CN105934514A

CN105934514A - 角质酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

Info

Publication number: CN105934514A
Application number: CN201480065727.6A
Authority: CN
Inventors: 孙婷; L.德马里亚; R.赛基亚; S.梅帕德姆瓦苏
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2016-09-07
Also published as: US9951299B2; EP3080254B1; KR102268532B1; PT3080254T; US20160355759A1; KR20160097252A; EP3080254A4; WO2015085920A1; EP3080254A1; BR112016013511A2

Abstract

具有亲本角质酶的角质酶活性的变体，这些变体在对应于SEQ ID NO:2的位置181、182、115、161、1、2、43、55、79、或5的一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变，其中该改变是针对位置181、115、161、43、55、79、和5的取代，以及针对位置1、2和182的缺失，并且其中变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％但是小于100％的序列一致性。编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及用于获得这些变体的方法和产生这些变体的方法。包括变体的组合物，以及用于使用变体的方法。

Description

角质酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

对序列表的引用

本申请含有计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及角质酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。

相关技术说明

聚(对苯二甲酸乙二酯)(缩写为PET)纤维占纺织工业所应用的聚酯的主要部分。这些纤维是由对苯二甲酸和乙二醇的缩聚并从熔化物拉伸纤维产生。

聚酯具有一定的核心优势，包括高强度、柔软的手感、拉伸阻力、耐沾污性、可机洗性能、抗皱性以及抗磨损性。然而，聚酯就其疏水性、起球、静电、可染性、作为粘附介质的钝性表面即软化或湿润度增强化合物、缺乏透气性以及不理想的发光或光泽外观不是那么最佳。

因为其强度，使聚酯织物和/或衣服易经受球粒形成，并且施用至聚酯短纤维材料的精加工布的工艺可能最重要的是为起球控制所设计的那些。所有短纤维材料趋于当在洗涤和穿着的过程中经受轻微磨损时在布表面形成具有缠绕纤维的小球或“球粒”。如果该织物包含相当大的比例的对弯曲磨损具有高耐受性的纤维时，这些球粒将以不足以产生不愉快的手感和外观的数目保留在布的表面。

聚酯的另一个问题是，在合成PET过程中，形成聚(对苯二甲酸乙二酯)的环状或线性低聚物，例如对苯二甲酸-双-2-苯甲酰氧基-乙酯(BETEB)和/或环状三(对苯二甲酸乙二酯)。这些低聚物部分地沉积在机械上并且部分地留在这些纤维之上/之内。低聚物趋于为织物给出浅灰色外观。这是归因于低聚物在该织物表面的沉积，具体地坦率地说该沉积是在高温湿加工像高温染色之后。这些低聚物可通过严格的碱处理去除，其导致纤维材料的显著损失。这些低聚物的有机提取是一种技术可能性，但不是工业上可行的。

除其他之外，工业上已通过应用角质酶对改进聚酯的特征作出了很大努力。

已知角质酶来自不同的真菌，例如一种丝状真菌角质酶，例如产自于腐质霉属或镰孢属的菌株，特别是特异腐质霉例如像特异腐质霉菌株DSM1800(US 5827719)、或豌豆腐皮镰孢。已经披露了用一种对苯二甲酸二乙酯水解酶(ETE水解酶)和/或一种乙二醇二苄基酯水解酶(BEB水解酶)降低聚酯织物和/或衣服的起球倾向的方法(WO 99/001604)、包括用一种酯酶酶处理聚酯来修饰聚酯的方法(WO 2001/34899)、以及包括使该环状低聚物经受一种或多种羧酸酯水解酶的作用的聚(对苯二甲酸乙二酯)的环状低聚物的酶水解(WO 97/27237)。

角质酶变体已被描述于例如WO 0192502中，其中已经披露了将特异腐质霉变体用于处理聚酯纺织品。

然而，持续地对酶促聚酯织物和/或衣服处理的改进的益处存在需要，包括增强这些酶对它们的底物的效率。因此鉴定此类具有改进特性的酶用于在处理织物的方法中使用是理想的。

发明概述

本发明涉及具有亲本角质酶的角质酶活性的变体，这些变体在对应于SEQ ID NO:2的位置181、182、115、161、1、2、43、55、79、或5的一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变，其中该改变是针对位置181、115、161、43、55、79、和5的取代，并且其中变体与SEQ IDNO:2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但是小于100％的序列一致性。

本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及获得这些变体的方法和产生这些变体的方法。

本发明此外涉及包括该变体的组合物，并且涉及包括使用该变体修饰聚酯的方法；包括使用该变体水解聚(对苯二甲酸乙二酯)的环状低聚物的方法；以及使用该变体降低包括聚酯或由聚酯组成的织物的起球倾向的方法。

定义

角质酶：术语“角质酶”意指具有角质酶活性(EC3.1.1.74)的一种脂肪分解酶，该酶催化以下反应：为了本发明的目的，如实例3中所述，角质酶活性是使用低聚物对苯二甲酸-双-2-苯甲酰氧基-乙酯(BETEB)作为底物确定的。BETEB是PET合成期间的一种副产物，并且通常在纺织品制造期间保留在该织物或衣服中。BETEB是通过例如对苯二甲酸、苯甲酸和乙二醇的缩合产生的，其与PET具有相同的苯甲酰氧基-乙酯单元。

在一个方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的角质酶活性的至少20％、例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。

在一些实施例中，该角质酶可以是包括SEQ ID NO:2的一个或多个(或若干个)氨基酸取代和/或缺失的变体。优选地，SEQ ID NO:2的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是1-20，例如1-10或1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。

片段：术语“片段”意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如若干个)氨基酸的一种多肽。其中该片段具有角质酶活性。在一方面，一个片段由以下项组成或包括以下项：至少172个氨基酸残基(例如，对应于SEQ ID NO:2的氨基酸17至188)。在一方面，片段包括SEQ ID NO:2的氨基酸数目的至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但是小于100％。在一方面，片段包括SEQ ID NO:2的氨基酸数目的至少172个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:2的氨基酸17至188)并且至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但是小于100％。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

改进的特性：术语“改进的特性”意指与变体相关的与亲本相比得到改进的特征。此类改进的特性包括但不限于比活性、底物裂解、底物特异性、热稳定性、以及减少的起球倾向。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸1至194，SEQ ID NO:2的氨基酸-35至-13是信号肽，并且SEQ ID NO:2的氨基酸-12至-1是前肽。本领域已知，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有角质酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸106至687。SEQ IDNO:1的核苷酸1至69编码信号肽。SEQ ID NO:1的核苷酸70至105编码前肽。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。

亲本或亲本角质酶：术语“亲本”或“亲本角质酶”意指一种角质酶，对该角质酶进行改变以产生本发明的酶变体。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。

聚酯纺织品：如在此使用的“聚酯”意指一种包含链内酯基并且源自一种二酸与一种二醇的缩合或源自羟基酸的聚合的线性聚合分子。本发明适用于脂肪族的和芳香族的聚酯两者。然而，特别优选的是芳香族的聚酯物品，其被用于产生纤维和树脂，并且包括合成地产生的长链聚合物，该长链聚合物包括按重量计至少85％、优选至少90％并且最优选至少95％的一种取代的芳香族羧酸的一种酯，例如取代的对苯二甲酸或对位取代的羟苯酸酯。其他有用的聚酯物品包括由本体聚合物、纱线、织物、薄膜、树脂以及粉末制成的那些。工业使用中的这些基本的聚酯包括聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、四亚甲基对苯二甲酸酯(PTMT)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)和聚萘二甲酸乙二醇酯(polyethylenenaphthalate)(PEN)、聚环己烷二亚甲基对苯二甲酸酯(CHDMT)、聚(乙烯-4-氧基苯甲酸酯)A-Tell、聚乙交酯、PHBA以及2GN。然而，PET是产生的最常见的线性聚合物并且占现今工业中采用的聚酯的多数。

此处使用的聚酯纺织品意指包括含有聚酯的纤维、纱线、织物以及衣服。该聚酯纱线或织物或衣服可以是以下的任何纱线或织物或衣服：其由纯的聚(对苯二甲酸乙二酯)制成，或其由聚(对苯二甲酸乙二酯)纤维和常规用于制造纺织品的任何其他材料的共混物制成。

在一方面，聚酯织物是一种织物共混合物，其包括至少5％(w/w)的聚酯，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的聚酯。在一方面，本发明的工艺应用于基本上由聚(对苯二甲酸乙二酯)聚酯材料，即纯的聚(对苯二甲酸乙二酯)聚酯材料组成的织物或衣服。

序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有角质酶活性的片段。在一方面，一个子序列由以下项组成或包括以下项：至少516个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸154至669)。在一方面，一个子序列包括SEQ ID NO:1的核苷酸数目的至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但是小于100％。在一方面，片段包括SEQ ID NO:1的核苷酸数目的至少516个核苷酸(例如SEQ ID NO:1的核苷酸154至669)并且至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但是小于100％。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有角质酶活性的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸替代；缺失意指占据一个位置的氨基酸的去除；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的角质酶活性的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

野生型角质酶：术语“野生型”角质酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的角质酶。

变体命名惯例

出于本发明的目的，将SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽用以确定另一种角质酶中的对应的氨基酸残基。将另一种角质酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志48:443-453)来确定与SEQ IDNO:2中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

另一种角质酶中对应的氨基酸残基的鉴别可以通过使用若干计算机程序使用其对应的缺省参数比对多个多肽序列来确定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多序列比较；3.5版或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcids Research)32:1792-1797)；MAFFT(6.857版或更新版本；加藤(Katoh)和库玛(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和朝都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)537:_39-64；加藤和朝都，2010，生物信息学26:_1899-1900)；以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83版或更新版本；汤普森(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)。

当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(ProteinEngineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。

在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。

缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、^*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195^*”或者“G195^*”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195^*+Ser411^*”或“G195^*+S411^*”。

不同的改变。可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”命名了以下变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

本发明详细说明

变体

本发明提供具有亲本角质酶的角质酶活性的变体，这些变体在对应于SEQ ID NO:2的位置181、182、115、161、1、2、43、55、79、或5的一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变，其中该改变是针对位置181、115、161、43、55、79、和5的取代，并且其中变体与SEQ IDNO:2的成熟多肽具有至少75％但是小于100％的序列一致性。

在一方面，该变体与亲本角质酶的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

在一方面，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽或SEQ ID NO:2的氨基酸1-194具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

在一方面，本发明的变体中的改变的数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或20个改变。

在另一方面，变体在对应于位置181、182、115、161、1、2、43、55、79和5的一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变。在另一方面，变体在对应于位置181、182、115、161、1、2、43、55、79和5的两个位置处包括改变。在另一方面，变体在对应于位置181、182、115、161、1、2、43、55、79和5中的任何一个的三个位置处包括改变。在另一方面，变体在对应于位置181、182、115、161、1、2、43、55、79和5中的任何一个的四个位置处包括改变。在另一方面，变体在对应于位置181、182、115、161、1、2、43、55、79和5中的任何一个的五个位置处包括改变。在另一方面，变体在对应于位置181、182、115、161、1、2、43、55、79和5中的任何一个的六个位置处包括改变。在另一方面，变体在对应于位置181、182、115、161、1、2、43、55、79和5中的任何一个的七个位置处包括改变。在另一方面，变体在与位置181、182、115、161、1、2、43、55、79和5中的任何一个的八个位置处包括改变。在另一方面，变体在对应于位置181、182、115、161、1、2、43、55、79以及5中的任何一个的九个位置处包括改变。在另一方面，变体在对应于位置181、182、115、161、1、2、43、55、79和5的每个位置处包括改变。

在另一方面，该变体包括在对应于位置181的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置181的位置处的氨基酸被Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Pro取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R181P或由其组成。

在另一方面，该变体在对应于位置182的位置处包括一个缺失或由其组成。在另一方面，在对应于位置182的位置处的氨基酸被缺失。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失G182*或由其组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置115的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置115的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、或Tyr取代，优选被Ile取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代V115I或由其组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置161的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，在对应于位置A161L的位置的氨基酸被Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或者Val取代，优选被Leu取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A161L或由其组成。

在另一方面，该变体在对应于位置1的位置处包括一个缺失或由其组成。在另一方面，在对应于位置1的位置处的氨基酸被缺失。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失Q1*或由其组成。

在另一方面，该变体在对应于位置2的位置处包括一个缺失或由其组成。在另一方面，在对应于位置2的位置处的氨基酸被缺失。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失L2*或由其组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置43的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置43的位置处的氨基酸是被Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Cys取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代A43C或由其组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置55的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置55的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Cys取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I55C或由其组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置79的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置79的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ala取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N79A或由其组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置5的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置5的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Val取代。在另一方面，该变体包括SEQID NO:2的成熟多肽的取代I5V或由其组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置181+182、181+115、181+161、181+1、181+2、181+43、181+55、181+79、181+5、182+115、182+161、182+1、182+2、182+43、182+55、182+79、182+5、115+161、115+1、115+2、115+43、115+55、115+79、115+5、161+1、161+2、161+43、161+55、161+79、161+5、1+2、1+43、1+55、1+79、1+5、2+43、2+55、2+79、2+5、43+55、43+79、43+5、55+79、55+5、79+5的位置处的改变或由其组成，如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置181+182+115、181+182+161、181+182+1、181+182+2、181+182+43、181+182+55、181+182+79、181+182+5、181+115+161、181+115+1、181+115+2、181+115+43、181+115+55、181+115+79、181+115+5、181+161+1、181+161+2、181+161+43、181+161+55、181+161+79、181+161+5、181+1+2、181+1+43、181+1+55、181+1+79、181+1+5、181+2+43、181+2+55、181+2+79、181+2+5、181+43+55、181+43+79、181+43+5、181+55+79、181+55+5、181+79+5、182+115+161、182+115+1、182+115+2、182+115+43、182+115+55、182+115+79、182+115+5、182+161+1、182+161+2、182+161+43、182+161+55、182+161+79、182+161+5、182+1+2、182+1+43、182+1+55、182+1+79、182+1+5、182+2+43、182+2+55、182+2+79、182+2+5、182+43+55、182+43+79、182+43+5、182+55+79、182+55+5、182+79+5、115+161+1、115+161+2、115+161+43、115+161+55、115+161+79、115+161+5、115+1+2、115+1+43、115+1+55、115+1+79、115+1+5、115+2+43、115+2+55、115+2+79、115+2+5、115+43+55、115+43+79、115+43+5、115+55+79、115+55+5、115+79+5、161+1+2、161+1+43、161+1+55、161+1+79、161+1+5、161+2+43、161+2+55、161+2+79、161+2+5、161+43+55、161+43+79、161+43+5、161+55+79、161+55+5、161+79+5、1+2+43、1+2+55、1+2+79、1+2+5、1+43+55、1+43+79、1+43+5、1+55+79、1+55+5、1+79+5、2+43+55、2+43+79、2+43+5、2+55+79、2+55+5、2+79+5、43+55+79、43+55+5、43+79+5、55+79+5的位置处的改变或由其组成，如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置181+182+115+161、181+182+115+1、181+182+115+2、181+182+115+43、181+182+115+55、181+182+115+79、181+182+115+5、181+182+161+1、181+182+161+2、181+182+161+43、181+182+161+55、181+182+161+79、181+182+161+5、181+182+1+2、181+182+1+43、181+182+1+55、181+182+1+79、181+182+1+5、181+182+2+43、181+182+2+55、181+182+2+79、181+182+2+5、181+182+43+55、181+182+43+79、181+182+43+5、181+182+55+79、181+182+55+5、181+182+79+5、181+115+161+1、181+115+161+2、181+115+161+43、181+115+161+55、181+115+161+79、181+115+161+5、181+115+1+2、181+115+1+43、181+115+1+55、181+115+1+79、181+115+1+5、181+115+2+43、181+115+2+55、181+115+2+79、181+115+2+5、181+115+43+55、181+115+43+79、181+115+43+5、181+115+55+79、181+115+55+5、181+115+79+5、181+161+1+2、181+161+1+43、181+161+1+55、181+161+1+79、181+161+1+5、181+161+2+43、181+161+2+55、181+161+2+79、181+161+2+5、181+161+43+55、181+161+43+79、181+161+43+5、181+161+55+79、181+161+55+5、181+161+79+5、181+1+2+43、181+1+2+55、181+1+2+79、181+1+2+5、181+1+43+55、181+1+43+79、181+1+43+5、181+1+55+79、181+1+55+5、181+1+79+5、181+2+43+55、181+2+43+79、181+2+43+5、181+2+55+79、181+2+55+5、181+2+79+5、181+43+55+79、181+43+55+5、181+43+79+5、181+55+79+5、182+115+161+1、182+115+161+2、182+115+161+43、182+115+161+55、182+115+161+79、182+115+161+5、182+115+1+2、182+115+1+43、182+115+1+55、182+115+1+79、182+115+1+5、182+115+2+43、182+115+2+55、182+115+2+79、182+115+2+5、182+115+43+55、182+115+43+79、182+115+43+5、182+115+55+79、182+115+55+5、182+115+79+5、182+161+1+2、182+161+1+43、182+161+1+55、182+161+1+79、182+161+1+5、182+161+2+43、182+161+2+55、182+161+2+79、182+161+2+5、182+161+43+55、182+161+43+79、182+161+43+5、182+161+55+79、182+161+55+5、182+161+79+5、182+1+2+43、182+1+2+55、182+1+2+79、182+1+2+5、182+1+43+55、182+1+43+79、182+1+43+5、182+1+55+79、182+1+55+5、182+1+79+5、182+2+43+55、182+2+43+79、182+2+43+5、182+2+55+79、182+2+55+5、182+2+79+5、182+43+55+79、182+43+55+5、182+43+79+5、182+55+79+5、115+161+1+2、115+161+1+43、115+161+1+55、115+161+1+79、115+161+1+5、115+161+2+43、115+161+2+55、115+161+2+79、115+161+2+5、115+161+43+55、115+161+43+79、115+161+43+5、115+161+55+79、115+161+55+5、115+161+79+5、115+1+2+43、115+1+2+55、115+1+2+79、115+1+2+5、115+1+43+55、115+1+43+79、115+1+43+5、115+1+55+79、115+1+55+5、115+1+79+5、115+2+43+55、115+2+43+79、115+2+43+5、115+2+55+79、115+2+55+5、115+2+79+5、115+43+55+79、115+43+55+5、115+43+79+5、115+55+79+5、161+1+2+43、161+1+2+55、161+1+2+79、161+1+2+5、161+1+43+55、161+1+43+79、161+1+43+5、161+1+55+79、161+1+55+5、161+1+79+5、161+2+43+55、161+2+43+79、161+2+43+5、161+2+55+79、161+2+55+5、161+2+79+5、161+43+55+79、161+43+55+5、161+43+79+5、161+55+79+5、1+2+43+55、1+2+43+79、1+2+43+5、1+2+55+79、1+2+55+5、1+2+79+5、1+43+55+79、1+43+55+5、1+43+79+5、1+55+79+5、2+43+55+79、2+43+55+5、2+43+79+5、2+55+79+5、43+55+79+5的位置处的改变或由其组成，如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置181+182+115+161+1、181+182+115+161+2、181+182+115+161+43、181+182+115+161+55、181+182+115+161+79、181+182+115+161+5、181+182+115+1+2、181+182+115+1+43、181+182+115+1+55、181+182+115+1+79、181+182+115+1+5、181+182+115+2+43、181+182+115+2+55、181+182+115+2+79、181+182+115+2+5、181+182+115+43+55、181+182+115+43+79、181+182+115+43+5、181+182+115+55+79、181+182+115+55+5、181+182+115+79+5、181+182+161+1+2、181+182+161+1+43、181+182+161+1+55、181+182+161+1+79、181+182+161+1+5、181+182+161+2+43、181+182+161+2+55、181+182+161+2+79、181+182+161+2+5、181+182+161+43+55、181+182+161+43+79、181+182+161+43+5、181+182+161+55+79、181+182+161+55+5、181+182+161+79+5、181+182+1+2+43、181+182+1+2+55、181+182+1+2+79、181+182+1+2+5、181+182+1+43+55、181+182+1+43+79、181+182+1+43+5、181+182+1+55+79、181+182+1+55+5、181+182+1+79+5、181+182+2+43+55、181+182+2+43+79、181+182+2+43+5、181+182+2+55+79、181+182+2+55+5、181+182+2+79+5、181+182+43+55+79、181+182+43+55+5、181+182+43+79+5、181+182+55+79+5、181+115+161+1+2、181+115+161+1+43、181+115+161+1+55、181+115+161+1+79、181+115+161+1+5、181+115+161+2+43、181+115+161+2+55、181+115+161+2+79、181+115+161+2+5、181+115+161+43+55、181+115+161+43+79、181+115+161+43+5、181+115+161+55+79、181+115+161+55+5、181+115+161+79+5、181+115+1+2+43、181+115+1+2+55、181+115+1+2+79、181+115+1+2+5、181+115+1+43+55、181+115+1+43+79、181+115+1+43+5、181+115+1+55+79、181+115+1+55+5、181+115+1+79+5、181+115+2+43+55、181+115+2+43+79、181+115+2+43+5、181+115+2+55+79、181+115+2+55+5、181+115+2+79+5、181+115+43+55+79、181+115+43+55+5、181+115+43+79+5、181+115+55+79+5、181+161+1+2+43、181+161+1+2+55、181+161+1+2+79、181+161+1+2+5、181+161+1+43+55、181+161+1+43+79、181+161+1+43+5、181+161+1+55+79、181+161+1+55+5、181+161+1+79+5、181+161+2+43+55、181+161+2+43+79、181+161+2+43+5、181+161+2+55+79、181+161+2+55+5、181+161+2+79+5、181+161+43+55+79、181+161+43+55+5、181+161+43+79+5、181+161+55+79+5、181+1+2+43+55、181+1+2+43+79、181+1+2+43+5、181+1+2+55+79、181+1+2+55+5、181+1+2+79+5、181+1+43+55+79、181+1+43+55+5、181+1+43+79+5、181+1+55+79+5、181+2+43+55+79、181+2+43+55+5、181+2+43+79+5、181+2+55+79+5、181+43+55+79+5、182+115+161+1+2、182+115+161+1+43、182+115+161+1+55、182+115+161+1+79、182+115+161+1+5、182+115+161+2+43、182+115+161+2+55、182+115+161+2+79、182+115+161+2+5、182+115+161+43+55、182+115+161+43+79、182+115+161+43+5、182+115+161+55+79、182+115+161+55+5、182+115+161+79+5、182+115+1+2+43、182+115+1+2+55、182+115+1+2+79、182+115+1+2+5、182+115+1+43+55、182+115+1+43+79、182+115+1+43+5、182+115+1+55+79、182+115+1+55+5、182+115+1+79+5、182+115+2+43+55、182+115+2+43+79、182+115+2+43+5、182+115+2+55+79、182+115+2+55+5、182+115+2+79+5、182+115+43+55+79、182+115+43+55+5、182+115+43+79+5、182+115+55+79+5、182+161+1+2+43、182+161+1+2+55、182+161+1+2+79、182+161+1+2+5、182+161+1+43+55、182+161+1+43+79、182+161+1+43+5、182+161+1+55+79、182+161+1+55+50、182+161+1+79+5、182+161+2+43+55、182+161+2+43+79、182+161+2+43+5、182+161+2+55+79、182+161+2+55+5、182+161+2+79+5、182+161+43+55+79、182+161+43+55+5、182+161+43+79+5、182+161+55+79+5、182+1+2+43+55、182+1+2+43+79、182+1+2+43+5、182+1+2+55+79、182+1+2+55+5、182+1+2+79+5、182+1+43+55+79、182+1+43+55+5、182+1+43+79+5、182+1+55+79+5、182+2+43+55+79、182+2+43+55+5、182+2+43+79+5、182+2+55+79+5、182+43+55+79+5、115+161+1+2+43、115+161+1+2+55、115+161+1+2+79、115+161+1+2+5、115+161+1+43+55、115+161+1+43+79、115+161+1+43+5、115+161+1+55+79、115+161+1+55+5、115+161+1+79+5、115+161+2+43+55、115+161+2+43+79、115+161+2+43+5、115+161+2+55+79、115+161+2+55+5、115+161+2+79+5、115+161+43+55+79、115+161+43+55+5、115+161+43+79+5、115+161+55+79+5、115+1+2+43+55、115+1+2+43+79、115+1+2+43+5、115+1+2+55+79、115+1+2+55+5、115+1+2+79+5、115+1+43+55+79、115+1+43+55+5、115+1+43+79+5、115+1+55+79+5、115+2+43+55+79、115+2+43+55+5、115+2+43+79+5、115+2+55+79+5、115+43+55+79+5、161+1+2+43+55、161+1+2+43+79、161+1+2+43+5、161+1+2+55+79、161+1+2+55+5、161+1+2+79+5、161+1+43+55+79、161+1+43+55+5、161+1+43+79+5、161+1+55+79+5、161+2+43+55+79、161+2+43+55+5、161+2+43+79+5、161+2+55+79+5、161+43+55+79+5、1+2+43+55+79、1+2+43+55+5、1+2+43+79+5、1+2+55+79+5、1+43+55+79+5、2+43+55+79+5的位置处的改变或由其组成，如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置181+182+115+161+1+2、181+182+115+161+1+43、181+182+115+161+1+55、181+182+115+161+1+79、181+182+115+161+1+5、181+182+115+161+2+43、181+182+115+161+2+55、181+182+115+161+2+79、181+182+115+161+2+5、181+182+115+161+43+55、181+182+115+161+43+79、181+182+115+161+43+5、181+182+115+161+55+79、181+182+115+161+55+5、181+182+115+161+79+5、181+182+115+1+2+43、181+182+115+1+2+55、181+182+115+1+2+79、181+182+115+1+2+5、181+182+115+1+43+55、181+182+115+1+43+79、181+182+115+1+43+5、181+182+115+1+55+79、181+182+115+1+55+5、181+182+115+1+79+5、181+182+115+2+43+55、181+182+115+2+43+79、181+182+115+2+43+5、181+182+115+2+55+79、181+182+115+2+55+5、181+182+115+2+79+5、181+182+115+43+55+79、181+182+115+43+55+5、181+182+115+43+79+5、181+182+115+55+79+5、181+182+161+1+2+43、181+182+161+1+2+55、181+182+161+1+2+79、181+182+161+1+2+5、181+182+161+1+43+55、181+182+161+1+43+79、181+182+161+1+43+5、181+182+161+1+55+79、181+182+161+1+55+5、181+182+161+1+79+5、181+182+161+2+43+55、181+182+161+2+43+79、181+182+161+2+43+5、181+182+161+2+55+79、181+182+161+2+55+5、181+182+161+2+79+5、181+182+161+43+55+79、181+182+161+43+55+5、181+182+161+43+79+5、181+182+161+55+79+5、181+182+1+2+43+55、181+182+1+2+43+79、181+182+1+2+43+5、181+182+1+2+55+79、181+182+1+2+55+5、181+182+1+2+79+5、181+182+1+43+55+79、181+182+1+43+55+5、181+182+1+43+79+5、181+182+1+55+79+5、181+182+2+43+55+79、181+182+2+43+55+5、181+182+2+43+79+5、181+182+2+55+79+5、181+182+43+55+79+5、181+115+161+1+2+43、181+115+161+1+2+55、181+115+161+1+2+79、181+115+161+1+2+5、181+115+161+1+43+55、181+115+161+1+43+79、181+115+161+1+43+5、181+115+161+1+55+79、181+115+161+1+55+5、181+115+161+1+79+5、181+115+161+2+43+55、181+115+161+2+43+79、181+115+161+2+43+5、181+115+161+2+55+79、181+115+161+2+55+5、181+115+161+2+79+5、181+115+161+43+55+79、181+115+161+43+55+5、181+115+161+43+79+5、181+115+161+55+79+5、181+115+1+2+43+55、181+115+1+2+43+79、181+115+1+2+43+5、181+115+1+2+55+79、181+115+1+2+55+5、181+115+1+2+79+5、181+115+1+43+55+79、181+115+1+43+55+5、181+115+1+43+79+5、181+115+1+55+79+5、181+115+2+43+55+79、181+115+2+43+55+5、181+115+2+43+79+5、181+115+2+55+79+5、181+115+43+55+79+5、181+161+1+2+43+55、181+161+1+2+43+79、181+161+1+2+43+5、181+161+1+2+55+79、181+161+1+2+55+5、181+161+1+2+79+5、181+161+1+43+55+79、181+161+1+43+55+5、181+161+1+43+79+5、181+161+1+55+79+5、181+161+2+43+55+79、181+161+2+43+55+5、181+161+2+43+79+5、181+161+2+55+79+5、181+161+43+55+79+5、181+1+2+43+55+79、181+1+2+43+55+5、181+1+2+43+79+5、181+1+2+55+79+5、181+1+43+55+79+5、181+2+43+55+79+5、182+115+161+1+2+43、182+115+161+1+2+55、182+115+161+1+2+79、182+115+161+1+2+5、182+115+161+1+43+55、182+115+161+1+43+79、182+115+161+1+43+5、182+115+161+1+55+79、182+115+161+1+55+5、182+115+161+1+79+5、182+115+161+2+43+55、182+115+161+2+43+79、182+115+161+2+43+5、182+115+161+2+55+79、182+115+161+2+55+5、182+115+161+2+79+5、182+115+161+43+55+79、182+115+161+43+55+5、182+115+161+43+79+5、182+115+161+55+79+5、182+115+1+2+43+55、182+115+1+2+43+79、182+115+1+2+43+5、182+115+1+2+55+79、182+115+1+2+55+5、182+115+1+2+79+5、182+115+1+43+55+79、182+115+1+43+55+5、182+115+1+43+79+5、182+115+1+55+79+5、182+115+2+43+55+79、182+115+2+43+55+5、182+115+2+43+79+5、182+115+2+55+79+5、182+115+43+55+79+5、182+161+1+2+43+55、182+161+1+2+43+79、182+161+1+2+43+5、182+161+1+2+55+79、182+161+1+2+55+5、182+161+1+2+79+5、182+161+1+43+55+79、182+161+1+43+55+5、182+161+1+43+79+5、182+161+1+55+79+5、182+161+2+43+55+79、182+161+2+43+55+5、182+161+2+43+79+5、182+161+2+55+79+5、182+161+43+55+79+5、182+1+2+43+55+79、182+1+2+43+55+5、182+1+2+43+79+5、182+1+2+55+79+5、182+1+43+55+79+5、182+2+43+55+79+5、115+161+1+2+43+55、115+161+1+2+43+79、115+161+1+2+43+5、115+161+1+2+55+79、115+161+1+2+55+5、115+161+1+2+79+5、115+161+1+43+55+79、115+161+1+43+55+5、115+161+1+43+79+5、115+161+1+55+79+5、115+161+2+43+55+79、115+161+2+43+55+5、115+161+2+43+79+5、115+161+2+55+79+5、115+161+43+55+79+5、115+1+2+43+55+790、115+1+2+43+55+5、115+1+2+43+79+5、115+1+2+55+79+5、115+1+43+55+79+5、115+2+43+55+79+5、161+1+2+43+55+79、161+1+2+43+55+5、161+1+2+43+79+5、161+1+2+55+79+5、161+1+43+55+79+5、161+2+43+55+79+5、1+2+43+55+79+5的位置处的改变或由其组成，如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置181+182+115+161+1+2+43、181+182+115+161+1+2+55、181+182+115+161+1+2+79、181+182+115+161+1+2+5、181+182+115+161+1+43+55、181+182+115+161+1+43+79、181+182+115+161+1+43+5、181+182+115+161+1+55+79、181+182+115+161+1+55+5、181+182+115+161+1+79+5、181+182+115+161+2+43+55、181+182+115+161+2+43+79、181+182+115+161+2+43+5、181+182+115+161+2+55+79、181+182+115+161+2+55+5、181+182+115+161+2+79+5、181+182+115+161+43+55+79、181+182+115+161+43+55+5、181+182+115+161+43+79+5、181+182+115+161+55+79+5、181+182+115+1+2+43+55、181+182+115+1+2+43+79、181+182+115+1+2+43+5、181+182+115+1+2+55+79、181+182+115+1+2+55+5、181+182+115+1+2+79+5、181+182+115+1+43+55+79、181+182+115+1+43+55+5、181+182+115+1+43+79+5、181+182+115+1+55+79+5、181+182+115+2+43+55+79、181+182+115+2+43+55+5、181+182+115+2+43+79+5、181+182+115+2+55+79+5、181+182+115+43+55+79+5、181+182+161+1+2+43+55、181+182+161+1+2+43+79、181+182+161+1+2+43+5、181+182+161+1+2+55+79、181+182+161+1+2+55+5、181+182+161+1+2+79+5、181+182+161+1+43+55+79、181+182+161+1+43+55+5、181+182+161+1+43+79+5、181+182+161+1+55+79+5、181+182+161+2+43+55+79、181+182+161+2+43+55+5、181+182+161+2+43+79+5、181+182+161+2+55+79+5、181+182+161+43+55+79+5、181+182+1+2+43+55+79、181+182+1+2+43+55+5、181+182+1+2+43+79+5、181+182+1+2+55+79+5、181+182+1+43+55+79+5、181+182+2+43+55+79+5、181+115+161+1+2+43+55、181+115+161+1+2+43+79、181+115+161+1+2+43+5、181+115+161+1+2+55+79、181+115+161+1+2+55+5、181+115+161+1+2+79+5、181+115+161+1+43+55+79、181+115+161+1+43+55+5、181+115+161+1+43+79+5、181+115+161+1+55+79+5、181+115+161+2+43+55+79、181+115+161+2+43+55+5、181+115+161+2+43+79+5、181+115+161+2+55+79+5、181+115+161+43+55+79+5、181+115+1+2+43+55+79、181+115+1+2+43+55+5、181+115+1+2+43+79+5、181+115+1+2+55+79+5、181+115+1+43+55+79+5、181+115+2+43+55+79+5、181+161+1+2+43+55+79、181+161+1+2+43+55+5、181+161+1+2+43+79+5、181+161+1+2+55+79+5、181+161+1+43+55+79+5、181+161+2+43+55+79+5、181+1+2+43+55+79+5、182+115+161+1+2+43+55、182+115+161+1+2+43+79、182+115+161+1+2+43+5、182+115+161+1+2+55+79、182+115+161+1+2+55+5、182+115+161+1+2+79+5、182+115+161+1+43+55+79、182+115+161+1+43+55+5、182+115+161+1+43+79+5、182+115+161+1+55+79+5、182+115+161+2+43+55+79、182+115+161+2+43+55+5、182+115+161+2+43+79+5、182+115+161+2+55+79+5、182+115+161+43+55+79+5、182+115+1+2+43+55+79、182+115+1+2+43+55+5、182+115+1+2+43+79+5、182+115+1+2+55+79+5、182+115+1+43+55+79+5、182+115+2+43+55+79+5、182+161+1+2+43+55+79、182+161+1+2+43+55+5、182+161+1+2+43+79+5、182+161+1+2+55+79+5、182+161+1+43+55+79+5、182+161+2+43+55+79+5、182+1+2+43+55+79+5、115+161+1+2+43+55+79、115+161+1+2+43+55+5、115+161+1+2+43+79+5、115+161+1+2+55+79+5、115+161+1+43+55+79+5、115+161+2+43+55+79+5、115+1+2+43+55+79+5、161+1+2+43+55+79+5的位置处的改变或由其组成，如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置181+182+115+161+1+2+43+55、181+182+115+161+1+2+43+79、181+182+115+161+1+2+43+5、181+182+115+161+1+2+55+79、181+182+115+161+1+2+55+5、181+182+115+161+1+2+79+5、181+182+115+161+1+43+55+79、181+182+115+161+1+43+55+5、181+182+115+161+1+43+79+5、181+182+115+161+1+55+79+5、181+182+115+161+2+43+55+79、181+182+115+161+2+43+55+5、181+182+115+161+2+43+79+5、181+182+115+161+2+55+79+5、181+182+115+161+43+55+79+5、181+182+115+1+2+43+55+79、181+182+115+1+2+43+55+5、181+182+115+1+2+43+79+5、181+182+115+1+2+55+79+5、181+182+115+1+43+55+79+5、181+182+115+2+43+55+79+5、181+182+161+1+2+43+55+79、181+182+161+1+2+43+55+5、181+182+161+1+2+43+79+5、181+182+161+1+2+55+79+5、181+182+161+1+43+55+79+5、181+182+161+2+43+55+79+5、181+182+1+2+43+55+79+5、181+115+161+1+2+43+55+79、181+115+161+1+2+43+55+5、181+115+161+1+2+43+79+5、181+115+161+1+2+55+79+5、181+115+161+1+43+55+79+5、181+115+161+2+43+55+79+5、181+115+1+2+43+55+79+5、181+161+1+2+43+55+79+5、182+115+161+1+2+43+55+79、182+115+161+1+2+43+55+5、182+115+161+1+2+43+79+5、182+115+161+1+2+55+79+5、182+115+161+1+43+55+79+5、182+115+161+2+43+55+79+5、182+115+1+2+43+55+79+5、182+161+1+2+43+55+79+5、115+161+1+2+43+55+79+5的位置处的改变或由其组成，如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置181+182+115+161+1+2+43+55+79、181+182+115+161+1+2+43+55+5、181+182+115+161+1+2+43+79+5、181+182+115+161+1+2+55+79+5、181+182+115+161+1+43+55+79+5、181+182+115+161+2+43+55+79+5、181+182+115+1+2+43+55+79+5、181+182+161+1+2+43+55+79+5、181+115+161+1+2+43+55+79+5、182+115+161+1+2+43+55+79+5的位置处的改变或由其组成，如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置181+182+115+161+1+2+43+55+79+5的位置处的改变或由其组成，如上文描述的那些。

在另一方面，该变体包括选自下组的一个或多个(例如，若干个)取代或由其组成，该组由R181P、G182*、V115I、A161L、Q1*、L2*、A43C、I55C、N79A、和I5V组成。

在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R181P+G182*、R181P+V115I、R181P+A161L、R181P+Q1*、R181P+L2*、R181P+A43C、R181P+I55C、R181P+N79A、R181P+I5V、G182*+V115I、G182*+A161L、G182*+Q1*、G182*+L2*、G182*+A43C、G182*+I55C、G182*+N79A、G182*+I5V、V115I+A161L、V115I+Q1*、V115I+L2*、V115I+A43C、V115I+I55C、V115I+N79A、V115I+I5V、A161L+Q1*、A161L+L2*、A161L+A43C、A161L+I55C、A161L+N79A、A161L+I5V、Q1*+L2*、Q1*+A43C、Q1*+I55C、Q1*+N79A、Q1*+I5V、L2*+A43C、L2*+I55C、L2*+N79A、L2*+I5V、A43C+I55C、A43C+N79A、A43C+I5V、I55C+N79A、I55C+I5V、N79A+I5V或由其组成。

在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R181P+G182*+V115I、R181P+G182*+A161L、R181P+G182*+Q1*、R181P+G182*+L2*、R181P+G182*+A43C、R181P+G182*+I55C、R181P+G182*+N79A、R181P+G182*+I5V、R181P+V115I+A161L、R181P+V115I+Q1*、R181P+V115I+L2*、R181P+V115I+A43C、R181P+V115I+I55C、R181P+V115I+N79A、R181P+V115I+I5V、R181P+A161L+Q1*、R181P+A161L+L2*、R181P+A161L+A43C、R181P+A161L+I55C、R181P+A161L+N79A、R181P+A161L+I5V、R181P+Q1*+L2*、R181P+Q1*+A43C、R181P+Q1*+I55C、R181P+Q1*+N79A、R181P+Q1*+I5V、R181P+L2*+A43C、R181P+L2*+I55C、R181P+L2*+N79A、R181P+L2*+I5V、R181P+A43C+I55C、R181P+A43C+N79A、R181P+A43C+I5V、R181P+I55C+N79A、R181P+I55C+I5V、R181P+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L、G182*+V115I+Q1*、G182*+V115I+L2*、G182*+V115I+A43C、G182*+V115I+I55C、G182*+V115I+N79A、G182*+V115I+I5V、G182*+A161L+Q1*、G182*+A161L+L2*、G182*+A161L+A43C、G182*+A161L+I55C、G182*+A161L+N79A、G182*+A161L+I5V、G182*+Q1*+L2*、G182*+Q1*+A43C、G182*+Q1*+I55C、G182*+Q1*+N79A、G182*+Q1*+I5V、G182*+L2*+A43C、G182*+L2*+I55C、G182*+L2*+N79A、G182*+L2*+I5V、G182*+A43C+I55C、G182*+A43C+N79A、G182*+A43C+I5V、G182*+I55C+N79A、G182*+I55C+I5V、G182*+N79A+I5V、V115I+A161L+Q1*、V115I+A161L+L2*、V115I+A161L+A43C、V115I+A161L+I55C、V115I+A161L+N79A、V115I+A161L+I5V、V115I+Q1*+L2*、V115I+Q1*+A43C、V115I+Q1*+I55C、V115I+Q1*+N79A、V115I+Q1*+I5V、V115I+L2*+A43C、V115I+L2*+I55C、V115I+L2*+N79A、V115I+L2*+I5V、V115I+A43C+I55C、V115I+A43C+N79A、V115I+A43C+I5V、V115I+I55C+N79A、V115I+I55C+I5V、V115I+N79A+I5V、A161L+Q1*+L2*、A161L+Q1*+A43C、A161L+Q1*+I55C、A161L+Q1*+N79A、A161L+Q1*+I5V、A161L+L2*+A43C、A161L+L2*+I55C、A161L+L2*+N79A、A161L+L2*+I5V、A161L+A43C+I55C、A161L+A43C+N79A、A161L+A43C+I5V、A161L+I55C+N79A、A161L+I55C+I5V、A161L+N79A+I5V、Q1*+L2*+A43C、Q1*+L2*+I55C、Q1*+L2*+N79A、Q1*+L2*+I5V、Q1*+A43C+I55C、Q1*+A43C+N79A、Q1*+A43C+I5V、Q1*+I55C+N79A、Q1*+I55C+I5V、Q1*+N79A+I5V、L2*+A43C+I55C、L2*+A43C+N79A、L2*+A43C+I5V、L2*+I55C+N79A、L2*+I55C+I5V、L2*+N79A+I5V、A43C+I55C+N79A、A43C+I55C+I5V、A43C+N79A+I5V、I55C+N79A+I5V或由其组成。

在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R181P+G182*+V115I+A161L、R181P+G182*+V115I+Q1*、R181P+G182*+V115I+L2*、R181P+G182*+V115I+A43C、R181P+G182*+V115I+I55C、R181P+G182*+V115I+N79A、R181P+G182*+V115I+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*、R181P+G182*+A161L+L2*、R181P+G182*+A161L+A43C、R181P+G182*+A161L+I55C、R181P+G182*+A161L+N79A、R181P+G182*+A161L+I5V、R181P+G182*+Q1*+L2*、R181P+G182*+Q1*+A43C、R181P+G182*+Q1*+I55C、R181P+G182*+Q1*+N79A、R181P+G182*+Q1*+I5V、R181P+G182*+L2*+A43C、R181P+G182*+L2*+I55C、R181P+G182*+L2*+N79A、R181P+G182*+L2*+I5V、R181P+G182*+A43C+I55C、R181P+G182*+A43C+N79A、R181P+G182*+A43C+I5V、R181P+G182*+I55C+N79A、R181P+G182*+I55C+I5V、R181P+G182*+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*、R181P+V115I+A161L+L2*、R181P+V115I+A161L+A43C、R181P+V115I+A161L+I55C、R181P+V115I+A161L+N79A、R181P+V115I+A161L+I5V、R181P+V115I+Q1*+L2*、R181P+V115I+Q1*+A43C、R181P+V115I+Q1*+I55C、R181P+V115I+Q1*+N79A、R181P+V115I+Q1*+I5V、R181P+V115I+L2*+A43C、R181P+V115I+L2*+I55C、R181P+V115I+L2*+N79A、R181P+V115I+L2*+I5V、R181P+V115I+A43C+I55C、R181P+V115I+A43C+N79A、R181P+V115I+A43C+I5V、R181P+V115I+I55C+N79A、R181P+V115I+I55C+I5V、R181P+V115I+N79A+I5V、R181P+A161L+Q1*+L2*、R181P+A161L+Q1*+A43C、R181P+A161L+Q1*+I55C、R181P+A161L+Q1*+N79A、R181P+A161L+Q1*+I5V、R181P+A161L+L2*+A43C、R181P+A161L+L2*+I55C、R181P+A161L+L2*+N79A、R181P+A161L+L2*+I5V、R181P+A161L+A43C+I55C、R181P+A161L+A43C+N79A、R181P+A161L+A43C+I5V、R181P+A161L+I55C+N79A、R181P+A161L+I55C+I5V、R181P+A161L+N79A+I5V、R181P+Q1*+L2*+A43C、R181P+Q1*+L2*+I55C、R181P+Q1*+L2*+N79A、R181P+Q1*+L2*+I5V、R181P+Q1*+A43C+I55C、R181P+Q1*+A43C+N79A、R181P+Q1*+A43C+I5V、R181P+Q1*+I55C+N79A、R181P+Q1*+I55C+I5V、R181P+Q1*+N79A+I5V、R181P+L2*+A43C+I55C、R181P+L2*+A43C+N79A、R181P+L2*+A43C+I5V、R181P+L2*+I55C+N79A、R181P+L2*+I55C+I5V、R181P+L2*+N79A+I5V、R181P+A43C+I55C+N79A、R181P+A43C+I55C+I5V、R181P+A43C+N79A+I5V、R181P+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*、G182*+V115I+A161L+L2*、G182*+V115I+A161L+A43C、G182*+V115I+A161L+I55C、G182*+V115I+A161L+N79A、G182*+V115I+A161L+I5V、G182*+V115I+Q1*+L2*、G182*+V115I+Q1*+A43C、G182*+V115I+Q1*+I55C、G182*+V115I+Q1*+N79A、G182*+V115I+Q1*+I5V、G182*+V115I+L2*+A43C、G182*+V115I+L2*+I55C、G182*+V115I+L2*+N79A、G182*+V115I+L2*+I5V、G182*+V115I+A43C+I55C、G182*+V115I+A43C+N79A、G182*+V115I+A43C+I5V、G182*+V115I+I55C+N79A、G182*+V115I+I55C+I5V、G182*+V115I+N79A+I5V、G182*+A161L+Q1*+L2*、G182*+A161L+Q1*+A43C、G182*+A161L+Q1*+I55C、G182*+A161L+Q1*+N79A、G182*+A161L+Q1*+I5V、G182*+A161L+L2*+A43C、G182*+A161L+L2*+I55C、G182*+A161L+L2*+N79A、G182*+A161L+L2*+I5V、G182*+A161L+A43C+I55C、G182*+A161L+A43C+N79A、G182*+A161L+A43C+I5V、G182*+A161L+I55C+N79A、G182*+A161L+I55C+I5V、G182*+A161L+N79A+I5V、G182*+Q1*+L2*+A43C、G182*+Q1*+L2*+I55C、G182*+Q1*+L2*+N79A、G182*+Q1*+L2*+I5V、G182*+Q1*+A43C+I55C、G182*+Q1*+A43C+N79A、G182*+Q1*+A43C+I5V、G182*+Q1*+I55C+N79A、G182*+Q1*+I55C+I5V、G182*+Q1*+N79A+I5V、G182*+L2*+A43C+I55C、G182*+L2*+A43C+N79A、G182*+L2*+A43C+I5V、G182*+L2*+I55C+N79A、G182*+L2*+I55C+I5V、G182*+L2*+N79A+I5V、G182*+A43C+I55C+N79A、G182*+A43C+I55C+I5V、G182*+A43C+N79A+I5V、G182*+I55C+N79A+I5V、V115I+A161L+Q1*+L2*、V115I+A161L+Q1*+A43C、V115I+A161L+Q1*+I55C、V115I+A161L+Q1*+N79A、V115I+A161L+Q1*+I5V、V115I+A161L+L2*+A43C、V115I+A161L+L2*+I55C、V115I+A161L+L2*+N79A、V115I+A161L+L2*+I5V、V115I+A161L+A43C+I55C、V115I+A161L+A43C+N79A、V115I+A161L+A43C+I5V、V115I+A161L+I55C+N79A、V115I+A161L+I55C+I5V、V115I+A161L+N79A+I5V、V115I+Q1*+L2*+A43C、V115I+Q1*+L2*+I55C、V115I+Q1*+L2*+N79A、V115I+Q1*+L2*+I5V、V115I+Q1*+A43C+I55C、V115I+Q1*+A43C+N79A、V115I+Q1*+A43C+I5V、V115I+Q1*+I55C+N79A、V115I+Q1*+I55C+I5V、V115I+Q1*+N79A+I5V、V115I+L2*+A43C+I55C、V115I+L2*+A43C+N79A、V115I+L2*+A43C+I5V、V115I+L2*+I55C+N79A、V115I+L2*+I55C+I5V、V115I+L2*+N79A+I5V、V115I+A43C+I55C+N79A、V115I+A43C+I55C+I5V、V115I+A43C+N79A+I5V、V115I+I55C+N79A+I5V、A161L+Q1*+L2*+A43C、A161L+Q1*+L2*+I55C、A161L+Q1*+L2*+N79A、A161L+Q1*+L2*+I5V、A161L+Q1*+A43C+I55C、A161L+Q1*+A43C+N79A、A161L+Q1*+A43C+I5V、A161L+Q1*+I55C+N79A、A161L+Q1*+I55C+I5V、A161L+Q1*+N79A+I5V、A161L+L2*+A43C+I55C、A161L+L2*+A43C+N79A、A161L+L2*+A43C+I5V、A161L+L2*+I55C+N79A、A161L+L2*+I55C+I5V、A161L+L2*+N79A+I5V、A161L+A43C+I55C+N79A、A161L+A43C+I55C+I5V、A161L+A43C+N79A+I5V、A161L+I55C+N79A+I5V、Q1*+L2*+A43C+I55C、Q1*+L2*+A43C+N79A、Q1*+L2*+A43C+I5V、Q1*+L2*+I55C+N79A、Q1*+L2*+I55C+I5V、Q1*+L2*+N79A+I5V、Q1*+A43C+I55C+N79A、Q1*+A43C+I55C+I5V、Q1*+A43C+N79A+I5V、Q1*+I55C+N79A+I5V、L2*+A43C+I55C+N79A、L2*+A43C+I55C+I5V、L2*+A43C+N79A+I5V、L2*+I55C+N79A+I5V、A43C+I55C+N79A+I5V或由其组成。

在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*、R181P+G182*+V115I+A161L+A43C、R181P+G182*+V115I+A161L+I55C、R181P+G182*+V115I+A161L+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*、R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C、R181P+G182*+V115I+Q1*+I55C、R181P+G182*+V115I+Q1*+N79A、R181P+G182*+V115I+Q1*+I5V、R181P+G182*+V115I+L2*+A43C、R181P+G182*+V115I+L2*+I55C、R181P+G182*+V115I+L2*+N79A、R181P+G182*+V115I+L2*+I5V、R181P+G182*+V115I+A43C+I55C、R181P+G182*+V115I+A43C+N79A、R181P+G182*+V115I+A43C+I5V、R181P+G182*+V115I+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*、R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C、R181P+G182*+A161L+Q1*+I55C、R181P+G182*+A161L+Q1*+N79A、R181P+G182*+A161L+Q1*+I5V、R181P+G182*+A161L+L2*+A43C、R181P+G182*+A161L+L2*+I55C、R181P+G182*+A161L+L2*+N79A、R181P+G182*+A161L+L2*+I5V、R181P+G182*+A161L+A43C+I55C、R181P+G182*+A161L+A43C+N79A、R181P+G182*+A161L+A43C+I5V、R181P+G182*+A161L+I55C+N79A、R181P+G182*+A161L+I55C+I5V、R181P+G182*+A161L+N79A+I5V、R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C、R181P+G182*+Q1*+L2*+I55C、R181P+G182*+Q1*+L2*+N79A、R181P+G182*+Q1*+L2*+I5V、R181P+G182*+Q1*+A43C+I55C、R181P+G182*+Q1*+A43C+N79A、R181P+G182*+Q1*+A43C+I5V、R181P+G182*+Q1*+I55C+N79A、R181P+G182*+Q1*+I55C+I5V、R181P+G182*+Q1*+N79A+I5V、R181P+G182*+L2*+A43C+I55C、R181P+G182*+L2*+A43C+N79A、R181P+G182*+L2*+A43C+I5V、R181P+G182*+L2*+I55C+N79A、R181P+G182*+L2*+I55C+I5V、R181P+G182*+L2*+N79A+I5V、R181P+G182*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*、R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C、R181P+V115I+A161L+Q1*+I55C、R181P+V115I+A161L+Q1*+N79A、R181P+V115I+A161L+Q1*+I5V、R181P+V115I+A161L+L2*+A43C、R181P+V115I+A161L+L2*+I55C、R181P+V115I+A161L+L2*+N79A、R181P+V115I+A161L+L2*+I5V、R181P+V115I+A161L+A43C+I55C、R181P+V115I+A161L+A43C+N79A、R181P+V115I+A161L+A43C+I5V、R181P+V115I+A161L+I55C+N79A、R181P+V115I+A161L+I55C+I5V、R181P+V115I+A161L+N79A+I5V、R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C、R181P+V115I+Q1*+L2*+I55C、R181P+V115I+Q1*+L2*+N79A、R181P+V115I+Q1*+L2*+I5V、R181P+V115I+Q1*+A43C+I55C、R181P+V115I+Q1*+A43C+N79A、R181P+V115I+Q1*+A43C+I5V、R181P+V115I+Q1*+I55C+N79A、R181P+V115I+Q1*+I55C+I5V、R181P+V115I+Q1*+N79A+I5V、R181P+V115I+L2*+A43C+I55C、R181P+V115I+L2*+A43C+N79A、R181P+V115I+L2*+A43C+I5V、R181P+V115I+L2*+I55C+N79A、R181P+V115I+L2*+I55C+I5V、R181P+V115I+L2*+N79A+I5V、R181P+V115I+A43C+I55C+N79A、R181P+V115I+A43C+I55C+I5V、R181P+V115I+A43C+N79A+I5V、R181P+V115I+I55C+N79A+I5V、R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C、R181P+A161L+Q1*+L2*+I55C、R181P+A161L+Q1*+L2*+N79A、R181P+A161L+Q1*+L2*+I5V、R181P+A161L+Q1*+A43C+I55C、R181P+A161L+Q1*+A43C+N79A、R181P+A161L+Q1*+A43C+I5V、R181P+A161L+Q1*+I55C+N79A、R181P+A161L+Q1*+I55C+I5V、R181P+A161L+Q1*+N79A+I5V、R181P+A161L+L2*+A43C+I55C、R181P+A161L+L2*+A43C+N79A、R181P+A161L+L2*+A43C+I5V、R181P+A161L+L2*+I55C+N79A、R181P+A161L+L2*+I55C+I5V、R181P+A161L+L2*+N79A+I5V、R181P+A161L+A43C+I55C+N79A、R181P+A161L+A43C+I55C+I5V、R181P+A161L+A43C+N79A+I5V、R181P+A161L+I55C+N79A+I5V、R181P+Q1*+L2*+A43C+I55C、R181P+Q1*+L2*+A43C+N79A、R181P+Q1*+L2*+A43C+I5V、R181P+Q1*+L2*+I55C+N79A、R181P+Q1*+L2*+I55C+I5V、R181P+Q1*+L2*+N79A+I5V、R181P+Q1*+A43C+I55C+N79A、R181P+Q1*+A43C+I55C+I5V、R181P+Q1*+A43C+N79A+I5V、R181P+Q1*+I55C+N79A+I5V、R181P+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*、G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C、G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C、G182*+V115I+A161L+Q1*+N79A、G182*+V115I+A161L+Q1*+I5V、G182*+V115I+A161L+L2*+A43C、G182*+V115I+A161L+L2*+I55C、G182*+V115I+A161L+L2*+N79A、G182*+V115I+A161L+L2*+I5V、G182*+V115I+A161L+A43C+I55C、G182*+V115I+A161L+A43C+N79A、G182*+V115I+A161L+A43C+I5V、G182*+V115I+A161L+I55C+N79A、G182*+V115I+A161L+I55C+I5V、G182*+V115I+A161L+N79A+I5V、G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C、G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C、G182*+V115I+Q1*+L2*+N79A、G182*+V115I+Q1*+L2*+I5V、G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C、G182*+V115I+Q1*+A43C+N79A、G182*+V115I+Q1*+A43C+I5V、G182*+V115I+Q1*+I55C+N79A、G182*+V115I+Q1*+I55C+I5V、G182*+V115I+Q1*+N79A+I5V、G182*+V115I+L2*+A43C+I55C、G182*+V115I+L2*+A43C+N79A、G182*+V115I+L2*+A43C+I5V、G182*+V115I+L2*+I55C+N79A、G182*+V115I+L2*+I55C+I5V、G182*+V115I+L2*+N79A+I5V、G182*+V115I+A43C+I55C+N79A、G182*+V115I+A43C+I55C+I5V、G182*+V115I+A43C+N79A+I5V、G182*+V115I+I55C+N79A+I5V、G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C、G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C、G182*+A161L+Q1*+L2*+N79A、G182*+A161L+Q1*+L2*+I5V、G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C、G182*+A161L+Q1*+A43C+N79A、G182*+A161L+Q1*+A43C+I5V、G182*+A161L+Q1*+I55C+N79A、G182*+A161L+Q1*+I55C+I5V

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在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*、181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I55C、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I55C、R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+N79A、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C、R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+N79A、R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+Q1*+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I55C、R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+N79A、R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I5V、R181P+G182*+V115I+L2*+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+L2*+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+L2*+N79A+I5V、181P+G182*+V115I+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+A43C+I55C+I5V、181P+G182*+V115I+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+N79A、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C、R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+N79A、R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+I55C+N79A、R181P+G182*+A161L+Q1*+I55C+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+I55C、R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+N79A、R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+I5V、181P+G182*+A161L+L2*+I55C+N79A、R181P+G182*+A161L+L2*+I55C+I5V、R181P+G182*+A161L+L2*+N79A+I5V、181P+G182*+A161L+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+A161L+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+A161L+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C、R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+N79A、R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I5V、R181P+G182*+Q1*+L2*+I55C+N79A、R181P+G182*+Q1*+L2*+I55C+I5V、R181P+G182*+Q1*+L2*+N79A+I5V、R181P+G182*+Q1*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+Q1*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+Q1*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+Q1*+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C、R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A、R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A、R181P+V115I+A161L+Q1*+I55C+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C、R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+N79A、R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I5V、R181P+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A、R181P+V115I+A161L+L2*+I55C+I5V、R181P+V115I+A161L+L2*+N79A+I5V、181P+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A、R181P+V115I+A161L+A43C+I55C+I5V、R181P+V115I+A161L+A43C+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C、R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A、R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I5V、R181P+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A、R181P+V115I+Q1*+L2*+I55C+I5V、R181P+V115I+Q1*+L2*+N79A+I5V、R181P+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A、R181P+V115I+Q1*+A43C+I55C+I5V、R181P+V115I+Q1*+A43C+N79A+I5V、R181P+V115I+Q1*+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+V115I+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+V115I+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+V115I+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C、R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A、R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V、R181P+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A、R181P+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V、R181P+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V、R181P+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A、R181P+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V、R181P+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V、R181P+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V、R181P+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C、G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A、G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A、G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C、G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+N79A、G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I5V、G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A、G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+I5V、G182*+V115I+A161L+L2*+N79A+I5V、182*+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A、G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+I5V、G182*+V115I+A161L+A43C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C、G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A、G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I5V、G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A、G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+I5V、G182*+V115I+Q1*+L2*+N79A+I5V、G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A、G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+I5V、G182*+V115I+Q1*+A43C+N79A+I5V、G182*+V115I+Q1*+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A、G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+I5V、G182*+V115I+L2*+A43C+N79A+I5V、G182*+V115I+L2*+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+A16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在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A、R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A、G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A、G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V、G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A、G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V、G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V、G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A、G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V、G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V、G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V、G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A、V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V、V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V、V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V、V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V、V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V或由其组成。

在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V或由其组成。

在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+A161L+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+V115I+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+G182*+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、R181P+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V、G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V或其组成。

在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R181P+G182*+V115I+A161L+Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+I5V或由其组成。

这些变体在一个或多个(例如，若干个)其他位置上可进一步包含一个或多个另外的改变。

这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham(坎宁汉)和Wells(威尔斯)，1989，Science(科学)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的角质酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。

在一方面，变体可以由以下项组成或包括以下项：至少172个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸17至188)。在一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的氨基酸数目的至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但是小于100％。在一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的氨基酸数目的至少172个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:2的氨基酸17至188)并且至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但是小于100％。

在一些方面，本发明涉及包括N-末端延伸的变体。该延伸可以构成对应于SEQ IDNO:2的氨基酸-17至-1或其截短的位置。在一些方面，本发明涉及一种变体，其中该N-末端延伸选自：(a)AAVDSNHTPAVPELVAR；(b)AVDSNHTPAVPELVAR；(c)VDSNHTPAVPELVAR；(d)DSNHTPAVPELVAR；(e)SNHTPAVPELVAR；(f)NHTPAVPELVAR；(g)HTPAVPELVAR；(h)TPAVPELVAR；(i)PAVPELVAR；(j)AVPELVAR；(k)；(l)PELVAR；(m)PELVAR；(n)ELVAR；(o)LVAR；(p)VAR；(q)AR；或(r)R。在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1和/或2的一个或多个(例如若干个)位置中包括缺失(例如Q1*、L2*、或Q1*+L2*)的变体可以具有前肽区的不同加工。在本发明的一些方面，这可以在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1和/或2的一个或多个(例如若干个)位置中产生既包括缺失(例如Q1*、L2*、或Q1*+L2*)又包括N-末端延伸的变体，该N-末端延伸选自：(a)AAVDSNHTPAVPELVAR；(b)AVDSNHTPAVPELVAR；(c)VDSNHTPAVPELVAR；(d)DSNHTPAVPELVAR；(e)SNHTPAVPELVAR；(f)NHTPAVPELVAR；(g)HTPAVPELVAR；(h)TPAVPELVAR；(i)PAVPELVAR；(j)AVPELVAR；(k)；(l)PELVAR；(m)PELVAR；(n)ELVAR；(o)LVAR；(p)VAR；(q)AR；或(r)R。

在一方面，与亲本酶相比，该变体具有改进的比活性。比活性可以如实例3所述通过水解BETEB来确定，和/或如实例4所述通过水解PET经pH变化和/或OD变化的增加来确定。

在一方面，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物结合。

在一方面，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物裂解。底物裂解可以如实例3所述通过水解BETEB来确定，和/或如实例4所述通过水解PET经pH变化和/或OD变化的增加来确定。

在一方面，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物特异性。底物特异性可以如实例3所述通过水解BETEB来确定，和/或如实例4所述通过水解PET经pH变化和/或OD变化的增加来确定。

在一方面，所述变体相比于亲本酶具有改进的热稳定性。热稳定性可以通过差示扫描量热法(DSC)或如实例3所述通过在规定温度下孵育后确定如通过水解BETEB所测量的残余活性，和/或如实例4所述通过水解PET经由pH变化和/或OD变化的增加来确定。

通过差示扫描量热法(DSC)确定的热稳定性是通过使用VP-毛细管差示扫描量热仪(微量热公司(MicroCal Inc.)，皮斯卡特维，新泽西州，美国)来进行的。将热变性温度Td(℃)视为温谱图(Cp相较于T)中的变性峰(主要吸热峰)的顶端，这些温谱图在200K/hr的恒定的程序化加热率下在缓冲液(50mM Tris；100mM NaCl pH 9)中加热酶溶液(约0.5mg/mL)之后获得。将样品溶液和参考溶液(大约0.2mL)从10℃下的储存条件装载到量热仪中(参考：不具有酶的缓冲液)，并且在20℃下热预平衡20分钟，随后从20℃至100℃进行DSC扫描。以+/-1℃的精确度确定变性温度。

在一方面，与亲本酶相比，该变体具有减少的起球倾向。起球倾向可以如实例4所述通过进行起球记录测试来确定。

亲本角质酶

亲本天冬酰胺酶可以是(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；(b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严格条件下与SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交；或(c)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这一成熟多肽具有角质酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽多达20个氨基酸，例如1-15、1-10、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个不同。

在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至194或由其组成。

在另一方面，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段由以下项组成或包括以下项：至少172个氨基酸残基(例如对应于SEQ ID NO:2的氨基酸17至188)。在一方面，片段包括SEQ ID NO:2的氨基酸数目的至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但是小于100％。在一方面，片段包括SEQ ID NO:2的氨基酸数目的至少172个氨基酸残基(例如SEQID NO:2的氨基酸17至188)并且至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但是小于100％。

在另一方面，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的等位基因变体。

在另一方面，该亲本由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严格条件下、低严格条件下、中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下或非常高严格条件下与(i)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(ColdSpring Harbor)，纽约)。

可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严格条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互互补体；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸106至687。在另一方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽、其成熟多肽、或其片段的多核苷酸。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。

在另一方面，该亲本是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

亲本可以是融合多肽或可裂解融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两种多肽之间进一步包括切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被位点，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森(Rasmussen)-威尔逊(Wilson)等人，1997，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯(Collins)-莱斯(Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白：结构、功能和遗传学(Proteins：Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。

该亲本可以从任何属类的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。

该亲本可以是一种细菌角质酶。例如，该亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)角质酶；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)角质酶。

在一方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)角质酶。

在另一个方面，该亲本是一种类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)角质酶。

在另一方面，该亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)角质酶。

该亲本可以是一种细菌角质酶。例如，该亲本可以是一种酵母角质酶，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)角质酶；或一种丝状真菌角质酶，如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑燕属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)角质酶。

在另一方面，该亲本是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)角质酶。

在另一方面，该亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、莫达瑞姆金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳霉(Thielavia achromatica)、阿波梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳霉(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳霉(Thielavia australeinsis)、菲美蒂梭孢壳菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳霉(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳霉(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳霉(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳霉(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳霉(Thielaviaspededonium)、耐热梭孢壳(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)角质酶。

在另一方面，该亲本是一种特异腐质霉角质酶、或者SEQ ID NO:2的角质酶或其成熟多肽。在另一方面，该亲本可以是丝核菌属(Rhizoctonia)例如立枯丝核菌(R.solani)的菌株，或链格孢属(Alternaria)例如甘蓝链格孢(A.brassicicola)的菌株(WO 94/03578)。角质酶也可以是亲本角质酶的变体，如描述于WO 00/34450或WO 01/92502中的那些。

将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。

变体的制备

本发明还涉及用于获得具有角质酶活性的变体的方法，这些方法包括：(a)在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置181、182、115、161、1、2、43、55、79、或5的一个或多个(例如，若干个)位置处将改变引入亲本角质酶中，其中该改变是针对位置181、115、161、43、55、79、和5的取代，以及针对位置1、2和182的缺失，其中该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但是小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有角质酶活性；以及(b)回收该变体。

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过使用涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(Nucleic Acids Res.)18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如，US 2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。

在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组、和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学30:10832-10837；US 5223409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)角质酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切右旋糖酐酶I、里氏木霉内切右旋糖酐酶II、里氏木霉内切右旋糖酐酶III、里氏木霉内切右旋糖酐酶IV、里氏木霉内切右旋糖酐酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。

该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是前导序列，对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

该控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。

该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。该多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列5’-端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下各项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切右旋糖酐酶V、柔毛腐质霉角质酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。

该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调控系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他例子是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。

用于丝状真菌细胞中的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法来完成。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌的细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不局限于产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、土生梭孢壳、长绒毛栓菌、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉的细胞。

可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及以本身已知的一种方式进行细胞壁再生的一个过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及科里蒂森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。

生产方法

本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

使用本领域已知的对这些变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。角质酶活性可以如实例3所述确定为对BETEB底物的水解活性。

可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。

在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。

组合物

在一些方面，本发明还涉及包括变体中的一种或多种(例如若干种)的组合物。

用途

本发明涉及的角质酶变体可以用来，例如，酶水解聚(对苯二甲酸亚乙酯)的环状低聚物，如环状三(对苯二甲酸亚乙酯)，缩写为c3ET。其通过用角质酶变体处理织物或纱线，可以去除含聚酯的织物或纱线中的此类环状低聚体，任选地随后通过用具有在从pH 7到pH 11范围内的pH的水溶液漂洗该织物或纱线。对聚酯的处理可以方便地在高于c3ET的玻璃态转变温度(约55℃)并且低于聚酯的玻璃态转变温度(约70℃)下进行。因此，该处理可以合适地在50℃-100℃、50℃-95℃、50℃-90℃、50℃-85℃、50℃-80℃、或60℃-75℃下进行。该方法可以按与WO 97/27237类似的方法进行。

该角质酶变体可以用来处理由聚酯组成或包括聚酯，例如像PET(乙二醇和对笨二酸的聚合物)、P3GT(1,3丙二醇和对苯二酸的聚合物)或其任何共混物的纺织品/织物。此类聚酯混纺物可以例如包括棉(聚酯/棉混纺物)和/或其他适合的纤维。该处理可以向由聚酯组成或包括聚酯的纺织品/织物提供益处，如降低起球倾向。

该角质酶变体可以用来改进对含PET的纱线或织物的功能性整理剂，方法是通过用该角质酶变体处理，随后用加工剂、如软化剂、抗皱树脂、抗静电剂、抗污剂，或者一些用来减弱无皱、持续压力或防火效果的试剂进行处理。用角质酶变体进行处理可以增加表面的官能团的数量，并且这可以用来附着功能性整理剂。整理剂的实例描述于由Nihon SeniSentaa KK于1998年10月15日公开的“SENSHOKU SIAGEKAKO BENRAN”中。

该角质酶变体还可用于降解和回收聚酯，如聚己酸丙酯(PCL)、聚-乙二醇-对苯二甲酸(PET)、聚乳酸、聚丁烯琥珀酸酯和聚(羟基丁酸)合(羟基戊酸)，例如，胶片和瓶子，例如，如JP-A5-344897中所述。

在一些方面，本发明涉及用于修饰聚酯的方法，该方法包括使用变体中的一种或多种(例如若干种)。

在一些方面，本发明涉及用于水解聚(对苯二甲酸乙二酯)的环状低聚物的方法，该方法包括使用变体中的一种或多种(例如若干种)。

在一些方面，本发明涉及修饰聚酯/棉混纺织物的方法，该方法包括使用角质酶和纤维素酶中的一种或多种。

在一些方面，本发明涉及用于降低包括聚酯或由聚酯组成的织物的起球倾向的方法，该方法包括使用变体中的一种或多种(例如若干种)。起球抗性的改进可以通过使用马丁代尔(Martindale)起球测试器(瑞士标准SN198525)来确定，如在下文段落“材料与方法”中所述。

通过以下实例进一步描述本发明，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

材料与方法

除非另外指明，这些材料是试剂等级的。

表1：变体中对应于SEQ ID No:2中的氨基酸位置的改变。

实例1：克隆和表达

通过使用包含突变的正向引物进行定点诱变来产生变体。PCR反应混合物包含50ng模板DNA；10pmol诱变引物；300umol dNTP’s；1X的5X HF Phusion缓冲液；0.5mMMgCl2；1单位Phusion聚合酶；以及高达25uL MilliQ水。PCR循环以98℃/2:00min；18x(98℃/1:00min，62℃/1:00min，72℃/(2*质粒长度，以kb计)min)；72℃/20:00min；保存于4℃下运行。根据所用的诱变引物的Tm改变退火温度。在PCR仪中在37℃下用0.5uL DpnI酶(直接添加至PCR反应混合物中)进行用DpnI的消化持续6小时。

将5.0uL的反应混合物直接转化进化学感受态大肠杆菌DH5α细胞中。接种2-6菌落用于质粒分离并且对质粒DNA序列进行确认是否掺入所希望的突变。

然后将所确认的具有希望的突变的质粒DNA转化到米曲霉中，并且针对处于小规模中(2mL于24孔板中)的蛋白表达对获得的克隆进行筛选。

小规模表达：

孢子悬浮液(将0.2g琼脂(RM026，海美迪(HiMedia))；0.05g吐温20(P9416，西格玛公司(Sigma))；和水补加至100mL进行热压处理并且分配到1mL Nunc管中)。

YPM培养基(10g酵母提取物(RM027，海美迪(HiMedia))；20g蛋白胨-(RM001，海美迪(HiMedia))；以及水补加至1000mL；将来自20％储备溶液的麦芽糖(RM3050，海美迪(HiMedia))在热压处理后添加，至最终浓度为2％)。

使用接种环和孢子悬浮液将来自转化的菌落的孢子从琼脂板转移并接种进于12孔或24孔培养板中的2mL YPM培养基中。将这些板在34℃在湿条件下不进行摇荡地孵育3天。将在培养基表面上形成的菌丝层去除并且在SDS-PAGE和活性测定中分析该培养基。

将40uL的等分试样与10uL SDS加样染料混合，在100℃下加热10分钟并加载至12％琼脂糖凝胶中，并且随后用考马斯亮蓝染色。将具有最好表达的菌落在COVE-N琼脂斜面上划线用于摇瓶发酵。

摇瓶发酵：

G2-Gly培养基(18g酵母提取物(RM027，海美迪(HiMedia))；24.0g甘油(87％，10409405001730，默克(Merck))；1.0mL Dowfax 63N10(诺维信公司)；以及补加至1000mL的离子交换水)。

MDU-2BP培养基(45.0g麦芽糖RM3050，海美迪(HiMedia))；1.0g硫酸镁(61777005001730，默克(Merck))；1.0g氯化钠(1.93206.0521，默克)；2.0g硫酸钾(61777405001730，默克)；12.0g磷酸二氢钾(1.93205.0521，默克)；7.0g酵母提取物(RM027，海美迪(HiMedia))；0.1mL Dowfax 63N10(诺维信公司)；0.5mL AMG Spormetal(KU6)(参见下文)；以及补加至1000mL的离子交换水)。

AMG Spormetal(KU6)(6.8g氯化锌(61752905001046，默克)；2.5g硫酸铜(61775905001730，默克)；0.13g无水氯化镍(8067220100，默克)；13.9g硫酸铁(61751005001730，默克)；8.45g硫酸锰(61754805001730，默克)；3g柠檬酸(60024205001730，默克)；以及补加至1000mL的离子交换水)。

将于挡板烧瓶中(200mL培养基于500mL烧瓶中)的约5mL的G2-Gly培养基倒入给定变体的产孢子斜面中。使用接种环将孢子从斜面中刮出并再悬浮于培养基中，将该培养基倾倒回具有剩余培养基的烧瓶中。将这些烧瓶用一层厚的米拉样(Mira-like)布和纸覆盖并且以180rpm在34℃下孵育24小时。过夜生长后，将2-5mL的G2-Gly培养物接种于在1L挡板烧瓶中的300mL MDU-2BP培养基中。在接种前，将50％脲添加至经热压处理的MDU-2BP培养基中至终浓度为0.5％。将这些烧瓶在34℃下以180rpm孵育72小时。72小时生长后，在12％SDS-PAGE上针对表达对上清液进行分析。一旦SDS-PAGE显示所希望的蛋白的表达，便递送发酵液用于纯化。

实例2：纯化

将发酵液在装有玻璃纤维滤膜夹心的布氏漏斗(145mm)上过滤。该滤膜夹心由GFD/A/C/B和F滤膜组成，其中滤膜D在布氏漏斗的顶部上并且滤膜F在布氏漏斗的底部。随后以维持在5psi的跨膜压力使该培养液穿过固定在GE仪上的0.2um中空纤维滤膜。

将无菌过滤培养液加载至具有混合态树脂HEA-(HEA是己胺)的第一柱上。将该树脂包装在具有柱直径为15mm且床高为200mm的玻璃柱(克朗实验室(Kron lab))中。使用BioRad Duoflow以如下所概述的顺序步骤自动化进行纯化工艺。除样品体积之外，所有体积是8-10x柱体积。

色谱/树脂	HEA HyperCel
		平衡缓冲液	100mM碳酸氢盐pH 10
样品	样品+100mM NaCl
		未结合的洗液1	100mM碳酸氢盐pH 10
未结合的洗液2	50mM乙酸钠，pH 4.5+300mM NaCl
		洗脱缓冲液	乙酸钠50mM，pH 4.5
洗脱模式	线性梯度

将来自第一柱的洗脱级分合并，并且通过用乙酸钠缓冲液50mM(pH4.5)将其稀释而将导电率调节至4mS/cm，之后装载至具有包装于玻璃柱(克朗实验室(Kron lab))中的阳离子交换树脂的第二柱上，所述玻璃柱具有柱直径为15mm且床高为200mm。使用BioRad Duoflow以如下所概述的顺序步骤自动化进行纯化工艺。除样品体积之外，所有体积是8-10x柱体积。

色谱/树脂	UNO S(阳离子交换树脂)
		平衡缓冲液	50mM乙酸钠pH 4.5
样品	含有乙酸钠的样品，pH 4.5(导电率小于4mS)
		未结合的洗液	50mM乙酸钠pH 4.5
洗脱缓冲液	乙酸钠50mM，pH 4.5+1M NaCl
		洗脱模式	分级梯度

将洗脱的级分合并，在SDS-PAGE上解析用于记录，在A₂₈₀处测量，包装并递送。

大规模纯化

将培养液进行离心(20000x g，20min)，并且将上清液小心地与沉淀物倾析分开并且通过耐洁(Nalgene)0.2um过滤装置进行过滤。

将5M NaCl溶液添加至0.2um滤液中，至终浓度为1M NaCl。将该混合物施加至在40mM H₃BO₃/NaOH、1M NaCl(pH 9.0)中平衡的癸胺-琼脂糖(Decylamine-agarose)柱(来自Upfront色谱公司(Upfront Chromatography)上，并且随后用5x柱体积平衡缓冲液洗涤并用70％(50mM H₃BO₃/NaOH，pH 9.0)和30％异丙醇的混合物逐步洗脱。

将来自癸胺琼脂糖步骤的洗脱峰施加至在20mM乙酸酸/NaOH(pH5.0)中平衡的SP-交联葡聚糖FF柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将角质酶用在平衡缓冲液与20mM乙酸/NaOH、1.0MNaCl(pH 5.0)之间的线性梯度洗脱超过3x柱体积。将来自包含角质酶的SP-交联葡聚糖FF柱的主峰通过SDS-PAGE进行分析，并且当在经考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上仅一个条带可见时，将级分作为经纯化的制备物合并。

实例3：角质酶活性

为了计算亲本和变体酶的残余活性，在两个温度下确定针对BETEB底物(12.5mg/mL BETEB；0.1％Triton X-100，H₂O)的水解活性：85℃被视为100％活性并且90℃被视为显示降低的活性。

对于每个测试温度，包括两个对照(“底物空白”和“酶空白”并且将其在与该酶样品类似的条件下进行测试。通过将25uL来自实例1的培养上清液(sub)或来自实例2的纯化酶(pur)、100uL底物进行混合，用40mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液pH 7.0(伯瑞坦-罗宾森缓冲液是硼酸、正磷酸和乙酸的等摩尔混合物。使用NaOH的5x摩尔溶液调节pH)补加至1mL来制备该酶样品。该“底物空白”包含100uL底物并且用40mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液pH 7.0补加至1mL。该“酶空白”包含25uL培养物上清液、100uL 0.1％Triton X-100并且用40mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液pH 7.0补加至1mL。以1000rpm在85℃或90℃下孵育20分钟后，通过将样品放置在冰上持续1至5分钟而立即停止反应。随后将其以13000rpm离心1分钟并且测量上清液在254nm处的吸光度。

将变体相比于亲本酶改进的残余活性表示为高于100的相对％RA。根据以下进行相对％RA的计算：相对％RA＝(变体％RA)/(SEQ ID NO:2％RA)*100

表2：角质酶变体相对于SEQ ID No:2的残余活性(RA)

实例4：在洗衣指数计中用角质酶进行生物抛光

在处于小规模(SSLOM)与全规模(FSLOM)二者的SDL-Atlas LP2洗衣指数计(LOM)中进行用角质酶的生物抛光。

将织物切成5x 10cm(约1g，用于SSLOM)和14x 14cm(约4-5g，用于FSLOM)的矩形碎片/小块布样。将该织物通过缝合锁边。将碎片在它们编号之前于65％+/-5％相对湿度和20℃+/-1℃下调节24小时，通过分析天平(对于100g以下的样品)或精密天平(对于100g以上的样品)称重并记录。

将一个经调节的碎片与提供机械辅助的10个小的耐酸钢球(M6M-SR-A4-80)一起放置于每个烧杯中。如这些表中所指示，基于对实际织物重量的计算，以液体与织物10:1的v/w比率添加缓冲液(布里顿-罗宾逊缓冲液，pH＝8)和酶溶液。测量在时间0小时于254nm处的OD吸光度和溶液的起始pH。

每个烧杯装配一种内衬有2个neoprin垫片的盖子并且用金属夹紧装置紧密闭合。将这些烧杯加载到预热至70℃的LOM中。在垂直位，在这4个鼓位中的每个中，使用金属架来接纳并固定5个烧杯。闭合该LOM盖子并进行洗涤。

2小时后，将这些织物转移至钝化溶液(2g/L碳酸钠)中在95℃下持续10分钟，并且随后在1L热水中冲洗两次，接着在1L冷水中冲洗两次。将这些织物滚动干燥(AEG，LAVATHERM 37700，德国)1小时，在此之后在评价之前将其如以上所述的进行调节。

将来自每个烧杯的处理浴以13000rpm离心1分钟并且确定pH和在254nm处的OD吸光度。评估织物的起球记录和重量损失。

根据产品手册，用BCA^TM蛋白测定试剂盒(BCA^TM Protein Assay Kit)(产品编号23225，可商购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.))测量酶蛋白。

OD吸光度和pH测量

通过在埃普多夫(eppendorf)管中水解PET或BETEB来研究角质酶活性。水解产物是对苯二甲酸盐及其酯，其具有254nm(UV)左右的特征吸收峰。在254nm的OD吸光度(OD₂₅₄)反映酶的向着聚酯的水解活性。增加对PET或BETEB的酶活性导致OD₂₅₄的增加。将OD₂₅₄在SpectraMax M2酶标仪(分子器件有限公司(Molecular Devices,LLC.))中读取。如果该吸光度超过该酶标仪的有效范围1.5的话，将该溶液进行稀释。稀释x15意指该溶液已被稀释15倍。

水解产物对苯二甲酸盐是酸性的并且将降低该溶液的pH。因此，酶活性之后可以是测量pH在该反应之前和之后的变化。

起球记录测试

将已经在标准气候(65％湿度，20℃)下预调节至少24小时的织物(包括处理的和未处理的)针对起球记录用Nu-马丁代尔(Martindale)测试仪(詹姆斯(James)H.希尔有限公司(Heal Co.Ltd)，英格兰)进行测试，用相同类型的未处理的织物作为磨损的织物。在2000回转之后进行标准的起球测试(瑞士标准(SN)198525)，通过从具有如下的定义的含义的1-5标记，其中1显示不良的抗起球而5显示优异的抗起球特性。因此马丁代尔起球记录得分越高，该生物抛光处理越有效。

记录5：没有起球

记录4：轻微起球

记录3：中度起球

记录2：明显起球

记录1：严重起球

允许1/2、1/4记录

对每个样品由不同的人进行三个分开读数，并且这三个读数的平均值被采用作为起球记录的最终结果。

表3：100％稳定的PET机织物于SSLOM¹中的生物打磨(bioblasting)

¹SSLOM是用100％稳定的PET机织物(阳离子可染色的，CHN-2011-00461)在70℃、pH 8.0下进行的。

²浓度被表示为mg的酶蛋白/g的织物。

³起球记录变化是约0.2。

表4：100％稳定的PET机织物于SSLOM¹中的生物打磨(bioblasting)

²浓度被表示为mg的酶蛋白/g的织物。

³起球记录变化是约0.2。

表5：100％稳定的PET机织物于FSLOM¹中的生物打磨

表6：100％稳定的PET机织物于FSLOM¹中的生物打磨

¹FSLOM是用100％稳定的PET机织物(阳离子可染色的，CHN-2011-00461)在70℃、pH 8.0下进行的。

²浓度被表示为mg的酶蛋白/g的织物。

³起球记录变化是约0.2。

表7：不同的PET-混纺棉织物于FSLOM¹中的生物打磨

¹FSLOM是用不同的PET-混纺棉织物在70℃、pH 8.0下进行的。

²浓度被表示为mg的酶蛋白/g的织物。

在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims

1.一种具有亲本角质酶的角质酶活性的变体，这些变体在对应于SEQ ID NO:2的位置181、182、115、161、1、2、43、55、79、或5的一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变，其中该改变是针对位置181、115、161、43、55、79、和5的取代，以及针对位置1、2和182的缺失，并且其中变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％但是小于100％的序列一致性。

2.如权利要求1所述的变体，其中该亲本角质酶选自下组，该组由以下各项组成：

a.与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％序列一致性的一种多肽；

b.由如下的多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或其全长互补体杂交；

c.由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少75％一致性；以及

d.SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段。

3.如权利要求1-2中任一项所述的变体，其中该变体包括SEQ ID NO:2的氨基酸数目的至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％。

4.如权利要求1-3中任一项所述的变体，其中改变的数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个改变。

5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，该变体包括选自下组的一个或多个(例如若干个)改变，该组由以下各项组成：R181P、G182*、V115I、A161L、Q1*、L2*、A43C、I55C、N79A、以及I5V。

6.如权利要求1-5中任一项所述的变体，该变体包括选自下组的改变或由其组成，该组由以下各项组成：

a.V115I+R181P+G182*

b.A161L+R181P+G182*

c.Q1*+L2*+I5V+A43C+I55C+N79A+V115I+R181P+G182*

d.Q1*+L2*+A43C+I55C+N79A+V115I+R181P+G182*

e.I5V+A43C+I55C+N79A+V115I

f.A43C+I55C+N79A

g.I5V+A43C+I55C+N79A+V115I+R181P+G182*

h.Q1*+L2*

i.I5V

j.A43C+I55C

k.N79A

l.V115I

m.A161L

n.R181P+G182*。

7.如权利要求1-6中任一项所述的变体，该变体进一步包括N-末端延伸。

8.如权利要求7所述的变体，其中该N-末端延伸选自：

a.AAVDSNHTPAVPELVAR

b.AVDSNHTPAVPELVAR

c.VDSNHTPAVPELVAR

d.DSNHTPAVPELVAR

e.SNHTPAVPELVAR

f.NHTPAVPELVAR

g.HTPAVPELVAR

h.TPAVPELVAR

i.PAVPELVAR

j.AVPELVAR

k.VPELVAR

l.PELVAR

m.ELVAR

n.LVAR

o.VAR

p.AR

q.R。

9.如权利要求1-8中任一项所述的变体，该变体相对于亲本具有改进的特性，其中这一改进的特性选自下组，该组由以下各项组成：比活性、底物结合、底物裂解、底物特异性、热稳定性、以及减少的起球倾向。

10.一种组合物，包括如权利要求1-9中任一项所述的变体。

11.一种用于修饰聚酯的方法，该方法包括使用如权利要求1-9中任一项所述的变体。

12.一种用于水解聚(对苯二甲酸乙二酯)的环状低聚物的方法，该方法包括使用如权利要求1-9中任一项所述的变体。

13.用于使用如权利要求1-9中任一项所述的变体降低包括聚酯或由聚酯组成的织物的起球倾向的方法。

14.编码如权利要求1-9中任一项所述的变体的多核苷酸。

15.一种包含如权利要求14所述的多核苷酸的核酸构建体。

16.一种包含如权利要求14所述的多核苷酸的表达载体。

17.一种包含如权利要求14所述的多核苷酸的宿主细胞。

18.一种产生角质酶变体的方法，该方法包括：

a.在适于表达该变体的条件下培养如权利要求17所述的宿主细胞；并且

b.回收该变体。

19.一种用于获得角质酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置181、182、115、161、1、2、43、55、79、5和71的一个或多个位置处将改变引入亲本角质酶中，其中该改变是位置181、115、161、43、55、79和5的取代以及位置1、2和182的缺失，并且该变体具有角质酶活性。并且回收该变体。