数之间的夹角。结果如图3所示，与超表达阴性植株(WT)相比，超表达阳性植株的分蘖角度从22.0°±5.3增加至37.9°±6.2，有效分蘖数从14.2±5.5减少到9.2±2.7，结实率从75.11％±0.1降低到35.99％±0.05，在图3的各图中的左边为miR160b超表达阴性植株(以WT标记)，在图3的各图中的右边为miR160b超表达阳性植株(以Ubi::miR160b标记)。

实施例5 超表达miR160b转基因植株中基因表达分析

为了验证超量表达miR160b转基因阳性植株中成熟miR160b的表达量是否得到提高，我们分别抽提处于分蘖旺盛期的超表达miR160b转基因阳性和阴性植株的根(R)、茎(C)、叶(L)、叶鞘(LS)、侧芽(B)、幼穗(P)这六个组织部位的RNA样品，通过采用与实施例2相同的方法检测miR160b的表达量，设置3次生物学重复、2次技术重复。之后我们用同样的RNA样品，反转录成cDNA，采用QRT-PCR检测OsARF13、OsARF18和OsARF22这三个靶基因的表达量(靶基因的QRT-PCR引物序列见表2)。具体步骤如下：1.利用TransZol(北京全式金生物技术有限公司)抽提RNA样品，具体操作步骤参见TransZol说明书。2.反转录采用M-MLV反转录试剂盒(购自invitrogen公司)，具体步骤如下：(1)将下列体系置于37℃水浴15min：toal RNA5μg,10×DNase buffer 1μl,DNase I 1μl,Add DEPC Water to 10μl；(2)向体系中加入1μl 25mM EDTA,室温2min；(3)65℃水浴5min，迅速置于冰上5min；(4)加入1μl oli(dT),65℃水浴10min，迅速置于冰上5min；(5)在上述处理好的RNA样品中加入下列体系：5×Firststrand buffer(购自promega公司)4μl,0.1M DTT 1μl,10mM dNTP 1μl,RRI 1μl,DEPCWater 1μl,在37℃预热2min；(6)向预热好的体系中加入1μl M-MLV(200U/μl)，小心混匀后置于37℃反应50min；(7)70℃灭活15min，-20℃保存。3.定量RT-PCR采用384孔PCR板在ViiA7上进行，使用2-△CT相对定量的方法进行表达量的比较。10μl反应体系包含：3μl反转录产物，5μlFastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(购自罗氏诊断产品有限公司),左右引物各0.25μl,Water 1.5μl。反应参数设置如下：95℃/10min；95℃/15sec，60℃/60sec，40cycles。结果如图4所示，成熟miR160b在超表达阳性植株6个组织中的表达量与超表达阴性植株相比都有不同程度的升高，由此可知水稻miR160b基因超表达载体(该载体的构建方法见实施例3中的详细说明)确实提高了成熟miR160b在植株体内的表达水平，而这3个靶基因的表达量在超表达阳性植株6个组织比超表达阴性植株6个组织中都有不同程度的降低，证实了miR160b对靶基因的表达具有抑制作用。

实施例6 miR160b基因的功能分析

1..RLM--5’RACE分析靶基因的剪切位点

通过生物信息预测和文献报道认为miR160的靶基因属于水稻ARF家族。microRNA的靶基因被miRNA-RISC切断后可以稳定存在一段时间，因此可以通过RACR的方法来分析miRNA-RISC切开RNA分子的位置。于是申请人选取了ARF家族中的3个基因(OsARF13、OsARF18和OsARF22)，采用RLM-5’RACE技术来检测这3个基因被成熟miR160b剪切的位置，设计的3个靶基因的引物，如下所示：

GeneRacer^TM5’Primer:CGACTGGAGCACGAGGACACTGA

GeneRacer^TM5’Nested Primer:GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA

OsARF13-RACE:AACACCACATCCCGTCAAACTGCCG

OsARF13-RACE-Nested：CATCATCTACACCCTCTGGAACCTG

OsARF18-RACE:CCAGCCGCATCACGGTAGAAAACA

OsARF18-RACE-Nested：GTGGTGCCATTCTGATTGCTTCTC

OsARF22-RACE:GAACTATCACGCCTGCTCAACTAAG

OsARF22-RACE-Nested：CGTATGACCCAAAGACAGACAAATC

miRNA靶基因剪切位点使用GeneRacer^TM试剂盒(购自invitrogen公司)，具体步骤如下：

1、连接RNA oligo：(1)在含有0.25μg GeneRacer^TMRNA oligo的离心管中加5μg幼穗的总RNA，用枪上下吸打混匀，悬浮RNA oligo；(2)65℃干浴5min，释放RNA的二级结构；(3)冰上放置2min，短暂离心；(4)向离心管中加入下列反应体系：10×Ligase Buffer 1μl，10mM ATP 1μl，RNase OUT^TM(40U/μl)1μl，T4RNA Ligase(5U/μl)，轻轻吸打混匀，短暂离心；(5)37℃干浴2h(6)短暂离心之后放置冰上。

2、纯化和沉淀RNA：(1)加90μlDEPC水，100μl苯酚：氯仿，颠倒混匀30s；(2)室温12000rpm离心5min(3)吸取上清到新离心管中；(4)加入2μl10mg/ml贻贝糖原10μl，3M醋酸钠(pH5.2)混匀继续加入220μl 95％乙醇混匀；(5)冰上放置10min；(6)4℃12000rpm离心20min沉淀RNA；(7)用枪头吸除上清，注意沉淀的方向；(8)加入500μl 70％乙醇，颠倒混匀；(9)4℃，12000rpm离心2min；(10)用枪头去除上清，短暂离心后除去剩下的乙醇；(11)超净工作台吹干1-2min；(12)加10μl DEPC水。

3、反转录(使用SuperScript^TMIII RT reaction)：(1)向10μl RNA样品中加入下列体系：primer 1μl，dNTP mix 1μl，sterile distilled water 1μl；(2)65℃干浴5min，释放RNA二级结构；(3)冰上放置1min，短暂离心；(4)在以上离心管中继续加入序列反应体系：5×First Strand Buffer 4μl，0.1M DTT 1μl，RNaseOUT^TM(40U/μl)1μl,，SuperScript^TMIIIRT(200u/μl)1μl；(5)用枪上下吸打混匀，短暂离心；(6)50℃干浴1h；(7)70℃失活15min，冰上放置2min，短暂离心；(8)加1μl RNaseH(2U)(9)37℃反应20min；(10)短暂离心，-20℃保存。

4、第一轮PCR，反应体系：取上述步骤获得的cDNA 2μl，GeneRacer^TM5’Primer 1μl，Gene specific primer1μl，10mM dNTP 1μl，2×GC buffer I 25μl，LA Taq 0.5μl，补灭菌超纯水至50μl。反应程序：94℃3min；94℃30s，68℃2min重复循环5次；94℃30s，65℃30s，68℃2min重复循环5次；94℃30s，60℃30s，68℃2min重复循环10次；94℃30s，55℃30s，68℃2min重复循环15次；68℃7min；25℃1min。

第二轮PCR，反应体系：第一轮PCR产物2μl，GeneRACE nest5’Primer 1μl，Genespecific nest primer1μl，10mM dNTP 1μl，2×GC buffer I 25μl，LA Taq 0.5μl，补灭菌超纯水至50μl。反应程序同第一轮PCR。将第二轮的PCR产物挖胶回收后克隆于T载体pEASY-T1cloning vector(购自北京全式金生物技术有限公司，该载体的图谱见图12)上，然后测序验证。结果如图5所示，OsARF13、OsARF18和OsARF22这3个基因被miR160-RISC剪切的位点位于miR160的第10和第11个核苷酸的位置。因此申请人认为OsARF13、OsARF18和OsARF22这3个基因是miR160b的靶基因。

2、表达Ubi::MIM160b使Ubi::miR160b的突变表型恢复

申请人之前的研究发现，增加miR160b基因的表达量，可以使植株的分蘖角度增加，于是，我们想知道如果抑制miR160b基因的表达是否会出现与miR160b基因的超量表达突变表型相反的表型。本申请利用德国马普生物发育研究所Detlef Weigel教授提的供质粒MT375(见图9)上携带的水稻天然target mimic基因OsIPS1(OsIPS1基因转录的mRNA上带有24nt与水稻miRNA osa-MIR399互补的序列)，参考target mimicry技术(Franco-Zorrilla等，Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNAactivity.Nat Genet,2007,39:1033-1037)设计MIM160b的引物，即在成熟miR160b的第10和第11个碱基之间增加3个碱基的突出环，使得成熟miR160b不能与靶基因结合，引物序列如下所示：

MIM-III：CCCTGCCTTCATACGCTATT

MIM-IV：ATTGCCAAATGTTTGAACGA

MIM160b–I：ATTGCCTGGCTCTAGACTGTATGCCACCTTAGTAGAGGTAAAAGTC

MIM160b–II：GGTGGCATACAGTCTAGAGCCAGGCAATTATTCGGTGGATGTCTGT

之后申请人采用重叠延伸PCR的方法将MT375质粒上OsIPS1中与osa-MIR399互补的序列替换为MIM160b互补的序列，形成人工target mimic基因。具体步骤如下：使用引物组合MIM160b-I+MIM-III和MIM160b-II+MIM-IV进行第一轮PCR反应，反应体系为：5×phusion HF Buffer 10μl,10mM dNTPs 1μl,50ng/μl MT375质粒1μl，10μM左、右引物各0.3μl，phusion DNA polymerase(finnzymes)0.5μl，补灭菌超纯水至20μl。反应条件为：98℃30s；98℃ 10s，58℃ 30s，72℃ 15s重复循环35次；72℃ 7min，25℃ 10s。将PCR产物于0.8％琼脂糖胶电泳，挖胶后用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)回收PCR产物，最后溶于20μl超纯水。用回收的第一轮PCR的两种PCR产物进行第二轮PCR。反应体系为：10x ExTaqE Buffer 2μl,10mM dNTPs 0.3μl，两种第一轮PCR产物各0.5μl，10μM的引物MIMIII和MIMIV各0.3μl，Ex Taq(宝生物工程大连有限公司)0.2μl，补灭菌超纯水至20μl。反应条件为：94℃ 5min；94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 1min重复循环30次；72℃7min，25℃ 10s。最终PCR产物克隆于T载体pEASY-T1cloning vector(北京全式金生物技术有限公司)上，然后测序验证。利用BamH I和Kpn I酶切后连接到pU2301(由pU1301空载体将载体上的潮霉素标记改为G418标记改造而来)载体上，构建得到pU2301-MIM160b载体(即Ubi::MIM160b，这两个载体命名不一样，实质上是同一个载体，见图11)。将构建好的pU2301-MIM160b载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105，分别转化水稻粳稻品种中花11(即ZH11)和miR160b基因超表达阳性。结果分别得到36和35株转基因植株，转化率分别为80.6％和77.8％，但是Ubi::MIM160b转中花11(ZH11)阳性植株中没有发现株型上的改变，而Ubi::MIM160b转Ubi::miR160b的阳性植株中出现了突变表型恢复的植株，利用QRT-PCR检测OsARF13、OsARF18和OsARF22三个靶基因在野生型(WT)ZH1,Ubi::MIM160b、Ubi::miR160b、Ubi::MIM160b/Ubi::miR160b中的表达量发现，Ubi::MIM160b中靶基因的表达量比WT高，Ubi::MIM160b/Ubi::miR160b中靶基因的表达量比WT低，但是比Ubi::miR160b高(如图6所示)。根据该结果可知MIM160b抑制了miR160b基因的表达，最终导致靶基因的表达量上升，从而使miR160b超表达的突变表型得到恢复。

2..分蘖角度以及生长素相关基因的表达量检测

本申请的研究结果显示超量表达miR160b基因表现出分蘖角度增大的突变表型，而且miR160b的靶基因属于水稻ARF家族，ARF是植物中一类生长素响应因子，它们通过结合在特定基因启动子区域的AuxRE元件(TGTCTC)上，激活或者抑制生长素应答基因的表达。因此为了进一步了解水稻mi160b和分蘖角度以及生长素的关系，本申请选择了一些调控分蘖角度的典型基因(例如LAZY1(LOC_Os11g29840),LPA1(LOC_Os03g13400)，TAC1(LOC_Os09g35980),以及与生长素相关的基因(例如GH3.1(LOC_Os01g57610)，GH3.4(LOC_Os05g42150，GH3.8(LOC_Os07g40290)，PIN1(LOC_Os02g50960)，IAA4(LOC_Os01g08320)，IAA21(LOC_Os06g22870))。采用QRT-PCR检测这些基因在超量表达miR160b阳性和阴性植株侧芽中的表达量(设计的定量RT-PCR引物序列见表2)。

表2 本发明中使用的OsARF、分蘖角度以及生长素相关基因的QRT-PCR引物

QRT-PCR实验的具体步骤参照实施例5的步骤进行，结果如图7所示。试验表明，分蘖角度基因LAZY1在超表达miR160b阳性植株中的表达量低于阴性植株，而LPA1和TAC1基因的表达量在超表达miR160b阳性和阴性植株中变化不明显。GH3.4、IAA4和IAA21基因的表达量与阴性植株相比明显下降，其他基因变化不明显。由此可知，提高miR160b基因的表达量改变了分蘖角度以及生长素相关基因的表达，说明miR160b介导的OsARF的抑制可能参与了生长素的响应过程以及水稻分蘖角度的调控。

Claims (4)

1.miR160b基因茎环结构DNA序列在调控水稻分蘖角度中的应用，其特征在于：所述的miR160b基因茎环结构DNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.miR160b基因茎环结构DNA序列在调控水稻分蘖角度中的应用，其特征在于：转录剪切后形成的成熟的核心序列如SEQ ID NO：3所示。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：通过超量表达或抑制表达miR160b基因，改变miR160b基因对水稻株型的调控模式。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的水稻株型包括分蘖角度。